（环境工程专业论文）米根霉利用鱼粉废水和淀粉废水直接发酵产l乳酸的研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 本研究以米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) a s3 2 5 4 为主要菌株，考察了菌株同时利用鱼 粉废水和淀粉废水直接发酵产乳酸的过程参数影响，探讨了实现这两类废水的循环利用 及低成本生产乳酸的新途径。 研究中先以鱼粉废水和淀粉作为培养基，考察了鱼粉废水浓度、淀粉量、p h 、菌种 形态对菌株产乳酸的影响。通过正交实验设计优化了培养基组分、接菌量和c a c 0 3 投加 量，利用方差分析( an 旧a ) 评价了各因素对乳酸产量的影响效果。结果表明：淀粉 作为碳源是最主要的影响因素，其次是p h 值，然后是鱼粉废水和接菌量。培养基组分最 佳浓度为：淀粉1 2 0g l ，鱼粉废水4 0 0 0m gc o d l ：最佳c a c 0 3 浓度和接菌量分别为2 0 g i 痢3 。 按照最佳培养基的浓度配比，淀粉废水浓缩3 倍。米根霉对淀粉废水和鱼粉废水直 接进行发酵，经过7 2h 发酵，乳酸产量达7 6 0g l ，生物量为5 3g l ，c o d 去除率达9 5 以上。废水发酵2 4h 时，脱氮率己达到最高7 2 7 。 关键词：乳酸；米根霉；鱼粉废水；淀粉废水；正交实验 d i r e c tf e r m e n t a t i o no ff i s h m e a lw a s t e w a t e ra n ds t a r c hw a s t e w a t e rt o l - l a c t i ca c i db yr h z o p u so r y z a e a b s t r ac t f i s h m e a lw a s t e w a t e r ( f w w ) a n ds t a r c hw a s t e w a t e r ( s w w ) ，w i t h o u ta d d i t i o n a ln u t r i e n t s ， w e r ei n v e s t i g a t e df o rt h ed i r e c tl a c t i ca c i dp r o d u c t i o nu s i n gr h i z o p u so r y a z ea s3 2 5 4 n e a i mw a st of i n do u tc _ h e a p e rr a wm a t e r i a l sf o rl a c t i ca c i dp r o d u c t i o na sw e l la st or e u s et h e f o o dw a s t e w a t e rr e s o u r c e s t h ei n v e s t i g a t i o nf i r s t l yf o c u s e do nt h ee f f e c to fc o n c e n t r a t i o no ff f wa n ds t a r c h ，i n i t i a l p h ，f u n g a lm o r p h o l o g yo nl a c t i ca c i dp r o d u c t i o n a l s o ，t h em e d i u mc o m p o n e n ta n d l e v e l so f i n o c u h ma n dc a c 0 3w e r ei n v e s t i g a t e db ye m p l o y i n gt h eo r t h o g o n a ld e s i g nw h i l et h ea c t u a l f a c t o r sa f f e c t i n gt h ep r o d u c t i o no fl - l a c t i ca c i dw e r ee v a l u a t e db ya n o v 八t h er e s u l t s i n d i c a t es t a r c ha sc a r b o ns o u r c ew a st h ep r i m a r yi n f l u e n c ef a c t o ro nl - l a c t i ca c i dp r o d u c t i o n ， f o l l o w e db yp h f i s h m e a lw a s t e w a t e ra n di n o c u l u m t h eo p t i m a ld o s e sf o rs t a r c h ，c a c 0 3 ， f i s h m e a lw a s t e w a t e ra n di n o c u l u ml e v e lw e r e1 2 0g 化2 0g k4 0 0 0m gc o d la n d3 ， r e s p e c t i v e l y b a s e do nt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u m ，f i s h m e a lw a s t e w a t e ra n dc o n c e n t r a t e ds t a r c h w a s t e w a t e rw e r ed i r e c t l yf e r m e n t e db yr h i z o p u so r y z a ea s3 2 5 4f o rl - l a c t i c a c i d p r o d u c t i o n t h eh i g h e s tl a c t i ca c i dp r o d u c t i o no f7 6 0g lw a sa c h i e v e dw i t h 5 3g lf u n g a l b i o m a s sa tf e r m e n t a t i o nt i m eo f7 2hw h i l er e m o v a lo fc o dr e a c h e da r o u n d9 5 n i t r o g e no f w a s t e w a t e rh a db e e nr e m o v e d7 2 7 b v 融i z o p u so r y z a ea s3 2 5 4a tf e r m e n t a t i o nt i m eo f2 4 h k e yw o r d s ：l a c t i ca c i d ；r h i z o p u so r y z a e ；f i s h m e a lw a s t e w a t e r ；s t a r c h w a s t e w a t e r ； o r t h o g o n a ld e s i g n 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：越瘩翻团蚴趣鲤蕴物匠数盏撬筮磋兰量二鱼熊亟猛乞 作者签名：造盏矗日期_ 塑堕年! 生月丛日 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目：盔翅盈缢邀毖遮塑速燃醢隧量蠢丝丝通拯携 作者签名：堕昌矗 日期： 趁五年卫月尘日 导师签名： 盔汤碑 日期：丝年坐月j ! 日 大连理工大学硕士学位论文 引言 乳酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等领域，尤其l 乳酸是合 成可降解塑料聚乳酸的重要原料。目前，乳酸是需求量仅次于柠檬酸的第二大有机酸， 并有逐年扩大的趋势。然而，乳酸的生产成本却一直居高不下，寻求廉价的原料作为生 产底物是十分必要的，因为底物成本是主要操作费用之一，占总生产消耗的3 0 - 4 0 。 乳酸的生产方法有很多，化学合成法因其原料( 乙醛和氢氰酸) 具有毒性而受限制； 细菌发酵可以生产大量乳酸，但是常因消旋作用得到d l 乳酸，纯度低；根霉菌属发酵 尤其米根霉可以得到光学纯度很高的l 哥l 酸，对实际生产更有意义。 食品废水因含有丰富的碳源、氮源和微量元素，是理想的生物资源化原料，鱼粉废 水和淀粉废水就是食品加工废水中典型的两类。本研究就是把鱼粉废水作为氮源、淀粉 废水作为碳源，利用米根霉对其进行发酵生产乳酸，同时达到淀粉废水和鱼粉废水的污 染减负。 米根霉利用鱼粉废水和淀粉废水直接发酵产l 晋l 酸的研究 1研究背景 乳酸是三大有机酸之一，是一种重要的化工原料。尤其l 乳酸对人体无毒副作用， 且易吸收，可直接参与体内代谢，同时它又是合成聚乳酸的原料。因此被广泛的应用于 食品工业、化工行业和酿造工业中【1 ，2 1 。 由于乳酸有广泛的应用领域，其需求量位居第二，仅次于柠檬酸，并有逐年扩大的 趋势。但是其生产成本仍居高不下，所以寻求一种新的低成本乳酸生产方式迫在眉睫。 1 1 乳酸的性质、结构及应用 1 1 1 乳酸的性质和结构 乳酸( 1 a c t i ca c i d ) ，又名a 羟基丙酸( a h y d r o x y p r o p a n o i ca c i d ) ，分子式为c 3 h 6 0 3 ，是 一种天然存在的有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。乳酸分子中有一个 不对称碳原子，因此具有旋光性。l 哥l 酸为右旋性，d 乳酸为左旋性，d l 乳酸为消旋 性，其结构式见图1 1 【3 】。 黼c h 3 h l ( + ) - 乳酸 h 3 醛h d ( _ ) 一乳酸 图1 i 乳酸结构式 f i g 1 1s t r u c t u r eo f l a c t i ca c i d 表1 1 乳酸异构体的理化性质 t a b 1 1p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fl a c t i ca c i di s o m e r s 乳酸异构体的理化性质如表1 1 所示【4 1 。乳酸不仅有多个功能基团，而且这些基团有 很好的相互协同作用。乳酸是具有光学活性的最小分子之一，人们不仅可以生产l ( + ) 乳酸、d ( + ) 乳酸或d l 一乳酸，而且这些构型不同的乳酸又可以形成化学及物理性质很不 相同的聚合物及其他衍生物。乳酸不仅可用化学法合成制得，更重要的是能用可再生资 大连理工大学硕士学位论文 源( 葡萄糖、淀粉、粮食、纤维素、工农业及民用废物等) 由发酵法进行大规模生产，而 且微生物发酵法生产乳酸，因其原料来源广泛、生产成本低、产品光学纯度高、安全性 高等优点而成为生产乳酸的重要方法。因此乳酸已被国内外公认是一个绿色平台化学 品，其需求量在几十万吨乃至几百万吨【5 】。 1 1 2 乳酸的应用 乳酸是三大有机酸之一，是一种重要的化工原料，广泛应用于食品、医药、化工、 纺织和农业等领域 6 1 。由于人体和动物体只含有l 乳酸脱氢酶，因此，只能利用自身产 生或摄入的l 乳酸。l 哥l 酸是哺乳动物体内正常代谢产物，在体内分解为氨基酸和二羧 酸物。经机体实验证明：d l 乳酸可以使肝糖增高，d 乳酸使血中乳酸盐增高。因而， 过量食用d l 乳酸和d 乳酸，会导致血中富含d 乳酸，使尿中酸度过高，引起代谢紊 乱而致病。所以在食品、酿造及医药行业中应使用l 哥l 酸，而在其它行业中对乳酸的构 型则不加限制。 酿造工业中，加入乳酸可以作为灭菌剂能防止杂菌繁殖，促进酵母菌发育，防止酒 混浊，提高啤酒品级，并延长保质期【7 1 。在医药领域，l 乳酸可直接配制成药物或制成 乳酸盐使用f 羽。l 乳酸、l 乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等复合配制成输液，可治疗酸中毒 及高钾血症。l 哥l 酸铁、l 乳酸钠、l 乳酸钙均是补充金属元素的良好药品。l 哥l 酸酯 在制药业中作压制药体的润滑剂，还可以用于制备降压类药物【9 】。在化学领域中，l - - 孚l 酸是合成聚乳酸的原料，聚乳酸无毒，具有良好的生物兼容性且可生物降解，它易被自 然界中的各种微生物或动植物体内的酶分解，最终形成二氧化碳和水，因而被认为是最 有前途的可生物降解高分子材料。聚乳酸有望在不久的将来代替p v c 、p p 等不可降解 塑料，以消除“白色污染”所造成的环境危机【l 0 1 。 1 2 米根霉乳酸发酵的研究进展 自然界中可产生乳酸的微生物很多，比如乳酸茵、肠球菌、霉菌、芽孢杆菌等。但 产酸能力强、可以应用到工业上的只有霉菌中的根霉属( r h i z o p u s ) 和细菌中的乳酸菌类 【】。根霉营养要求简单，根霉菌菌丝体比细菌大，易于分离，有利于制得高质量的乳酸 产品。尤其是根霉属发酵可得到光学纯度很高的l ( + ) 哥l 酸，易于精制，有利于工业化生 产高纯度的l 乳酸，这对进一步生产乳酸聚合物极为重要。相对于乳酸菌发酵乳酸常因 消旋作用而得至i j d l 乳酸，根霉菌属成为国内外广泛采用发酵生产的菌种【5 j 。 1 2 1 米根霉 米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) 是根霉属中的一种，匍匐菌丝弧形、无色，向四周蔓延。掩 米根霉利用伯粉废水和淀粉废水直接发酵产l 乳酸的研究 子囊刚出现时黄白色，成熟后变成黑色。菌落初期为白色，老熟后灰褐色或黑色( 如图 12 ) 。 米根霉好氧发酵生产乳酸具有所用底物粗糙、营养需求简单、产物构型专一等优点 ”“。当前，寻找廉价原料以降低乳酸生产成本是人们关注的热点之一，这些原料主要 自玉米、土豆、菠萝、甘蔗、淀粉等农业n t - 废弃物及食品, 自1 2 - 废水i 】”j 。米根霉生产 乳酸不仅能解决大量塑料造成的环境污染问题，而且能充分利用废弁的资源，对于农副 产品深加工及环境保护都具有重要的意义。 圈l2 米根霉形态 f i 9 1 2 m o r p h o l o 目v o f r h i z o p u so r y z a e 1 2 2 米根霉发酵代谢途径 米根霉发酵代谢途径示意( 见图12 ) ，w r i g h t 等【l ”通过”c 放射性同位素标记的 方法确定了米根霉体内的代谢剐络，j “c 标记葡萄糖和醋酸盐，来估计代谢的最终产 物和糖的利用率，并通过t f l u x 程序分析所得到的数据，程序分析得到的结果和实际 线粒体及细胞质中的产物如丙酮酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐是一致的，从而确定了米 根霉的代谢模型。它是经e m p 途径生成丙酮酸，然后丙酮酸分成两个支路，一部分丙 酮酸进入线粒体中进行t c a 循环，而另一部分存在于细胞质内的丙酮酸在乳酸脱氢酶、 内酮酸脱羧酶和丙酮酸羧化酶的催化下分别生成乳酸、乙醇、苹果酸和富马酸。依据形 成产物情况，该发酵也属十混合酸发酵类型 目前普遍认为，在米根霉的糖分解代谢过程中，主要包括e m p 途径和t c a 途径， 并没有磷酸戊糖途径。在米根霉细胞内存在两个独立调控的丙酮酸库：( ”基质丙酮酸 库，丙酮酸可以进入乙醇、乳酸、草酰乙陵、节果酸和富马酸合成途径；( 2 ) 线粒体丙 酮酸库，丙酮酸进入t c a 循环。随着外界条件的扰动，米根霉的代谢机制也发牛着变 化，如葡萄糖浓度增大时，e m p 选径和进入乳酸合成逢往的通量都相应增大。 大连理工大学硕士学位论文 蹦p 上b 啪h 瞰p 丫孓眦一刚 a id 眦_ 刚 土 1 2 3 米根霉产乳酸的发酵底物 由于米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) 好氧发酵生产乳酸具有所用底物粗糙、营养需求简单、 产物构型专一等优点f 1 2 】，所以米根霉的发酵底物原料来源广泛，既可以是葡萄糖这类 的单糖物质，也可以是淀粉、纤维素等多糖类物质。 在多数情况下，葡萄糖是米根霉发酵产乳酸的首选碳源，其次是淀粉和纤维素类物 质。由于底物成本是发酵生产的主要运行费用之一，占总生产成3 0 4 0 【1 8 1 ，所以廉价易 得的淀粉和纤维素类物质是当前被确认为乳酸生产中最符合成本效益的碳源。 淀粉是一种多糖，主要存在于土豆和木薯的块茎以及种子和谷物( 如小麦、玉米和 大米) 中。y u 和h a l l g 等f 1 9 】用米根霉n 砌也3 9 5 直接对大麦、木薯、玉米、燕麦和大米进 行了发酵产乳酸的研究。同样，马铃薯浆液和马铃薯淀粉废弃物也可作为底物被米根霉 2 0 , 2 1 】和少根根霉【2 2 , 2 3 1 发酵生产乳酸。研究中，玉米淀粉在发酵前大多要用酶先进行水解 2 4 2 6 】。s a i t o 等【2 7 】发现，果胶酶不仅可以增加淀粉的生物利用性，还能改变代谢物的生成， 如乳酸和乙醇等物质。 目前，纤维素类物质作为底物用米根霉发酵生产乳酸的研究也很多。w o i c i e c h o w s k i 等【2 8 】在湿度为5 0 时，把0 5 硫酸浸泡的木头碎屑放入到喷枪中，2 0 5 0 c 蒸汽处理5m i n 后，将其送入到减压的旋风分离机中，膨胀爆破，水解提取，得到还原糖作为发酵底物。 在起始底物浓度为7 5g l ，c n b t 为5 5 时，发酵1 2 0h ，可以得到乳酸最大产量1 9 1 3g l 。 米根霉利用鱼粉废水和淀粉废水直接发酵产l 哥l 酸的研究 p a r k 等【2 9 j 用纤维素酶水解办公室废纸，分批发酵的乳酸产量为4 9 1g l ，得率0 5 9g g 。 金滨峰等【3 0 】采用废弃的玉米芯作为原料，分别用硫酸和纤维素酶这两种方式水解玉米 芯，得到的葡萄糖作为底物用米根霉对其发酵，得到乳酸产量为2 7g l 。 1 2 4 废弃物质作米根霉发酵底物的前处理 米根霉利用可再生资源或有机废物进行乳酸发酵时，需要对原料进行预处理。将原 料中含有的纤维素或淀粉等多糖类物质转化为乳酸发酵所需的单糖( 主要为葡萄糖) 。 废弃物做原料需要先进行粉碎，然后经水解将淀粉、纤维素等大分子液化后或直接 转化为葡萄糖。水解通常可以采用2 种方式：酸解和酶解。酸解指原料在硫酸、盐酸的 强酸作用下水解为葡萄糖，可以在常温也可以在高温高压下进行。酶解则是指在胞外水 解酶的催化作用下，原料中的淀粉、纤维素物质被水解为葡萄糖。对纤维素基质而言， 一般利用纤维素水解酶直接进行糖化，转化为葡萄糖。对于淀粉基质，水解通常分为2 步：第1 步为液化，即利用a 淀粉酶，将淀粉分子中的0 【1 ，4 糖苷键断开，转化为可溶性 淀粉即糊精；第2 步是糖化，即糊精在葡萄糖淀粉酶作用下转化为葡萄糖。影响酶解效 果的主要参数有温度、p h 值、反应时间、原料经磨碎后的颗粒粒度等。 r i c h t e r 等1 3 l 】人以黑麦淀粉为原料进行酶解研究，发现在温度8 0o c ，p h = 6 0 ，颗粒平 均粒度2f i l m 时，淀粉的液化度可达n 9 9 6 2 ；在温度5 0o c ，p h = 4 5 ，反应时间为2h 时，可溶化淀粉的糖化度可达到9 4 4 6 。 白冬梅等【3 2 】研究了以q 淀粉酶为主的、多种酶配合作用的玉米粉无蒸煮乳酸发酵发 酵工艺。在玉米粉乳中，添加a 淀粉酶8u g 干淀粉，纤维素酶5u g 原料，酸性蛋白酶2u g 原料，脂肪酶1u g 原料可以提高米根霉r 1 0 2 1 的糖化作用，经过4 4h 的发酵，发酵罐中 产l 乳酸7 1 6 5g l ，总糖由10 5 4 5g l 降至1 0 5g l ，淀粉利用率可达9 9 ，达到并超过 了高温蒸煮乳酸发酵的水平。 1 2 5 米根霉发酵工艺 迄今为止，工业上米根霉发酵生产l 乳酸工艺多采用通风搅拌式发酵法，这是一种 传统的培养方式，即一次投料一次放罐，米根霉的批式发酵要注意控制温度、p n 值、 溶解氧、培养基成分及浓度等。发酵过程中所产生的乳酸使发酵液p h 逐渐降低，导致 对菌体生长和乳酸形成的抑制。为此不得不采取加入c a c 0 3 的办法中和生产的乳酸。 c a c 0 3 在发酵过程中起着重要作用，因为c a 2 + 不仅对菌体的生长发育有重要的促进作 用，并且在菌体形态控制方面发挥着重要作用；另外，乳酸钠和乳酸铵可以作为最终产 物被直接利用，所以为了便于乳酸分离的提取和消除大量碳酸钙造成的严重污染，对发 酵过程工艺改进是必要的。 大连理工大学硕士学位论文 为了提高乳酸生产率，改进分离过程，近年来围绕乳酸生产各个单元过程发展了许 多技术：采用半间歇或连续操作改进生产率，采用固定化技术或细胞循环反应器得到高 浓度细胞提高产量，采用发酵一分离耦合的萃取发酵技术1 3 3 1 。 天津大学孙彦等【3 4 】采用聚氨酯泡沫法固定化米根霉发酵生产l 哥l 酸速率提高了3 倍，固定化方法简单易行，所制得的细胞稳定性强，容易扩大生产；h a n g 等【3 5 j 和h a m a m c i 等【3 6 1 分别对海藻酸钠固定化米根霉生产乳酸进行了研究；t a m a d a 掣了7 j 将米根霉细胞固 定化到聚二甲基丙烯酸乙二醇酯为单体用丫射线诱导得到高分子载体上，固定化后的乳 酸得率大6 5 ，比产酸速率比游离菌高1 8 倍。 y m 等阱】在气升式发酵罐内米根霉发酵有玉米淀粉直接生产l 乳酸，得到乳酸质量 浓度为1 0 2g l 得率为8 5 。乳酸发酵过程中产物乳酸对菌体生长和产酸产生抑制作用， 影响了产物浓度的提高。 1 2 6 米根霉菌体形态对乳酸发酵的影响 在米根霉乳酸发酵过程中，菌体表现出很复杂的形态，主要有分散菌丝体、小球态、 絮状体和较大块的聚结物等【3 8 】。菌体的形态影响着发酵液的流变学特性和反应器的质量 传递效能，对乳酸的生成和糖的消耗速率以及糖的转化率有重要的影响作用。 p a z o u k i 3 9 】指出，培养基的组成和浓度、接种量、和通气等因素对真菌的形态有影 响作用。由于在米根霉发酵过程中，影响菌体形态的因素较复杂，且不同的操作条件下， 影响米根霉菌体形态在变化，而且它们在主次关系也是不同的，所以到现在还没有一个 具体的控制米根霉菌体形态的方案。 g e r i n 等【4 0 】提出在发酵罐中由于丝状真菌的生长特性造成菌体的形态主要为菌球或 高粘稠的悬浮菌丝体。分散菌丝体导致发酵液的粘度增加，且流动为假塑性，这就降低 了发酵液的气液传质系数，使发酵过程不均一。p r i t 【4 l 】指出，当菌球的直径增加时，在 菌球的内部营养条件的供给受到限制，菌体生长仅局限于菌球的表面，因而传质过程和 菌球的内部的生长成为发酵过程的限制条件。由于在好氧微生物培养中氧的供给是非常 重要的影响条件之一，所以小球态的菌对氧供给的影响方面进行了较多的研究，e l e a z a r 【4 2 】通过建立数学模型在拟和菌丝球内部氧传递动力学过程，得到菌球的直径的大小影响 着氧在菌丝球内的传递。 l i a o 等 4 3 , 4 4 】研究中表明对大多数真菌微生物而言，球形颗粒态的菌体可以有效地提 高发酵效果。对米根霉的球形菌体形成有重要影响的因素为接菌量及底物中作为碳源的 p d b 、大豆蛋白胨、碳酸钙和金属离子等。其中金属离子起着显著的负面影响，大豆蛋 白胨对球形菌体的形成起积极作用。此外，在培养过程中p d b 和碳酸钙有利于米根霉 形成表面平滑的小颗粒菌体。接菌量在小于1 5 1 0 9 孢子l 时，对球形菌体的形成没有 米根霉利用鱼粉废水和淀粉废水直接发酵产l 哥l 酸的研究 明显影响。用球形颗粒态的米根霉a t t c 2 0 3 4 4 发酵生产乳酸，发酵3 0h 后乳酸量达到 6 5 0g m 。 总之，菌体形态对发酵过程的影响是很大的，在真菌菌体形态的影响因素和控制方 法方面的研究需要进一步加深。 1 3 鱼粉废水 1 3 1 鱼粉废水的来源与分布 鱼粉是饲料工业特别是水产饲料中重要的动物性蛋白质原料。随着饲料工业的飞速 发展，全球对鱼粉的需求量日益增长。目前，国际鱼粉市场主要供应地主要是南美的秘 鲁和智利4 5 1 。我国是世界最大的鱼粉消费国内，年消费量约1 3 0 万吨左右【蛔。现在鱼粉 加工废水污染问题越来越严重，已引起鱼粉加工企业当地政府与环保部门的重视，并开 始限期治理【4 。 1 3 2 鱼粉废水的特征 鱼粉废水具有较高的温度，呈棕黄色粘稠状、有腥臭味、无毒【4 引。废水中含有悬浮 物( 鱼粉) 、蛋白质及鱼油等物质，水中固体物质含量约占2 3 ，蛋白质含量约占2 0 。 废水c o d 含量高，约占3 0 0 0 0m g l 。废水中富含大量n 、p 及无机盐离子，排放量大。 1 3 3 鱼粉废水的传统处理方式 目前，鱼粉废水主要有以下几种处理方式：通过过滤( 超滤法和纳滤法等) 的方法 进行处理废水、通过厌氧方法处理以及利用电解法处理鱼粉废水等等。 l i n 等【4 9 】选用分子切割量( m w c o ) 为3 0 0 0 0 的膜对鱼粉废水进行超滤，超滤过程中的 压力为3 0p a ，将溶液经过不断的循环过滤直到溶液体积减小到原来的2 0 2 5 ，然后进 行冷冻干燥。但在超滤过程中，随着时间的延长，膜表面会沉积很多污垢，致使流量减 小。如果对溶液进行前处理，或在膜表面加固定水解酶可能会使这种现象得到改善。 a f o n s o 掣4 8 】对位于塔尔卡瓦诺( 智利中部港市) 一家鱼粉厂家的废水进行了研究， 首先对操作条件进行了优化，条件为横跨膜压为5b a r ，流速为4n g s ，温度为室温，p h 自然。并通过微滤法对废水进行预处理，然后用多管道陶瓷膜( m w c o = 1k d a ) ，进行 纳米过滤实验，结果表明纳米过滤是一个有效而且环保的技术，但是此方法的缺点是膜 污染比较严重。 d r i v s h o l m 等【5 0 】利用厌氧池硝化法处理鱼粉废水，c o d 去除率达8 0 ；厌氧处理后 的废水，其出水中仍有较高的c o d 残留，进一步的硝化处理效果也不理想1 5 。利用厌氧 硝化池对鱼粉废水进行处理，必须先对鱼粉废水进行稀释，以降低废水的c o d 值，蛋白 大连理工大学硕士学位论文 质值和盐度。另外，厌氧硝化本身要求进水的c o d 值较低，所以处理效率较低。 a s p 6 等【5 2 】利用海底沉积物和猪粪作为菌种，对鱼粉废水进行了厌氧生物处理，认为 直接接种海底沉积物作为菌种，对鱼粉废水进行了厌氧生物处理是可行的。处理废水中 产沼菌和硫还原菌比例较高，为0 0 0 2 5 ，在直接接种猪粪运转l o 天后，甲烷化作用完全 消失。 1 3 4 鱼粉废水资源化利用 鱼粉废水中富含大量的营养物质，另外，蛋白质、鱼油这些高经济价值物质未经回 收利用也是一种巨大的浪费【5 引。 如何把这些废弃的营养物质转化为可利用的新资源，成为研究的热点。当前对利用 鱼粉废水生产高附加值产品、微生物絮凝剂、动物诱食剂、乳酸等研究已经有文献报道。 于锋等【5 4 j 对鱼粉废水蛋白干物质回收和废水厌氧发酵生产沼气的一、二级处理工艺 进行了研究，探讨了蛋白干物质回收的最佳条件、沼气产气率和c o d 去除率的影响因素。 结果表明：鱼粉废水一级处理可回收3 4 蛋白干物质，回收率为3 0 。鱼粉废水二级 处理的沼气产气率o 3 8m 3 k gc o d ，c o d 去除率8 6 。研究取得了理想的处理效果，为 开发鱼粉废水处理技术，提高鱼粉生产经济效益，解决环境污染问题做了有益探索。另 外，由于鱼粉废水中含有大量的蛋白质，通过水解的方法可以得到氨基酸，付晚涛等【5 副 通过盐酸水解经过蒸发鱼粉废水得到的糊状物得至l j l 7 种氨基酸，并优化了水解条件，制 取氨基酸的工艺简单，成本低，具有明显的环境效益和经济效益。 ， 童群义等【5 6 】将鱼粉生产的压榨工序所产生的废水浓缩后，添加适量酶以酶解鱼汁， 然后经吸附、干燥等工艺，生产出具有浓郁鱼腥味的动物诱食剂。并通过正交试验对酶 法水解、产品配方、干燥等工艺条件进行了详细的研究，获得了较好的生产工艺条件。 并进行了中试和工业化应用试验。该产品具有生产工艺简单，质量稳定性好，价格低廉 等优点。 周旭等【5 7 】利用从污水处理厂分离得到的假单胞菌p s e u d o m o n a s s pg x 4 1 ，以一定浓 度的鱼粉废水为替代培养基合成微生物絮凝剂，并考察了絮凝剂的性能，通过实验证明 利用鱼粉废水作为替代发酵培养基来生产微生物絮凝剂是可行的，对高岭土的絮凝率可 高达9 5 以上，且具有良好的稳定性。徐斌等【5 8 】对p s e u d o m o n a s s pg x 4 1 菌利用鱼粉废 水产生的絮凝剂净化无机和有机废水进了试验。该絮凝剂对高岭土悬浊液、土壤悬浊液、 活性炭悬浊液和电瓷厂废水有很好的除浊性能；生活污水、重油催化污水和针织染纱水 等几种有机废水亦有较好的除浊能力和c o d 去除能力。 董涛等【5 9 】研究了r o r y z a ea s3 2 5 4 和a s3 4 1 以鱼粉废水替代蛋白胨作为氮源发酵 产乳酸情况。研究结果表明，r o r y z a ea s3 2 5 4 前2 4h 总氮降低显著，去除率达4 8 ， 米根霉利用鱼粉废水和淀粉废水直接发酵产l 乳酸的研究 之后氮的利用较缓慢，7 2h 时总氮去除率约为5 5 。r o r y z a ea s3 2 5 4 和r o r y z a ea s3 4 1 乳酸得率最大达n o 6 5 眺和0 4 5g g 。 1 4 淀粉废水 淀粉是一种重要的工业原料，除供食用与加工食品外，更广泛的应用于纺织、造纸、 医药、发酵、化工等行业。淀粉生产大约有8 0 是以玉米为原料，其余以薯类、小麦、 大麦、燕麦以及其他富含淀粉的植物块根等为原料。目前，我国年产淀粉3 0 0 多万吨。 在淀粉生产过程中，废水排放量很大( 平均每生产1 吨淀粉需排放l o 2 0m 3 废水) ，而 且这类废水都是含有大量淀粉、蛋白质、糖类、脂肪等有机物的高浓度有机废水，废水 的c o d 值一般在8 0 0 0 3 0 0 0 0m g l ，b o d 值在5 0 0 0 2 0 0 0 0m g l ，s s 值在3 0 0 0 5 0 0 0m g l ， p h4 6 ，属酸性高浓度废水【6 0 彤】。 1 4 1 淀粉废水的传统处理方式 淀粉废水的传统处理方式有物理法、化学法、物理化学法、生化法、物理生物法等。 物理法主要的处理方式包括吸附法、气浮分离法、膜分离法等等；物理化学法最主要的 方式是通过加入絮凝剂，使分散状态的有机物脱稳，凝聚，形成聚集状态的粗颗粒物质 从水中分离出来；生物处理法可分为厌氧生物处理法和好氧生物处理法。 厌氧生物处理法主要是在缺氧条件下通过厌氧微生物( 包括兼氧微生物) 作用，将淀 粉废水中各种复杂的有机物分解为甲烷和c 0 2 等物质，同时把部分有机质合成细菌胞体， 通过气、液、固分离，使污水得到净化。在淀粉废水处理中用到的厌氧生物处理方法有 上流式厌氧污泥床反应器( u a s b ) 、厌氧填料床、厌氧滤池、厌氧折流板反应器( a b r ) 、 厌氧塘等方法。好氧生物处理法是指有氧条件下通过好氧微生物的作用，将淀粉废水中 各种复杂的有机物进行好氧降解，使污水得到净化。在淀粉废水处理中用到的好氧生物 处理方法有s b r 法、c a s s 法、接触氧化法、好氧塘法等。由于淀粉废水有机负荷高， 处理难度大，在实际生产中往往将好氧处理法和厌氧处理法结合而用。 1 4 2 淀粉废水资源化利用 与其它单纯的减负处理工艺相比，淀粉废水的资源化回收方法既可以去除废水中的 一部分污染物，减轻环境的负担，又可以回收有用产品，创造经济效益。目前，淀粉废 水的资源化利用技术主要包括利用淀粉废水发展生态农业建设、从淀粉废水中生产回收 有用组分以及利用淀粉废水生产新能源等方面。 ( 1 ) 利用淀粉废水发展生态农业建设 目前，国内利用淀粉废水进行生态建设的技术已有下列报道：沈仲韬【6 6 】根据海门县 大连理工大学硕士学位论文 淀粉厂污水的水质特征，设计了以废水治理为主体，结合养鱼、灌溉、沼气、水生植物 等的一个综合的“生态工程”实施方案，实现了淀粉废水的资源化处理。杨风江1 67 j 等将 玉米淀粉废水经隔栅沉淀后的沉淀物用于喂猪、鸡等，废水排入氧化塘自然发酵1 2 天， 排入水葫芦池净化7 天，再排入细绿萍池，净化7 天，达到农田灌溉水质标准，这部分水 用于灌溉稻田、果树和蔬菜等。张美华等嘟】将淀粉废水沉降底泥以适量的化肥调制成复 合肥，应用于水稻盆栽试验的增产机理研究。研究结果表明，该复合肥具有使水稻营养 生长和生殖生长间的协调功效。证实了利用工业废水的资源化产物进行农业生态建设的 切实可行性。 ( 2 ) 从淀粉废水中回收蛋白 近年来，从淀粉废水中回收蛋白的文献报道越来越多。例如：内蒙古农科院的熊淑 芳【6 9 】等采用超滤法从马铃薯淀粉废水中回收蛋白质，所得的粗蛋白干重为1 4g l ，蛋白 含量为6 5 。汤利飞等【7 0 l 用板式超滤器回收高梁、豌豆为原料的黄浆废水中的蛋白质， 选用了分子量为1 2 万的p s 膜，使蛋白截留率达至i j 9 7 8 。许昭和等【7 1 ，7 2 1 采用一种新研制 的天然絮凝费u ( f n f ) 对玉米淀粉废水进行了处理以及回收蛋白粉的试验研究，废水的 c o d 去除率为8 5 1 ，b o d 去除率为8 0 8 ，水质基本达到国家规定排放标准；每吨废 水可回收1 0 妇蛋白粉，粗蛋白含量3 6 4 5 ，含1 6 种氨基酸，可作动物蛋白饲料。邓述 波等【7 3 】用微生物a 9 所产的絮凝剂处理淀粉厂的黄浆废水。经絮凝沉降处理后，废水的 s s 和c o d 去除率分别可达8 5 5 和6 8 5 ，效果明显优于常用的化学絮凝剂。且微生物 絮凝剂具有无毒、无二次污染的特点，絮凝所得的蛋白可作为动物饲料进行综合利用。 张佩芳等【7 4 】采用聚n 乙酰d 葡萄糖胺( 又名甲壳质) 作为絮凝剂，在p h 值为3 5 的条 件下，对淀粉废水进行絮凝处理的试验研究，废水的c o d 去除率为6 8 ，且得到的沉 淀物可作饲料或肥料。 ( 3 ) 利用淀粉废水生产新能源 ( i ) 产沼气 采用厌氧生物技术对淀粉废水进行处理，不但可培养出活性良好的颗粒污泥，还能 产生出新能源沼气。 目前，国内外最常用的厌氧工艺是u a s b 反应器。例如：徐州的李燕【7 5 】等采用u a s b 对面粉厂的淀粉废水处理进行了试验研究。结果表明，c o d 去除率可达9 0 以上，沼气 产量最高可达3 9 7l h ，沼气中的甲烷含量为6 0 7 0 。另外，杨景亮【7 6 1 ，张振家f 7 7 1 以及 郑平【7 8 】也采用了u a s b 工业装置处理淀粉废水并回收沼气。冯世骥等【7 9 】采用了u a s b 和 a f 相结合的工艺- u b f 处理海南某淀粉厂的木薯淀粉水，c o d 去除率达到9 0 以上，去 除1k gc o d ，产沼气0 6m 3 。 米根霉利用鱼粉废水和淀粉废水直接发酵产l 乳酸的研究 ( i i ) 生物制氢 食品加工业生产的废水浓度高、碳水化合物丰富，因此其具有生物制氢的潜力。当 前已经有学者对土豆淀粉加工废水、苹果加工废水、糖果加工废水生物产氢进行了研究。 g i n k e l 等【8 0 】对土豆淀粉加工废水进行了产氢的研究，氢气的产生使废水的c o d 去 除率在5 1 1 范围。在不添加其他营养物质时，土豆淀粉废水的氢气转换率在2 1 2 8l l 废水。依照土豆淀粉加工厂的废水产氢率1 0lh 2 l 的数据计算，土豆加工厂的废水年 流量产氢效益，据估计每年可以达到6 5 0 0 0 美元。 李俊生等【8 l 】对利用淀粉废水制取氢气和去除有机物的效果进行了研究，采用厌氧发 酵方式。实验结果为氢气产量8 2 0m l 3 0 0m l 废水，废水的c o d 去除率为5 5 。 ( i i i ) 生物发酵产乳酸 j i n 等【2 2 】选用了土豆淀粉废水和玉米淀粉废水作为生产培养基，用少根根霉 ( r h i z o p u sa r r h i z u s ) d a r3 6 0 1 7 生产乳酸，当初始淀粉浓度为2 0 6 0g l 时，经过4 0h 的发酵，乳酸产量为1 9 5 4 4 3g m ，相应得率为0 8 5 - 0 9 6g g 。 1 4 , 3 处理方法比较 传统的淀粉废水处理工艺，如气浮法、絮凝沉淀法、生物法等处理淀粉废水，具有 处理量大、去除效果好、技术成熟等优势，但设备投资费用和运行费都较高。利用淀粉 废水为原料进行养殖、种植和灌溉，使其能为农业生态建设服务，创造了经济效益。但 是该方法仅限于农业，不适合在城市推广使用；从淀粉废水中回收蛋白，虽然也实现了 经济效益，但是c o d 去除率相对较低，还需进行二次处理；采用厌氧工艺处理淀粉废水 并回收沼气，是一种高效、节能的方法，但是厌氧技术启动慢，且受p h 值变化的影响较 大，需严格控制其操作条件。利用微生物对淀粉废水处理产生氢气和乳酸的方式，达到 了资源的循环利用，但是存在利用率不高的问题。 传统的处理工艺，虽然达到了很好的处理效果，但是其投入费用大，只具有社会效 益。相比之下，淀粉废水的资源化则是充分利用其中有机物质、生物活性物质以及所含 的营养物质，带来了一定的经济效益。虽然在废水的处理效果上不及传统的处理工艺， 但是生态资源化处理和综合利用是一条良好的途径，有着广泛的运用前景，值得大力推 广。 1 5 本课题的研究意义 鱼粉废水和淀粉废水排放量大，但富含大量的蛋白质、糖类及无机盐离子等营养物 质，具有潜在利用价值。本研究是在乳酸生产过程中把鱼粉废水作为微生物生长的氮源， 淀粉废水作为碳源。在优化的碳氮比下，以米根霉为发酵菌种，在实现了乳酸的低成本 大连理工大学硕士学位论文 生产的同时处理这两种废水，具有明显的社会效益、环境效益和经济效益。 米根霉利用鱼粉废水和淀粉废水直接发酵产l 辱l 酸的研究 2 实验内容、材料与方法 2 1 实验方案 具体实验方案如下所示： 测定鱼粉废水、淀粉废水水质指标 1r l 以鱼粉废水和淀粉为底物进行发酵实验 、 1r 鱼粉废水与淀粉废水混合直接发酵 土 动力学考察、废水处理效果测定 2 2 实验材料 2 2 1 菌株 米根霉俾o r y z a e ) a s3 2 5 4 、a s3 4 1 ，购自中国科学院微生物研究所。 2 2 2 培养基 斜面培养基：p d a 培养基。 组成：马铃薯2 0 0g ，葡萄糖2 0g ，水1 0 0 0m l ，琼脂1 5 2 0g ，p h 自然。 制法：去皮马铃薯2 0 0g ，切成小块，力h1 0 0 0m l 水，煮沸至马铃薯块能被玻璃棒戳 破。用4 5 层纱布过滤，滤液补足水分，! j h 2 0g 葡萄糖，琼脂1 5 2 0g ，充分溶解，加水补 充因蒸发而减少的水份。培养基分装入试管中，在1 2 1o c 高压蒸汽灭菌2 0m i n 后倾斜摆 放，冷却即得。 种子培养基( g l ) ：可溶性淀粉1 0 ，蛋白胨5 ，酵母膏5 ，k i - 1 2 p 0 40 2 ，m g s 0 4 7 h 2 0 o 2 ；1 2 1o c 灭菌2 0m i n 。 发酵培养基：鱼粉废水稀释一定倍数后加入淀粉，1 2 1o c 灭菌2 0m i n 。 鱼粉废水：来自大连龙源鱼粉有限公司。 大连理工大学硕士学位论文 淀粉废水：来自大连龙港食品有限公司。 2 3 实验仪器 型号名称生产厂家 y j 8 7 5 b 垂直净化工作台 电子分析天平 恒温空气浴振荡器 h c t p l1 b 架盘药物天平 1 0 1 2 a b 电热鼓风干燥箱 u v 9 10 0 型分光光度计 台式离心机 电子万用炉 p h s 一3 c 精密p n 计 显微镜 i x 7 1 荧光倒置显微镜 微型旋涡混合仪 微波密封消解c o d 快速测定仪 t d g c 2 3 k 接触式调压器 不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅 冰箱 a m i n e xh p x - 8 7 h k d n 0 8 a 上海阳光实验仪器有限公司 北京赛多利斯仪器系统有限公司 国华企业s h z 一8 2 北京医用天平厂 天津市泰斯特仪器有限公司 北京瑞利分析仪器公司 上海安亭科学仪器厂 天津市泰斯特仪器集团有限公司 上海精密科学仪器有限公司 麦克奥迪实业集团有限公司 奥林巴斯 上海沪西分析仪器有限公司 汕头市环海工程总公司 中国德力西集团电源有限公司 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 新飞f r e s t e e hb c d 2 01e b i o r a d 公司 上海洪纪仪器设备有限公司 米根霉利用鱼粉废水和淀粉废水直接发酵产l 乳酸的研究 可溶性淀粉 碳酸钙 磷酸二氢钠 m g s 0 4 7 h 2 0 酵母膏 蛋白胨 乙二胺四乙酸二钠 氢氧化钠 钙羧酸 乙醇 碘 碘化钾 苯酚 3 ，5 二硝基水杨酸 硫酸银 硫酸亚铁铵 浓硫酸 重铬酸钾 硫酸亚铁 琼脂 浓盐酸 淀粉 丁二酸 反丁烯二酸 0 t 淀粉酶 硒粉 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 分析纯 市售级 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 沈阳市新西试