（遗传学专业论文）重组大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基体外分子交联的初步研究.pdf

首都师范大学硕士学位论文 缩略表 cbc dtt eieze3 gs h gs sg i ptg i m ac p age t tg tt db upp c o o m a s s i e b l u e d y e g - 2 5 0 d i t hi o t hr e i t o l u b i q u i t i n - a c t iv a t i n g e n z y me u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n g e n z y me u b i q u i t i n - p ro t e i n l i g a s e r e d u c e d g l u t a t h i o n e o x i d i z e d g l u t a t h i o n e i s o p rop y l - p - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e i mm o b i l i z e d me t a l a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y p r o t e i n d i s u l f i d e i s o m e r a s e p e p t i d y l p roly l - c i s - t r a n s - i s o me r a s e p o l y me r i s e 山a i n rea c t i o n pr o t e a s o me s p o l y a c r y l a mi d e g e l e l e c t r o p h o res i s t i s s u e t r a n s g l u t a mi n a s e t a r t r a t e d e h y d r a t a s e b e t a s u b u n i t u b i q u i t i n - p r o t e a s o me s p a t h w a y u b i q u i t i n iir dpcs pppp ub 首都师范大学硕士学位论文 摘要 本实 验以 大肠杆菌酒石酸脱氢酶p 亚基 ( t t d b ) 为研究材料， 探索了其在体 外的 交联情况。 首先利用p c r技术 从大 肠杆菌b l 2 1 中获取t t d b基因，克隆到 p g m - t 载体并测序; 序列测定无误后连接到表达载体p t r c h i s c i p t g诱导 表达。 重组蛋白 以包含体形式存在， 应用t a l o n固 定化金属亲和树脂以 变性的方法纯 化，通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性， 复性率可达 7 0 %。将复性后的 蛋白 与溶菌酶通过热诱导去折叠 和氧化重折叠方法进行体外蛋白 质分子交联实 验。结果 表明:蛋白 质在其变性的 临界温度反应时，出 现交联二聚体和多聚体; 这些蛋白 质分子间 交联包括分子间二硫键和异肤键: 在氧化重折叠反 应液中加入 还原剂二 硫苏 糖醇 ( d t t ) 后， 不但没有分子间 二硫键形成， 也没有异肤键形 成。 实验还发 现 l y s o z y m e 和t t d b间亦能形成交联。另外， 本文还利用 p c r 定点突 变技术将此t t d b基因的6 个半 胧氨酸全部突 变为丝氨酸， 突变后的 重组蛋白 在 与野生型蛋白 相同的热诱导去折叠条件下，完全没有二聚体和多聚体的形成。 以上结果进 一步证明了蛋白 质体 外交联可通过以 下三步进行:1 )蛋白 质构 象 包括二 级结 构的改 变; 2 ) 形成分 子间二 硫键; 3 ) 形成分子间 异肚键且分子间 二硫键能促进随后异肤键的形成。 关 键词: 酒 石 酸 脱 氢 酶r 亚 基， 热 诱 导 去 折 叠 和 氧 化 重 折 叠， 蛋白 质 分 子 交 联， 二硫键，异肤键，p c r定点突变 首都师范大学硕士学位论文 ab s t r a c t e s c h e r i c h i a c o l i t a r tr a t e d e h y d r a t a s e b e t a s u b u n i t ( t t d b ) i s s t u d y e d t o m a k e c l e a r i n v i t r o p r o t e i n c r o s s - l i n k i n g . b y u s i n g t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( p c r ) t e c h n i q u e , t t d b g e n e w a s a m p l i fi e d fr o m t h e e s c h e r i c h i a c o l i b l 2 l c e l l . t h e f r a g m e n t w a s i n s e rt e d i n t o p l a s m i d p g m- t a n d c o n f i r m e d b y d n a s e q u e n c i n g . t h e n t h e t a r g e t g e n e w a s s u b c l o n e d i n t o t h e e x p r e s s i o n p l a s m i d p t r c h i s c b y t h e s i t e s o f t w o r e s t r i c t i o n e n z y m e b a m h i a n d h i n d l i l . t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s i n d u c e d b y i p t g i n e s c h e r i c h i a c o l i b l 2 1 ， a n d t h e e x p r e s s i o n w as a s s o c i a t e d w i t h f o r m a t i o n o f i n c l u s i o n b o d i e s w i t h s d s - p a g e e l e c t r o p h o r e s i s . t h e r e c o mb i n a n t p r o t e i n w a s p u r i fi e d b y i m m o b i l i z e d m e t a l a ff i n i ty c h r o m a t o g r a p h y ( i m a c ) , a n d r e f o l d e d b y d i a l y s i s . t h e r m a l u n f o l d i n g a n d o x i d a t i v e r e f o l d i n g o f l y s o z y m e a n d t t d b l e d t o t h e f o r m a t i o n o f c r o s s - l i n k e d d i m m e r s / o l i g o m e r s as r e v e a l e d 妙 s d s - p a g e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ; n o d i m m e r s / o l i g o m e r s w e r e d e t e c t e d w h e n t h e r e f o l d i n g a n d u n f o l d i n g s o l u t i o n c o n t a i n e d t h e r e d u c i n g a g e n t d i t h i o t h r e i t o l ( d t t ) . h e t e r o g e n e o u s p r o t e i n s b e c o m e c r o s s - l i n k e d f o l l o w i n g t h e f o r ma t i o n o f h e t e r o m o l e c u l a r i n t e r c h a i n d i s u l f i d e b o n d s d u r i n g t h e r m a l u n f o l d i n g o f a m i x t u r e o f l y s o z y m e a n d t t d b . i n a d d i t i o n ,t h e c y s / s e r p o i n t m u t a t i o n i n p r o t e i n t t d b a b r o g a t e d i t s a b i l i ty t o c r o s s - l i n k i n t o h o mo d i m e r s t h e r e r e s u l t s p r o v i d e f u r t h e r e v i d e n c e t h a t i n v i t r o p r o t e i n c r o s s - l i n k i n g c a n b e a c c o m p l i s h e d i n t h r e e c o n c e r t e d s t e p s : ( 1 ) a c h a n g e i n p r o t e i n c o n f o r m a t i o n ; ( 2 ) f o r m a t i o n o f in t e r c h a i n d i s u l f i d e b o n d s ; a n d ( 3 ) f o r m a t i o n o f i n t e r c h a i n i s o p e p t i d e c r o s s - l i n k s . k e y w o r d s : t a r t r a t e d e h y d r a t a s e b e t a s u b u n i t ( t t d b ) , t h e r m a l u n f o l d i n g , o x i d a t i v e r e f o l d in g , p r o t e i n c r o s s - l i n k i n g , d i s u l f i d e b o n d s , i s o p e p t i d e b o n d s , p c r p o i n t mu t a t i o n 首都师范大学硕士学位论文 第一章 综述 1 . 1 蛋白 质折叠概述 蛋白 质由2 0 种氨基酸组成，具有多种多样的功能，几乎参与了 生命活动的 所有方面并起着关键作用。 蛋白质折叠所要解答的问题， 就是伸展的多肤链是怎 样形成特定的立体结构并因之具有生物功能的。 1 . 1 . 1体外蛋白 质折叠 1 . 1 . 1 . 1蛋白 质变性学说 6 0 多年前， 我国生化界先驱吴宪教授提出了著 名的蛋白 质变性学说， 即“ 天 然蛋白 质之分子， 因环境种种之关系， 从有 秩序而坚密之构造， 变为无秩序散漫 之 构 造， 是为 变性 作 用。 若 数分 子 相 撞 而缠 结 ， 则 为 凝固 作 用 ( c o a g u la t io n ) . 蛋白 质变性之种 种事实，均可以 此说 解释之。 4 0 年后， a n f i n s e n 具体提出蛋白 质折叠的全部信息存在于多肤链的 氨基酸顺序中， 即 蛋白 质的一级结 构决 定其高 级结构的学说。 由 蛋白 质变性学说可知， “ 无秩序散漫 之构 造 : a 是蛋白 质折叠研究中 所说的 “ 伸展态”( u n f o l d i n g ) 。 去除变性因素后，自 动恢复到“ 有秩序而坚密之构造” ， 就是蛋白 质折叠研究中的“ 折叠 ”( f o l d i n g ) 。所以 蛋白 质变性和复性的理论包含 了蛋白质折叠研究的内容。 1 . 1 . 1 .2体外蛋白 质折叠研究进展 近年 来的研究表明， 伸展的肤链 ( u ) 经过早期折叠进入中间态 ( 1 ) ，然后 由中间 态过渡到 最终的具有三维结构和功能的天然态 ( n ) : 二 快 .慢 u-1一m 对大多数小分子蛋白 质来说， 变性的蛋白 质在没有外来援助的情况下可以通 过再折叠达到天然状态。即: a . 无秩 序态的瓦解 ( c o l l a p s e )和二级结构的形成。 再折叠一开始很快形成 二级结构，但处于不稳定状态。 b . 二级结构的稳定阶段。 c . 多途径折叠。不同蛋白 质二级结构单 元的联合和装配方式不同，即通过 多途径导致从变性态转变为天然态。 d . 走向天然态。通过稳定二级结构的相互作用进入天然态。这一阶段是折 首都师范大学硕士学位论文 叠的最后过 程，比 早期过程慢。 在这一阶段， 侧链被包装在特定的位置， 分子变 得越来越紧密，成为有特定三维结构和生物功能的蛋白质分子。 1 . 1 .2体内 蛋白 质折叠 体内 蛋白 质折叠的 环境与 体外是很不相同的。 体外蛋白 质折叠的 环境单纯， 折叠从完整的 肤链开 始; 在体内， 环 境复杂， 有很多其它因子和蛋白 质存在， 而 且新生肤的n端一出 现， 折叠 就开始。 一般情况下，体外折叠效率低而体内 折 叠效率高。 进一步的研究表明 ， 至少有二类蛋白 质因子参与了体内的蛋白 质折叠 过 程: 一 类 是 折 叠 酶， 包 括 蛋白 质 二 硫 键 异 构 酶 (p r o t e i n d is u lfi d e is o m e r a s e ,p d i ) 和 肤 基 脯 氨 酞 顺 反 异 构 酶 ( p e p ti d y l -p r o ly l c i s/ tr a n s is o m e r a s e ,p p i) : 另一 类 是 分 子 伴 侣 ( m o l e c u la r c h a p e ro n e ) . 1 . 1 .2 . 1折叠酶 这类酶催化与蛋白 质折叠直接有关的、对形成功能构象所必需的共价键变 化 。 1 . 1 .2 . 1 . 1 蛋白 质二硫键异构酶 在哺乳类， p d i 是由 分子量为5 7 k d a 的 亚基构成的同聚二聚体，主要存在 于细胞的内 质网 中。 其中， 每 个 p d i 分子含有4 个硫氧化蛋白 样的结构域，每 个结构域都有一个位于分子表 面突环内 的二疏基 / 二硫键活性 位点 1 1 。 许多 证据表 明， 在真核细 胞内 质网中， 许多分泌性蛋白的新生多 肤的 折叠都需要p d i ， 但是， p d i 并不决定蛋白 质折叠的 途径， 而是促 进不正 确二 硫键配对的快速往返穿 梭而 使 正 确 二 硫 键 形 成 21 . 二硫键 二硫键是指在空间结构上相距较近的两个半肌氨酸的琉基氧化形成的共价 键，可以 把不同 肤链或一条 肤链的 不同 部分连接起来 ( 如图 功 。二 硫键可以 是折 叠 途径 中 的 关 键 步 骤， 或 仅 仅 是 简 单 地 增 强蛋 白 质的 稳 定 性 3l ， 但 对 许 多 蛋白 质 而言， 二硫键是它 们最终折叠 产物的 永久特征， 在蛋白 质的 结构维持 和活性 保持 方面起着重要作用。 最近的 研究结果表明 ， 即 使蛋白 质最终产物并不包含二 硫键， 二 硫键仍然可以 起到促进折叠的作 用 4 1 。 现在己 经知道， 大肠杆菌体内 二硫键的 氧化形成和还原异 构都是酶催 化的 过程， 所有参与这些过程的酶的一级结构都含 有 活 性 位点c y s 一x 一 x 一 c y s s lc y s -x - x - c y s o 首都师范大学硕士学位论文 促 进r h b m p - 2 的 活 性 恢 复。 蛋白 质h a in a n t o x in - n 12 a 1的 复 性 也 验 证 了 这 一 点 ( g s h 5 .0 m o l/ l ,g s s g 0 .5 m o l几 ) . 最 近， h e v e h a n 2 4 1的 研 究 表 明 ， 这 一比 例 关系 须随 蛋白 质浓度作调 整。实 验中 还原性和 氧化性琉基试剂比 例介于3 : 11 : 1 之间时， 复 性 效 率 最 佳。 空 气中 的 氧 也 是 很 好的 二 硫键 催 化剂 。 m e n z e ll a 12 5)等的 研究 成 功 地利用空气中的 氧使前 凝乳酶原复性， 复性中需要检测溶液的p h值， 而且适量 加入精氨酸和中 性表面活化剂可提高复 性效 率. . 分子伴侣对复性的影响 研究表明， 分子 伴侣能 结合解链和半折叠的蛋白 质结构， 降低蛋白 质聚集并 有效促进蛋白 质折叠。 a t p的 加入可 使分子伴侣将目 的 蛋白由 结合态游离出 来， 进行折叠， 而且多 种分子伴侣对复性 有协同 作用。 目 前已从不同 来源得到多 种分 子 伴侣并 应用 于 蛋白 质复 性。 n a m 26 1从 大 肠杆 菌中 成 功诱 导 并 纯 化出 d n a k , d n a j , g r p e , g r o e l , g r o e s 5 种 分 子 伴 侣 ， 它 们能 促 进 碳 酸 a f 酶b 的 复 性 。 在分子伴侣作用机制的基础上，有人用人工分子伴侣系统对蛋白 质进行复 性。 人工分子伴侣由 去垢剂和环 糊精组成， 去垢剂可以 与蛋白 质结合， 形成复合 体， 抑制蛋白 质聚集， 然后环糊精从复 合体中 剥离掉去垢剂，蛋白 质进行折叠。 d o n g 2 71研 究了 人 工 分 子 伴 侣 对 溶 菌 酶 复 性 的 影 响， 实 验 中 复 性 效 率 随 人 工 分 子 伴侣浓度的上升而增高。 . 其他小分子添加剂的作用 许多小分子添加剂对提高复性产量有帮助。 它们分子量较小， 易接近目 的蛋 白质并与之结合， 而且具有不易聚集的性 质， 可以带动目 的蛋白的复 性。 它们的 分子内部大都含有c = n , c = s等类似共价键的 结构， 如盐酸肌和精氨 酸 ( c = n ) , 二甲 基亚 矾 ( s = 0 ) 、乙 酞化环糊精 ( c =0 )等。 这种结 构可能与蛋白 质疏水基 团的 结合有关。 在对蛋白 质透析复性的 基础上， 可适当 运用这些添加剂。 由于不同的蛋白质有不同的分子大小、 结构形式和等电点， 因此很难找到一 种方法适用于所有蛋白 质的复性。 但蛋白 质的 基本组成成分是氨基酸， 空间结 构 有一定的 规律可寻。 各种蛋白 质对外界物理或化学条 件的反应， 蛋白 质内部 化学 键的成键要求又都有相似性， 因此， 各种蛋白 质的复性方 法可以 彼此借鉴。 但对 于某一种特定蛋白 质来说， 其最佳复性方法，需 要在实 验中 进一步探索得到。 1 .2蛋白 质交联 ( p r o t e i n c r o s s - l i n k i n g ) 概述 首都师范大学硕士学位论文 突变体 ( g l u 3 2 4 s e r ) ， 纯化的 p d i 突变体 ( g l u 3 2 4 s e r ) 蛋白中 完全没有形成异 肤交联二聚体，说明g l u 3 2 4 是一 个参与在体外形成异肤键的 氨基酸残基( 5 3 1 1 .3本实验研究对象及技术路线 本 实 验以 大 肠 杆 菌l -酒 石 酸 脱 氢 酶a 亚 基 ( l - ta rt ra te d e h y d r a t as e b e t a s u b u n it t t d b ) 为研究对象， 试图为 蛋白 质交 联的 三步假说提供 进一步的 证据。 t t d b共 有 2 0 1 个氨基酸残基， 其中 包括6 个半肤氨酸残基。 我们用p c r技 术获取此基 因，与t a克隆载体连接后测 序; 选取序列正确的目 的基因与p t r c h i s c表达载 体连接， i p t g诱导表达后用t a l o n固定化金属亲和树脂 ( i m a c ) 纯化; 将纯 化得到的融合蛋白进 行体外 热诱导去折叠和 氧化重 折叠实 验， 观察其交联情况。 随后， 我们又用p c r 定点 突变技术 将其中的6 个c y s 残 基全部 突变为s e r 残基， 再依照上述步骤获取突变型融合蛋白， 进行体外热诱导去折叠和氧化重折叠实 验。 此 外， 我 们 还 将 野 生 型t td b 与 另 一 种 蛋白 质 溶 菌 酶 ( ly s o z y m e ) 混 合 进 行同 样 的交联实验，以 观察异源蛋白 之间的 交联情况。 首都师范大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 . 1材料 2 . 1 . 1 菌株及质粒 大肠杆菌b l 2 1 、 大肠杆菌d h 5 n 、表达载体p t r c h i s c均为本实验室保存。 2 . 1 .2工具酶与试剂 各种限制性内 切酶、 t 4 d n a连接酶、 考马斯亮蓝r 2 5 0 和溶菌酶购自 华美生 物 工 程 公 司; d n t p , p f u d n a 聚 合 酶 购自 上 海生 工 生 物 公司 ; d n a 快 速 纯 化 回 收试剂盒及质粒快速提取试剂盒购自 鼎国生 物工程公司; 平末端d n a片断连接 试剂盒购自 北京天为时代科技有限公司;t a l o n金属亲和树脂购自 c l o n t e c h , p a l o a l t o , c a : 其它试剂均为分析纯 产品。 2 . 2方法 2 .2 . 1野生型t t d b 基因的 克隆、目 的蛋白 的获得及体外 蛋白 交联实 验 2 .2 . 1 . 1 p c r方法合 成野生型t t d b基因 两 个寡聚脱氧核糖核着酸引 物 p 1 ( 5 g g g g a t c c a a a a a a t g a a a a a g a t c c t g a c 3 ) 和 p 2 ( 5 g g a a g c t t a t t t g a t g t a a t g g a c g 3 ) 为上海生工生 物公司合成。 上 游引 物5 端 含b a m h l 酶切位点， 下游引物5 ， 端含 h i n d f i l 酶 切位点。这两个酶切位点是p g m - t 克隆载 体所不具 有的。 取 对 数生 长 期 的 大 肠 杆 菌b l 2 1 菌 液2 a l 作 为p c r 反 应 的 模 板 ， 反 应 体 系 为 : 2 0 m m o l/ l t r is -c l (p h 8 .8 ) , 1 0 m m o l/ l k c i , 5 m m o l/ l m 9 c iz , 0 .1 p m o l/ l寡 聚脱 氧 核 营酸p 1 和p 2 , 4 种d n t p (各0 .2 5 m m o u l ) , 5 u p f u 聚 合 酶， 总 体 积5 0 匹。 反 应条 件为 : 9 4 c 变 性1 m in , 5 2 退 火1 .5 m in , 7 2 延 伸3 m in ， 循 环 3 0 次 ， 取1 0 泌 反 应混 合 物 进 行1 % 琼 脂 糖 凝 胶电 泳 检 测 。 2 . 2 . 1 .2重组克隆 质粒及表 达质粒的构建 2 . 2 . 1 . 2 . 1 相关d n a操作方法 . 电泳后目的片断的回收 用d n a快速纯化/ 回收试剂盒回收电 泳后的p c r产物，具体方法参照产品 说明。 切取的凝胶要尽量薄; 一定要等到凝胶完全溶化后再上柱; 为确保回收后 目的 片断的高浓度， 实验中 均采用说明中 建议的 最小洗脱体积。 首都师范大学硕士学位论文 .限制性内切酶反应 参 照产品 说明中 推荐的反应条件， 根据所用酶的种类， 选择合适的反应缓冲 液， 加入适量的d n a和酶， 在最 适温度下反 应2 - 3 小时。 酶的用量不要超过反 应体积的1 0 %， 以 免 甘油影响 酶的 活性引 起“ 星号活性” 。 本实验所用酶为b a m h i 和 h i n d l i i ，两者所需反应缓冲液均为 b u ff e r e e . d n a连接反 应 1 . p c r产物与克隆载体 p g m- t的连接 为 保 证p c r 产 物 序 列 的 完 全 正 确， 本 实 验 选 用p f u d n a 聚 合 酶。 它 是目 前 所发现的 保真性最高的酶， 原因在于 这类酶有 3 - 5 外切酶活性。因此 p c r产 物 末端 没 有a ， 必 须 用t a q d n a 聚 合 酶 进 行 末端 加a反 应， 才 能 与t 载 体 连 接。 具体步 骤参照北京天为时代平 末端d n a片断 连接试剂盒。 2 . 酶 切 产 物 与 表 达 载 体p t r c h is c 的 连 接 参照t 4 d n a连接酶 产品说明中 推荐的粘末端连接反应条件与体系。 对于不 同的 载体和d n a插入片断， 要 取得成功的连接， 应分别建立具有不同 摩尔比例 的连接反应。 在大多数 情况下，1 : 11 : 3的 摩尔比例都可获得较好的连接效果。 本实验采用1 : 3 的连接反 应体系， 具体如下: 表一连 接反 应体系( l l ) p g m- t + t t d b ( b a m h u h i n d i i i ) 6 p t r c h i s c ( b a m h u h i n d i ii ) 2 i o x t 4 i i g as e b u ff e r i 几 i i g a s e 1 t o t a l r e a c t i o n s y s t e m 1 0 . 感受态细胞的制备 用c a c l : 大量制备大肠 杆菌d h 5 出1, 2 1 感受态细胞， 具体步骤如下 ( 均需无 菌条件) : 1 . 从3 7 划线培养活化1 62 0 h 的新鲜平板中 挑取一个单 菌落， 接种到2 m l l b液体培养 基中， 3 7 、 2 0 0 r p m摇培过夜; 2 .次日 ， 吸取 i m l 过夜培养的液体菌液， 接 种于4 0 m l l b液体培养基中， 3 7 、 3 0 0 r p m 剧 烈 振 荡 培 养 至o d 6w. 达0 .3 - 0 .4 , 4 冷 却1 0 m in ; 首都师范大学硕士学位论文 ( 以下均需低温操作) 3 . 4 0 0 0 r p m ， 离心1 0 m i n ， 真空抽干; 4 . 用 1 0 m l 冰预冷的0 . 1 m c a c 1 2 悬浮菌体， 冰 浴 3 0 m i n ， 每隔1 0 m i n 混 匀一次; 5 . 4 0 0 0 r p m离心1 0 m i n 收菌; 6 .重复4 - - 5 步 骤一次; 7 . 加 1 m l 冰预冷的0 . 1 m c a c 1 2 打匀; 8 加 1 m l 预冷的无菌甘油，分 装成小 份， - 2 0 冻存。( 甘油占 总体 积 3 0 - 5 0 %) . 转化 1 .用冷却的 无菌 吸头从感受态细胞悬液中取2 0 0 p l 转移到无菌的微量离心 管中， 加入适当稀释的 质粒5 - 1 0 p l( 质 粒体积 不要超过感受态体积的1 0 %) ， 轻轻旋转棍匀; 2 . 冰上放置3 0 m i n ; 3 . 4 2 水浴中热激9 0 s e e ( 不要摇动离心管) ， 快速转移到冰浴中， 冷却1 - 2 m m ; 4 . 加3 7预 热的 培养基8 0 0 p l ，然后将离心管转移到3 7 摇床上 ( 可温 和 地 摇 动以 提 高 转 化 效 率， 但 不 要 超 过2 2 5 rp m ) , 温 育4 5 m i n ; 5 . 每l b 平 板 上( 含1 0 0 g g / m l 氨 节 青 霉 素， a m p ) 涂布2 0 m g / m l x - g a l 4 0 g l 和1 m i p t g 4 p l , 3 7 c 温育6 0 m i n 以 上; 6 . 吸取适量 转化液1 0 03 0 0 a l 涂布在3 7 预热的上述l b 平板上， 室温放 置 至液体被完全吸收; 7 . 3 7 0 c 倒置培养 1 21 6 h o . 质粒d n a的碱提取法 1挑 一 单 菌 落 于3 m l l b 液 体 培 养 液( 含1 0 0 p g / m l 氨 节 青 霉 素， a m p ) 中 ， 3 7 ， 2 0 0 rp m摇 培 过 夜 : 2 . 次 日 冰 浴 冷却 菌 体， 1 2 0 0 0 rp m ， 离 心1 m i n 收 菌 。 吸 去 培 养 液， 真空 抽 干; 3 .重悬于1 0 0 g l 冰预冷的 溶液 i 中， 剧烈振荡; 首都师范大学硕士学位论文 溶液 i : 5 0 m m o l / l葡萄糖 2 5 m mo l / l t ri s - h c i ( p h 8 .0 ) 1 0 m m o l/ l e d t a ( p h 8 . 0 ) 4 加2 0 0 p l 新 配 制 的 溶 液i i ， 快 速 颠 倒 离 心 管5 次( 不 要 振 荡) ， 将离 心 管 置于冰上: 溶液 i i , 0 . 2 m o l / l n a o h ( 临 用前 用 1 0 m o l / l贮存液稀释) 1 % s ds 5 . 加1 5 0 p l 冰 预 冷的 溶 液 i ii ， 盖 紧 管口 ， 温 和振 荡1 0 s e c ， 使 溶 液ii i 分 散 均匀，之后置于冰上3 - 5 m i n ; 溶液i i i :乙酸钾 6 0 m l 5 m 冰乙酸1 1 . 5 m l 水2 8 . 5 n 止 6 . 4 *c , 1 2 0 0 0 r p m离 心5 m in ， 转 移 上 清于 另 一 只 离 心 管中 ; 7 . 加 等 体 积 酚 / 氯 仿 抽 提 一 次 。 4 、 1 2 0 0 0 r p m离 心5 m in ; 8 .用2 倍体积的 无水乙 醇沉淀双链d n a ,振荡混匀，室温静置2 m i n ; 9 . 1 2 0 0 0 rp m 、 4 离 心5 m in ; 1 0 .小心吸去上清， 将管倒置在纸巾 上，除去乙 醇干燥d n a ; 1 1 ， 用 1 m l 7 0 %乙 醇于4 洗涤双链d n a ，除上清，空气中干燥 1 0 m i n ; 1 2 . 用5 0 p l t e ( 含 无d n a 酶 的 胰r n a s e )重悬 ， 打 匀， -2 0 贮 存 。 2 .2 . 1 .2 . 2重组载体的构建 用1 % 琼 脂 糖凝 胶电 泳 ， 试 剂 盒回 收p c r 产物 中 约6 0 0 b y 的d n a 片段 后 ， 进行加a反应， 与p g m- t 载体连接， 直接转化大肠杆菌d h s 。 细胞， 在 铺有l b 培 养 基 ( 含 氨节 青 霉 素1 0 0 g g /m l ) 的 平 板 上 培 养1 6 h 。 挑取 白 色单 菌 落 提 取 质 粒酶切鉴定，并送公司测序。 将筛选的正确基因通过内 切酶b a m h l 和h i n r 1 i i i 双 酶 切， 然后 与 同 样 双 酶 切 的 表 达 载 体p t r c h i s c 连 接， 转 化 大 肠 杆 菌d h s 。 细 胞 ， 挑取单菌落提取质粒酶切鉴定。 载体构建图示如下: 首都师范大学硕士学位论文 图1 1重组质 粒p g m - t 十 t t d b 和p t r c h i s c - t t d b的构建图 2 .2 . 1 .3 i p t g诱导表达融 合蛋白 将 构 建 好的 上 述重 组 表 达 质 粒p t r c h is c - t td b 转 化 大 肠 杆菌b l 2 1 细胞 ， 培 养1 6 h 后， 接 种 单 菌 落 于2 m l l b 培 养 液( 含 氨 节 青 霉 素1 0 0 g g /m l ) 中 ， 3 0 摇床培养过夜。 次日 用新鲜的l b培养液 稀释至 1 0 0 倍，3 0 剧烈摇菌培养至 o d 6 0 0 达。 . 4 - 0 . 6 ， 然后升温到3 7 加入i p t g ( 终浓度0 . 8 m m o l / l ) 诱导表达4 h e 取 1 0 0 p l 菌液7 0 0 0 r p m离心4 m i n , s d s - p a g e 进行表 达水平分析。 另取1 m l 菌液7 0 0 0 r p m离心4 m i n ， 菌体悬浮于1 0 0 p l 裂解液( 溶菌酶1 0 0 p g / m l , t r i s - h c 1 p h 8 .0 5 0 m m o l / l , e d t a 2 m m o l / l ) 混匀， 3 0 0c 裂解1 5 m i n ; 1 2 0 0 0 r p m离心2 0 m in ， 收集沉淀和上清，分别 进行s d s - p a g e 分析。 2 . 2 . 1 . 4金属鳌合亲和层析技术( i m a c ) 纯化融合蛋白 取以 上 述 条 件 大 量 培 养 并 诱 导 的 菌 液3 0 m l , 4 0c . 7 0 0 0 r p m 离心2 0 m in , 菌体 用 p b s 和d d h 2 0各 洗一 遍， 用t a l o n固 定化金属亲和树脂以 变性方法纯 化目 的蛋白 5 4 1 首都师范大学硕士学位论文 具体步骤如下: 1 ) 将上述洗涤后的菌体沉淀溶于 3 m l , 变性 e x t r a c t i o n / w a s h缓冲液 ( 5 0 m m o l / l n a h z p o 4 , 1 m o l / l n a c 1 , 6 m o l/ l 盐酸肌, p h 7 . 0 ) 中，混 匀至透明状。 4 、 1 0 0 0 01 2 0 0 0 rp m离 心2 0 m in ， 弃 沉 淀， 上 清 作 为 待 纯 化 样品 . 2 ) 用上述变性 e x t r a c t i o n / wa s h缓冲液平衡加有金属亲和层析树脂的 t a l o n 柱 三 次 。 7 0 0 r p m离 心2 m in ， 去 上 清。 重复 该步 骤 两 次 。 3 ) 加入待纯化 样品1 m l . 浸润 树脂3 0 s e c 后， 温和颠倒柱子5 m i n ， 使日 的 蛋白 与 树 脂充 分 结 合。 7 0 0 r p m离 心2 m in ， 弃 上 清。 如 果 样 品 较 多， 可 多 次 重复该步 骤。 4 ) 用上述变性 e x t r a c t i o n / w a s h缓冲液冲洗柱子 3 次，以 洗去未结合的杂蛋 白。 7 0 0 r p m离心2 m i n ， 弃上清. 5 ) 加4 0 06 0 0 m l , 含眯哇基的e l u t i o n缓冲液洗脱目 的蛋白。重复该步骤一 次。 6 ) 将收 集的蛋白 装入透析袋内， 在8 m o u l 尿素溶液中 透析过夜，以除去蛋 白中的盐酸肌。 7 ) 取少 量进行s d s - p a g e电 泳分析， 检测蛋白 纯度。 2 . 2 . 1 . 5蛋白 质浓度的 测定 用b r a d f o r d 法测定蛋白 质 浓度。 具体步骤 如下: 1 . 用5 0 m m o l/ l t r is - c i( p h 7 .6 ) 缓 冲 液 将1 0 0 0 p g / m l的 溶 菌 酶 ( ly s o z y m e ) 稀释成一系列浓度的标准品 ( 单位:g g / m l ) : 2 0 0 , 1 5 0 , 8 0 , 5 0 , 0 ( # 0 ,# 1 . . . . .# 5 ) 。 并 以 纯 化的t td b 做 为 未 知 浓 度 的 样 本 ( a , b , c ) e 2 . 取5 p l 标准品( # 0 , # 1 . . ， 二 # 5 ) 或未知浓 度样本( a , b , c ) 于%孔微量滴 定槽中。重复两次加入。 3 . 每 槽 再 加1 0 0 p l 考 马 斯 亮 蓝 染 色 液g -2 5 0 ( c o o m a s s i e b l u e d y e g - 2 5 0 , c s g ) 。 在 全 部 样 本槽 加 完 前 ， 不 要中 断 添 加; 整 个 操 作时 间 不 要 拖 太 久，同时小心避免气泡产生。 4染料因密 度较大，很容易沉积在下方。轻拍滴定盘的一侧， 使添加的各 成份均匀混合。若仍有气泡，小心用大头针刺破。 5 . 室温 静置1 0 m i n。 首都师范大学硕士学位论文 6 . 以g e n i o s 酶标仪测5 9 5 r u n吸光值 。 7 . 作图画出 标准曲 线， 并计算未知样本浓度。 2 . 2 . 1 . 6包涵体的复 性 将 变性纯化的目 的蛋白 浓度调至0 . 3 - 0 .5 m g / m l ,随后 装入透析袋中， 连续 用6 m m o l / l 尿素 复性液 ( 5 0 m m o l/ l t r i s - h c i , l m m o l / l e d t a , 1 m m o l / l g s s g , l m m o l / l g s h , 0 . 4 m o l / l l - a r g , 6 m m o l / l 尿素 ， p h 8 .2 ) ; 3 m m o l / l 尿素复性液 ( 5 0 mm o l / l t r i s - h c i , l m mo u l e d t a , 1 m m o l几 g s s q1 m mo l / l g s h , 0 . 4 mo v l l - a r g , 3 m m o v l尿素， p h 8 .2 ) ; 2 m m o l / l尿素复性液 ( 5 0 m m o l / l t r i s - h c i , l m m o l / l e d t a , 1 m m o l / l g s s q1 m m o l / l g s h , 0 . 4 m o l / l l - a r g , 2 m m o l / l 尿素,p h 8 . 2 ) ; 1 m m o l/ l尿素复性液 ( 5 0 m m o l / l t r i s - h c i , l m m o l / l e d t a , l m m o l/ l g s s qi m m o l / l g s h , 0 . 4 m o l / l l - a r g , i m m o l / l 尿素， p h 8 . 2 ) ; 0 . 1 m m o v l 尿素复 性液 ( 5 0 m m o l / l t r i s - h c i , l m m o l/ l e d t a , 1 m m o l/ l g s s c t 1 m m o l / l g s h , 0 . 4 m o l/ l l - a r g , o . l m m o n 尿素， p h 8 .2 ) :无尿素复性液 ( 5 0 m m o l / l t r i s - 14 0, 1 m m o l/l e d t a , 1 m m o l/ l g s s g , 1 m m o l/l g s h ,0 .4 m o l/ l l - a r g ,p h 8 .2 ) 分 步 透 析， 每步复 性2 4 h . 2 . 2 . 1 . 7野生型融合t t d b与溶菌酶 ( y y o z y m e )的体 外热变性交联 以 溶菌酶 ( l y s o z y m e ) 、 野生型t t d b 及两 者的棍 合物为实验样品， 分别在同 样的 氧 化还 原 反 应 体 系 ( 2 5 m m o l/l t r is - h c i p h 7 .6 ,2 .0 m m o l/ l g s h , 1 .0 m m o l/ l g s s g s 1 . 0 m m o l / l e d t a ) 及各自 变性的临界 温度( t m ) ( l y s o z y m e 7 5 0c , t t d b 7 5 ) 中反 应3 0 m i n . s d s - p a g e凝胶电泳分析。 2 .2 .2突变 型t t d b 基因的克 隆、目 的 蛋白的 获得及体 外蛋白交联实验 2 .2 .2 . 1 p c r定