（环境科学与工程专业论文）固定化石油降解菌的制备及其性能表征.pdf

关于学位论文的独创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在指导教师指导下独立进行研究工作所取得的 成果，论文中有关资料和数据是实事求是的。尽我所知，除文中已经加以标注和致谢外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得中国石油 大学( 华东) 或其他教育机构的学位或学历证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对研究所做的任何贡献均已在论文中作出了明确的说明。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名：羞：函垫日期：如年多月p 日 学位论文使用授权书 本人完全同意中国石油大学( 华东) 有权使用本学位论文( 包括但不限于其印刷版 和电子版) ，使用方式包括但不限于：保留学位论文，按规定向国家有关部门( 机构) 送交学位论文，以学术交流为目的赠送和交换学位论文，允许学位论文被查阅、借阅和 复印，将学位论文的全部或部分内容编入有关数据进行检索，采用影印、缩印或其他复 制手段保存学位论文。 保密学位论文在解密后的使用授权同上。 学位论文作者签名：盎醴 指导教师签名： 日期：知年 日期：7 力1 1 年 厂月口日 多月 日 摘要 本文针对石油污染土壤的现状，以从石油污染土壤中筛选出的石油降解菌s m 3 作为 固定化对象，选择不同的材料作为固定化载体，分别采用吸附法和包埋法制备固定化微 生物。以原油降解率为目标，研究了固定化微生物的制备条件，并对优选出的固定化微 生物进行性能表征。吸附法研究结果表明：选择1 3 种天然材料作为固定化载体，通过对 比实验确定了y j 0 5 作为最佳载体材料，由其作为载体吸附制备的固定化微生物对原油 的7d r 解率高达6 1 ，较游离菌提高4 0 左右；对于载体y j 0 5 ，考察外界因素对吸菌 量的影响，当吸附时间为1 5h 、温度为3 0 、转速为1 6 0r p m 、载体量为1 0m l 时，载体 对菌的固定率最大，降解效果也最好；b e t 结果表明y j 0 5 和y j 0 7 的孔径为6 1 3n i l l ， 为介孔结构，y j 0 7 具有l l y j 0 5 更好的比表面积和孔容，y j 0 7 也可以考虑作为固定化 材料，可以从材料的结构方面探索一系列天然材料作为固定化载体；电镜扫描( s e m ) 结果表明：y j 0 5 主要为柱状孔结构，降解后材料结构会变的疏松，固定化菌起到了降 解作用，由于其无污染、不需回收，可以满足土壤修复的应用，达到以废治废的目的。 包埋法选择p v a n a 2 s 0 4 、p v a h 3 8 0 3 、壳聚糖和海藻酸钙壳聚糖为包埋材料，通过实 验确定了各包埋法制备固定化微球的最佳条件并得出以下结论：最佳包埋方案为 p v a n a 2 s 0 4 ( 活性炭) 法，其最佳制备条件为：p v a 浓度9 ，c a c l 2 浓度1 ，活性炭浓 度7 ，反应时间3h ，该小球具有良好的机械强度、弹性和渗透性，对原油的降解率为 5 8 2 5 ；扫描电镜( s e m ) 结果表明：p v a n a 2 s 0 4 ( 活性炭) 具有内疏外密的结构， 适合溶质的输入与输出；y j 0 5 固定化微球具有与活性炭微球相同的疏松网状结构，这 一发现对拓宽致孔剂的种类很有启发作用；与包埋法相比，吸附法不引入其它污染物质、 操作简单，且能为y j 0 5 的资源化利用提供一条有效的途径，最终选择y j 0 5 吸附固定细 菌来修复土壤。 关键词：固定化石油降解菌；吸附法；包埋法；天然载体；性能表征 p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fi m m o b i l i z e do i l d e g r a d i n gs t r a i n q i nl i ji a o ( e n v i r o n m e n t a ls c i e n c ea n de n g i n e e r i n g ) d i r e c t e db yp r o f z h a n gx i u x i a a b s t r a c t t h i sp a p e ra i m i n ga tt h ep o l l u t i o ns t a t u so fo i lt os o i l ，t h eo i ld e g r a d i n gb a c t e r i an a m e d s m - 3w h i c hw a ss e l e c t e df r o mt h eo i lc o n t a m i n a t e ds o i lw a su s e da st h ef i x e do b je c t ，a n d d i f f e r e n tm a t e r i a l sw e r es e l e c t e da si m m o b i l i z a t i o nc a r d e r ，p r e p a r i n gi m m o b i l i z e db a c t e r i ab y a d s o r p t i o nm e t h o da n de m b e d d i n gm e t h o dr e s p e c t i v e l y w i t ho i ld e g r a d a t i o nr a t ea st h eg o a l ， t h ep r e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fi m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s mh a db e e ns t u d i e d ，a n dt h e p e r f o r m a n c eo ft h es e l e c t e do p t i m a li m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s mw a sc h a r a c t e r i z e d t h e r e s u l t so fa d s o r p t i o nm e t h o di n d i c a t e dt h a t ：t h i a e e nk i n d so fn a t u r a lm a t e r i a l sw e r ec h o s e na s i m m o b i l i z a t i o nc a r r i e r ，b yt h ec o m p a r i n ge x p e r i m e n t ，y j - 0 5w a si d e n t i f i e da st h eb e s tc a r t i e r m a t e r i a l ，w i t hy j - 0 5a st h ec a r r i e rm a t e r i a l ，t h ei m m o b i l i z e dc r u d eo i ld e g r a d i n gb a c t e r i a s d e g r a d a t i o nr a t eo nc r u d eo i lr e a c h e dm o r et h a n61 i n7d a y s ，w h i c hw a s4 0 h i g h e rt h a n t h ef r e eb a c t e r i a ；i ta l s oi n v e s t i g a t e de x t e r n a lf a c t o r si n f l u e n c eo nt h ea b s o r p t i o na m o u n to f b a c t e r i aa n dd e t e r m i n e dw h e nt h ea d s o r p t i o nt i m ew a s15 h ，t h et e m p e r a t u r ew a s3 0 * ( 2 ， r o t a t i n gs p e e dw a s16 0 r p ma n dt h ev o l u m eo fc a r r i e rw a s10 m l ，b o t ht h ei m m o b i l i z e dr a t ea n d t h ed e g r a d a t i o nr a t ec o u l dr e a c ht h eh i g h e s t ；t h eb e tr e s u l t so fy j 0 5a n dy j 0 7s h o w e dt h a t t h e yh a das i m p l em e s o p o r o u ss t r u c t u r ef o r6 13n i n t h es u r f a c ea r e aa n dv o l u m eo fy j 0 7 w e r eb e r e rt h a ny j - 0 5 ，s oy j - 0 7c o u l da l s ob ec o n s i d e r e da si m m o b i l i z e dm a t e r i a l s ，i tc a n e x p l o r ea s e r i e so fn a t u r a lm a t e r i a l sa si m m o b i l i z e dc a r d e ri nt e r m so fm a t e r i a ls t r u c t u r e ；t h e r e s u l t so fs c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) s h o w e dt h a tt h e r ew a s m a i n l yc o l u m n a rp o r e s t r u c t u r eo ny j 0 5 ，t h es t r u c t u r ew o u l db e c o m el o o s eb e c a u s eo ft h ed e g r a d a t i o no ft h e i m m o b i l i z e db a c t e r i a , a n dt h ei m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s mw i t hy j - 0 5c o u l ds a t i s f yt h e a p p l i c a t i o no fs o i lb i o r e m e d i a t i o nt oa c h i e v et h ep u r p o s eo fw a s t ec o n t r o lb yw a s t eb e c a u s eo f i t sp o l l u t i o n - f r e ea n dw i t h o u tr e c y c l i n g p v a - n a 2 s 0 4 ，p v a h 3 8 0 3 ，c h i t o s a na n dc a l c i u m a l g i n a t e c h i t o s a nw e r es e l e c t e da sc a r r i e ri ne m b e d d i n gm e t h o d ，t h eo p t i m u mi m b e d d i n g c o n d i t i o n so fv a r i o u sm e t h o d sw e r ed e t e r m i n e db yt h ee x p e r i m e n ta n di td r a wc o n c l u s i o n sa s f o l l o w s ：t h eb e s te m b e d d i n gs o l u t i o nw a sp v a - n a 2 s 0 4 ( a c t i v a t e dc a r b o n ) m i c r o s p h e r e ，t h e o p t i m u mp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r ep v ac o n c e n t r a t i o n9 ，c a l c i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o n 1 ，a c t i v a t e dc a r b o n7 a n dr e a c t i o nt i m ew a s3 h ，i nw h i c hc o n d i t i o n st h eo i ld e g r a d a t i o n r a t ew a s5 8 2 5 a n dt h em i c r o s p h e r e sh a de x c e l l e n tm e c h a n i c a ls t r e n g t h ，f l e x i b i l i t ya n d p e r m e a b i l i t y ；s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) r e s u l t ss h o w e dt h a tp v a - n a 2 s 0 4 ( a c t i v a t e dc a r b o n ) m i c r o s p h e r ew i t ht h es t r u c t u r eo fl o o s e i n n e ra n dd e n s eo u t s i d es u i t a b l ef o r i n p u t i n ga n do u t p u t i n go fs o l u t e ，t h ef i n d i n go fy j 一0 5i m m o b i l i z e dm i c r o s p h e r e sa n d a c t i v a t e dc a r b o nm i c r o s p h e r e sw i t ht h es a m el o o s en e t w o r ks t r u c t u r ew a sv e r yi l l u m i n a t i n gt o w i d e nt h et y p eo f p o r o g e n ；c o m p a r i n gw i t ht h ee m b e d d i n gm e t h o d ，a d s o r p t i o nm e t h o dd i d n t i n t r o d u c eo t h e rp o l l u t a n t s ，w h i c ho p e r a t i o ni ss i m p l ea n dc a np r o v i d ea ne f f e c t i v ew a yf o rt h e r e s o u r c eu t i l i z a t i o no fy j 一0 5 ，f i n a l l yc h o o s i n gy j - 0 5a d s o r p t i o nm e t h o dt of i xb a c t e r i at o r e p a i rt h es o i l k e y w o r d s ：i m m o b i l i z e do i ld e g r a d a t i o nm i c r o o r g a n i s m ；a d s o r p t i o nm e t h o d ；e m b e d d i n g m e t h o d ；n a t u r a lc a r r i e r s ；p r o p e r t i e sc h a r a c t e r i z a t i o n 目录 第一章文献综述l 1 1 课题来源与选题依据1 1 2 国内外研究现状分析2 1 2 1 固定化细胞的载体材料和方法2 1 2 2 同定化细胞的特性7 1 2 3 固定化技术在处理废水和十壤污染治理方面的研究8 1 2 4 微生物同定化技术的研究展望1 l 1 3 研究目标、研究内容、拟解决的关键问题1 1 1 3 1 研究目标1 l 1 3 2 研究内容1 1 1 3 3 拟解决的关键问题1 2 1 4 拟采取的研究方法、技术路线及其可行性分析1 2 1 4 1 研究方法12 1 4 2 技术路线12 1 4 3 可行性分析13 第二章石油降解菌的驯化1 4 2 1 材料和方法14 2 1 1 材料14 2 1 2 实验方法15 2 2 结果与讨论1 7 2 2 1 油含量的测定1 7 2 2 2 石油降解菌的筛选1 7 2 2 3 细菌生长曲线的绘制18 2 3 小结。l9 第三章吸附法制备固定化微生物及其性能研究2 0 3 1 实验仪器、药品与材料2 0 3 1 1 仪器设备2 0 3 1 2 实验试剂2l 3 1 3 实验材料2l 3 2 实验方法2 2 3 2 1 固定化原油降解菌的制备方法2 2 3 2 2 载体材料的成分分析2 2 3 2 3 载体材料的初次筛选2 6 3 2 4 载体材料的吸附曲线2 6 3 2 5 最佳载体材料的确定2 7 3 2 6 外界因素对载体吸菌率与降解率的影响2 7 3 2 7 最佳固定化方案的确定2 9 3 2 8 吸附法制各的固定化微生物相关性能的表征2 9 3 3 结果与讨论3 0 3 3 1 载体材料的成分分析3 0 3 3 2 固定化载体的筛选3 2 3 3 3 外界因素对载体吸菌率与降解率的影响3 4 3 3 4 最佳固定化方案的确定4 2 3 3 5 吸附法制备的固定化微生物相关性能的表征4 3 3 4 小结4 6 第四章包埋法制备固定化微生物及其性能研究4 8 4 1 材料和方法4 8 4 1 1 材料4 8 4 1 2 固定化微球的制备方法5 0 4 1 3 同定化微球相关性能的测定方法5 1 4 2 结果与讨论5 2 4 2 1 固定化微球的制备5 2 4 2 2 最佳配比下固定化微球降解率的比较6 2 4 2 3 固定化微球的性能6 3 4 3 吸附法与包埋法的对比研究7 1 4 4 小结一7 2 结论一7 3 参考文献7 4 攻读硕士学位期间取得的学术成果一8 2 弱【谢8 3 v 中国石油大学( 华东) 硕 二学位论文 第一章文献综述 1 1 课题来源与选题依据 本课题来源于中国石油科技创新基金研究项目“固定化微生物修复石油污染土壤 ( 2 0 0 9 d 5 0 0 6 0 7 01 ) 。 土壤是一种极其复杂的动态的具有生命的介质，它由矿物颗粒、有机物、水分、气 体和微生物组成。土壤作为水、热冷、碳等物质的储存系统，它将建立土地、空气和水 之间的界面并从生态和非生态的角度完成许多重要功能。土壤的污染越来越受到人们 的关注，保证土壤修复的效率，恢复健康生产也就变得越来越重要。 石油污染土壤是石油及石化企业的重要污染之一，石油污染物会对人体及环境造成 很大的毒害。国内外处理石油污染土壤的方法主要有：焚烧法、堆放法、填埋法以及生 物修复法等【2 1 。生物修复法是实现土壤生态恢复的最经济、最彻底也是最有效的手段【3 】。 石油污染土壤的生物修复，是传统的生物处理方法的延伸，它是指利用微生物或植 物或动物将存在于土壤中的石油污染物直接降解为二氧化碳和水或转化成为其它无害 物质的工程技术系统。传统的生物处理方法，是将游离微生物直接投放入土壤中，进行 土壤修复，降解过程使污染物的成分趋向于更复杂，一些次生代谢物和中间降解产物的 毒性更大。而且，系统内降解菌有效浓度低、与环境竞争力弱、抗有毒污染能力差等缺 点，因而对原油的降解能力较低。另外，微生物修复石油污染土壤现场环境中的游离微 生物可能会与土著菌形成恶性竞争或难以适应环境而导致其不能很好地应用于原位石 油污染土壤的修复。 为了克服传统生物处理技术的不足，近年来，人们采用固定化技术，即利用物理或 化学手段将游离的微生物或酶，定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的 一种基本技术【4 羽。与游离微生物修复技术相比，其特点是对完整的微生物细胞进行固 定，提高细胞的生物稳定性，包括质粒的稳定性【7 】；提高单位体积介质中微生物细胞密 度：固定化后的微生物能长期保持活性；固定化细胞颗粒的微环境有利于降低与土著菌 的恶性竞争博j ，避免被噬菌体吞噬，降低极端p h 和被污染土壤中毒性物质对微生物体的 毒害【9 j ，使其在复杂环境中也可稳定地发挥高效能；微生物被各种载体固定后，单位体 积内有效浓度大大提高，提高了污染物降解率；固定化后的成品再生性能好，可以长期 反复使用。就修复石油污染的土壤而言，固定化微生物技术比游离微生物具有明显的优 势，固定化载体还可以作为一种膨松剂，有利于氧气的传递，这对石油的矿化降解至关 第一章文献综述 重要i l o 】。目前，固定化微生物技术已成为国内外生物科学、环境科学及其相关学科的研 究重点。 影响微生物固定化的三大类因素包括：微生物性质( 种类、培养条件、活性和浓度) ， 载体性质( 种类、表面电荷、表面亲水性、表面粗糙度和化学组成等) 及环境特征( p h 值、温度、离子强度、水流状态和基质类型与浓度等) 1 5 】。选择何种固定化方法、固定 化载体、运作工艺以及反应器的选择，使固定化微生物保持高稳定性和高活度、降低成 本、延长使用寿命、保证机械强度和传质的统一是固定化技术在环境修复中能否被广泛 应用的关键j ，其中载体性能是关系到同定化技术成败的关键因素。 因此，本课题的主要任务是通过实验比较优选出比较适宜的固定化载体和固定化方 法。考察制备过程中各种因素( 包括载体用量、菌胶比、吸附时间、交联时间等) 对固 定化微生物性能( 包括机械强度、孔径、传质性能等) 的影响，同时对制备出的固定化 微生物进行结构和性能表征。 1 2 国内外研究现状分析 微生物固定化技术被广泛用于修复受污染的流体介质( 如废水) 和半流体介质( 如 泥浆) 环境中【1 2 ，13 1 ，它具有菌体密度高，耐毒性能力强，可重复使用等优点【14 1 ，但将固 定化微生物技术应用于修复受石油污染土壤的研究，国内外报道较少。固定化微生物在 含有土著菌的自然土壤中，对污染物的降解占有绝对的优势，降解效果明显好于土著菌。 对于固定化细胞的制备，前人做了大量的工作，针对不同的处理对象( 大气、水和 土壤) ，对固定化材料和固定化方法的选择有不同的要求，主要方法有吸附法、包埋法、 交联法和共价结合法，研究最多的是吸附法和包埋法；固定化材料主要有有机材料、无 机材料和复合材料。由于用途的多样化使得对其性能的要求也不一样，从现有文献来看， 主要针对固定化细胞的特性研究，包括孔径、机械强度、弹性、传质性能、成球难易程 度、载体对微生物的毒性等方面的具体研究。 1 2 1 固定化细胞的载体材料和方法 理想的固定化细胞载体应该具有以下特征：易于成型，操作简单；对细胞无毒；基 质通透性好，传质性能稳定；不易被微生物分解；机械强度高，使用寿命长；价格低廉， 重复利用率高；无二次污染，无需回收等。细胞固定化技术的关键在于选择何种载体和 所采用的载体材料的性能以及对应选择何种固定化方法，目前所采用的固定化载体材料 大致可分为三类：有机高分子载体、无机载体和复合载体1 5 。引。有机载体的固定化方法 2 中国石油人学( 华东) 硕1 ：学位论文 主要采用包埋法，此法是利用高聚物在形成凝胶时将细胞包埋在其内部，从而达到固定 细胞的目的【1 9 , 2 0 】。无机载体材料的固定化方法主要采用吸附法，另外结合有机载体材料 组成复合载体材料利用包埋法制备固定化微生物。 1 2 1 1 有机高分子材料和包埋法 有机高分子载体材料可分为天然高分子和合成有机高分子凝胶载体两种，主要采用 包埋法制备固定化细胞。 包埋法是利用高聚物在形成凝胶时将细胞包裹在网格结构中或半透性聚合薄膜内， 小分子的底物和产物可以自由扩散，而细胞却不会扩散到周围介质中去。包埋法可操作 性强；反应条件温和，可保持细胞的活性，制备的小球机械强度高；细胞不易渗漏，稳 定性好；有较高的容量，包含细胞的量可达5 0 7 0 ，是目前研究最广泛的固定化方 法，但包埋材料会一定程度阻碍溶质的扩散，并对大分子底物不适用。 包埋法固定化细胞时，温度、p h 值、载体浓度等是影响固定化效果的主要因素。温 度是影响包埋小球机械强度的关键因素，温度高不利于保持颗粒性状；载体浓度直接影 响固定化细胞的性能，一般来说，载体浓度越高，固定化小球的机械强度越大，但粘度 也会增加，操作难度变大，且不利于营养物质和氧的传递，影响微生物的生长【2 。 天然高分子凝胶载体一般无毒性，传质性能好，但机械强度低，寿命短，厌氧条件 下易被微生物分解。常见的此类载体有琼脂、角叉莱胶、海藻酸钠等，其中海藻酸钠满 足上述优点，且价格低廉，是应用最为广泛的载体之- - 1 2 2 1 ，还有近来研究的比较热门的 新载体甲壳素和壳聚糖2 3 之7 1 。 目前常用海藻酸钠c a c l 2 来实现固定化，但其制备的海藻酸钙凝胶强度较低，易生 物分解，在含有微生物生长所必需的m 9 2 + 、k + 等阳离子溶液或高浓度的磷酸盐溶液中易 破碎和溶解17 1 。这种侵蚀作用会破坏固定化细胞的三维结构，从而缩短使用寿命，不利 于重复利用，运行时间延长，侵蚀作用越明显。为避免这种现象，可以对固定化细胞进 行化学处理以改善其机械性能。p a i l 2 8 】等分别用颗粒活性炭吸附固定细菌和海藻酸钙包 埋细菌( 内含1 粉末活性炭、4 海藻酸钙、1 湿菌体) 来降解高浓度苯酚废水，将制 备的海藻酸钙凝胶颗粒在聚乙烯亚胺溶液中浸泡，来提高其机械强度，结果表明：当来 水苯酚浓度为1 0 0 0m g l 时，海藻酸钙颗粒比颗粒活性炭具有更高的苯酚去除率。也可 通过加入膨润土、碳酸钙和二氧化硅等添加剂【2 9 1 ，以及改变c a c l 2 浓度等方法来提高固 定化颗粒的机械强度，达到改善固定化细胞稳定性的目的【3 0 ，3 1 1 。聂荣【3 2 】等针对藻酸盐载 体耐久性差的缺点，通过减少包埋量、补充c a 和添加b a 这三种不同的方法来提高藻酸盐 3 第一章文献综述 固定化颗粒的耐久性。结果表明，网格中c a 2 + 的流失是引起海藻酸钙凝胶强度下降的主 要原因。减少包埋生物量在短期内能提高藻酸盐载体的耐久性，但其理化性能会随着包 埋生物量的减少而降低。而补充c a 2 + 、添力l l b a 2 + 不但能使固定化颗粒长时间保持稳定， 且加固后的固定化颗粒能保持良好的理化性能。包永华【3 3 】等采用液芯海藻酸钙包囊固定 化技术来改善胶囊的传质性能，结果表明，与传统的海藻酸钙包埋法相比，营养物质的 传入和细胞代谢物的排出相对容易；细胞生长均匀，空间位阻小；还可降低囊内细胞或 酶的泄露，降低染菌的几率。 壳聚糖是近来研究比较多的新型载体材料，其生物相容性好，可在室温下凝胶化， 而且在磷酸盐缓冲液、m g ”、k + 、n a + 离子存在下都稳定。吴国杰【3 4 】等以海藻酸钠和壳 聚糖为原料合成固定化载体材料，研究了海藻酸钠质量分数、固化时间、壳聚糖含量、 覆膜时间等对载体硬度的影响，并将壳聚糖作为固定化啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 的载体应用于麦汁发酵，探讨了上述4 种因素对外观发酵度的影响。 合成有机高分子凝胶载体一般强度较大，抗生物分解性强，但传质性能较差，在进 行细胞固定时会降低细胞的活性。常见的有聚丙烯酰胺( p a m ) 、光硬化树脂、聚乙烯 醇、聚丙烯酸凝胶等l l 。由这些物质制成的凝胶小球，通常表面有一层较薄的均匀球壳， 结构为内疏外密，内部呈蜂窝状，有大量孔洞，可以包埋许多细胞。这种多孔结构有利 于细胞的包埋，也有利于基质及降解产物的传递，表面球壳可阻止细胞渗出。 聚乙烯醇( p o l y v i n y la l c o h o l ，p v a ) 的分子式为( c h 2 c h o h ) n ，是日本学者开发 的一种人工合成有机高分子载体材料，其价格低廉，化学稳定性好，抗微生物分解性能 强，相对p a m 凝胶，对生物的毒性很小，细胞的活性损失小，是目前国内外研究最为广 泛的一种包埋固定化载体。p v a 凝胶的常用制备方法有两种：一种是p v a 冷冻法，另 一种是p v a h 3 8 0 3 法。a m a n d a 等1 3 5 1 以p v a h 3 8 0 3 包埋法固定假单孢菌p s e u d o m o n a s 在流 化床反应器中连续降解苯酚。结果表明，固定化细胞具有良好的机械强度，连续运行两 周进水酚浓度从2 5 0m e , l 逐渐提高到1 3 0 0m g , l ，出水酚浓度均为0 ，降解效果显著。 但是，p v a 作为固定化细胞载体有一定的局限性，由于固定化过程引入的交联剂是 硼酸溶液，其酸性对细胞有一定的抑制作用，致使固定化细胞活性不高；由于p v a 的高 粘性，交联过程易发生粘连现象，成球困难；p v a 颗粒水溶胀性很大，强度会随着使用 时间的延长而变弱，不利于实际应用。基于以上这些问题，很多学者做了大量研究。在 聚乙烯醇溶液中加入适量海藻酸钠，溶解均匀后将其滴入c a c l 2 溶液中，这样形成的凝 胶颗粒形状更规则，且其机械强度比一般p v a 固定化颗粒高。陈敏等【3 0 】在聚乙烯醇的固 4 中国石油人学( 华东) 硕上学位论文 定化过程中添加了活性炭，不仅改善了微球的通透性，有利于传质过程的进行，而且使 得固定化细胞具有吸附和包埋的双重效果。李花子等【3 6 j 采用延时包埋法与加入化学药剂 ( 丙烯酰胺) 法对p v a 硼酸法进行了改进。结果表明，两种方法制得的聚乙烯醇固定 化颗粒不易破碎、水溶膨胀性得到了很好的改善；电镜观察发现，改进后的聚乙烯醇凝 胶网络密实均匀、网丝相互联结，其网状结构明显优于未改进凝胶的网状结构。侯红萍 p 7 j 等以聚乙烯醇和海藻酸钠为包埋材料，加入硅藻土或活性炭或a 1 2 0 3 为吸附剂，发现 有助于颗粒成型，能改善其通透性、增加孔隙和机械强度，达到吸附和包埋的双重效果。 1 2 1 2 无机载体材料和吸附法 无机载体如活性炭、硅藻土、多孔陶珠、沸石、红砖碎粒、氧化铝、砂粒、微孔玻 璃、高岭土等，具有机械强度大、对微生物无毒性、不易被微生物分解、耐酸碱、成本 低、寿命长等特性，因而是一类重要的载体材料【3 8 , 3 9 】。 吸附法是通过吸附作用和电荷效应或利用载体对细胞的亲和性将细胞直接吸附在 水不溶性载体上的一种固定化方法。吸附法是一种比较简单的固定化方法，一般只需将 载体放入细胞悬液中，搅拌或浸泡一段时间，然后倒掉并洗去没有被吸附的游离细胞， 即制得固定化细胞。吸附法操作简单、合乎细胞的生理条件，不会对细胞的活性造成影 响；吸附法也有其弊端，其一就是它的吸附容量小。为了增大对生物体的吸附量，载体 材料应该是多孔性的，且其孔径应比细胞的直径大，一般应比菌体大4 5 倍，但若孔隙 太大，比表面积就变少，不利于吸附。所以，所选的载体应该有一最适宜的孔径或最适 宜的比表面积，最适宜值由菌体种类及载体材料决定；其二是吸附法固定化细胞结合强 度低，易脱落。 吸附法固定微生物细胞时，p h 值、载体的性质等均影响细胞与载体之间的相互作用。 只有当载体的特征、细胞的性质及细胞与载体间的相互作用等参数配合恰当时才能形成 稳定的固定化微生物( 即微生物细胞载体复合物) ，应用于实际系统【1 5 】。 无机载体大多具有多孔结构，内部孔隙较大，可容纳不断增殖的微生物，满足固定 化生物所需要的吸附量。无机载体在与微生物接触时，通过静电吸引，将微生物固定在 载体上，该方法简单易行，只需把载体放入培养好的微生物溶液中，固定一段时间即可。 1 2 1 3 复合载体材料和固定化方法 复合载体材料是有机载体材料和无机载体材料的组合，两类材料各有其优缺点，在 许多性能方面互补，因此，选择合适的有机载体和无机载体组成复合载体，以改进材料 的。l 生能t 2 0 j ，复合载体材料既可用吸附法又可用包埋法制备固定化微生物。 5 第一章文献综述 b l a c kg m 等1 4 0 】成功将酵母菌固定在多孔碎木料表面上，液相流化床发酵罐比气流 搅拌循环床发酵罐中的固定化菌密度大，更能克服发酵罐中的浮力。两种反应堆都被成 功应用于长时间的连续操作。 马梅荣【4 ”等选取无机载体和有机载体数种，包括活性炭、砖粉、木炭、土壤、树叶、 麦麸、麦壳、花生皮、黄豆荚、玉米叶、锯末。以微生物的数量作为检测指标，考察了 载体的种类( 单一载体) 、配比( 混合载体) 、温度和载体水分含量等单因素对载体吸 菌量的影响。结果表明：混合载体比单一载体吸菌效果好，更适合于微生物的生长繁殖。 不同温度和载体水分含量对吸菌量也有一定的影响。 l i n 等人【4 2 j 采用联合包埋法，在溶解好的海藻酸钠中加入粉末活性炭和菌 p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ，用于降解五氯苯酚( p c p ) 。活性炭在复合固定化体系中 作为吸附剂，主要用于富集有毒污染物，便于微生物进一步降解；固态底物可以促进生 物降解并减少其他生物的干扰。结果表明，复合固定化体系比游离体系显示出更好的降 解性能和稳定性能，显示出复合载体材料的优越性。j i nx i n 等【4 3 】用吸附树脂和壳聚糖 ( i p c s r ) 复合固定青霉素酰化酶，其酶活性和蛋白质固载量分别为1 3 0 0u g 干载体和 2 7m g g 干载体，与未加壳聚糖的吸附树脂( i p r ) 相比，其比活性提高了2 倍。i p c s r 循环使用3 5 次后还能保持7 5 的酶活性，而i p r 仅使用l o 次后就已失活。 宋建彬】等用无机多孔材料硅藻土( c e l i t e ) 在低压下强化吸附壳聚糖，再用戊二醛 活化，以此为载体通过共价结合固定化青霉素酰化酶，克服了壳聚糖颗粒机械强度不够 和比表面积不大的缺点。 陈芳艳【4 5 】等在p v a 中加入累托石，两者复合，旨在取得对微生物吸附与包埋的双重 效果，为含菲废水的处理和菲污染水体的生物修复提供参考。同时将固定化小球置于己 二胺溶液中进行表面硬化处理1h ，结果获得了机械强度和传质性能都不错的固定化微生 物小球。实验还可以考虑与海藻酸钠复合包埋，加入其它的无机多孔材料，强化p v a 的 传质性能，减小包埋法传质阻力大的缺点。 有机载体和无机载体还包括天然的植物材料、贝壳和粉煤灰等，为了不在修复环境 中引起新的污染，近年来关于天然材料的研究越来越多。 郭静仪 4 6 1 等利用木屑作为载体，以菌q k 一1 为固定化对象，吸附法制备固定化微生 物对含油废水进行处理，原油去除率大大高于单纯投加菌液或菌液和木屑的混合物。信 欣1 47 j 等采用厌氧+ 好氧工艺，对比考察以贝壳为载体的固定化微生物与游离污泥床对黄 姜皂素废水的c o d 和氨氮去除能力，结果表明固定化体系启动时间较短，对废水的处理 6 中国石油人学( 华东) 硕l ：学位论文 能力要高于游离微生物体系的处理6 只匕1 - - , 力。d ec a s t r oh f 1 4 8 】等用稻草作为固定微生物脂 肪酶的载体，用戊二醇作活化剂，聚乙烯乙二醇( p e g ) 为稳定剂，设计2 2 因素实验研 究p e g 分子量的影响和酶的固载量。v e g a ，e a 等1 4 9 1 利用大麦稿秆固定化下水道污泥吸附 降解铜矿山地区污染土壤中的c u 2 + 、c d 2 + 和p b 2 十等金属离子，以吸附解吸等温线来评价 固定化污泥的吸附量和吸附可逆性。 以上研究的吸附型固定化载体多为天然载体和农作物的废弃物，选择这些载体用于 治理环境可以到达变废为宝的目的，也为废弃农作物提供了一条资源化利用的途径。这 些研究取得了一定的进展，只是众所周知，吸附法制各的固定化微生物容易脱附，有效 菌量减少，从而影响使用次数和降解率，实验可以从防止吸附菌体的脱落方面入手，如 添加粘稠剂等；也可以通过实验获取最大吸附量的参数。 1 2 2 固定化细胞的特性 随着固定化细胞技术的研究与应用越来越普遍，人们对固定化细胞的内部机理越来 越感兴趣，研究重点开始转向固定化细胞的特性研究。 1 2 2 1 形态学变化 用包埋法制备的固定化细胞形状大多为球形，也有制成块状、条状或膜状的。用吸 附法制备的固定化细胞的形态取决吸附物质的形状。对固定化细胞形态的研究主要通过 扫描电子显微镜、光学显微镜和电子显微镜等来表征。通常没有发现细胞形态上有明显 变化，但是人们发现，在球形固定化凝胶内，细胞的分布并不均匀5 0 1 ，而是接近于球的 外表面【5 l - 5 3 1 。球形颗粒的内部结构可能受胶凝时间、载体浓度和种类、促阳离子溶液的 浓度、粘度和p h 、内部微粒和温度等因素的影响，而导致细胞的分布不均1 5 0 】。有时， 细胞在凝胶内的小空隙内繁殖，直到最后充满整个可利用的空间。被包埋细胞新陈代谢 活动的加剧会导致细胞形态的改变，p e r t o t 等【5 4 】观察到：固定在海藻酸盐内的壁厚膨胀 的雀稗麦角菌细胞具有粒状细胞质和液泡，这种现象在游离细胞中是从来没出现过的。 1 2 2 2 生理学特征 固定化细胞的一个最重要和最明显的生理学特征是细胞的活性。通常需要采取多种 方法来测定处于固定化条件下的细胞的生理状态，例如，对释放出的细胞进行活计数， 直接在显微镜下镜检，测定细胞重量的改变，测定氧或营养物的吸收等。 细胞种类、接种浓度和分布状况、载体性质、溶液性质以及固定化细胞微环境等是 影响细胞生理学特征的主要因素。对固定