（果树学专业论文）外源一氧化氮对核桃幼苗抗旱性的影响.pdf

山东农业大学硕士学位论文 英文缩写符 s n p c h l a c h l b n o s p n t r c - s c i n i r n r a b a p o d s o d c a r m d a p r o f v f m p k p k k o p s p p n p q q p o h p si p s 0 2 一 符号说明 中文全称 硝普钠 叶绿素a 叶绿素b 一氧化氮合酶 挣光合速率 蒸腾速率 气孔导度 胞间c 0 2 浓度 亚硝酸还原酶 硝酸还原酶 脱落酸 过氧化物酶 超氧化物酶 过氧化氢酶 丙二醛 脯氨酸 p s n 最大光化学量子产量 蛋白激酶 蛋白激酶激酶 p s 实际光化学效率 蛋白磷酸酯酶 非光化学猝灭系数 光化学促灭系数 羟自由基 光合系统i 光合系统 超氧阴离子自由基 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：地 导师签也1 日 期：j 丑r 矿 外源氧化氮对核桃幼苗抗旱性的影响 中文摘要 用不同浓度的一氧化氮( n i t r i co x i d e 。n o ) 供体硝普钠( $ o d i u n l n i l o p r u s s i d e ，s n p ) 预处理一年生核桃( j u g l a n sr e g i al ) 幼苗，采用生 理生化方法，初步探讨了外源n o 提高核桃干旱胁迫下抗性的作用和机 制。 试验结果表明： 1 ) 外源n o 处理降低了干旱胁迫下核桃幼苗质膜相对透性及膜脂过 氧化产物丙二醛的积累：3d 的恢复生长后，s n p 处理组质膜相对透性及 丙二醛含量恢复较对照苗快。其中5 0 0 1 u n o l l 的s n p 处理对细胞膜保 护作用最为显著( p o 0 5 ) 。 2 ) 干旱胁迫初期核桃叶片中s o d 、c a t 活性显著提高，是核桃幼苗 对于旱胁迫的一种自身适应和调节的能力。随着胁迫程度的加深，核桃叶 片中s o d 、c a t 活性迅速降低。外源n o 处理可以提高干旱胁迫下一年 生核桃叶片s o d 和c a t 的活性，并能维持在较高的水平上。幼苗恢复 正常生长以后，外源n o 处理的幼苗细胞膜透性和膜保护酶活性恢复较 对照快。说明外源n o 处理的核桃幼苗，受干旱胁迫损伤较轻，细胞膜 的修复较快，其中以s n p 5 0 0 1 m a o l l 处理的幼苗效果显著( p o 0 5 ) 3 ) 外源n o 可显著诱导干旱胁迫下脯氨酸、可溶性糖的积累 ( p ；核桃；干旱胁迫；保护酶；抗逆性；生 理生化 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a e t o n e - y e a ro l dw u l n u t s 一( d u g l a n sr e g i al ) w e l et r e a t e dw i t hd i f f e r e n t c o n t e n t s ( 2 5 0 、5 0 0 和1 0 0 0i m o l l ) o f e x o g e n o u sn i t r i co x i d eu n d e rd r o u g h t s 虹e s s t h e nw es t u d i e dh o wn i l r i eo x i d ee n l a a n e e dt h er e s i s t a n c ea b i l i t yo f p l a n t su n d e rd r o u g h ts t r e s st h r o u g hp h y s i o l o g i c a la n db i o c l a e m i e a lm e t h o d s 1 1 圮m a i nr e s u l t sw 黜雒f o l l o w s ： 1 1 1 蛇s n pl l e a l m e n tw a sa b l et oa u c v i a t et h ea c c u m u l a t i o no f m e m b r a n ep e r m e a b i l i t ya n dm d ac o n t e n ti nw a l n u t su n d e rd r o u g h ts t i e s s a 矗e ra3 - d a yr e c o v e r y , t h em e m b r a n ep e r m e a b i h t ya n dm d ac o n t e n to ft h e w u l n u t st r e a t e dw i t hs n pg o tb a c kt ot h el e v e l so fn o r m a ls e e d l i n g s ，w h i l e t h o s eo fs t r e s ss e e d l i n g sw e r en o ta b l et og e tr e c o v e r yc o m p l e t e l yd u et ot h e d r o u g h td a m a g e hp a r t i c u l a r , t h ee f f e c t so f5 0 0 1 t m o l f l $ n pw 舔m o s t s i g n i f i c a n t , 2 5 0 1 m a o l l s n pa n d1 0 0 0 1 t m o l ls n p f o l l o w e d 2 $ 1 r e s sw a so n eo ft h ei n d u c e m e n t sw h i c hc a u s et h eb r e a k i n go u to f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ( 1 s ) i n p l a n t s o d 、p o da n d c a t w e r e k n o w n 蹈 d e f e n s i v em e c h a n i s ma g a i n s th i g hc o n t e n tl e v e lo fr o $ b yc a t a l y z i n gt h e c o n v e r s i o no f0 2 - - - a n dt o x i c1 - 1 2 0 2t oo x y g e n s o da c t i v i t ya n dc a tn e t i v i t y r i s e df i r s t ；t h e nf o l l o w e db yad r o p a t t e rs n pt r e a t m e n t , b o t hs o da c t i v i t y a n dc a ta c t i v i t yw e i ei n c r e a s e du 妇c t r o t l g h ts 吨鼹a f t e r3d a y sx 跚m l e d g r o w t h , t h em e m b r a n ep e r m e a b i l i t ya n dt h ea c t i v i t i e so f a n t i o x i d ee n z y m e so f t h el r e a t e do l i o sr e c o v e r e de a r l i e rt h a nt h o s eo fc o n t r o lo n c st m d e rd r o u g h t s 吐e s s ，w h i c hw o u l db et h ec o n f i r m a t i o nt h a tt h ed a m a g ec a u s e db yd r o u g h t s t l e s $ c o u l db ea v o i d e dt o1 1c 髓 t a i ne x t e n tb ，re x o g e n o u sn o ，i np a r t i c u l a r , t h e e q t e e to f 5 0 0 1 a m o l ls n p 啊佻m o s ts i g n i f i c a n t , 2 5 0 1 t m o f l s n p a n d 1 0 0 0 1 如a m o l ls n p f o l l o w e d 3 p r o l i n ea n ds o l u b l es u g a rf i l eo s m o t i cr e g u l a t o r si nc e l l , w h i c h m a i n t a i n e dt h ec o m p l e t e n e s so f t h ec e l lm e m b r a n es l l u c t u r e i te n a b l e dt h ec e l l t 0s t a b i l i z ep r o t o p l a s mc o l l o i da n dt h ep r o c e s so f m e t a b o l i s m t h i se x p e r i m e n t s h o w e dt h a te x o g e n o u sn oc o u l da l l e v i a t et h ed a m a g ec a u s e db yd r o u g h t b t r c s , st h r o u g ha c c u m u l a t i n gp r o l i n ea n ds o l u b l es u g a r a f t e r3c l a y sr e s a m a e d 3 外源一氧化氨对核桃幼苗抗旱性的影响 g r o w t h , p r o l i n ea n ds o l u b l es u g a rc o n t e n to ft h es e e d l i n g sl l e a t e dw i t hs n i g o tb a c kt ot h el e v e l so fn o r m a ls e e d l i n g s ，w h i l et h o s e o fd r o u g h tb - t l 屯s s , s e e d l i n g sw e l en o t a b l et og e tr e c o v e r y c o m p l e t e l yd u e t ot h ed r o u g h td a m a g e 4 d r o u g h t s t r e s s s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d c h l o r o p h y l l c o n t e n t , p h o t o s y n t h e t i cr a t eon ) ，t r a n s p i r a t i o nr a t e ( t r ) ，g t o m a t a lc o n d u c t a n c e ( o s ) a n d c h l o r o p h y l lf l u o r e s c e n c ep h o t o c h e m i c a le f f i c i e n c yo fp s i i ( f v f m ) ，q u a n t u m y i e l do fp s h ( o p s i d ，p h o t o c h e m i c a lq u e n c h i n gc o e f f i c i e n t ( q p ) a n d n o n - p h o t o c h e m i c a lq u e n c h i n go ff l u o r e s c e n c e q ) i nl e a v e so fw u l n u t s n ot r e a t m e n ti n c r e a s e dc h l o r o p h y l lc o n t e n t , p 皿t r , g sa n df v f m ，o p s i i ，q v a n dn p qu n d e rd r o u g h ts t r e s s i n t e r c e l l u l a rc 0 2c o n c e n n a t i o n ( c od r o p p e d f i r s t ，f o l l o w e db yar i s eu n d e rd r o u g h ts t r e s s t h ec io f l e a v e st r e a t e dw i t hn o c o n t i n u e dt od e c r e a s e b u tw i t has m a l le x t e n t n l i sr e v e a l e dt h a tn 0c o u l d m o d u l a t ep h o t o s y n t h e s i si np l a n t , a n di n c r e a s ep l a n ta d v e r s i t yr e s i s t a n c eb y e n h a n c i n gp h o t o s y n t h e s i s k e yw o r d s ：n i t r i co x i d e 饼o ) ；w a l n u t ( d u g l a n s 懈缸l ) ；d r o u g h ts t r e s s ； p r o t e c t i v ee n z y m e s ；s t r e s sr e s i s t a n c e ；p h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s l x y 4 山东农业大学硕士学位论文 l 引言 1 1 果树对水分逆境的胁迫响应 植物与环境刺激的相互作用长期以来被认为是植物生理学中一个重 要而有成效的研究领域。作物生长与产量很大程度上受制于环境因素( 光、 c 0 2 、温度、水分、营养等) ，而后者又与遗传决定的植物生理生化系统相 互影响。植物的生长和产量是植物遗传基因在特定环境下表现的产物。植 物的地理分布、生长发育的节奏以及产量的形成均受环境制约。许多作物 的实际产量与该作物的最高记录产量常常相差数倍，乃至1 0 2 0 倍之多。 作物产量不能充分发挥的主要原因是不良环境的危害，其中干旱是限制作 物产量和品质的一个重要因素 。 水的生理重要性反映在它的生态重要性上，凡是温度允许生长的地 方，地面上植物的分布就受水分供应有效性的控制。l e v i t t ( 1 9 8 0 ) 认为， 水分逆境是指环境中的水分不足干旱，或是水分过多拱涝就当今世 界和我国的农业生产实际，干旱对作物的威胁最严重( 刘友良等，1 9 9 2 ) 。 据统计，世界干旱、半干旱地区占地球陆地面积的三分之一在我国， 干旱、半干旱地区约占国土面积的二分之一，即使在非干早地区其主要农 业区也经常出现不均匀降水，受到季节性干旱的侵袭。因此，于旱是一种 普遍影响作物生产力的环境胁迫( n a o r ，1 9 9 9 ；t u r n e r ，1 9 8 9 ) ，果树大 多栽培于丘陵、山地，更易受到水分胁迫的影响。 干旱是一种多维度的胁迫因子，即它对植物的影响是从不同的器官水 平上进行的。就整个植物界这一层面而言，植物对干旱胁迫的响应相当复 杂，因为这种响应所提供的信息是集植物在所有组织水平上对胁迫影响作 出的跨空间跨时间的反应于一体的( b l u m ，1 9 9 6 ) 。抗旱植物在失水过程 中表现出的特点非常明显，即在水分关系、生化和生理过程、膜结构以及 亚细胞器官的超显微结构方面都发生了变化( 曲桂敏等，1 9 9 9 ；陈立松等， 1 9 9 9 ；吴强盛等，2 0 0 3 ) 。 与其它作物一样，果树对干旱胁迫的反应和适应性研究主要集中在两 个方面：一是果树形态特征对于旱胁迫的反应及适应性，二是果树生理生 化指标在干旱胁迫下的变化 外源一氧化氮对核桃幼苗抗旱性的影响 1 1 1 叶片形态和解剖结构对水分胁迫的反应和适应性 叶片是植物进行光合作用制造有机养分的主要器官，同时，植物耗用 的水分中绝大多数通过叶片以水汽的形态蒸腾散失，叶片的形态及解剖结 构与抗旱性有一定的联系。 叶片小而厚实，则叶肉细胞及其液泡也相应较小，这种由小细胞组成 的叶肉组织在植物因严重干旱造成细胞质壁分离时，可以减少胞间连丝受 破坏的程度( d a u b e n m i r e ，2 0 0 1 ) 。李永清( 1 9 9 8 ) 报道，叶片小而厚实的龙 眼品种较叶片大而薄的龙眼品种抗旱。经干旱处理的葡萄叶片有增厚的趋 势( 李晓燕等，1 9 9 4 ) 。胡又厘发现，与桃、龙眼等树种相比，余甘叶片小， 抗旱性强。 叶片表面长有茸毛j 可以阻止水分的蒸腾、屏蔽辐射吸热以及提高散 热能力( 黎裕，1 9 9 7 ) 李永清( 1 9 9 8 ) 提出，抗旱性强的钝叶龙眼，叶表密 生星状茸毛，起到了积极的阻止水分散失的作用。刘友1 曼( 1 9 9 2 ) 指出，菠 萝叶片的气孔周围覆盖有毛状体，水分蒸腾量较低陈立松( 1 9 9 7 ) 指出， 气孔是植物体内的水分向外扩散的主要通道，一旦气孔关闭，角质层就成 了防止水分散失的最后一道屏障。角质层由角质和疏水的蜡质组成，角质 层越厚、蜡质含量越高，许多果树如梨、柿、杏、菠萝、龙眼等的叶片角 质层发达，蒸腾系数小。经过抗旱锻炼的植株叶片中，角质层中的蜡质含 量增加，角质层阻力提高。 栅栏组织厚实是那些生长在不良的水分平衡条件下的植物的一个特 征( 赵友华，1 9 9 3 ) 。李晓燕等( 1 9 9 4 ) 对葡萄进行研究后认为，c t p ( 栅栏组 织厚叶厚) 值越大，s r ( 海绵组织厚叶厚) 值越小，抗旱性越强。胡又厘指 出，抗旱性很强的余甘，其栅栏组织与海绵组织的厚度之比是1 ：1 0 6 ， 是文冠苹的3 倍多，是沙枣的5 倍多，而其抗旱性明显强于后两者姚允 聪等( 2 0 0 1 ) 指出，干旱胁迫造成苹果叶片的栅栏组织加厚、细胞排列趋紧 变短，海绵组织变薄。此外，叶肉细胞和表皮细胞小且排列紧密，也多是 判断植株抗旱性强弱的依据之一。 气孔孔径小，水分散失的阻力大，因此多认为气孔孔径小，则果树抗 旱性强。胡又厘报道，与桃、龙眼等相比，余甘的气孔孔径最小，其抗旱 性最强。葡萄品种气孔小，抗旱性强( 李晓燕等，1 9 9 4 ) 在干旱条件下， 6 山东农业大学硕士学位论文 苹果( 先净b 江等，1 9 9 8 ) ，葡萄( 李晓燕等，1 9 9 4 ) 气孔缩小，避免水分的散 失，果树对干旱的这种适应性反应也旁证了气孔小则抗旱性强的关联。 气孔密度与果树抗旱性关系的研究有两种结果，但多数观点( 曲泽洲， 1 9 8 5 章文才，1 9 8 7 等) 认为，气孔密度越小，抗旱能力越强，依据是气 孔密度与气体交换阻力成反比( 吕忠恕，2 0 0 2 ) ，气孔密度小，气体交换阻 力大，将减少蒸腾，同时，通过叶片散失水分的途径少。 在水分胁迫情况下，叶片生长减缓，主要标志是叶面积减少：一是叶 片伸展提前结束。h s i a o ( 1 9 7 3 ) 、王万里( 1 9 8 1 ) 和k l a l n e r ( 1 9 8 3 ) 的研究表 明，从细胞的生长阶段来看，一旦水分不是，叶片细胞扩展过程很快受到 抑制，细胞分裂仍能忍耐干旱缓慢地维持分裂，说明细胞扩展过程对水分 胁迫的反应比细胞分裂过程更为敏感( 樊梦康，1 9 8 6 ) ，导致单叶叶面积比 正常条件下形成的要小。二是长时间严重的水分亏缺将增加落叶或枝条枯 死( j o n e se ta l ，1 9 8 5 ) p r o e b s t i n g ( 1 9 8 1 ) 将樱桃树置于干旱气候中一周后， 供给相当于蒸发量1 5 的水，结果发现某些枝条顶端枯死，叶面积对根系 的比例明显下降，从而阻止因水分胁迫对果树伤害的扩展。叶面积的减少， 可以直接减少水分的支出，防止土壤和植物体水势的继续下滑( j o n e s 等， 1 9 8 5 ) 叶片的运动。一是叶片卷曲或萎蔫。我国广泛分布的卷柏在干旱时叶 片完全卷起，几乎变干，一旦髂除干旱，迅速恢复。陆挪 4 ( 1 9 9 9 ) ) 指出， 干旱胁迫下叶片容易卷曲或萎蔫，是抗旱能力强的表现。但胡海荣( 2 0 0 1 ) 认为此结论不当，他认为，所有植物的叶片都是以卷曲或萎蔫的方式来适 应水分胁迫。聂华堂( 1 9 9 1 ) 对柑桔的研究结果继续支持了陆挪生的观点： 抗旱性强的品种叶片萎蔫，但不脱落，恢复供水后，叶片恢复常态；抗旱 性弱的品种，叶片萎蔫，即使恢复供水，仍有脱落。二是改变叶位。s a v e 等( 1 9 9 3 ) 报道，草莓经干旱处理后，叶片大多数朝北，而湿润处理的则相 反。谷瑞生等( 1 9 9 4 ) 报遭，水分胁迫下，核桃复叶中的小叶下垂，随着 胁迫程度的增加，小叶下垂程度增大，趋向于向平行于太阳辐射方向。三 是改变叶角。以上3 种运动都是通过改变叶片与太阳光线的角度以减少直 接辐射，防止或减轻过热和水分散失，是植物对外界干旱条件的主动反应 和暂时调整 7 外源一氧化氨对核桃幼苗抗旱性的影响 1 1 2 渗透调节作用 干旱对植物引起的主要胁变是细胞脱水，植物要生存下去，必须采取 某种措施( 结构上或功能上) 使其在干旱威胁下避免脱水，或者在短时期 内恢复膨压并重新生长，其中最有效的措施就是渗透调节( o s m o t i c a d j u s t m e n t , o a ) 。所谓渗透调节是指植物在渗透胁迫条件下，通过细胞内 主动积累溶质，降低渗透势，从而降低水势，以保持从外界继续吸水，维 持细胞膨压等生理过程的正常进行( 邹琦等，1 9 9 8 ) 。渗透调节的关键是 细胞内溶质的主动积累和由此导致的渗透势的降低( 李德全等，1 9 9 2 ) 渗透调节的主要生理作用有：维持细胞膨压基本不变；保持细胞 继续生长；维持气孔开放，以利于c 0 2 进入叶肉细胞，使光合作用正常 进行；推迟卷叶，延缓叶片死亡；保持酶活性和维持细胞膜的正常功 能等植物的渗透调节这一概念由h s i a o ( 1 9 7 3 ) 最先提出，此后j o n e s ( 1 9 7 8 ) ，m u n n s ( 1 9 8 1 ) ，m o r g a n ( 1 9 8 4 ) ，h s i a o ( 1 9 8 4 ) 分别在高 粱、小麦、玉米、水稻等作物上都发现干旱可以诱导渗透调节的发生许 多研究也证实，在水分胁迫下，几乎所有的果树树种都具有渗透调节能力， 但因不同树种以及处理方式的不同，渗透调节能力不同。在缓慢发展的水 分胁迫过程中易产生渗透调节，而快速脱水( 如利用p e g 处理或盆栽处 、理方式) 则影响o a 的产生( 李德全，1 9 9 3 ) 。例如，盆栽桃树在水分胁迫 下未产生o a ( 夏阳，1 9 8 9 ) ，而田间栽培的桃树则似乎存在着渗透调节 ( c h a l i n e r s 等，1 9 8 3 ) 1 1 3 光合作用 众多试验研究证明( 罗华建等，1 9 9 9 ；程来亮等，1 9 9 0 ；刘殊，1 9 9 7 ； 杨建民，1 9 9 3 ；s c h u l t zi - i r , 1 9 9 7 ) ；干旱胁迫使果树光合速率降低、蒸腾 速率降低、气孔阻力增加。干旱逆境直接影响光合机构的结构和活性，如 叶绿体类囊体的组分、透性及流动性等，叶绿体的显微结构、叶绿素含量 及叶绿素a b 比值的变化。干旱胁追条件下，植物叶表面气孔关闭，阻止 了c 0 2 进入体内，导致光合作用下降。同时，由于得不到外界c 0 2 ，光所 形成的化学能不能像在正常的c 0 2 固定条件下被用掉，叶片就会发生光抑 制作用，造成叶绿体超微结构持续的损坏或不可逆的破坏0 v l e h d y , 1 9 9 4 ； 郭连旺等，1 9 9 6 ) 。通常，干旱胁迫伴随着高光强，叶片吸收过多的光能 山东农业大学硕士学位论文 不能及时有效地被植物利用或耗散时，植物就会遭受强光胁迫，引起光合 能力下降，发生光合作用的光抑制( 许大全等，1 9 9 2 ) 。贾虎森( 2 0 0 i ) 研究 发现，中度干旱后期至严重干旱胁迫下，苹果叶片表现出以p s i 反应中 心活性降低为主要特征的光抑制。 1 i 4 自由基积累与膜脂过氧化 水分胁迫对果树细胞的伤害最直接、最明显的表现是：细胞膜透性增 大，稳定性降低，电解质、氨基酸、可溶性糖等被动外渗。抗旱性强的果 树质膜透性增加的幅度较小( 陈立松，1 9 9 9 ) 。大量的研究表明，植物遭受 逆境胁迫或在衰老过程中，细胞内活性氧产生与清除的平衡会遭到破坏， 积累起来的活性氧就会对植物细胞造成伤害( 王建华等，1 9 8 9 ；陈少裕， 1 9 8 9 ：c h o w d h u r ye ta l ，1 9 8 5 ) 大量的研究证明干旱引起的膜伤害是由 于生物自由基引发膜脂过氧化作用和保护酶活性下降造成的任茅雁等， 1 9 9 5 ；沈秀英等，1 9 9 5 ：李广敏等，1 9 9 4 , 。罗建华等，1 9 9 9 ；聂华堂等， 1 9 9 1 ：潘东明等，1 9 9 3 于同泉等，1 9 9 6 ) 膜脂过氧化会引起膜中蛋白 质聚合和交联以及类脂的交化，使膜上的孔隙变大，通透性增加，离子大 量外渗，引起细胞代谢紊乱，严重时导致植物伤害或死亡。 1 1 5 抗氧化防御系统 8 0 年代以来，人们对干旱胁迫下植物体内抗氧化防御系统进行了大 量研究，现已确定它是由一些能清除活性氧的酶系和抗氧化物质组成，如 超氧歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c 卸和抗坏血酸( a s a ) 等。它们协同起作用共同抵抗干早胁迫诱导的氧化伤害，单一的抗氧化酶 或抗氧化物不足以防御这种氧化胁迫如s o d 催化两个超氧自由基发生 歧化作用反应形成0 2 和h 2 0 2 , h 2 0 2 再被p o d 和c a t 催化除掉。在整个 氧化防御系统中，s o d 是所有植物在氧化胁迫中起重要作用的抗氧化酶 一般来讲，干旱胁迫下植物体内抗氧化保护酶的活性与植物抗氧化胁迫能 力呈正相关( 蒋明义等，1 9 9 1 ) ，抗旱性强的植物，在干旱胁迫下，s o d 、 c a t 的活性较高，能有效地清除活性氧，阻止膜脂过氧化。 1 2 植物一氧化氮( n o ) 研究进展 氮氧化物( n o x ，包括n o 和n 0 2 等) 作为一类温室效应气体对植 物的生长发育具有广泛的影响。然而，与其他活性氧一样，n o x 长期以来 9 外源一氧化氮对核桃幼苗抗旱性的影响 被当作毒性分子看待( h u f t o n c t a l ，1 9 9 6 ；w e l l b u m ，1 9 9 0 ) 。自从d e l l e d o n e 等( 1 9 9 8 ) 和d u m e r 等( 1 9 9 8 ) 发现n o 可以作为植物抗病反应的信号 分子后，n o 植物学的研究引起了国际植物学界的密切关注 1 2 1n 0 的发现及理化性质 1 9 世纪医学上就开始用n o 的生成剂有机硝酸酯和硝酸甘油治疗 心脏缺血，但一直未认识到其本质就是n o 在起作用，更未意识到内源 n o 的存在所起的重要的生物学意义。7 0 年代由于对亚硝胺的致癌作用 的研究，人们发现巨噬细胞能被l 精氨酸及n o 所激活，而增强巨噬细 胞的杀菌和杀肿瘤作用。8 0 年代，f u r c h g o r 等( 1 9 8 0 ) 发现促进血管扩 张的内皮衍生因子( e n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n gf a c t o r ，e d r f ) 就是n o ， 硝酸甘油的扩血管作用是源于这一功能的活性代谢产物n o 。随后，研究 发现n o 在中枢神经系统中起作用，并证实脑细胞中存在一氧化氮合成 酶( 方芳等，1 9 9 8 ) 8 0 年代以来，人们通过对血管内皮衍生因子化学本 质( 即n o 的揭示) 以及n o 在巨噬保免疫功能和神经细胞传递功能及 中枢神经疾病中作用的研究，确认了n 0 是一种新型的细胞间通讯的气 体信号分子 在动物和医学界研究关注n o 的同时。n o f i t a k e 等( 1 9 9 6 ) 用n o 处 理马铃薯( s o l a n u m t u b e r o s u ml ) ，发现n o 可诱导其植保素( p h y t o a l e x i n ) 的积累。n i n n c m a n n 等( 1 9 9 6 ) 、i ) e l l e d o n n c 等( 1 9 9 8 ) 和d r o n e r 等( 1 9 9 8 ) 证实在植物体内有一氧化氮合酶( n 0 s ) 的存在，n o 在植物抗病反应中 起信号作用。s a n g l ( 1 9 9 8 ) 进一步提出了活性氧在植物抗病反应中的作 用模式图。另有证据表明n o 对诸如植物的呼吸作用( m i l l a ra n dd a y ， 1 9 9 6 ) 、光形态发生( p h o t o m o r p h o g c n e s i s ) ( b e l i g n ia n dl a m a t t i n a ，2 0 0 0 ) 、 种子萌发( b c l i g n ia n di 舢口a l t i n a ，2 0 0 0 ；c a r oa n dp u n ：t a r u o ，1 9 9 9 ) 、根和 叶片的生长发育( l e s h e m ，1 9 9 6 1r i b e i me ta l ，1 9 9 9 ) 、果实等组织的成 熟和衰老、胁迫响应及植物抗病防御反应等生理过程都有明显的调节作 用。 n o ( n i t r i co x i & ，n o ) 在常温下是气体，分子小，脂溶性，极易透 过细胞膜进行扩散，在生物组织中半衰期只有几秒，并具有高度的化学反 应能力( 臧梦维等，1 9 9 6 ) 。它不仅对合成处的细胞，且能对相邻细胞中 l o 山东农业大学硕士学位论文 的靶分子发生作用，起着细胞内与细胞间的信息传递功能( 方芳等，1 9 9 8 ) 。 n o 可以三种形式存在，分别是n o 自由基( n o ) 、亚硝基阳离子( n o + ) 、 硝基阴离子( n o 一) ，除了n o 具有生物活性外，n o + 和n o 一也具有生物 学效应( n e i l le ta l ，2 0 0 3 ) 1 2 2 植物体内n o 的来源 在向日葵( h e l i a n t h u sa l l n u u sl ) 、甘蔗( s a e c h a r u mo f f i c i n a r u ml ) 、 玉米( z e am a y sl ) 、油菜( b a s s i c ae a m p e s t r i s ) 、云杉( p i e e am a s t ) 、菠 菜( s p i n a e ad e r a c e a ) 、烟草( n i e o t i a n at a b a e u ml ) 和羽扇豆( l u p i n u s h i m n u s ) 等多种植物体内都检测到n o 的存在。植物体内存在多条形成 n 0 的途径，如通过一氧化氮合酶( n i t r i co x i d es y n t h a s c ，n o s ) ( n e i l l e ta l ， 2 0 0 3 ) 、硝酸还原酶( n i u a t c n i t d t e ，n r n i r ) ( m o r o t e t a l ，2 0 0 2 ) 和非酶 途径( c o o n e y e ta l ，1 9 9 4 ) 形成n o ( 图1 ) ( w o j t a s z e k ，2 0 0 0 ) 1 2 2 1 一氧化氮台酶( n 0 s ) 途径 在哺乳动物中，n o 的合成通过三种类型的一氧化氮合酶( n o s ) 实 现( d e l l e d o n e e ta l ，1 9 9 8 ) 。它是以黄素腺嘌呤二核苷酸( 1 l a v i na d e n i n e d i n u c l e o f i d e ，f d l a ) 、黄素单核苷酸( n a v i nm o n o n u c l e o f i d e ，n 悄) 、血红 素( h a e m a e h r o m e ) 、四氢叶酸( t e t r a h y d r o f o l a t e ) 以及钙调蛋白 ( e a l m o d u l i n - b i n d i n gp r o t e i n ) 为n o s 辅基，以l 精氨酸( l - a r g ) 、0 2 及 还原型辅酶i i ( r e d u c e dn i c o t i n a m i d e a d e n i n e ，n a d p h ) 为底物催化而成 ( m a r i e t t a ，1 9 9 3 ) 。n o s 编码基因分别为：诱导型n o s ( i n d u c i b l e n o s ， i n o s ) 、内皮细胞型n o s ( e n d o t h e l i a l n o s ，e n o s ) 和神经元型n o s ( n e u r o n a ln o s 。n n o s ) ( b r e d te ta l ，1 9 9 1 ) 。n n o s 和e n o s 活性依赖 于c a 2 + i c a m ，引起n o 短期释放；i n o s 活性不依赖于c a 2 * c a m ，在 某些细胞因子的诱导下，引起长时间n o 释放( w e n d e h e n n ee ta l ，2 0 0 1 ) 动物中不少n o s 蛋白已被纯化，基因已被克隆( n m h a n a n d x i e ，1 9 9 4 ) 。 外源一氧化氮对核桃幼苗抗早性的影响 f i g 1 - 1 p o s s i b l ep a t h w a yo f n i t r o g e nm o n o x i d e 芦l i l c 6 锄i np i a n t s ( w o j m z e k , 2 0 0 0 ) 植物体中也已证实有n o s 存在。最早表明植物中可能存在类似哺乳 动物的n o s 的证据是n i n n m 和m a i e r ( 1 9 9 6 ) 在豆科植物 m u c c u n ah a s s j o o 中检测到n o s 的活性。同时，c u c t o 等( 1 9 9 6 ) 在 l u p i n u s a l b u s 的根和茎节中也发现了n o s 的活性，随后d e l l e d o n n e 等 ( 1 9 9 8 ) 和d u r n c r 等( 1 9 9 8 ) 分别在烟草和大豆( g l y c i 船m a x l ) 中也 检测到n o s 的活性，这种活性受到动物n o s 抑制剂的抑制，他们还进 一步证明了n o 作为信号参与了植物的抗病反应在小麦( z h a oc ta l ， 2 0 0 1 ) 、玉米( r i b e i r oe ta l ，1 9 9 9 ) 、大豆( c a r oa n dp u n t a m l o ，1 9 9 9 ) 等 植物中也发现了类似的n o s 活性。 然而，植物中存在类似于哺乳动物的n o s 仍然只是一个推测。虽然 在多种植物中检测到n o s 活性( n i n n e m a n n na n dm a i e r ，1 9 9 6 ；c u e t oe t a l ，1 9 9 6 ；r i b e i r oe ta l ，1 9 9 9 ；c a r oa n dp u n t a r u l o ，1 9 9 9 ；z h a oe ta l ，2 0 0 1 ) 并且在使用抗动物n o s 的单克隆抗体检测植物组织时也发现专一的免 疫反应蛋e i ( p e d r o s oa n d i ) u r z a n ，2 0 0 0 a ) ，但至今尚未得到植物的n o s 基 因或蛋白。由于已由众多的实验证据表明植物n o s 的存在，植物n o s 山东农业大学硕士学位论文 相关基因和蛋白的分离或许只是技术和时间的问题。 直到2 0 0 3 年5 月，美国康乃尔大学c h a n d o k 登载 c e l l ) 杂志上 首次报道了他们完成的受t m v 诱导的烟草烈o s 基因的克隆工作，并 鉴定其是一种分子量为1 2 0 k d a 的甘氨酸脱羧酶( g l y e i n ed e e a r b o x y l a s e c o m p l e s ，g d c ) p 蛋白的变体形式。而且，从活性大小、所需的辅助因 子、抑制剂敏感性和动力学参数来看，该i n o s 与动物甜0 s 具有许多 明显的相似性( c h a n d o ke ta l ，2 0 0 3 ) 。同年1 0 月，c r a w f o r d 研究小组 在拟南芥中也克隆到了与植物生长和激素信号转导有关的n o s 基因和 相应的互补d n & ( c o m p l e m e n t a r yd n a ，e d n a ) ( 命名为a t n o s i ) ，通 过研究彳删在第一个外元处产生变异的突变体发现，受脱落酸 ( a b s d s i ea c i d ，a b a ) 调控的n o 产生和气孔关闭被明显阻断，并且表 现为叶绿素丧失，苗、根和花序的生长推迟，育性下降，而导入外源a t n o s i 或用n o 供体处理后上述性状均得以恢复。进一步研究发现，植物n o s 蛋白的氨基酸序列与动物n o s 无明显的同源性。至此，植物体中存在 n o s 终被证实( g u oe t a l ，2 0 0 3 ) 1 2 2 2 硝酸还原酶( n 脯淤) 途径 高等植物中n r n i r 是氮代谢的关键酶。n r n i r 常常催化硝酸盐或 亚硝酸盐和n a d h 或n a d p h 形成n o ( n a t h a na n dx i e ，1 9 9 4 ) 。已在向 日葵、菠菜、玉米中发现由n r 催化形成的n o 。不同植物不同组织或器 官影响n r 的因子不同。如，叶片的n r 主要受光的调控，光下黄瓜 ( c t m u n i ss a t i r u s ) 叶片中的n r 增强；暗处n r 活性下降。而根部的n r 活性无光暗依赖性，但缺氧、加接偶联剂或甘露糖降低根中a t p 水平可 激活根系n r ；而高氧可以促进n r 失活( d e e ta l ，2 0 0 1 ) n r 既受环境条件如光、c 0 2 或0 2 的快速调解，又受外来物质的影 响例如，高c 0 2 下黄瓜叶片中n r 活性高于低c 0 2 的；黄瓜植株同化 c 0 2 的速率可调控n r 的活性和表达；果糖显著刺激叶片和根中n r 基 因的转录( l a r i o se ta l ，2 0 0 1 ) 。呼吸链抑制剂( k r e s o x i m - m e t h y l ，k r o m ) 促使菠菜叶片中n r 活性下降，完全阻止黑暗引起的n r 活性下降( g l a a b f f a l ，1 9 9 9 ) , 盐胁迫下n r 活性的日变化规律及基因的m r n a 都会发生 改变( a m - e 1e ta i ，2 0 0 0 ) ；酚类物质可抑制小麦叶片中的n r 活性，此 外源一氧化氨对核桃幼苗抗旱性的影响 种抑制效应与酚类物质的结构和浓度相关( a l b a s s a m ，2 0 0 0 ) ；此外，c a 2 + 、 蛋白激酶( p r o t e i n k i n a s e ，p k ) 、蛋白激酶激酶( p r o t e i n k i n a s e k i n a s e ，p k k ) 、 蛋白磷酸酯酶( p r o t e i n p h o s p h a t a s e s ，p p ) 、1 4 3 3 蛋白和蛋白酶都可调控 n r 活性( m a c k i n t o s ha n dm e e k ，2 0 0 1 ) 1 2 2 3 非酶途径 植物也通过多种非酶途径形成n o ( 图1 ) 如由n o 的供体硝普钠 ( s o d i u n m i t r o p m s s i d e ，s n p ) 、s - 亚硝基- n - 乙酰青霉胺 ( s - n i 仃o s o - n - a c