检验科设备中的常用测量分析方法.doc

检验科设备中的常用测量分析方法及设备不包括医用影象学设备（CT）、手术室设备和医用治疗（理疗）设备的内容。一、检验科设备的种类及功能（一）按功能分类1、生化分析仪：用于测定人体体液中的各种生化指标，如血糖、血脂、无机离子、血清酶、肝功、蛋白质及非氮类化合物等常规生化指标。2、酶标仪：ELISA原理，固相抗原,两对半3、血凝仪：凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)4、血球记数器：记红细胞、白细胞、血小板等5、DNA测序与PCRA、C、G、T四个碱基变性：95，双链变两个单链；退火：55，复性；延伸：72，复制，两个单链变两个双链。30个循环。6、显微图象处理设备：显微镜尿沉渣、血常规：红细胞:每高倍视野见到3个以上的红细胞为异常现象.红细胞可提示肾脏和系统性的多种疾病,包括肾外伤,也可见于剧烈运动后.红细胞可见于外伤性的导尿后、结石的通过、或月经的污染。血尿可见于肾孟肾炎、肾结石、肾肿瘤和泌尿道的其它恶变、也可见于出血性疾病。 白细胞：大量白细胞（脓尿症）的存在提示泌尿道感染。脓尿还可见于急性肾小球肾炎，这些白细胞多是分叶型的中性粒细胞。肾移植病人的尿沉渣中见到大量的单核细胞可提示早期组织排斥现象。 上皮细胞：大量的肾性上皮细胞可提示活动性的肾小管变性。这些细胞常见于急性坏死和肾乳头炎坏死期病人尿沉渣中。 细菌：正常尿液中无细菌存在。标本中大量细菌的存在提示泌尿道感染。标本中白细胞的存在有助于对污染与感染的区分。 酵母菌：酵母菌细胞（白色念珠菌）可提示尿道念珠菌感染，特别是见于糖尿病患者。真菌还常见于女性阴道念珠菌感染者的被污染的尿液中。 寄生虫：尿中大多数寄生虫来自粪便或阴道分泌物的污染。尿道寄生虫感染可与细胞的存在有关，如血吸虫。 精虫：精虫常见于射精和性交后尿液中。 管型：管型常见于肾小球远曲小管中形成，也可在下行Henle环或集合管中形成。管型形成的条件包括酸性环境、高盐浓度、尿流量的减少和蛋白的存在。管型是根据其内容物而命名，（如红细胞管型、白细胞管型等）红细胞管型提示急性肾小球肾炎、肾梗塞、胶原组织疾病、或亚急性细菌性心内膜炎所致的肾损害的唯一指证。白细胞管型可见于急性肾小球肾炎肾综合症、或肾盂肾炎的患者尿液中。 由于肾盂肾炎可保持完全无症状的，尽管它可发展到损害肾组织，因此仔细检查尿沉渣中的白细胞管型是十分重要的。在某些病例中，它是无症状情况下的唯一的实验室取证。 上皮细胞管型是由融化的脱层管细胞所形成。因此，偶尔见到一个或成堆的肾性上皮细胞并非异常。但是，在任何引起肾小管损害的疾病中，大量上皮细胞管型的出现可提示上皮的过度脱层，如见于肾疾病、子痫、淀粉样病变、和重金属中毒或其它毒素的中毒。透明管型形成Tam-Horsfall蛋白的凝胶体，与肾小球毛细管的损害有关，此损害使蛋白质通过肾小球滤过而漏出。这种损害可以是永久性的也可是暂时性的，是由高热、体位的影响（躯位、立位）、情绪压抑、或剧烈运动所致。 颗粒管型“粗颗粒”和“细颗粒”是用于形容管型内容物一细胞破碎颗粒的粗细程度的。在正常尿液中可见到一个颗粒管型。大多数情况下，颗粒管型提示肾盂肾炎。颗粒管型还见于慢性肾脏疾病。7、尿分析仪尿常规：尿胆原、葡萄糖、酮体、胆红素、蛋白质、亚硝酸盐、白细胞、红细胞、（pH、比重）（二）按原理分类1、光电类：光谱分析、光度分析、荧光分析光电检测技术以及近红外光谱技术、激光技术、多通道光谱检测技术等现代光学技术 21世纪是生命科学的世纪，是光电子学的世纪。在医疗检验学方面，很多基于光谱学、光电子学方法的仪器，比如生化分析仪、血糖仪、酶链免疫分析仪、尿分析仪、细胞分析仪、DNA测序等，这方面的仪器是检验设备中最重要的组成部分之一。在国外，检验方法、检验仪器的研究出现了突飞猛进发展，新技术、新思想不断涌现。而我国，在这方面相对比较落后，大型医院所需的高档次检验设备，基本依赖进口。2、电化学类电解质分析仪3、图象分析类4、色度分析类尿分析仪、干式生化仪、干式电解质分析仪二、光度分析方法在检验设备中的应用（一） 吸光光度分析方法1、原理“吸光光度分析方法”又称“紫外及可见分光光度法（Ultraviolet-visible Spectrophotometry, UV-Vis）”，是根据物质分子对紫外及可见光谱区的吸收特性和吸收程度，对物质进行定性和定量分析的一种吸收光谱法。全自动生化分析仪检验血液中各物质含量的分析是吸光光度分析方法的应用之一，根据分析化学中的显色反应，利用不同的生化试剂把不同物质的含量通过颜色深浅反应出来，再由郎伯-比尔定律定量分析其浓度。布格（Bouguer）和郎伯（Lambert）先后在1729年和1760年阐明辐射强度和吸收层厚度的关系，1852年比尔（Beer）又提出辐射强度和吸收物浓度也具有类似的关系，这便是著名的布格-郎伯-比尔定律1。比尔定律的数学表达式为： A=bc (2-1) 式中，A为吸光度，I0为入射辐射强度，It为透过辐射强度，b为吸收层厚度（cm），C为吸收物的摩尔浓度（M），为摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）。此定律广泛应用于紫外-可见-红外光谱区吸收测量，全自动生化分析仪中各项生化指标的检验也依据于此定律。比尔定律的成立是以下列条件为前提的：（1） 入射辐射为单色辐射；（2） 吸收过程中各物质无相互作用，但各物质的吸光度具有加合性；（3） 辐射与物质的作用仅限于吸收过程，没有荧光、散射和光化学现象；（4） 吸收物是一种均匀分布的连续体系。如偏离以上任意一点，吸光度与浓度（或吸收层厚度）的线性关系将受影响，从而影响分析结果的准确度。其中（2）、（3）由生化分析试剂的特性来保证，（1）由光学系统来保证，（4）由搅拌机构来保证。2、吸光光度分析方法的误差来源荧光和光化学反应的影响通常的生化试剂的荧光效率很低，产生的荧光又是各向同性的，只有非常少的一部分沿透射方向进入检测器，所以荧光的影响是可以忽略的。采用后分光技术时，即复色光先照射比色池再进入单色器，由于样品所受的光辐射比较强，有可能发生光化学反应，因此，一方面要尽量减弱入射光的强度，另一方面要选择不容易发生光化学反应的检验试剂。反射和散射效应的影响比尔定律成立的前提条件是吸收物是一种均匀分布的连续体系，如果待测液体有浑浊质点，当光辐射通过时会产生散射效应，它对吸光光度分析方法测量的影响表现为光程不确定，散射光的一部分和透射光一起进入检测器，导致比尔定律的偏离。然而，浑浊的试样在临床生化检验中是极为常见的，甚至一些检验项目本身就是以测量试样浊度为基础的，为了减小散射效应的影响，可采取双波长或三波长分光光度法。光的非单色性带来的误差比尔定律的重要假设条件之一是入射光为单色光，但是，即使是现代高精度分光光度计，也不可能获得纯单色光。分光光度计单色光的纯度主要取决于色散元件和光学系统设计。大多数分光光度计只能获得近似于单色的狭窄通光带，它仍然具有复色光的性质，而复色光可导致比尔定律的正或负向偏离仪器杂散光的影响杂散光是指进入探测器而处于待测波长光谱带宽以外的其它波长的光。它主要来源于光学元件表面的散射、单色器内壁的散射和由于单色器密封不好而带来的漏光。杂散光的存在，干扰了对正常光辐射强度的检测，可引起严重的测量误差。由于一般杂散光不随被测液体浓度的变化而变化，或者变化很小，所以它主要影响检测结果的线性，被测液体浓度越高，影响越严重。非平行光入射的影响比尔定律的前提条件之一是采用平行入射光束，以确保全部光束通过同一厚度的吸收介质。当入射光束偏离平行性较大时，就会明显地导致偏离比尔定律。如图1所示，设吸收体为一长度为b的具有平行透光面的吸收池，当有非平行光存在的情况下，平均光程一般大于b，故测量吸光度A测大于真吸光度A，以和R分别表示入射角和折射角，非平行光的光程为b/cosR，以入射角为入射光的透光率为10-A/cosR，总透光率为：T=图1 非平行光入射当n=4/3, 最大=13.5，R最大=10时，测量吸光度A测与真实吸光度A之间的差别如下表所示。表2-1 由于入射光束不平行引起的吸光度测量误差真实吸光度A0.11.02.05.0测量吸光度A测0.10051.0052.0105.025电子学系统带来的误差电子学系统对吸光度测量所引入的误差可从以下几个方面考虑：(1)系统的非线性电子学的非线性包括探测器的非线性、放大器的非线性以及A/D转换器的非线性。探测器的非线性是探测器本身所固有的，任何探测器都有所适用的线性范围，超过这个范围，它的非线性将明显加剧。因此，要根据实际条件选择适当的探测器。电子学放大器也不是理想的，也存在线性度和线性范围的问题。在检测吸光度比较大的被测液体时，为了提高检测精度，一是采用变增益放大器，一是采用对数放大器。在变增益放大器中还存在不同放大倍数时，放大器本身工作条件变化而引起失调电流、失调电压的改变，这也反映在放大器非线性的问题上；另外，放大倍数比一定准确，它的误差也会引起非线性误差。在对数放大器中，失调电流的存在使放大器偏离对数曲线，在检测结果上，就会表现出系统存在非线性误差。A/D转换器和放大器一样，存在非线性误差和失调电压，最终使系统的线性变差。(2)系统的噪声以及系统外的干扰电子学系统的噪声是属于随机，噪声的波形是任意的，由于噪声的存在使检测结果在一个真值上叠加了一个起伏，这样我们在进行数据采集时就会有误差。来自系统以外的电磁干扰会产生和噪声一样的结果。对于强信号和弱信号来说，当系统和系统所处的干扰环境一定时，噪声和干扰的水平是一样的，因此在检测结果上，弱信号更容易偏离其固有的真值。(3)系统的稳定性电子学系统的稳定性要求包括放大器系统、光源电源的温度漂移和光源辐射的长时间稳定性。一般检测吸光度要经过两次测量，第一次检测空白参比液的透过光强，第二次检测被测液体的透过光强，二者经过计算得到吸光度。如果这两次测量是相继完成的，测量过程又很快，对电子学系统的稳定性要求就相对低些。相反，在很多场合这两次测量过程相隔的时间很长，甚至超过24小时，则对电子学系统的稳定性提出了很高的要求。3、仪器的组成光源（电源）系统：光辐射与I的4次方成正比恒温系统：37单色器：滤光片、光谱仪比色池：流动、分立探测器：光电池、光电倍增管放大器：高输入阻抗、低噪声、电流-电压变换数据采集：A/D精度要求，3ABS=1/1000；3ABS-2.999ABS=18位A/D；1ABS-0.999ABS=12位A/D分析软件：医学相关（二）生化分析仪及显色反应1、显色反应的定义利用比尔定律测液体的浓度，若待测物质本身有较深的颜色，直接测定；待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂（color reagent）。按显色反应的类型来分，主要有氧化还原反应和络合反应两大类，而络合反应是最主要的。在分析血液中不同的物质的含量时，需要有不同的显色反应，即使用不同的生化试剂。2、测量波长的选择为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光，这称为“最大吸收原则”（maximum absorption）。选用这种波长的光进行分析，不仅灵敏度高，且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯-比尔定律的偏离。但是，在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时，则应重新选择入射光波长。例如，用丁二酮肟光度法测钢中镍时，络合物丁二酮肟镍的最大吸收波长为470nm，但试样中的铁，用酒石酸钠掩蔽后，在470nm处也有一定吸收，干扰镍的测定。为避免铁的干扰，可以选择波长 520 nm进行测定，虽然测镍的灵敏度有所降低，但酒石酸铁不干扰镍的测定。3生化检验项目中的各种生化试剂，都有自己特定的工作波长范围，只有在相应的波长范围内进行吸光光度法测试，才能得到正确结果。3、参比溶液的选择利用参比溶液来调节仪器的零点，可消除由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，扣除干扰的影响。在一般的分析化学反应中，选择参比溶液应遵循如下规则：1 试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。2 显色剂为无色，被测试液中存在其他有色离子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。3 显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。4 显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。5 改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除干扰。在生化检验项目中，由于血清本身是带有颜色的，可根据不同试剂的实际情况，选择用试剂或蒸馏水作参比溶液。4、干扰及其消除方法试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。例如干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰。干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，便显色反应不完全，也会造成干扰。干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。为消除以上原因引起的干扰，可采取以下几种方法。a. 选择适宜的显色反应条件，比如控制溶液酸度，使干扰离子不与显色剂作用。b. 加入掩蔽剂，使其与干扰离子反应生成相对无色的配合物。选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成的络合物的颜色应不干扰待测离子的测定。c. 加入氧化剂或还原剂，使其与干扰离子反应，改变干扰离子的价态。d. 利用校正系数e. 用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。f. 选择适当的波长g. 当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加显色剂的用量来消除干扰。h. 分离干扰离子，当以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法。在生化检验中，为了消除干扰一个试剂盒中常常由两个不同的试剂组成，其中一个是显色剂，另一个是掩蔽剂、氧化剂或还原剂。5、生化分析中的一般定量方法生化分析的一般过程利用比尔定律检测人体血液中某种物质含量时，一般要进行如下几步操作过程：1、 血清分离：通过离心机，把血清从全血中分离开来，以消除血细胞对生化检验的影响。2、 加入试剂。检验不同的物质，需要有不同的显色反应，即用不同的试剂盒。按照试剂盒说明书的要求，结合生化分析仪的实际情况，把合理比例的待测血清样品和试剂混合在一起，搅拌均匀。在许多试剂盒中，存在两种试剂，在加入显色剂前，要加入掩蔽剂、氧化剂或还原剂，以消除干扰物质的影响。3、 恒温反应。试剂和样品的反应情况，受反应温度的影响很大，所以，为了得到一个重现性比较好的反应结果，要求反应过程中，试剂和样品应处于一个恒温环境。现在，大多数试剂盒的反应温度在37C，少数在25C、30C，要求其它温度的比较少见。4、 吸光度检验。每种试剂盒都有其特定的分析方法：吸光度法、终点法、动力学法、双波长法等。不同的分析方法对吸光度检验的要求也不同，吸光度法、终点法只关心显色反应结束时反应液的吸光度，动力学法则要求对反应过程中的吸光度都要检测。计算结果。在得到吸光度数值后，可根据试剂盒说明书上给定的计算方法计算结果。吸光度法由比尔定律，如果被测样品的吸收层厚度b已知，即比色池的光程已知，被测样品的摩尔吸光系数也可以通过有关手册或文献查到，在测得被测样品的吸光度A后，通过比尔定律便可求出被测样品的浓度，即：C=A/（b）这种方法称为吸光度法，又叫绝对法。终点比色法利用终点法进行定量分析时要作分别对空白、标准、待测样品三个试样进行测量，得到三个吸光度值，分别为：A空白、A标准、A待测样品，然后按照下式计算得到待测样品浓度。C待测样品=C标准（A待测样品-A空白）/（A标准-A空白）其中A空白：n毫升蒸馏水加入到m毫升试剂中，在恒温环境中反应确定的时间后，反应液的吸光度。A标准：n毫升标准液加入到m毫升试剂中，在恒温环境中反应确定的时间后，反应液的吸光度。A待测样品：n毫升标准液加入到m毫升试剂中，在恒温环境中反应确定的时间后，反应液的吸光度。C标准：试剂盒中标准液的给定浓度。n、m的数值由试剂盒给定，或者根据试剂盒按比例确定。反应温度和反应时间也由试剂盒给定。不难看出，终点分析方法试剂盒中，血清中待测物质的含量和反应液的最终吸光度成正比，而与反应过程无关。它属于分析化学中的标准对照法。在应用时应注意试剂空白的测量，一般当参比溶液选择蒸馏水时，如果采用上式进行计算，要先计算试剂空白的吸光度，然后再从标准和待测样品反应液吸光度中扣除。也可以直接采用试剂空白作为参比溶液，检测吸光度，即可认定A空白为0。动力学法动力学分析法是以测量反应物浓度与反应速率之间的关系为定量基础的，它一般可用分光光度计、荧光分光光度计、化学发光仪作为检测手段。与传统的热力学方法不同，动力学法是在反应达到平衡态前就开始测定，因而扩大了可利用的化学反应范围，克服了经典分光光度法的弱点，使分光光度法有了新的发展。在分析化学中，动力学法是一种重要的定量分析方法；在临床检验中，动力学法是研究人体中各种酶的重要手段。临床检验中，酶的测定通常包括两种类型：一种是以酶为分析对象的分析，这就是通常所说的酶活力测定法；另一种是以酶为分析工具或分析试剂的分析，一般可称为酶分析法。前者的目的在于测定样品中某种酶的含量或活性；后者则主要用酶作试剂测定样品中酶以外的其它物质的含量。二者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是以酶能唯一而高效地催化某化学反应为基础，通过对酶反应速度的测定或对生成物等浓度的测定而检测相应物质的含量。双波长吸光光度分析方法原理使两束不同波长的单色光以一定的时间间隔交替地照射同一吸收池，测量并记录两者吸光度的差值A。A与吸光物质浓度成正比，这是双波长法定量的理论依据。1优点与单波长法不同，双波长法在同一样品、同一吸收池条件下分别检验两个不同波长单色光下的吸光度，得到吸光度差。它有如下优点：（1） 除来自样品内部的干扰当被测样品存在吸收干扰物或散射干扰物时，由于两个波长吸光度的测量值来自于同一比色池，相减后，可以基本消除干扰，区分出待测物的浓度，它改善了单波长吸收测量的选择性、灵敏度和准确度，在一定程度上也改善了测量的精密度。（2） 低吸收池误差在单波长法中，为了提高测量的准确度，要求样品池和空白参比池的透光性质完全一样，否则会产生误差。但在双波长法中，由于两束光沿着相同的光程通过同一吸收池，因而吸收池的透光性引起的误差可以忽略。正是因为双波长法有着单波长法无可比拟的优点，在许多临床生化检验试剂盒中，都同时给出了单波长法和双波长法两种检验参考波长。（三）ELISA（酶链免疫）原理与酶标仪固相抗原与血清反应，看血清中有无抗体（四）凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)的光度学检验原理光度法、磁珠法、钩子法三、色度分析仪器在检验设备中的应用尿试纸、血糖试纸，干法生化、电解质试纸（一）色度分析方法三基色坐标（二）色度分析仪器的组成组成：三色光源（电源）系统、探测器、放大器、数据采集与处理、分析软件四、荧光检测与DNA测序（一） 意义（二） PCR与DNA的复制四种特殊标记的碱基，可中断复制过程A、C、G、T四个碱基变性：95，双链变两个单链；退火：55，复性；延伸：72，复制，两个单链变两个双链。30个循环引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成： 1、 在高温（95）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；2、 在低温（3755）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；3、 在Taq酶的最适温度（72）下，以引物3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板