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國 立 成 功 大 學 生 物 化 學 研 究 所 碩 士 論 文 國 立 成 功 大 學 生 物 化 學 研 究 所 碩 士 論 文 人類細胞色素C 參與活化C a s p a s e s 的胺 基酸之鑑定 人類細胞色素C 參與活化C a s p a s e s 的胺 基酸之鑑定 Identification of the Residues of Human Cytochrome c Involved in Activating Caspases 研究生：蔡 育 宏 指導教授：莊 偉 哲 教授 中華民國九十三年七月 I 中中 文文 摘摘 要要 計畫性細胞凋亡在不同的真核生物中的胚胎發育及組織的發展恆定扮 演十分重要角色。在正常細胞受到刺激之後，有兩條不同的途徑會引發細胞 凋亡。其一途徑是外在受體受到所引發的細胞凋亡，其次是與細胞中的粒腺 體相關的內在途徑。這兩條訊息傳遞路徑都已經有相關的文獻研究。其中細 胞色素 C 在於細胞受到刺激之後會從粒腺體中釋放出來並且與 Apaf-1 蛋白 結合成 apoptosome 進而引發內在路徑的細胞凋亡。細胞色素 C 是與 Apaf-1 的 WD40 區域產生蛋白交互作用活化 procaspase 9 並進而產生 caspase 3 的 活化造成細胞凋亡。但是並無相關文獻指出關於細胞色素 C 是藉由哪些氨 基酸與 Apaf-1 產生交互作用。因此，我們先使用牛的 transducin 綜合體 (2TRC)與大腸桿菌 Tolb 蛋白(1CRZ)模擬出可能的 Apaf-1 的 WD40(7)與 WD40(6)區域之結構。藉由結構分析，我們假設人類細胞色素 C 之鹼性氨基 酸 Lysine 可能與 Apaf-1 的 WD40 區域之酸性氨基酸 Aspartic acid 存在有重 要的相互作用。因此，我們將人類細胞色素 C 上的 K72, K73, K86, K87 and K88 突變成 Ala ， 我們想要去驗證是否上述的 Lys 在與 Apaf-1 蛋白交互作用 中扮演的角色。此外，有文獻研究指出 Y67 的硝化作用會造成細胞色素 C 的結構改變並影響其活化 caspases 的能力。因此，我們也對於 Y67 做了 Y67W、Y67H、Y67A、Y67F 之突變。我們將上述的人類細胞色素 C 之突 變株表現在大腸桿菌中並使用K562細胞株細胞液去進行caspase 3的活性分 析。我們實驗中所使用的受質是螢光且具特異性的 caspase 3 之受質 Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethyl coumarin(DEVD-AFC)。分析人類細 胞色素 C 造成 caspases 活化的氨基酸。我們在實驗結果中發現 K86、K87、 K88 若突變成 Ala 則會使得活化 Caspase 3 的能力降低。因此，我們猜測這 些胺基酸可能是參與和 Apaf-1 作用的胺基酸並對於細胞凋亡有更進一步的 瞭解。 II 英英 文文 摘摘 要要 Apoptosis is an important form of programmed cell death required for the embryonic development and tissue homeostasis of multicellular organisms. The extrinsic death receptors- and intrinsic mitochrondria-dependent pathways following the apoptotic stimulus leading to caspases activation have been well characterized. Cytochrome c released from mitochondria functions as a trigger for the formation of apoptosome in the intrinsic apoptotic pathway. The apoptosome is a heptameric complex comprised of apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1) and cytochrome c. The apoptosome binds and activates procaspase-9, resulting in activation of further caspases, such as caspase-3, which orchestrate the final packaging of the apoptotic cell. Apaf-1 is a 130-kDa protein consisting of a caspase recruitment domain (CARD), an arm domain, and two WD-40 repeats. It was shown that the WD-40 repeats act as a recognition domain for mitochondrial damage through binding to cytochrome c, allowing Apaf-1 to oligomerize and interact with procaspase-9 through the CARD-CARD interaction. However, little is known about how human cytochrome c interacts with Apaf-1. Using 3D structure of bovine transducin / complex (2TRC) and E. coli Tolb protein (1CRZ) as structural templates, 3D model structures of two WD-40 repeats (WD-40 (7) and WD-40 (6) was generated using homology modeling. Based on the structural analyses of human cytochrome c docking into two WD-40 repeats of Apaf-1 model, we hypothesized that the basic residues K72, K73, K86, K87 and K88 of cytochrome c maybe involved in the interaction with the acidic D residues of two WD-40 domains of Apaf-1. It was reported that the nitration of Y67 residue promoted a conformational change, resulting in affecting activation of caspases by cytochrome c. To identify the residues of III cytochrome c involved in activation of caspases, we used site-directed mutagenesis on human cytochrome c and cell-free caspase activation assay to carry out the study. In this study we have expressed seven cytochrome c mutants (K72A/K73A, K72A/K86A, K86A/K87A/K88A, Y67A, Y67F, Y67H, and Y67W) and purified them to homogeneity with the yields of 5-15 mg/L. To identify the interaction between human cytochrome c and Apaf-1, we determined the biological activity of recombinant cytochrome c by using a cell-free caspase activation assay. This method indirectly measures their ability to bind Apaf-1, and the fluorogenic Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethyl coumarin (DEVD-AFC) was used as the caspase-3 substrate. The mutations of K72, K86, K87, and K88 to alanines caused the decrease in activating caspase 3, suggesting that these residues maybe involved in Apaf-1 binding. These results may be important not only for identifying the binding residues of cytochrome c to apaf-1, but also for understanding cell apoptosis. IV 誌 謝 感謝這兩年多來成大生化所的莊偉哲教授及同時畢業的博士鄭文義學 長的指導及提攜 ， 並對在百忙之中撥冗來參與論文口試並給予寶貴意見的周 三和教授及黃太煌教授表示誠摯的感謝。 同時感謝在 WJ C L A B中身為大姊大的陳秋月學姐，一隻魚有兩個身體 的朱苑萍學姐，吃素一年有兩個可愛小孩的陳怡均學姐及其老公鄭俊和學 長，還有同窗共甘苦兩年的黑熊劉祐禛同學及家中都是男丁的黃湘琦同學， 以及迷迷糊糊的王佩如學妹 ， 笨牛球迷紀仁智學弟與其同黨的白熊張家豪學 弟還有即將踏入實驗室的笨獅球迷陳貯俊學弟，聰明象迷謝堯勲學弟，同是 南一中畢業的王志傑學弟 ， 同是醫技系畢業的杜威德學弟與無緣的蔡慧穎學 妹和黑熊的學弟劉建良學弟，還有同時進實驗室而已經畢業豪哥許家豪學 長、孫千惠學姐、廖如樺學姐等在這兩年多來的陪伴，讓我留下珍貴美好的 回憶。此外，還要感謝林銘德教授實驗室的成員（族繁不及備載），尤其是 丸老大蔡宛華學姐在細胞相關實驗上的指導與幫助 ， 以及成大生化所的所有 老師與同學及生化所所辦成員的照顧與陪伴。 最後，感謝養育我的父母，提供我無憂慮的求學環境，使我能夠順利地 取得碩士學位 ， 在此致上最深的敬意與感謝並將此份榮耀獻給我的父母蔡崇 熙先生與陳彩雲女士以及在我身旁陪伴我一路走來的每一個人。 育宏 2 0 0 4 / 0 7 / 1 5 V 目目 錄錄 中文摘要中文摘要 I 英文摘要英文摘要 II 誌謝 誌謝 IV 目錄目錄 V 表目錄 表目錄 VII 圖目錄 圖目錄 VIII 中英對照表 中英對照表 X 縮寫檢索表 縮寫檢索表 XI 儀器 儀器 XII 第一章第一章 緒論 緒論 1 1-1 背景簡介 背景簡介 1 1-1-1. 血基質蛋白質血基質蛋白質 1 1-1-2. 細胞色素細胞色素 C 3 1-1-3. 微過氧化酶微過氧化酶 6 1-2 研究目標 研究目標 9 第二章第二章 材料與方法 材料與方法 11 2-1 各種實驗用之重組蛋白質製備各種實驗用之重組蛋白質製備 11 2-1-1 酵母菌細胞色素酵母菌細胞色素 C 的基因選殖及重組蛋白的表現與純化的基因選殖及重組蛋白的表現與純化 11 2-1-2 人類人類 cytochrome c 重組基因及其突變株重組蛋白之構築重組基因及其突變株重組蛋白之構築 19 2-1-3 人類人類 cytohrome c 重組蛋白及其突變株重組蛋白之純化重組蛋白及其突變株重組蛋白之純化 20 VI 2-1-4 SDS-PAGE 分析分析 22 2-2 人類人類 cytochrome c 參與活化參與活化 Caspases 之氨基酸研究之氨基酸研究 26 2-2-1 K562 細胞萃取液之製備細胞萃取液之製備 26 2-2-2 Caspases 3 活化之測試活化之測試 27 2-3 微過氧化酶的酵素活性測定微過氧化酶的酵素活性測定 29 2-3-1 乙醯化微過氧化酶乙醯化微過氧化酶 Ac-MP-11 的製備的製備 29 2-3-2 微過氧化酶的過氧化酶微過氧化酶的過氧化酶(peroxidase)的酵素活性測定的酵素活性測定 32 第 三 章第 三 章 實 驗 結 果實 驗 結 果 34 3-1 細 胞 色 素細 胞 色 素 C 重 組 蛋 白 質 製 備 及 特 性 分 析重 組 蛋 白 質 製 備 及 特 性 分 析 34 3-1-1 人 類 細 胞 色 素人 類 細 胞 色 素 C 及 其 突 變 之 重 組 蛋 白 的 製 備 與 鑑 定及 其 突 變 之 重 組 蛋 白 的 製 備 與 鑑 定 34 3-1-2 人 類 細 胞 色 素人 類 細 胞 色 素 C 及 其 突 變 之 重 組 蛋 白 活 性 之 鑑 定及 其 突 變 之 重 組 蛋 白 活 性 之 鑑 定 35 3-2-1 酵 母 菌 細 胞 色 素酵 母 菌 細 胞 色 素 C 及 其 突 變 株 重 組 蛋 白 製 備 與 鑑 定及 其 突 變 株 重 組 蛋 白 製 備 與 鑑 定 36 3-2-2 微 過 氧 化 酶 的 製 備 結 果微 過 氧 化 酶 的 製 備 結 果 37 3-2-3 微 過 氧 化 酶 的 過 氧 化 酶微 過 氧 化 酶 的 過 氧 化 酶 (peroxidase)酵 素 活 性 研 究酵 素 活 性 研 究 38 第 四 章第 四 章 討 論討 論 39 4-1 細 胞 色 素細 胞 色 素 C 及 其 突 變 之 重 組 蛋 白 質 的 表 現及 其 突 變 之 重 組 蛋 白 質 的 表 現 39 4-2 細 胞 色 素細 胞 色 素 C 及 其 突 變 之 重 組 蛋 白 質 活 性 測 試及 其 突 變 之 重 組 蛋 白 質 活 性 測 試 41 4-3 微 過 氧 化 酶 的 酵 素 活 性微 過 氧 化 酶 的 酵 素 活 性 43 第 五 章第 五 章 結 論結 論 44 參考文獻參考文獻 45 表表 55 圖圖 61 VII 表表 目目 錄錄 表表 1：各種廣泛分佈於自然界中之血基質蛋白質及其功能：各種廣泛分佈於自然界中之血基質蛋白質及其功能 55 表表 2：血基質蛋白質之第五配位基、第六配位基與遠端胺基酸在其 蛋白質功能上扮演重要角色 ：血基質蛋白質之第五配位基、第六配位基與遠端胺基酸在其 蛋白質功能上扮演重要角色 55 表表 3：各種重組基因所用的引子：各種重組基因所用的引子(primer)鹼基序列鹼基序列 56 表表 4：各株人類細胞色素：各株人類細胞色素 C 突變蛋白的質譜分析突變蛋白的質譜分析 57 表表 5：各種人類細胞色素：各種人類細胞色素 C 重組蛋白質的產率與純度重組蛋白質的產率與純度 58 表表 6：各株：各株 Yeast 細胞色素細胞色素 C 突變蛋白的質譜分析突變蛋白的質譜分析 59 表表 7：各種：各種 Yeast 細胞色素細胞色素 C 重組蛋白質的產率與純度重組蛋白質的產率與純度 60 VIII 圖圖 目目 錄錄 圖圖 1：在真核生物中細胞色素：在真核生物中細胞色素 C 位於粒線體的內外膜間質中，會與粒 線體的內膜進行鬆散式的結合，在呼吸鏈中進行電子傳遞的功 能 位於粒線體的內外膜間質中，會與粒 線體的內膜進行鬆散式的結合，在呼吸鏈中進行電子傳遞的功 能 61 圖圖 2：在細胞受到細胞凋零：在細胞受到細胞凋零(apoptosis)的訊息刺激之後，會將細胞色 素 的訊息刺激之後，會將細胞色 素 C 從粒線體中釋放到細胞質並導致細胞走向細胞凋零從粒線體中釋放到細胞質並導致細胞走向細胞凋零 61 圖圖 3 ： 同時將： 同時將 human 的的 cytochrome c 基因與基因與 yeast cytochrome c heme lyase 基因基因(cyc-3)一起構築到一起構築到 pET-21a (+)質體之流程圖。質體之流程圖。 62 圖圖 4：利用重疊延伸方式產生定點突變之示意圖。：利用重疊延伸方式產生定點突變之示意圖。 63 圖圖 5：將：將 yeast iso-1-cytochrome c 突變成人類突變成人類 cytochrome c 所使用的 八段引子及突變後的人類 所使用的 八段引子及突變後的人類 cytochrome c 基因序列。基因序列。 64 圖圖 6：人類細胞色素：人類細胞色素 C 的相關突變的相關突變 Y67、K72、K73、K86、K87、 K88 於結構空間上的分佈圖於結構空間上的分佈圖 65 圖圖 7：人類細胞色素：人類細胞色素 C 分別利用分別利用(A) SP Sepharose 進行粗純化進行粗純化 (B) P-30 Gel 進行純化時所利用進行純化時所利用 A280 偵測記錄之繪圖偵測記錄之繪圖 66 圖圖 8：利用：利用 Tricine-SDS-PAGE 分析分析 cytochrome c 及其突變純化之結 果 及其突變純化之結 果 66 圖圖 9 ： 人類細胞色素： 人類細胞色素C突變蛋白突變蛋白 K72A-K73A/K86A-K88A進行進行 HPLC 精純化時所利用精純化時所利用 A415 偵測記錄之繪圖偵測記錄之繪圖 67 圖圖 10：利用大腸桿菌所表現的人類細胞色素：利用大腸桿菌所表現的人類細胞色素 C 及其突變蛋白之質譜 分析圖 及其突變蛋白之質譜 分析圖 68 圖圖 11：利用：利用 K562 cell lysate 使用人類細胞色素使用人類細胞色素 C 及不同突變株所進 行的 及不同突變株所進 行的 Cell-free caspase activation assay 的分析結果圖的分析結果圖 69 IX 圖圖 12：利用：利用 K562 cell lysate 使用人類細胞色素使用人類細胞色素 C 及不同物種之細胞 色素 及不同物種之細胞 色素 C （Horse 與與 Yeast） 所進行的） 所進行的 Cell-free caspase activation assay 的分析結果圖的分析結果圖 70 圖圖 13：利用：利用 K562 cell lysate 與人類細胞色素的不同濃度的與人類細胞色素的不同濃度的 Cell-free caspase activation assay 的分析結果圖的分析結果圖 70 圖圖 14：人類、馬類與酵母菌的細胞色素：人類、馬類與酵母菌的細胞色素 C 蛋白質初級結構比對圖蛋白質初級結構比對圖 71 圖圖 15：Yeast 細胞色素細胞色素 C 水解後所製備的水解後所製備的(A)乙醯化微過氧酶乙醯化微過氧酶 Ac-MP-11 的分子構造的分子構造(B)MP-11 與與 MP-8 之序列之序列 72 圖圖 16：水解細胞色素：水解細胞色素 C 製備製備 MP-11 與與 Ac-MP-11 整個流程圖整個流程圖 73 圖圖 17：用分光光度儀偵測：用分光光度儀偵測 MP-11 的過氧化酶活性之動力學的過氧化酶活性之動力學 73 圖圖 18：Yeast 細胞色同時將細胞色同時將 Saccaromyces cerevisiae 的的 iso-1-cyto- chrome c 基因基因(cyc-1)與與 cytochrome c heme lyase 基因基因(cyc-3) 一起構築到一起構築到 pET-21a (+)質體流程圖。質體流程圖。 74 圖圖 19 ： Yeast cytochrome c 重組蛋白經由鎳離子螯合親和性色層分析 法純化時所利用 重組蛋白經由鎳離子螯合親和性色層分析 法純化時所利用 A280 偵測記錄之繪圖偵測記錄之繪圖 75 圖圖 20：利用：利用 Tricine-SDS-PAGE 分析分析 Yeast cytochrome c WH16 純化 之結果 純化 之結果 75 圖圖 21：利用大腸桿菌所表現的酵母菌細胞色素：利用大腸桿菌所表現的酵母菌細胞色素 C-WH16 與與 Pepsin 水 解產物 水 解產物 Y-MP11(CWHC) 之質譜分析圖之質譜分析圖 76 圖圖 22：微過氧化酶之過氧化酶型態酵素活性分析：微過氧化酶之過氧化酶型態酵素活性分析 77 X 中中 英英 對對 照照 表表 血基質 heme 血基質蛋白 hemoprotein 緩衝液 buffer 沖洗緩衝液 elution buffer 層析 chromatography 膠體過濾層析 gel filtration chromatography 冷凍乾燥 lyophilization 質譜 mass spectra 高壓液相層析 high performance liquid chromatography (HPLC) 分光光度計 spectrophotometer 比色小槽 cuvette cell 透光長度 pathlength 吸光係數 extinction coefficient 光學吸收光譜 optical spectra 細胞色素 C cytochrome c 熱循環器 PCR machine XI 縮縮 寫寫 檢檢 索索 表表 Amp Ampicillin Bisacrylamide N,N-Methylene bisacrylamide bp base pair d.d. H2O double distilled water dNTP deoxyribonucleoside triphosphate E. Coli Escherichia Coli EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid HPLC high performance liquid chromatography IPTG Isopropyl-D-thiogalactoside kb kilobase kDa kilodalton LB Luria-Bertani O.D Optical density PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR Polymerase chain reaction rpm rotation per minutes SDS Sodium dodecyl sulfate TEMED N,N,N,N-tetramethylethylene diamine TFA trifluoroacetic acid TOCSY Total correlation spectroscopy Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethane XII 儀儀 器器 1.離心機 SIGMA-201 CENTRIFUGE 5415C HITACHI himac CR21 SORVALL INSTRUMENTS RC5C 2.震盪水槽 ADVANTEC LAB-Thermo-shaker TS-20 HOTECH Orbital shaker bath-902 3.電泳設備 Bio-RAD Mini-protean II Hofer Mupid-2 Mini-gel Hofer Semi-dry transfer units TE77 4.電力供應器 PHARMACIA Electrophoresis Supply EPS 300 PHARMACIA Electrophoresis Supply EPS 600 PHARMACIA Electrophoresis Supply EPS 3500 XL 5.細胞壓碎機 OHTAKE French Press 6.pH 測定計 WPA pH meter CD-720 CORNING pH/ion meter 150 7.分光光度計 BECKMAN DU 640 XIII 8.液相層析純化系統 PHARMACIA LKB-Optical Unit UV-1 LKB-Control Unit UV-1 LKB FRAC-100 LKB-Pump P-1 REC 102 9.真空乾燥器 Hetovac VR-1 10.熱循環器 Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400 11.高效能液相層析儀 Millpore Watres pump Model 510 LC spectrophototometer Model 481 Automated gradient controller Beckman 18C column 12.冷凍乾燥機 LABCONCO Cascude Freeze Dryer-18 Freeze Dry System 13.發酵槽 New branswick scieneific fermator Bioflo 2000 14.螢光偵測儀 PEEKIN ELMER HTS 7000 Bio Assay Reader 1 第一章第一章 緒論緒論 1-1 背景簡介背景簡介 1-1-1. 血基質蛋白質血基質蛋白質 (Hemoproteins) 血基質(heme)是種重要且分佈廣泛的金屬性輔因子(cofactor)，存在於 多種具有不同功能的蛋白質或酵素中，其構造是由四個比喀(pyrrole)以次 甲基(methylene)圍成一個共平面的環，此環稱為紫質(porphyrin)，紫質的 外部則是有甲基(methyl)、乙烯基(vinyl)與丙酸(propionate)等取代基，若 紫質的內部中央鍵結上一個鐵原子，我們便稱作血基質，其中鐵是與四 個比喀上的氮原子(N)形成鍵結。 其實整個血基質的作用位置(active site)就是內部中心的鐵，因鐵具有 六個配位(coordinate site)，在其鍵結上紫質平面上的四個氮之後，還空出 兩個與紫質平面垂直的配位 ， 即是鐵的第五 、 第六配位或稱為垂直軸(axial) 配位。所以，鐵可以利用這兩個垂直軸配位與其它物質產生交互作用 (interaction)，進而達到催化的效果。 含有血基質這種輔因子的蛋白質稱作血基質蛋白質，血基質蛋白質 的作用非常多樣，廣泛分佈於自然界並且執行重要的功能，包括過氧化 氫(H2O2)的利用與分解，如：過氧化酶(peroxidase)與過氧化氫酶 (catalase)；氧氣的攜帶與貯存，如：血紅蛋白(hemoglobin)、肌球蛋白 (myoglobin)；電子的傳遞，如：細胞色素 b5 與 c (cytochromes b5, c)；苯 環物質的氧化，如：細胞色素 P450 (cytochrome P450)等不同的作用(如表 1)。雖然各種血基質蛋白質都含有血基質，但血基質中鐵的許多性質，如 2 氧化狀態(oxidation state)、電子組態(spin state)以及垂直軸配位基等的不 同使得血基質蛋白質各具有不同的功能。 其中，在鐵的氧化態方面有正二價鐵或正三價鐵；在鐵的電子組態 方面有 high spin 或 low spin，此外；在鐵的兩個垂直軸配位中，其中一個 配位也就是第五配位是鍵結到蛋白質本身的胺基酸(此胺基酸稱之為近端 配位基(proximal ligand)或是第五配位基(fifth ligand)，而空出來的另一個 配位，即第六配位則是血基質的作用中心(active site)，可與受質(substrate) 產生反應以達到催化的目的；也可以鍵結到其它的物質，或著是鍵結到 蛋白質本身的另一個胺基酸(稱之為軸配位基(axial ligand)或是第六配位 基(sixth ligand)，而且位於軸配位基周圍之遠端胺基酸亦大大地影響了血 基質蛋白質的催化功能。以上的種種，使得血基質蛋白質表現出廣泛且 多樣的功能(如表 2)。 3 1-1-2. 細胞色素細胞色素 C (Cytochrome c) 細胞色素C是一種水溶性的血基質蛋白質，廣泛的存在於各式物種的 生物中，在真核生物中細胞色素C存於粒線體的內外膜間質中，它會與粒 線體的內膜進行鬆散式的結合，細胞色素C在細胞中的主要生理功能包括 有：在粒線體的內外膜間質中當電子攜帶者(electron carrier)，在呼吸鏈中 從cytochrome c reducatase接受電子，然後再將電子傳遞給cytochrome c oxidase (如圖1) (Pettigrew, et al., 1987; Morre, et al., 1990; Scott, et al., 1996)；以及近年來之研究則發現細胞色素C與細胞凋亡(apoptosis)(Liu, et al., 1996; Li, et al., 1997; Zou, et al., 1997; Hu, et al., 1999; Saleh, et al., 1999; Jiang, et al., 2000)及氧化壓力(oxidative stress)(Hashimoto, et al., 1999)這兩種重要的生物性過程有關，在細胞凋亡的過程中細胞色素C從 粒 線 體 中 釋 放 到 細 胞 質 ， 在 細 胞 質 中 細 胞 色 素 C 會 與 apoptotic protease-activating factor-1 (Apaf-1) (Hu, et al., 1999; Benedict, et al., 2000) 結合，細胞色素C則是經由與Apaf-1的WD-40 repeats區域結合進而造成 Apaf-1的結構改變(Benedict, et al., 2000)，這個結構的改變主要是將 Apaf-1的caspase recruitment domain (CARD)暴露出來，進而吸引並且活化 pro-caspase-9(Hu, et al., 1998; Adrain, et al., 1999)，pro-caspase-9與細胞色 素C及Apaf-1的複合體會聚集(assembly)形成更大型被稱之為apoptosome 的 複 合 體 ， apoptosome 則 會 進 一 步 活 化 下 游 的 pro-caspase-3 ， 當 pro-caspase-3被活化成caspase-3後則正式將細胞導向細胞凋亡的結果(如 圖2) (Kluck, et al., 1997; Bossy-Wetzel, et al., 1998; Jiang, et al., 2000; Adrain, et al., 2001; Shi, et al., 2001; Acehan, et al., 2002; Adams, et al., 2002)。 由於細胞色素 C 具有的生理功能中，都必須與其他的蛋白質進行蛋 4 白質與蛋白質間交互作用(protein-protein interaction)，才能執行正常的生 理功能，由於與細胞色素 C 有進行蛋白質與蛋白質間交互作用的蛋白質 相當的多 ，例如 cytochrome c reducatase、 cytochrome c oxidase 、cytochrome c peroxidase 及 Apaf-1，細胞色素 C 在與 Apaf-1 結合並活化 Apaf-1 的研 究中，已經知道細胞色素 C 的完整結構特性在活化 Apaf-1 中扮演著非常 重要的角色，而與細胞色素 C 的氧化還原能力(redox activity)並無任何關 係(Kluck, et al., 1997; Yang, et al., 1997) ， 更有研究指出在細胞凋亡的過程 中，細胞色素 C 會被一氧化氮(NO)進行 nitrosylation 的修飾或一氧化氮 (NO)與 superoxide anion (O-)形成的過氧亞硝酸(peroxynitrite)進行 nitration 的修飾，被修飾後的細胞色素 C 會增加其活化 Apaf-1 的能力 (Hortelano, et al., 1999; Cassina, et al., 2000; Chung, et al., 2001; Schonhoff, et al., 2003)；由於具有正確結構之細胞色素 C 在與 Apaf-1 進行交互作用 中扮演著非常重要的角色，因此我們想去探討細胞色素 C 是利用哪些胺 基酸與 Apaf-1 進行交互作用；由於目前的研究幾乎是利用馬類或其它物 種的細胞色素 C 進行相關的研究，因此我們想更清楚的去瞭解人類細胞 色素 C 與 Apaf-1 的交互作用，首先就必須獲得人類細胞色素 C 以進行研 究。我們對於細胞色素 C 是如何跟這些蛋白質進行交互作用而造成細胞 凋亡感到興趣。藉由分析人類細胞色素 C 與目前已知的蛋白之間的相互 作用發現離胺基酸(Lysine)扮演非常重要的角色，經過因此我們假設 K72、K73、K86、K87、K88 等離胺基酸可能是和 Apaf-1 蛋白有進行蛋 白質與蛋白質間交互作用的重要胺基酸。因此，我們將離胺基酸突變成 丙胺酸(Alanine)來探討相關位置的離胺基酸(Lysine)扮演的角色。此外， 我們對於人類細胞色素 C 中的酪胺酸(Tyrosine)進行分析，發現在人類細 胞色素 C 中的 Y46、Y48、Y67、Y74、Y97 的 5 個酪胺酸(Tyrosine)中， 以 Y67 最有可能為 peroxynitrite 進行硝化作用(Nitration)的修飾作用之胺 5 基酸。因此，我們將酪胺酸 67 (Tyrosine)進行突變，將 Y67 改變為色胺 基酸(Tryptophane)、組胺酸(Histidine)、丙胺酸(Alanine)與苯丙胺酸 (Phenylalanine)等胺基酸。由於色胺基酸(Tryptophane)與組胺酸(Histidine) 都有可能是 peroxynitrite 進行修飾作用的胺基酸(Landar et al., 2003)，而 丙胺酸(Alanine) 與苯丙胺酸(Phenylalanine)則不會受到硝化作用的影 響，因此可以觀察是否硝化作用的修飾對於酪胺酸 67 (Tyrosine)有無特異 性存在。此外，我們假設人類細胞色素 C 中的酪胺酸 67(Tyrosine)可能因 為硝化作用的修飾造成甲硫胺酸 80(Methionine)與 Heme 的相對位置改變 而使得人類細胞色素 C 的結構改變進而影響其結構與功能，因此我們將 酪胺酸 67 (Tyrosine)轉變成較大的色胺基酸(Tryptophane)，觀察是否會因 為酪胺酸 67 (Tyrosine)突變成較大的色胺基酸(Tryptophane)，進而造成甲 硫胺酸 80(Methionine)的位移而影響人類細胞色素 C 的結構功能。瞭解人 類細胞色素 C 在細胞凋亡時是藉由哪些胺基酸與其他細胞體內蛋白交互 作用而產生功能，即可使我們對於細胞凋亡的機制有更進一步的認知。 6 1-1-3. 微過氧化酶微過氧化酶 (Microperoxidases) 將細胞色素 C 利用不同的蛋白水解酶(protease)進行水解，可得到含 有血基質及只有 5 個至 11 個胺基酸的血基質蛋白質，這些小的血基質蛋 白質皆具有過氧化酶活性(peroxidative activity)，所以稱作微過氧化酶 (microperoxidase 簡稱之為 MP)，其中較常被研究的微過氧化酶是含有 11 個胺基酸的 MP-11 或是含有 8 個胺基酸的 MP-8(如圖 15) (Tsou, et al., 1951; Tuppy, et al., 1955; Paleus, et al.,1955; Aron, et al., 1986; Baldwin, et al., 1987; Adams, et al., 1993; Chuang, et al., 1999)。 因紫質具有高度的疏水性(hydrophobic)，使得微過氧化酶水溶液在高 濃度下會因疏水性的交互作用(hydrophobic interaction)而造成凝聚 (aggregation)現象，如此便影響到定量的準確性。若將微過氧化酶之蛋白 質骨架N端游離的氨基(-amino)鍵結上乙醯基(acetyl group)變成乙醯化 微過氧化酶(N-acetyl-microperoxidase，簡稱為 Ac-MP)，即可減少微過氧 化酶的凝聚現象，所以乙醯化微過氧化酶應是較微過氧化酶更佳的過氧 化酶模型(model) (Wang, et al., 1989; Carraway, et al., 1996) ，因此我們皆 以乙醯化微過氧化酶來做為研究的模型，在我們的研究中發現，微過氧 化酶除了已知的過氧化酶 (Baldwin, et al., 1987; Adams, et al., 1990) 與 單氧化酶 (monooxygenase) (Baldwin, et al., 1986) 二種酵素型態的活性 以外還具有過氧化氫酶型態的活性 ， 而這三種酵素的簡單介紹如下 (如表 1)： 過氧化酶的第五配位基是組氨酸(histidine)，其作用是以過氧化氫為 氧化劑來氧化一些受質，而過氧化氫本身即可被還原成水而被代謝掉， 其反應式如下: SH2 + H2O2 peroxidase S + 2 H 2O，也就是在過氧化酶的催 化下，過氧化氫本身還原成水，而另一些受質則被去氫化(dehydrogenation) 7 而氧化，此為細胞內代謝過氧化氫(H2O2)的重要酵素。 過氧化氫酶的第五配位基是酪氨酸(tyrosine)，其作用是以過氧化氫 (H2O2)為受質，將過氧化氫分解成水並釋放出氧氣，其反應式如下: 2H2O2 catalase 2 H2O + O2，過氧化氫酶與過氧化酶一樣都是細胞內代謝過氧化氫 (H2O2)的重要酵素。 單氧化酶主要的典型代表是細胞色素 P450 ， 細胞色素 P450 的第五配 位基是半胱氨酸(cysteine)，其主要的功能是將生物體內將一些對細胞有 毒害作用的物質進行氫氧化(hydroxylation)，以增加這些有毒物質的水溶 性使之容易排出體外，其反應式如下： 2H+ + SH + 2e- + O2 monooxygenase SOH + H2O 因為這三種型態酵素的自然酶(native enzyme)的第五配位基 分別為組氨酸(His)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)。因此，我們利用置換 微過氧化酶的第五配位基與模擬遠端配位基來探討配位基在血基質蛋白 質的酵素功能上所扮演的角色。所以，我們將利用基因選殖(cloning)的方 法從酵母菌 Saccaromyces cerevisiae 中選殖出其 iso-1-cytochrome c 基因， 並將其基因送至大腸桿菌(E. coli)中表現出組氨酸態的細胞色素 C，其 次；將利用重疊延伸方法(overlap extension method)產生定點突變株，用 以製備 L20D/Q21D 的細胞色素 C，最後；再利用蛋白水解酶的水解，製 備出 MP-11 (CDDC)，來探討第五配位基附近帶有正電荷的胺基酸在血基 質蛋白中對催化功能的影響。亦利用重疊延伸方法產生定點突變株來模 擬 Cytochrome c peroxidase 的遠端配位基胺基酸對於過氧化酶功能的影 響 ， 因 此 製 備WH20 (L20R/Q21R/T24W/V25H) 與WH16 (T17R/R18V/L20W/Q21H)的細胞色素 C，最後，再利用蛋白水解酶的水 解，製備出 MP-11 (CRRCHWH)及 MP-11 (RVCWHCH)，來探討遠端配 位基的胺基酸在血基質蛋白中對催化功能有何影響。此外，亦利用重疊 8 延伸方法產生含有RGD Loop的酵母菌細胞色素C的定點突變株 ， 此Loop 位於兩個與 Heme 連結的 Cys(分別是 Cys19 與 Cys22)區域中，再利用蛋 白水解酶的水解，製備出含有對不同的組合蛋白(Integrin)具有特異性之 RGD Loop 的微過氧化酶，以探討不同序列對於不同的不同的組合蛋白 (Integrin)的辨認是否有差異，此外 Microperoxidases 因含有 Heme 而具有 的 Peroxidase 活性，我們也期望在日後可以應用在特定的組織染色之中。 9 1-2 研究目標研究目標 我們構築可以表現出具有功能性細胞色素C的質體在大腸桿菌中表 現並純化之，我們構築的人類細胞色素 C 及其相關的突變蛋白將用來探 討人類細胞色素C是藉由哪些胺基酸跟其它蛋白質如Apaf-1進行交互作 用而引發 caspases 的活化造成細胞的凋亡。 我們的研究目標大致分為以下幾個主要方向： A. 利用重疊延伸方法產生定點突變株，探討使用大腸桿菌表現出來的 人類細胞色素 c 及其相關的突變蛋白 K72A-K73A 與 K86A-K88A 及 K72A-K73A/K86A-K88A 雙重突變。 B. 探討人類細胞色素可能藉由哪些胺基酸跟其它蛋白質如 Apaf-1 進 行交互作用進而引發 Caspases 的活化。 C. 探討 Peroxynitrite (ONOO-)對於人類細胞色素 C 中的酪胺酸 67 (Tyrosine)是否進行修飾作用並研究其造成細胞凋亡的能力的影響。 D. 利用重疊延伸方法產生定點突變株，製備 L20D/Q21D 的細胞色素 C，最後；再利用蛋白水解酶的水解，製備出