淋巴细胞活化的分子机制课件.ppt

第十二章淋巴细胞活化的分子机制以及应答过程,淋巴细胞活化是指淋巴细胞在抗原或致分裂原刺激下所发生的一系列细胞生物化学变化过程，包括细胞活化信号的传递、多种相关酶的活化。细胞最终分裂成子代淋巴细胞并分化成熟为各种亚群的淋巴细胞，发挥各自的免疫功能。,第一节细胞信号传递系统的分子基础,细胞的信号传递系统可以概括为受体-信号放大器-效应器三大组成部分。受体负责识别和接收外界信号或刺激，继而激活胞内信号放大系统，再由胞内信息分子将转导后的信号传递至靶分子，引起包括酶活性、基因表达、膜通透性改变等一系列生理或病理效应。在上述复杂的信号传递系统中，蛋白质（即信号分子）的可逆性磷酸化作用就如同“分子开关”一样，调节信号传递途径的畅通无阻。,信使分子按其功能大致可分为三类：,第一信使：指细胞外的信息分子，如激素、CKs等。第二信使：胞内的信息分子称为第二信使，包括cAMP、cGMP、Ca2+、DAG、NO、神经酰胺等。第三信使：指一类专在胞浆和细胞核之间进行信息传递的信使分子。它们多半是DNA结合蛋白或转录调控因子，参与基因的表达调控。这类核蛋白又称之为“核内第三信使”。,第二节细胞信号传递过程中所涉及的酶和接头蛋白,一、蛋白酪氨酸激酶,蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,PTK)是一类催化ATP上-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。迄今发现的蛋白酪氨激酶中多数是属于致癌RNA病毒的癌基因产物，也可由脊椎动物的原癌基因产生。根据PTK是否存在于细胞膜受体可将其分成非受体型和受体型。,（一）非受体型PTK,Src家族：包括p60src、p56lck、p59fyn、p59yes、(p62yes)、p56lyn、p59hck、p55fgr和p55blk等。Syk家族：包括Syk和ZAP-70Tec家族：包括Btk、Tec、Itk、DSrc29、Etk和Rlk。这些PTKs缺乏胞外及跨膜序列，因此通过其N末端与细胞膜表面蛋白的胞浆内结构域相连接，从而发挥信号转导作用。,1Lckp56lck是分子量为56kDa的单链分子，由509个氨基酸残基组成。Lck分子结构可以分为四个功能区:膜接触区，位于N-端，N-端第2位Gly能结合豆蔻酸，通过豆蔻酸(myristicacid)与细胞膜内侧面相连；底物作用区，包括SH2和SH3结构域；激酶活性区，即SH1结构域，这一区域在氨基酸组成上与其它src家族成员高度同源。其中273位的赖氨酸（Lys）是ATP结合点，394位的酪氨酸（Tyr）为自身磷酸化位点；调节区，位于羧基端，与Lck激酶活性的调节有关。Tyr505是调节性磷酸化位点。,调节区在静止细胞中，Lck在Tyr505上发生磷酸化，但当细胞活化时这个残基则发生去磷酸化，随之发生激酶的活化以及Tyr394的自身磷酸化。目前研究认为，CD45通过使Tyr505去磷酸化对Lck起正调控作用；而p50csk是使Tyr505发生磷酸化对Lck则起负调控作用。CD45和p50csk对其它src家族PTKs也发挥着同样的调节作用。,信号分子的特殊结构域SH结构域：,src同源区2(srchomology2,SH-2)是一个保守的蛋白序列，约有100个氨基酸残基组成，能够识别蛋白中磷酸化的酪氨酸残基。src同源区3(SH-3)，为一个保守的氨基酸序列，约含50个氨基酸，可见于多种胞浆信号蛋白以及肌动蛋白结合蛋白中。目前研究发现SH-3识别的部位是一些富含脯氨酸的区域。,2Fynp59fyn见于多种细胞中。Fyn基本结构类似于Lck。它通过氨基末端豆蔻酸的基团共价结合于胞浆膜内面，Fyn有一个自身磷酸化位点Tyr417，羧基末端有一个负调控功能域，包括含有一个酪氨酸磷酸化位点Tyr528。Fyn与TCR/CD3链结合，Fyn的活化可引起CD3链的磷酸化。,3LynLyn也是一种主要分布于造血细胞的非受体型PTK。在B细胞中，Lyn参与BCR，CD19和CD40等的信号转导。,4Syk家族Syk家族有Syk和ZAP70两个成员，二者结构相似，在N端有两个SH2结构域，C端有一个SH1激酶结构域。两个SH2结构域可与多种刺激性免疫受体胞浆区的活化ITAM基序结合，介导多种受体引起的细胞活化信号。Syk家族分子的激活一般晚于Src家族。（1）SykSyk（spleentyrosinekinase）表达于大部分造血细胞，B细胞表达水平最高。（2）ZAP-70最早发现与TCR复合体中的CD3链相关，所以称为相关蛋白（associatedprotein,ZAP-70）。ZAP-70分子量为70kDa，主要表达在T细胞和NK细胞。,（二）受体型PTK,受体型PTK属于I型跨膜分子，胞膜外区一般结构复杂且高度糖基化，可以结合相应的配体。激酶结构位于胞浆区，激酶结构中有一个ATP结合基序。另外，一般在胞浆区含有一定数量的自身磷酸化位点。根据它们的结构不同，受体型酪氨酸激酶可以分为9种类型,其中较常见的有4种。受体型酪氨酸蛋白激酶活化后可激活胞浆中多种分子，如STAT、PLC、PI-3K、GAP、Raf等。,二、蛋白酪氨酸磷酸酯酶,T细胞活化中所发生的多种蛋白分子酪氨酸磷酸化提示必需有蛋白酪氨酸磷酸酯酶(proteintyrosinephosphatase,PTP/PTPase)来拮抗这种作用，通过负反馈来维持机体生理功能的平衡。,（一）受体型PTPCD45,1CD45的基本结构与分布CD45是位于白细胞表面的白细胞共同抗原(leukocytecommonantigen,LCA)。CD45可以高水平表达在淋巴细胞以及除了红细胞和血小板之外的其它所有的造血细胞上。CD45为单链跨膜蛋白。2CD45的异构型CD45分子一个明显的特点是存在结构和分子量不同的异型(isoform)。CD45异型产生的分子基础是由于CD45mRNA水平的不同拼接所致，另外由于翻译后糖基化修饰不同，更增加了CD45分子的多样性。最著名的CD45异构型是CD45R。,3CD45分子的配体CD22?4CD45分子的功能CD45直接参与TCR和BCR介导的活化信号，在淋巴细胞的活化过程中起重要作用。CD45的底物主要是Src家族成员，如Lck、Fyn、Lyn等。静止T细胞中Lck是无活性的，其分子的505位点氨基酸被磷酸化。Lck激酶活性的升高是与Tyr505去磷酸化相一致。CD45也可使有活性激酶中主要自身磷酸化Tyr394发生去磷酸化，从而引起激酶活性的抑制。,5Ca2+浓度与CD45活化的关系活化T细胞内酪氨酸磷酸化水平升高与细胞内钙离子浓度升高相关，推测高浓度钙离子可能对CD45具有负调控作用。抗原同TCR结合，随后CD4和CD45发生共凝集，从而导致CD45介导的p56lck去磷酸化而活化，细胞内钙离子水平的突然升高又可灭活CD45，从而使二级底物发生短暂的酪氨酸磷酸化以及活化信号的传递；随后细胞内钙离子水平又回到最初的水平，CD45也从无活性状态中恢复过来，使p56lck在Tyr394位点发生去磷酸化而灭活，以及其它能终止信号转导途径起始步骤中起关键作用的酶发生去磷酸化。,（二）非受体型PTP,1SH2-containingtyrosinephosphatase1（SHP-1）分布局限，仅表达于造血细胞（红细胞和血小板除外）。SHP-1是造血细胞信号转导中的一种重要的负调控因素。SHP-1的作用机制是：一方面通过SH2结构域与磷酸化的ITIM基序结合；另一方面通过PTP酶活性使底物去磷酸化而被灭活。2.SHP-2与SHP-1不同，SHP-2表达十分广泛，在不同的条件下，SHP-2可发挥正的或负的调节作用,三、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶,蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶是机体中分布十分广泛的蛋白激酶，种类繁多，调节机制也十分复杂。此处仅介绍PKC和MAPK。,（一）蛋白激酶C（PKC）,PKC(proteinkinaseC)是一类Ca2+、磷脂依赖性的蛋白激酶，在跨膜信号传递过程中起着重要作用。PKC通过催化多种蛋白质上Ser/Thr磷酸化，调节多种细胞的代谢、生长、增殖和分化。,1PKC的结构和分类PKC的所有亚类都由一条单肽链组成，分子量大约为6783kDa，其结构可分为四个保守区C1C4(nPKC和aPKC缺少C2区)和五个可变区V1V5。其中C1区可能是膜结合区。此区中的序列与佛波酯和二酰甘油(DAG)的结合有关。C2区与PKC对Ca2+的敏感性有关。C1和C2在结构上不同于其它蛋白激酶，能结合Ca2+、磷脂、DAG和TPA，因此C1和C2区又称为调节区。C3区包括一个ATP结合序列，该区域与其它蛋白激酶的ATP结合位点具有很高的同源性，又称催化区。C4区包含一个底物结合区，是识别磷酸化底物所必需的。,2PKC的转位与激活PKC广泛分布于多种组织、器官和细胞，静止细胞中PKC主要存在于胞浆中，当细胞受到刺激后，PKC以Ca2+依赖的形式从胞浆中移位到细胞膜上，此过程称之为转位(translocation)。一般将PKC的转位作为PKC激活的标志。静止细胞中PKC一般以非活化形式存在。PKC的活性依赖于钙离子和磷脂的存在，但只有在DAG存在下，生理浓度的钙离子才起作用，这是由于DAG能增加PKC对底物亲和力的缘故。PIP2在PLC作用下水解生成DAG和IP3。IP3促进细胞内钙离子的释放，在激活PKC过程中与DAG起协同作用。,乙酸豆寇佛波酯(TPA;或PMA)是一种促肿瘤剂，由于其结构与DAG相似，可在很低浓度下模拟DAG，活化PKC。由于TPA与PKC的结合牢固，使PKC处于持续的激活状态，易导致代谢紊乱。3PKC的抑制剂多种化学物质或抗生素对PKC活性具有抑制作用，根据抑制剂作用PKC靶部位的不同可以将抑制剂分为二组:一组是作用于催化区的抑制剂，它们可与蛋白激酶的保守残基结合，因此对PKC无明显的选择性；另一组是作用于调节区的抑制剂，它们可与Ca2+、磷脂和二酰基甘油/佛波酯相结合，因而有较高的选择性。,（二）MAP激酶,丝裂原活化的蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinase,MAPK）是一组可以被多种细胞外信号激活的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶。MAPK主要参与生长因子、激素、细胞因子、应激等各种刺激下的细胞反应，以及细胞的生长、分化等。MAPK属于一种Ser/Thr蛋白激酶，可在多种不同的信号转导途径中充当一种共同的信号转导成份，且在细胞周期调控中发挥重要的作用。在T细胞中有三种主要的MAP激酶，ERK、JNK和p38。,1ERK（extracellularreceptor-activatedkinase）当细胞膜受体与配体结合后，通过受体型PTK的作用，使Sos（一种GEF）转位到膜内侧，催化Ras-GTP途径激活，后者作用于Raf，引起丝氨酸/苏氨酸激酶活性激活。Raf引起MEK1和MEK2的丝氨酸磷酸化并使之激活。MEK1和MEK2是双特异性蛋白激酶，可以使ERK1和ERK2的202204位的TET序列中的酪氨酸和丝氨酸残基发生磷酸化并激活。最终活化的ERK使ELK磷酸化，ELK使c-fos基因转录，Fos蛋白是AP-1的组成成分之一。,2JNK（c-junN-terminalkinase）JNK是由与Ras平行的Rac-GTP途径激活的。Grb2连接Vav，Vav使Rac-GDP释放GDP，然后Rac连接GTP成为Rac-GTP，通过MAP激酶的级联反应最终活化JNK，JNK使Jun蛋白磷酸化，Jun是AP-1的另外一个组成成分。3p38激活p38的因素与JNK相似。活化的p38转位到细胞核内，作用于核内的转录因子，引起基因的转录。,四、G蛋白和小G蛋白,（一）G蛋白,G蛋白既参与由TCR/CD3、PLC介导的信号传导，又在B细胞BCR介导的信号传导中发挥作用。G蛋白属于作用于受体和效应器之间的偶联蛋白。由于它们能结合并水解GTP，故称之为G蛋白，又称鸟苷酸调节蛋白（guaninenucleotideregulatoryprotein）。G蛋白偶联的信号转导是由G蛋白、G蛋白偶联体和效应系统共同组成的信号传导单位。,1受体G蛋白受体分子量为4045kD，由一条单链形成的7个螺旋的跨膜结构，反复7次穿越细胞膜，其中C末端和第5、6跨膜区螺旋为G蛋白结合部位。几乎所有与G蛋白偶联的受体都有相似的氨基酸顺序。,2G蛋白的分子结构与分类G蛋白属于一个庞大的三聚体同源蛋白家族，种类已多达40余种，大多数存在于细胞膜上，由、三个不同的亚单位构成，总分子量为100kDa左右。其中亚单位在多数G蛋白中都非常类似，分子量36kDa左右。亚单位分子量在811kDa之间，除Gt外，大多数G蛋白的亚单位都是相同的。两个亚单位结合紧密，只有当蛋白变性时才使之分开。各种G蛋白的差别主要在亚单位，根据亚单位的不同可以将G蛋白分为Gs、Gi、Go、Gq、G?及Gt等六类。这些不同类型的G蛋白在信号传递过程各自发挥不同的作用。,除此之外，在细胞内还存在另一类G蛋白，这类G蛋白具有鸟核苷酸的结合位点，有GTP酶活性，其功能也受鸟核苷酸调节，但与跨膜信息传递似乎无直接相关。在结构上不同于前述的G蛋白，分子量较小，在2030kDa之间，不是以、三聚体方式存在，而是单体分子，因此被称为小G蛋白(smallGproteins)。如ras表达产物为一种小G蛋白。,3G蛋白循环受体(R)在与配体(L)结合之前是与G蛋白分离的，G蛋白的3个亚基呈聚合态，并与GDP结合成G-GDP形式，此时的受体呈低亲和力，以RL表示。受体与配体结合被激活后，形成L-RH-G复合物，其中RH表示受体己从低亲和力转为高亲和力状态，同时GDP从亚基上释放出来。在Mg2+存在时，GTP将取代GDP与G亚基结合，并进一步使整个复合体解聚为三部分：RL(又恢复为低亲和力受体)、G复合体和激活后的Gs-GTP。后者可进一步激活效应器，即腺苷酸环化酶。Gs亚基本身具有GTP水解酶活性，将所结合的GTP水解为Gs-GDP后，再与G亚基结合，重新形成Gs原先的三聚体形式。,4G蛋白偶联的信号系统（1）与腺苷酸环化酶相关的信号传递系统Gs和Gi蛋白通过不同的机制激活或抑制细胞上的腺苷酸环化酶(AC)体系。腺苷酸环化酶可使ATP水解并环化生成cAMP。细胞内cAMP水平的改变及激活依赖于cAMP的蛋白激酶(PKA)。（2）与cAMP磷酸二脂酶相关的信号传递系统该系统是与视觉信号传递有关的效应系统。（3）与磷脂酶C相关的信号传递系统磷脂酶C(PLC)是存在于细胞膜浆膜面上的一种关键酶类，有9种异构体，可分为、和四组。在T细胞活化过程中，参与信号传递的主要为PLC-亚型。,（二）小G蛋白,小G蛋白是一组分子量约2025kDa的单体鸟苷酸结合蛋白。虽然没有G蛋白的三聚体形式，但具备了G蛋白的功能特点。有着广泛的调节功能。,1Ras途径参与信号传递过程的Ras蛋白是c-ras基因的产物，属于一类低分子量(2lkDa)的G蛋白，具有GTP结合活性和水解活性(即GTPase活性)，又称为p21ras蛋白。Ras蛋白具有两种可以互变的构象(Ras-GDP、Ras-GTP),只有呈Ras-GTP构象时才能激活Ras蛋白下游的信号传递过程，故Ras蛋白在信号传递途径中起“开关”样作用。Ras蛋白本身不含有疏水区，但是可通过翻译后的化学修饰过程，使其C-末端的半胱氨酸残基被脂肪酰基修饰，藉此与细胞膜结合。因此，Ras蛋白与细胞膜的结合过程为其功能所必需。,Ras蛋白的激活有赖Sos蛋白。Sos蛋白(thesonofsevenless蛋白)，是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanineexchangefactor,GEF）。Sos蛋白原来在胞浆中是以无活性的分算状态存在的。当受体与配体结合.Grb2中的SH-2区域则与受体PTK所催化的自身磷酸化的某些位点结合，Grb2含有SH3结构域可以和富含脯氨酸的Sos蛋白结合并聚集。形成受体-Grb2-Sos复合物，从而使细胞浆中分散的Grb2-Sos富集于膜内侧。聚集起来的Sos具有GEF活性，可使Ras-GDP释放出GDP，然后Ras蛋白迅速与GTP结合，变为Ras-GTP活化形式。此外，还有一种GTP水解酶的激活蛋白(GAP)，可与Ras-GTP结合，并激活其GTPase活性。,在信号传递系统中，Ras蛋白的“下游”通路与蛋白质丝氨酸和苏氨酸的磷酸化反应有关。现已证明，从酵母至哺乳类细胞中，均存在着非常相似的蛋白质磷酸化级联反应系统，涉及Raf-1、MAPK激酶系统。Raf-1是PKC的天然底物，又是一个潜在的SerThr蛋白激酶，其分子中有3个以上的磷酸化位点。Raf-1可由两条途径被激活，即活化的Ras蛋白介导的途径和PKC介导的途径，二者可以交汇。Raf作用于ERK激酶途径，最终使c-fos基因启动，产生Fos蛋白，而Fos蛋白是组成转录因子AP-1的主要组成成分。,2Rac途径Vav蛋白参与的Rac作用途径。Vav蛋白是c-vav基因的产物，分子中含1个SH-2结构和2个SH-3结构，还有1个亮氨酸拉链区、1个核定位信号序列。TCR发生交联后的T细胞以及经EGF-R、PDGF-R、IgE-R以及IgM-R刺激途径的其它细胞类型如成纤维细胞、嗜碱性粒细胞、B淋巴细胞均有Vav蛋白的募集，并具有了GEF活性，Vav蛋白使Rac-GDP释放GDP而变成游离的Rac，然后Rac结合GTP而成为有活性的RacGTP。Rac-GTP使JNK磷酸化而活化，后者使Jun蛋白磷酸化。而磷酸化的Jun和新合成的Fos蛋白组成转录因子AP-1。,五、参与磷脂代谢的酶,（一）磷脂酶C,磷脂酶C（phospholipaseC,PLC）是存在于胞浆膜上一个关键酶，有9种异构体，分为、和四组。PLC作用于PIP2产生三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)，IP3和DAG是淋巴细胞活化的重要信号。除PLC组外，其余PLC组均不具有跨膜序列，所以PLC在水解PIP2时必须与细胞膜结合。在淋巴细胞活化过程中，参与信号转导的主要为PLC。PLC为单链分子，分子量约140kDa。PLC分子结构中包括2个SH2结构域和一个SH3结构域。,当受体受到活化刺激后，引起胞浆中与之相邻的Src家族的PTK活化，并进而引起Syk/ZAP-70家族活化。这些活化的蛋白激酶，以及本身具有PTK活性的膜受体等活化后，可以直接通过磷酸化作用活化PLC，也可通过PI-3K诱导PIP3的产生而激活PLC。PIP3一方面直接诱导PLC活化，另一方面还可以诱导胞浆中Tec家族PTK活性，通过Tec家族PTK的磷酸化作用促进PLC的活化。,活化的PLC水解磷脂酰4，5-二磷酸肌醇（PIP2），形成1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和1,2-酰基甘油(diacylglycerol,DAG）第二信使。IP3的作用是与内质网上的受体结合，使Ca2+从胞内贮备中释放出来，并打开细胞膜上离子通道让胞外Ca2+进入细胞内，最终导致细胞内Ca2+浓度升高。DAG则可特异地激活蛋白激酶C（PKC），提高PKC对底物的亲和力，从而启动下游蛋白磷酸化级联反应，引起细胞活化、基因转录。,（二）PI-3激酶,PI-3Kinase（PI-3K）由p110和p85两个亚单位组成。p85亚单位含有SH2和SH3结构域，能与上游分子磷酸化的酪氨酸残基相连。P110亚单位是酶活性区，不但具有脂激酶活性，而且还具有蛋白激酶活性。活化的PI-3K能使PI变成PIP2，有利于磷脂酰肌醇信号传递途径。PI-3K还能活化PKC。,六、接头蛋白,接头蛋白（adapterprotein）具有可携带许多信号分子进入到特定细胞器的功能，以此来促进信号转导。接头蛋白含有可与其它蛋白分子结合的区域，起承上启下的作用。接头蛋白有跨膜和胞浆两种形式，在淋巴细胞识别抗原后发挥迅速募集信号分子和促进级联反应建立的作用。,（一）LAT,LAT（linkerforactivationofTcells）主要表达于T细胞等。LAT是一种I型膜蛋白，包括较短的N端胞膜外区，跨膜区和较长的胞浆区。LAT含有多个酪氨酸磷酸化位点。LAT在ZAP-70的作用下发生酪氨酸磷酸化并进而结合Grb2,PLC,PI-3K等多种下游分子。LAT跨膜区附近的二个半胱氨酸是棕榈酰化的位点，使LAT成为脂筏结构中的一个重要分子。,（二）SLP-76,SLP-76（SH2domain-containingleukocytePhosphoproteinof76kDa）是一个533个氨基酸的造血细胞特异性接头蛋白，N端有三个酪氨酸磷酸化位点，可以结合Vav蛋白；分子中部有一段富含脯氨酸的序列，可结合Grb2的SH3结构域；C端有一个SH2结构域，可结合多种蛋白质的磷酸化酪氨酸序列。SLP-76在T细胞抗原受体信号转导中起着中枢性的调控作用。,（三）Grb2,Grb2(growthfactorreceptorbindingprotein2)是最典型的接头蛋白，N端和C端分别有一个SH3结构域，中间夹着一个SH2结构域。Grb2分布广泛，在生长因子受体和淋巴细胞抗原受体的信号转导中起重要作用。,（四）Cbl-b,1995年,KeaneMM等克隆了一种新的基因cbl-b,它与原癌基因c-cbl(cell-casitasBlineagelymphoma,c-cbl)有惊人的核苷酸和氨基酸同源性。其编码的蛋白称为Cbl-b(CasitasB-celllineagelymphoma-b,cbl-b),分子量约108kDa。Cbl-b蛋白的结构类似c-Cbl蛋白,同样含有一个富脯氨酸结构域、一个核定位信号、一个C3HC4锌指和一个假定的亮氨酸拉链。Cbl-b蛋白与信号转导蛋白相互作用,调节它们的作用或受它们的调节。抗原刺激后，T细胞和B细胞中的Cbl-b发生酪氨酸磷酸化，结合PI-3Kp85亚单位和Vav蛋白。Cbl-b是多个PTK信号转导途径中进化保守的负调节分子。,第三节T细胞的活化与应答过程,T淋巴细胞介导的免疫应答也称细胞免疫应答，可分为三个阶段：T细胞特异性识别抗原阶段；T细胞活化、增殖和分化阶段；效应性T细胞的产生及效应阶段。,一、T细胞对抗原的识别,T细胞通过TCR识别并结合APC表面MHC分子递呈的抗原多肽。CD4+T细胞的TCR是与MHCII类分子所递呈的抗原肽结合，而CD8+T细胞的TCR则与MHCI类分子所递呈的抗原肽结合。T细胞识别抗原，依赖于抗原肽-MHC-TCR三元件，因而抗原肽激活T细胞表现出抗原特异性及MHC限制性。超抗原只是选择性地结合到TCRV区和MHCII类分子的外侧，不受MHC的限制。,二、T细胞与APC的特异性结合,若TCR能识别相应的抗原肽-MHC分子复合物，则T细胞与APC发生特异性结合，并由CD3分子向胞内传递特异性识别信号，导致抗原特异性T细胞的激活和增殖。T细胞的CD4和CD8分子是TCR识别抗原的辅助受体，可分别与MHC类分子和MHC类分子结合，增强TCR与抗原肽-MHC分子结合的亲和力。APC和T细胞表面还表达参与细胞间相互作用的多种免疫分子对，其中一些又称为共刺激分子。协同刺激信号（co-stimulatorysignal）。,T细胞与APC之间的物理接触是抗原识别的基础。TCR与MHC-抗原肽复合物之间的亲和力较低，不足以单独介导T细胞与APC之间的稳定粘附。由TCR复合物介导的信号转导需要较长时间或反复的TCR与MHC-抗原肽之间的接合（engagement）。因此，T细胞与APC表面黏附分子之间的相互作用使上述接合成为可能。T细胞表面表达多种黏附分子，与APC表面的黏附分子以受体-配体相互作用使二者得以紧密接触，在细胞与细胞接触的部位形成了一个瞬时性的特殊结构，称为免疫突触（immunologicalsynapse）。,免疫突触是指T细胞在和APC识别结合过程中，多种跨膜分子聚集在富含神经鞘磷脂和胆固醇的“脂筏”（raft）状结构上，并相互靠拢成簇，形成细胞间相互结合的部位，在免疫突触形成的后期，其中心区为TCR和抗原肽-MHC分子复合物，以及T细胞膜辅助分子和其相应配体，周围环行分布着大量的其他细胞黏附分子。免疫突触的形成是TCR、黏附分子与细胞骨架共同作用的结果。此结构有助于增强TCR与抗原肽-MHC复合物相互作用的亲和力和促进T细胞信号转导分子的相互作用、信号通路的激活及细胞内亚微结构极化，涉及到细胞骨架系统和细胞器的结构及功能变化，从而参与T细胞的激活和细胞效应的有效发挥。,三、T细胞活化信号转导过程,当T细胞受到抗原信号刺激后，活化信号由胞外传导至胞内，需经历一个由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白质磷酸化与脱磷酸化反应的环节。这是一个可以互相转换的过程。磷酸化的底物主要是丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸。催化这一反应的酶称为蛋白激酶，如PKC和PTK等。此外，还有参与脱磷酸化的PTP等。信号转导(signaltransduction)。,(一)脂筏与免疫受体的信号转导,细胞膜是由磷脂双分子层组成的液态结构，蛋白质分子镶嵌其中，作为膜受体或膜相关分子，沟通细胞内外的信息。但在细胞膜中，脂类分子的分布并不是均一的，在某些局部集中分布着鞘脂和胆固醇等脂类。由于鞘脂具有较长的紧密折叠的烃链因而具有较高的熔点，在胆固醇的结合下，形成液态磷脂平面中的固态结构，犹如漂浮在大海中的小舟，因此被称为脂筏（lipidraft）。,脂筏的直径一般为70nm左右。脂筏中的成分不仅有脂类分子，更重要的是与脂筏相关的蛋白分子。蛋白分子通过两种方式与脂筏结合：一般是通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚在鞘脂分子上；另一种是通过蛋白质的烷基化修饰，与鞘脂的烃链结合。Lck可在Gly2发生豆蔻酸化，在Cys3和Cys5发生棕榈酸化，因而Lck与脂筏组成性结合。,在静止T细胞膜表面，有多种与TCR信号转导有关的分子组成性地存在于脂筏中。除Lck外，接头蛋白LAT通过棕榈酸化结合在脂筏中，TCR辅助受体CD4、CD8以及协同分子CD28和CD2等也都组成性分布在脂筏中。Csk结合蛋白是一个烃基化蛋白，定位于脂筏中，并结合Csk，使后者对相邻的Lck发挥磷酸化的抑制作用，维持Lck的非活化状态。CD45分子处于脂筏之外，但由于脂筏较小，每个脂筏上只能随机分布几个蛋白分子，所以CD45仍有机会作用于Lck活性中心的酪氨酸，调节Lck的活性。,当抗原与TCR结合，TCR及其相关的信号分子在与APC细胞相结合的部位形成特殊的免疫突触。免疫突触的中央主要是小脂筏融合而成的大的脂筏斑，其中包含有与脂筏组成性结合的CD4/CD8、CD28、Lck、LAT等，也有被活化信号募集而来的ZAP-70、SLP-76、Vav等。当活化的TCR/CD3在受到活化刺激后，ITAM发生磷酸化，与脂筏的亲和力提高，所以交联的TCR/CD3也处于免疫突触的中央。CD2位于脂筏斑的外围。较大的黏附分子LFA-1与APC上的ICAM-1结合，围绕在外周，稳定突触的结构但不结合脂筏。CD45则在免疫突触之外。在免疫突触形成的过程中，脂筏可能起到了运输和聚集信号分子的作用。,（二）PTK的活化,T细胞活化信号转导的早期，因受体交联而活化的胞内酶类有蛋白酪氨酸激酶(PTK)。参与T细胞活化早期的PTK主要有Lck和Fyn及ZAP-70等。Lck主要与CD4或CD8的胞浆尾部相连。Fyn与CD3的链相连，ZAP-70在胞质中，当受体交联时，与TCR有关的膜蛋白如CD3、CD4或CD8的胞浆尾部同时聚在一起，促使带有酪氨酸的蛋白发生磷酸化而活化，产生激酶活化的级联反应，将活化信号传递给其他分子。,在T细胞应答的初始阶段，TCR特异性识别APC表面的抗原肽-MHC分子复合物。同时T细胞的CD4或CD8分子分别与APC表面MHC类或类分子的单态区结合，在APC和抗原特异性T细胞之间形成稳定的分子间聚合体，它包括MHC分子、抗原肽、TCR、CD4或CD8以及CD45。因此，与CD4或CD8相连的lck得以在空间上靠近TCR的胞浆内区域。CD45是具有PTP活性的分子，可使Lck和Fyn分子的调控区去磷酸化，而激活Lck和Fyn。靠近CD3的Fyn活化了CD3各链的ITAMs后，并由于CD4或CD8与MHC分子结合，Lck的作用使ITAMs的磷酸化更完全。酪氨酸磷酸化后，胞内带有SH-2功能区的ZAP-70分子则与之结合。,CD3亚基含有3个ITAM，共有6个保守的酪氨酸残基，均能被磷酸化。ZAP-70蛋白原先游离在胞浆中，当其与结合后，便征集到TCR复合物的膜周围，同时其本身的PTK激酶活性又被膜周围定位的lck激活，成为一个偶联中介物，继而作用于其下游的效应分子。经历上述启动过程，Src家族中的PTK成员及ZAP-70PTK均被聚拢到膜周围，与活化的TCR及其共受体定位在一起。,（三）TCR介导的信号传递的下游过程,1PLC-活化活化的ZAP-70使接头蛋白(LAT，SLP-76)磷酸化，它们可将胞浆中的PLC-募集到细胞膜内面。此处的活化型ZAP-70和其它激酶（如Tec家族的Itk）可使PLC-分子中的酪氨酸残基发生磷酸化而活化。活化的PLC-可裂解细胞膜上的磷酯酰肌醇二磷酸(phosphatidylinosito1bisphosphate，PIP2)，产生两个重要的信息分子：三磷酸肌醇(inositol1,4,5-triphosphate,IP3)和甘油二酯(diacylglycerol,DAG)。,IP3经胞浆扩散至内质网，与其受体结合并刺激内质网膜Ca2+通道开放，释放胞内钙储备，使细胞浆内游离Ca2+浓度快速升高。同时，TCR介导的信号也可开放细胞膜Ca2+通道，使Ca2+流入胞内。上述反应结果使细胞浆内膜Ca2+浓度比静息状态高68倍。高水平的游离胞浆Ca2+与胞浆内的钙调素（calmodulin）结合形成钙-calmodulin复合物。该复合物活化胞浆内的钙调磷酸酶(calcineurin)，活化的钙调磷酸酶使转录因子NF-AT去磷酸根而活化，并从胞浆转位到核内。DAG是疏水性的，形成后留存在细胞膜内侧面。游离钙和DAG的组合作用使与细胞膜相连的PKC活化。由PKC活化转录因子NF-B。,2019/12/15,81,可编辑,2MAP激酶活化ZAP-70活化后可经Ras和Rac活化MAPK级联反应。活化型ZAP-70可使接头蛋白LAT磷酸化，并与Grb2的SH2结构域结合。Grb2与LAT结合后，因其分子结构中含有SH3结构域，所以可募集富含脯氨酸的Sos蛋白，Sos具有GEF作用，可使Ras分子上的GDP释放，然后Ras结合GTP，Ras水解GTP而活化下游的MAP。MAP激酶途径：Ras-GTP活化Raf-1，Raf-1使MEK-1磷酸化，MEK-1又使ERK1,2磷酸化，活化的ERK使Elk磷酸化，磷酸化的Elk刺激c-fos转录。Fos蛋白为转录因子AP-1的一个成分。,与Ras相平行发生的是，由TCR-相关激酶磷酸化的接头蛋白也募集和活化一个称为Vav的GEF。Vav蛋白对另一个小G蛋白Rac产生作用。活化的Rac（Rac-GTP）可诱导细胞骨架的变化，参与TCR簇化和免疫突触的形成。活化型Rac导致JNK（c-junN-terminalkinase）的MAP激酶活化。由于在许多细胞中JNK可被紫外线/渗透性应激或炎性细胞因子（TNF-和IL-1）等有害刺激所激活，故又将其称为应激活化蛋白激酶（stress-activatedproteinkinase,SAPK）。活化型JNK可使jun蛋白磷酸化，后者是AP-1的另一个成分。Fos/Jun是AP-1。,（四）CD28协同信号活化途径,CD28与B7的相互作用为T细胞活化提供了第二活化信号。这种信号是T细胞活化所必需的。CD28分子的胞浆部分有数个潜在的磷酸化位点。当CD28被交联后，可由Lck和Fyn引发这些位点（如Y173和Y191）发生酪氨酸磷酸化。它们与PI-3K的p85亚单位结合后，使PI-3K激活，有助于Ras上的GTP/GDP交换，导致MAP激酶途径的活化。CD28能活化Vav相关的Rac途径。导致JNK活化，使Jun蛋白磷酸化而有活性。,CD28也可以阻断T细胞中的抑制信号。例如，当LAT被活化的时候，另一种接头蛋白叫做Cbl-b附着在复合体上，Cbl-b磷酸化抑制T细胞活化，部分是由于阻断了依赖PI-3K的TCR介导的信号传递。CD28信号通过活化Vav和Rac途径，可以阻断Cbl-b的抑制作用，从而增强TCR信号。,四、转录因子的活化和表达,所有信号传导最终将作用于不同的转录因子，并通过转录因子调控细胞基因及增殖分化。涉及T细胞活化的基因有近百种。根据其活化顺序可将这些基因划分为3种，即时基因（已报导9个）；早期基因（54个）；晚期基因（21个）。按这些基因的功能又分成3类：细胞原癌基因、细胞因子基因和细胞因子受体基因。,（一）转录因子活化,T细胞活化信号经磷酯酰肌醇代谢活化PKC和钙离子信号途径及Ras-MAP激酶途径，产生激酶磷酸化的级联反应。放大了开始时的活化信号，使T细胞内转录因子活化，结合到有关基因的调控区，增强了启动子的活性，促使转录开始。如IL-2基因的转录调节，是由转录因子结合到IL-2基因的调控区(增强子和启动子)。该处的几个转录因子结合点，包括AP-1、NF-B、NFAT，它们是经不同转导途径来的信号活化DNA结合蛋白(转录因子)。,1NF-AT未经活化的细胞，其NFAT是停留在胞浆中，而活化时，由于胞浆钙离子浓度增加，经钙离子活化信号作用，活化Calcineurin，钙调磷酸酶使NF-AT去磷酸化而激活，激活的NF-AT从胞浆进入细胞核，NFAT作为一种转录调节蛋白，与AP-l转录因子一起，作用到IL-2基因的增强子。这一点对于IL-2基因转录非常重要。,目前临床上常用的免疫抑制药，如环孢菌素(cyclosporinA，CsA)和FK506均是以阻止NF-AT转位到IL-2基因上，由于阻止IL-2基因转录而发挥免疫抑制作用。环孢菌素A(cyclosporinA,CsA)是由11个氨基酸组成的环状分子，FK506为大环内酯抗生素，分子量228。CsA和FK506免疫抑制作用十分相似，其机理主要是抑制T细胞活化过程中IL-2、IL-4、TNF-、IFN-等基因的转录，抑制细胞因子合成，降低IL-2R和转铁蛋白的表达，抑制B细胞针对胸腺依赖抗原的抗体形成。,CsA的作用机制：CsA进入细胞内，与胞内蛋白环孢亲和素（cyclophilin）结合，形成复合物。后者与胞内的钙调磷酸酶结合并抑制其酶活性。钙调磷酸酶的上游激活物为钙离子和钙调蛋白（calmodulin），下游靶蛋白为胞浆转录因子NF-AT，因而CsA抑制了钙调磷酸酶，使胞浆NF-AT不能向细胞核内移动，而发挥阻断IL-2转录的作用。FK506与靶细胞内FK506结合蛋白(FK506bindingprotein,FKBP)结合形成复合体，使Calcineurin磷酯酶活性受到抑制，阻止NF-AT的去磷酸化，从而阻止了NFATC向细胞核内转移，影响IL-2等基因的转录。,2核因子NF-BNF-B(nuclearfactorB，NF-B)是由TCR活化信号激活的另一种转录因子。在静止细胞中，NF-B与IB（inhibitorofB）结合，后者抑制NF-B活化。T细胞活化后，PKC/MAP激酶途径和钙均可使IB磷酸化,IB磷酸化后可使泛素分子与其结合，促使IB迁移至蛋白酶体，在蛋白降解中起作用。同时，NF-B与IB解离，并由胞浆转移至细胞核。,3.AP-1AP-1（activatingprotein-1）是存在于多种类型细胞中的转录因子，但在T细胞活化中特异性被活化。AP-1实际是一个DNA结合蛋白家族的名称。目前特征最明了的AP-1是由c-fos和c-Jun所组成。AP-1活化包括c-fos蛋白的合成和预先存在的c-Jun蛋白的磷酸化。ERK途径增强c-fos的转录和合成，PKC途径对此也起到了促进作用。JNK磷酸化c-Jun。含有磷酸化Jun的AP-1复合物的转录活性大为增强。,（二）T细胞基因表达,在T细胞活化过程中至少有4个原癌基因参与。细胞原癌基因是一种正常细胞基因，其产物可存在于细胞内不同部位，参与细胞的生长与分化，如c-fyn和c-lck基因编码酪氨酸激酶。c-fos和c-myc基因则属于即时基因，它们的产物参与启动细胞内DNA合成。Ras基因的产物p21ras是T细胞信号转导中的一个重要成分。Ras蛋白的上游信号大多是PTK介导的。活化的Ras再作用于下游分子Raf-1、MAPK，进而启动c-fos。Rac基因产物是另外一个小G蛋白p21rac。,在T细胞活化初期半小时内核转录因子(如fos/jun、NFAT)和原癌基因c-myc表达，数小时后，可见到多种细胞因子及其受体合成。再后，出现与细胞分裂有关的转铁蛋白受体分子及迟现抗原如粘附分子VLA-l的表达。由于细胞因子及其受体基因活化转录，再经自分泌或旁分泌作用使细胞进入生长的G1期，核DNA含量迅速增加，胞体增大，胞浆增多，随后经有丝分裂期(S期)，表现为细胞增殖，数量增多，即克隆扩增。在有不同细胞因子作用下，活化T细胞经分化成为有不同功能的效应细胞，部分细分化成记忆细胞。,T细胞活化后诱生细胞因子和表面分子表达而表现多种效应功能和调节功能。活化诱生的两个重要膜蛋白即CD40L和FasL。CD40L是活化的CD4+T细胞表面膜蛋白。CD40L与B细胞表面CD40结合，为B细胞活化提供第二信号，促使B活化、增殖，并进行Ig类别转换，促进体液免疫，经CD40L与CD40的结合，可使APC的B7-1和B7-2的表达增加，进一步活化T细胞，而放大T细胞对抗原的应答。成熟的CD8+T细胞和CD4+T细胞活化后表达FasL增加，FasL与表达Fas分子的细胞结合导致细胞凋亡，除杀伤靶细胞外，也在免疫耐受及免疫调节中起作用。,五、T细胞增殖与分化,在有病原生物或其他免疫原刺激时，能识别这些抗原肽-MHC分子复合物的特异T细胞数量非常少，但是由于T细胞活化后的快速克隆扩增，可使数量迅速增加。T细胞活化的细胞内信导转导触发了某些T细胞膜蛋白(如细胞因子受体)和细胞因子(如IL-2)的基因转录和蛋白合成。这一结果引发了活化后细胞行为的两大变化：细胞分裂和细胞分化。,T细胞分裂的群体表现形式为细胞增殖，IL-2与IL-2高亲和力受体的相互作用是始动和促进该过程的关键因素。初始T细胞大量增殖实质是抗原特异性T细胞克降扩增。使抗原特异性T细胞达到整体功能所需的数量水平。T细胞分化并行于增殖过程。抗原的性质和所分泌细胞因子的类型决定分化的结果。随着抗原的清除，大多数活化T细胞死于细胞凋亡，以维系自身稳定的基础静息状态。少数抗原特异性T细胞分化成为长寿命的记忆T细胞，在再次抗原刺激时发挥快速的免疫应答作用。,（一）细胞因子分泌是T细胞活化主要的表现形式,在T细胞活化中，抗原和协同刺激分子传递的信号触发一些细胞因子的基因转录和蛋白合成。初始T细胞产生的最重要的细胞因子是IL-2。IL-2发挥T细胞生长因子的作用。在不同性质的抗原刺激下，初始T细胞还可分泌不同种类的细胞因子，产生不同的效应，尤其可导致初始T细胞的功能分化和作用发挥。同时，活化T细胞还可增强许多细胞因子受体的表达水平。,（二）IL-2及受体基因表达是T细胞克隆性增殖的关键因素,IL-2受体表达是T细胞活化的关键环节。IL-2受体以和链二聚体或、和链三聚体形式表达，其二聚体中的链与IL-2呈低亲和力的结合。当T细胞活化后，T细胞表达IL-2受体的链(CD25)，与IL-2受体的、链结合，形成高亲和力受体，导致即便对于低水平的IL-2也有很高的反应性。在T细胞活化过程中，大多数CD4+T细胞和某些CD8+T细胞可有l2天的IL-2的表达。此间，IL-2与IL-2高亲和力受体的作用可导致T细胞的分裂、增殖。,（三）细胞增殖抗原特异性T细胞克隆扩增,初始T细胞增殖的结果是抗原特异性T细胞克隆扩增，即由少量抗原特异性初始T细胞分裂，增殖到清除抗原所需的大数量水平。末接触抗原前，对特定抗原特异性的初始T细胞克隆频率为1/105106淋巴细胞。抗原致敏后，抗原特异性T细胞的数量大幅度增高，可达l/10个CD8+T细胞和1/1001000个CD4+T细胞。随着抗原的清除，抗原特异性T细胞数量快速减少。平时存活的记忆T细胞频率为1/104。,（四）效应T细胞的分化：初始T细胞CD4+T细胞分化成为T辅助细胞,伴随T细胞增殖，CD4+T细胞分化成效应细胞亚群，产生不同类别的细胞因子，发挥作用各异的效应。Th细胞有Thl和Th2细胞两个功能亚群。IFN-是Th1细胞分泌的重要细胞因子，Th2细胞优势分泌IL-4和IL-5。CD4+T细胞分化成Thl或Th2细胞取决于免疫应答早期存在的刺激因素，其中抗原性质和细胞因子类型是关键因素。,Thl分化途径是机体对感染或活化巨噬细胞和活化NK细胞的微生物的应答。许多细胞内感染微生物导致抗原活化的CD4+T细胞(ThO)分化成Thl效应细胞。活化的NK细胞可分泌IFN-，继而活化巨噬细胞产生IL-12。IL-12结合于CD4+T细胞(ThO)表面的IL-12受体，活化转录因子STAT4。STAT4促进ThO分化成Thl效应细胞。Th2分化出现在对寄生虫和变应原(a11ergen)的应答之中，通常不伴随固有免疫应答和巨噬细胞活化。ThO分化成Th2亚群依赖于IL-4。除细胞因子外，抗原的性质、浓度以及共刺激因子也影响Th细胞的发育。细胞内感染微生物诱导Thl细胞的分化，而细胞外感染微生物如大多数细菌则诱导Th2的发育。,（五）效应T细胞的分化：初始T细胞CD8+T细胞分化成细胞毒T细胞,前细胞毒T淋巴细胞(pre-CTL)分化成为功能性CTL主要涉及细胞毒功能的获得。CTL分化的最重要的特征是膜结合型细胞浆颗粒的发育。这些颗粒包含穿孔素和颗粒酶。根据CTL不同的细胞因子产生谱将CTL分类为：Tcl和Tc2。在CTL所识别靶细胞低/不表达共刺激因子时，CTL分化需要Thl和APC的辅助。在病毒感染DC时，可直接促使CTL的分化。,（六）细胞分化产生长寿命、功能静息的Tm细胞,某些抗原刺激的T淋巴细胞前体分化成为记忆T细胞(Tmemorycell，Tm)。记忆T细胞介导快速和增强的再次免疫应答。记忆T细胞可被低浓度抗原和细胞因子以及低水平的共刺激分子所激活。在抗原被清除后，记忆T细胞可以功能沉寂和缓慢细胞周期的形式在宿主体内存活多年。记忆T细胞随年龄增长而