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多糖含量测定的几种不同方法比较 淮北煤炭师范学院信息学院 2012级学士学位论文 多糖含量测定的几种不同方法比较 系 别: 信 息 学 院 专 业: 生 物 工 程 学 号:20081853021 姓 名: 姜 玉 龙 指 导 教 师: 查 岭 生 指导教师职称: 讲 师 2012年 5 月 10 日多糖含量测定的几种不同方法比较姜玉龙淮北师范大学信息学院 生物系指导老师: ?岭生摘要:本文综述了多糖含量测定的几种常用方法,主要有苯酚-硫酸法、3, 5-二硝基水杨酸法简称DNS法、蒽酮-硫酸法、色谱法、红外光谱定量分析多糖法等。并对这些方法的优缺点进行了分析和比较。这些方法可为多糖含量测定提供一定的参考,并为多糖含量测定的更深入研究提供一定的理论基础。关键词:多糖;含量;测定;方法 A review of different methods to the determination of polysaccharides JIANG YulongDepartment of Biology, School of Information, Huaibei Normal UniversityTutored by ZHA LingshengAbstract: Paper reviewed some different methods to the determination of polysaccharides, in it phenol-vitriol method, 3, 5-two nitro salicylic acid DNS method, anthrone-vitriol method, chromatography, infrared spectrum quantitative analysis and etc had been dealed with. And the advantages and disadvantages of these methods are analyzed and compared. It provided some related information and based theories to the determination of polysaccharides content.Key words:polysaccharides; content; determination; methods 目 录中文摘要I英文摘要II1前言12化学法测定多糖含量12.1苯酚-硫酸法12.2 3, 5-二硝基水杨酸法简称DNS法22.3蒽酮-硫酸法23色谱法测定多糖含量的研究33.1气相色谱法GC33.2 液相色谱法HPLC33.3薄层色谱法TLC44其他方法44.1红外光谱定量分析多糖法44.2生物传感器法55结论56展望6参考文献6致谢91前言 多糖polysaccharides,PS是由10个以上的单糖聚合而成的生物高分子1。多糖包含均多糖homosaccharide和杂多糖heterosaccharide。前者是由同一种单糖组成,后者则是由两种以上不同的单糖组成。多糖除含有单糖外,还含有糖醛酸、氨基糖、糖醇、脱氧糖等基团。多糖按来源可分为动物多糖、植物多糖、微生物多糖和藻类多糖;按酸碱性可分为酸性多糖、中性多糖及碱性多糖;按溶解性可分水溶性多糖、水不溶性多糖、酸性多糖和碱性多糖等2。多糖的研究是现代药学研究的热点之一,多糖具有多种功效,经研究表明其在免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗溃疡、降低胆固醇、降血压以及抗血栓等多方面具有良好的药理活性。在多糖工业生产过程中,常需对多糖的含量进行测量和监控,由于多糖的种类繁多,多糖含量和存在形式也多变。因此,选择适当的多糖分析方法十分重要。传统的多糖含量测定方法为苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法,但这两种方法测定步骤繁琐,而且只能测定样品中总糖的含量,若样品中含有单糖,则会使测定结果偏高;再者硫酸具有严重的腐蚀性,苯酚极易氧化,给实验操作带来极大不便。3, 5-二硝基水杨酸法简称DNS法具有操作简便、快速、灵敏度高、杂质干扰较小等优点,近年来逐渐被应用于植物药、中成药、海洋生物药等药物中多糖含量的测定3-5。本文综述了多糖测定的几种常用方法,并对其优缺点进行了比较。这些方法可为多糖含量测定提供一定的参考,并为多糖的更深入研究提供部分理论基础。 2化学法测定多糖含量2.1苯酚-硫酸法 在多糖的定量分析中,苯酚-浓硫酸法是被广泛应用的方法之一6。其原理是多糖在浓硫酸作用下水解成单糖并迅速脱水生成糠醛衍生物,与苯酚缩合成有色化合物,以葡萄糖为标准品,然后用紫外分光光度计在约490nm处测定光吸收值与糖浓度的线性关系,进而对样品定量,所得的测定结果是以葡萄糖含量计的多糖含量。该方法具有操作简单、快速、重复性好,显色后稳定性较好等优点,但对有色样品结果易偏高。 苯酚-硫酸比色法主要用于甲基化的糖、戊糖、寡糖类以及多聚糖的测定。甚至可以用于糖肽和糖蛋白的测定7-8。此法优势在于可以进行大量样品的测定,实验时基本不受蛋白质存在的影响,且产生的有色化合物在120min内颜色稳定。从目前各种文献资料来看,苯酚硫酸法测定的最大吸收波长多在480-491nm范围内,而实际应用时会因为水解出单糖种类的不同而出现偏差,如螺旋藻多糖中含有鼠李糖、半乳糖、甘露糖、核糖等成分,最大吸收波长在480nm处;茯苓多糖水解后得木糖、核糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖,最大吸收波长于490nm处9。杨春等指出苯酚暴露于空气中或在日光下被氧化逐渐变成粉红色,故应进行沙浴回流,用棕色瓶子收集馏出液。得到纯净苯酚。实验用苯酚溶液未加硫酸为现配溶液,并且每次用苯酚浓度一致,否则将会影响实验结果。苯酚液配制时,需按比例加入一定量的铝片和碳酸氢钠蒸馏,所得馏分再加蒸馏水配得10。2.2 3, 5-二硝基水杨酸法简称DNS法 3, 5-二硝基水杨酸法简称DNS法是一种新的多糖含量测定的方法,此法已被用于植物药、中成药、海洋生物药等药物中多糖成分的含量测定11。DNS法测多糖含量具有操作简便、快速、灵敏度高杂质干扰较小等优点。DNS法测定原理为3, 5-二硝基水杨酸与多糖水解产物还原糖共热后生成棕红色的氨基化合物 3-氨基-5-硝基水杨酸,在一定的范围内,还原糖的含量和反应液颜色成比例关系,利用比色法可测定多糖的含量。DNS比色法中,色素等还原性物质可与DNS显色剂显色,采用水解前测定值校正水解后测定值的方法,简便、有效地排除了色素等杂质的干扰12-15。DNS试剂即3, 5-二硝基水杨酸试剂,可采用直接配制的方法,也可先配制甲液和乙液,再将两液混合。配制显色剂过程中加入结晶酚可增加试剂的显色作用,亚硫酸钠可进一步增强试剂的稳定性。在选择测定波长时要考虑多方面的因素,既要考虑是否为最大吸收波长,又要考虑在该波长下测定结果是否稳定。样品测试液的制备过程中,酸水解时间不能太短也不能太长,时间短则多糖水解不完全,时间长则单糖和盐酸发生化学反应生成糖醛,不能和3, 5-二硝基水杨酸发生缩合反应。因此,水解时间要严格控制,否则会影响测定结果的准确性。该方法为半微量定糖法,简便、快速、适用于大量样品的测定。改良的DNS方法可使己糖和戊糖的混合糖样的分析结果更准确16。 此外,尹银嘉等采用DNS法测二味康口服液中多糖的含量,二味康口服液具有益气扶正,补脾益肾等功效,主要成分为黄芪和刺五加17。制剂工艺主要保留了多糖成分。用该法测定多糖含量可以克服用苯酚-硫酸法测定过程中硫酸带来的腐蚀性,因此安全可靠。2.3蒽酮-硫酸法 蒽酮-硫酸法是多糖类在浓硫酸作用下水解、脱水,再与蒽酮结合成有色化合物,于最大吸收波长处测吸光度18-20。蒽酮-硫酸法稳定性较差,宜新鲜配制并注意避光。此外,色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰。 蒽酮-硫酸法测多糖含量,特点是几乎可以测定所有的碳水化合物,不但可以测定戊糖与己糖,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用蒽酮法可以一次测出总量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值。同时,苯酚有毒性,为致癌物质,且对某些多糖可能诱导发生副反应,致使测得结果不准,使用蒽酮则避开了此点不足。此外,不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误差。蒽酮-硫酸法测定时的最大吸收波长差异范围较大,一般葡萄糖在580nm处有最大吸收峰,而从目前文献来看,植物多糖最大吸收波长多在562-630nm范围内21。在测定过程中,待测液需在冰水浴中缓慢滴加蒽酮-硫酸液,经过一定时间,在沸水浴中反应后,冰浴降温后测量。另外,蒽酮-硫酸溶液的加入量要与供试品溶液成一定比例才有较好的显色效果,加热时间要足够。 3色谱法测定多糖含量的研究3.1气相色谱法GC 气相色谱法可定性、定量分析多糖的组分和含量。一般是将多糖酸水解或甲醇醇解,用衍生物法以增加其挥发性。在GC研究中,糖有两类衍生物,一类是三甲基硅醚衍生物,是通过糖在吡啶或二甲基亚砜等非水溶剂中与六甲基二硅烷,三甲基氯硅烷,双三甲基硅烷基乙酰胺,三氟甲磺酸三甲基硅酯等反应形成,这类衍生物容易制取并具有较强挥发性。另一类糖衍生物是醋酸衍生物,包括三氟醋酸盐多羟基醇衍生物,三氟醋酸多羟基醇衍生物,醋酸乙醛肟衍生物,醋酸腈衍生物等。气相色谱分析法常用的色谱柱有填充柱和毛细管色谱柱22-24。近年来,随着多程序升温技术的完善,石英毛细管柱应用更为普遍,在糖分析中主要采用AT-1701、DB-1701、HP-1701、OV-1701、OV-17、OV- 225、SE-30、SE-33、SE-52、DB-1 等。被分离产物的检测常采用灵敏度高、选择性好的检测器,最常用的氢火焰离子化检测器hydrogen flameionization detector,FID,具有最高的选择性和灵敏度。此外也用到火焰光度检测器 flame photomericdetector,FPD、电子捕获检测器electron capturdetector,ECD、质谱检测器MS等。3.2 液相色谱法HPLC 糖的高效液相色谱分析方法已成为常规分析方法。可对单糖和寡糖进行常量和微量分析。高效液相色谱分析糖类化合物色谱柱一般采用氨基键合固定相,可用于分离一般的单糖、寡糖等。常用的氨基键合色谱柱有碳水化合物柱、Amino- sil-X-1、Lic hroe orb-NH2、Hypersil NH2、Polygosil 60-5NH2、YMG-NH2、Amide-80、ZORBAX 氨基柱等。乙腈和水通常可作为流动相,糖的保留时间随水的比例减少而减少。C18和C8硅烷色谱柱也常用于糖分析。此外,阳离子交换柱也可用于糖分析,一般是以聚苯乙烯型阳交换色谱树脂制作,有H+型、Ca 2+、Ag+、Pb2+等离子型。一般以水作流动相,在较高温度75-85下,分离效果较好。HPLC常用的检测器有示差折光检测器differential refractometers,RI、蒸发光检测器evaporative lightscattering detector,ELSD、紫外检测器ul travioletdetector,UV、荧光检测器fluorescence detector,FLD、电化学检测器electrochemical detector,ED等。RI检测器具有样品毋需衍生化、操作简单、稳定性高等优点,但存在灵敏度偏低、不适合梯度洗脱、受流速和温度影响大等缺点;ELSD是一种质量检测器,其灵敏度比RI检测器高;UV 检测器主要用于在190-210nm有紫外吸收的非衍生醛糖、酮糖、二糖和脱氧糖等,二级管阵列检测器photodiode ar ray detector,PDA是紫外-可见光检测器中的一种,二者灵敏度远高于RI和ELSD检测器;FLD是利用物质的荧光吸收而实现检测,灵敏度更高。由于糖类不具有紫外吸收和荧光吸收,需对其进行衍生化处理。检测极限可达到pmol-amol级,可比RI检测器灵敏度提高1000倍。常用的糖类紫外衍生化试剂有2,4-二硝基苯、对甲氧基苯胺、2-氨基吡啶、6- 氨基喹啉、苯甲酸、对氨基苯甲酸乙酷、3-甲基-1-苯基-2吡唑琳酮、苯甲酰氯等。另外糖醇可以对硝基苯甲酰氯p-nitrobenzoyl chloride衍生后可在260nm检测,肌醇在以异氰酸苯酯phenyl isocyanate衍生后在240nm处可检测25。 作为荧光检测的衍生化试剂主要2-氨基吡啶、芴甲基羟基肼、邻氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺、2,3-二氨基萘、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、乙酰乙酰苯胺、3-4-羧基苯甲酰基-2-喹啉羧基醛、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸、1-氨基芘-3,6,8-三磺酸、7-氨基-萘磺酸、四甲基若丹明等26。3.3薄层色谱法TLC 薄层色谱又叫薄层层析,是根据样品组分与吸附剂的吸附力及其在展层溶剂中的分配系数的不同而使混合物分离。薄层层析对设备要求不高,分离效果好、操作简便、分离速度快1-3h、样品需要量较少500ng-1g,纸色谱因分离时间和样品量均处劣势,逐渐淘汰。邓国栋等以双波长薄层扫描技术测定了一种茶叶多糖的单糖组成。建立了单糖浓度和斑点面积的定量关系,以此对样品中各单糖作定量分析,并对阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖检测限可达 1.2g。TLC方法还可以实现糖醇、寡糖等分析,检测限都可达到g级别。利用高效薄层色谱high per-formance thin layer chromatograph,HPTLC,进行薄层扫描,检测限可达到ng级27。 4其他方法4.1红外光谱定量分析多糖法 红外光谱定量分析多糖是通过对特征吸收谱带强度的测量来求出组份含量。其理论依据是朗伯-比耳定律28。定量分析方法可用标准曲线法、求解联立方程法方法进行定量分析。利用傅里叶变换红外光谱估测多糖含量时,一般认为糖量的特征波在970cm和1182cm之间。Blakeney等用近红外反射光谱测定了谷物中非淀粉多糖,该方法快速、便宜,作为一种快速分析具有营养功能重要多糖的方法使用具有很大的潜力。 4.2生物传感器法 生物传感器法利用酶的专一性反应,能实现糖的快速分析。葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等糖类的快速分析生物传感器已较成熟,检测限达3.510-5mol/L29。 5结论 通过以上介绍的对多糖含量测定的几种不同方法比较,不难发现每种方法都有自己的优缺点,现在就对这几种方法针对不同植物多糖含量的测定进行一下比较。 传统的多糖含量测定方法为苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法,但这两种方法测定步骤繁琐,而且只能测定样品中总糖的含量,若样品中含有单糖,则会使测定结果偏高;再者硫酸具有严重的腐蚀性,苯酚极易氧化,给实验操作带来极大不便。3, 5-二硝基水杨酸法简称DNS法具有操作简便、快速、灵敏度高、杂质干扰较小等优点,近年来逐渐被应用于植物药、中成药、海洋生物药等药物中多糖含量的测定30。 DNS法测定原理为3, 5-二硝基水杨酸与多糖水解产物还原糖共热后生成棕红色的氨基化合物3-氨基-5-硝基水杨酸,在一定的范围内,还原糖的含量和反应液颜色成比例关系,利用比色法可测定多糖的含量。DNS比色法中,色素等还原性物质可与DNS显色剂显色,采用水解前测定值校正水解后测定值的方法,简便、 有效地排除了色素等杂质的干扰。DNS试剂即3, 5-二硝基水杨酸试剂,可采用直接配制的方法,也可先配制甲液和乙液,再将两液混合。配制显色剂过程中加入结晶酚可增加试剂的显色作用亚硫酸钠可进一步增强试剂的稳定性。在选择测定波长时要考虑多方面的因素,既要考虑是否为最大吸收波长,又要考虑在该波长下测定结果是否稳定。样品测试液的制备过程中,酸水解时间不能太短也不能太长,时间短则多糖水解不完全,时间长则单糖和盐酸发生化学反应生成糖醛,不能和3, 5-二硝基水杨酸发生缩合反应。因此,水解时间要严格控制,否则会影响测定结果的准确性。 DNS法可用于羧甲基壳聚糖的含量测定,邹巧根等用该法测得了羧甲基壳聚糖的含量,羧甲基壳聚糖为壳聚糖的羧甲基化产物31。壳聚糖是从虾、蟹类等甲壳类海洋生物中提取出的甲壳素经脱乙酰化得到,羧甲基壳聚糖由于引入羧甲基使其水溶容性大大增强,在制药、生物医用材料行业用途广泛。由于组成羧甲基壳聚糖的单糖结构为羧甲基氨基葡萄糖和羧甲基乙酰氨基葡萄糖而且均为还原糖,从原理上分析很适合用DNS法测定其含量,最终测定结果与理论相符。苏广宇等人在研究产几丁质酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化实验中,也采用了DNS法测定多糖含量。几丁质广泛存在于甲壳纲动物虾蟹及昆虫的甲壳中,具有抗癌活性,免疫调节等作用。由于几丁质很稳定,在测定其含量前必须先进行降解,其中酶解法反应条件温和,不必加入其他反应试剂,不发生其他副反应,产物聚合度适中、节能、高效、无污染,所以常用酶解法先进行酵解再进行含量测定,其测定方法与用 DNS法测其他多糖方法类似。 DNS法越来越多的被用于多糖的含量测定,越来越受工作者的关注。采用 DNS法可以克服传统方法的不足,而且测定结果准确度高,精密度良好,安全可靠,操作简单,原理清晰明了,容易掌握,因此,DNS法具有很好的应用前景。 6展望 多糖的研究虽然较生命科学中其他三大类物质蛋白质、核酸和脂类起步为晚,但由于其在生命过程中重要的生理功能及其广泛的应用被不断挖掘,引起了人们越来越大的兴趣。现在多糖已成为天然药物及保健品研发中的重要组成部分。同时也应看到,无论是国内还是国外,多糖的研究与蛋白质和核酸的研究相比还有相当的差距。所以开展各种植物多糖分离纯化及含量测定方法研究,既有理论意义,也有现实意义。此外,糖分析还有其他一些方法,随着检测仪器不断革新升级,多糖含量检测方法趋于多样化。多糖含量检测总的发展趋势是使检测过程更简便、快速、准确、实现痕量检测、在线检测及更多反应结构信息等。参考文献1 李卫彬,阳文辉,黄锁义,等. 当归总糖、还原糖和多糖的含量测定方法探讨J. 微量元素与健康研究,2008,253: 46-47.2 王俊,朱一凡. 槲寄生多糖的提取分离和含量测定J. 中国中药杂志,2007, 3222: 2387-2390.3 王红英,钱斯日古楞,赵前程,等. 3, 5-二硝基水杨酸比色法测定麦冬多糖含量J. 沈阳农业大学学报,2005,365: 628-6304 崔本连,宋海韬,齐放,等. 3, 5-二硝基水杨酸法测定安络小皮伞菌中多糖的含量J. 长春中医药大学学报,2007,234: 25-26.5 何国光,刘晔玮,张鹤等. 黄参多糖含量测定条件优选J. 中国公共卫生,2008,2411: 1400-1401.6 刘丹. 对多糖测定方法的探讨J. 四川文理学院学报自然科学版,2008,182: 49-51.7 杨瑞瑞,李国华,樊宝娟. 灵芝多糖的含量测定方法探讨及改进J. 陕西中医学院学报,2009,325: 62-63.8 佘晓雷,张可,郑旭霞. 芦荟中多糖含量测定方法的探讨J. 营养学报,2003,252: 149-152.9 徐晓飞,蒋丽,唐健,等. 植物多糖的保健功能及开发前景J. 中国食物与营养,2007,1: 48-50 10 杨春,杨金笛,林帅. 菊花、野菊花中的总糖含量测定J. 山西中医,2009, 246: 40-41 11 张崇禧,黄建军,施威等.不同采收期刺五加叶中多糖含量测定J. 人参研究,2008,1: 12-15 12 孟江,周毅生,廖华卫. 不同产地鱼腥草多糖含量测定J. 时珍国医国药,2008,194: 822-823 13 成玲,武彦,石军. 不同提取工艺对黄芪多糖含量测定的影响J. 内蒙古科技与经济,2007,13: 88 14 胡斌杰,景中建,郝喜才.灵芝不同部位多糖含量测定J. 食品研究与开发, 2007,286: 129-131 15 乔云,姚峰,李俏,等. 影响白术多糖提取工艺的因素探讨J. 中成药,2001,234: 293-294 16 蒋秋燕,乔旭光,张振华. 影响大蒜多糖提取的因素及其条件优化J. 中国食品学报,2005,54: 101-104 17 尹银嘉,巍士超,马宝瑕. 3, 5-二硝基水杨酸法测二味康口服液中多糖的含量J. 中国医院药学杂志,2003,237: 414-416 18 方积年,丁侃. 多糖的研究开发中值得注意的一些问题J. 食品与药品,2007,912: 1-4 19 王在贵,刘朝良,杨世高,等. 茶多糖的提取与初步纯化J. 中国饲料, 2008,10: 38-40 20 林颖,吴蔬敏,吴雯,等. 天然产物中糖含量测定方法正确性的研究J. 天然产物研究与开发,1996,83: 5 21 方积年. 多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子量测定J. 药学通报,1984,1910: 46-49 22 王静,王晴,向文胜,等. 色谱法在糖类化合物分析中的应用J. 分析化学, 2001,292: 222-227 23 王永华. 气相色谱分析应用M. 北京: 科学出版社,2006: 105-146 24 张峻松,曲志刚,贾春晓,等. 香料烟中游离糖的毛细管气相色谱分析J.郑州轻工业学院学报,自然科学版,2003,181: 71-73 25 方积年,丁侃. 多糖的研究开发中值得注意的一些问题J. 食品与药品,2007,912: 1-4 26 闫巧娟,韩鲁佳,江正强,等. 黄芪多糖的分子量分布J. 食品科学,2004,258: 27-30 27 邓国栋,郁建平. 利用双波长薄层扫描法测定多糖的单糖组成J. 山地农业生物学报,2004,234: 334-336 28