（食品科学与工程专业论文）菜籽粕制备复合氨基酸螯合铜的研究.pdf

菜籽粕制备复合氨基酸螯合铜的研究 摘要 菜籽粕是菜籽榨油过程中经压榨脱脂后产生的一种副产物，其粗蛋白含量 一般为2 8 - 4 0 ，为全价优质的植物蛋自疆2 1 。僵是，匿翁我国对菜籽粕的利 用很有限，仅用作肥料或按少量比例添加作反刍动物和淡水鱼养殖饲料，利用 价值不高。本文通过研究开发制备氨基酸螯合铜来提升菜籽粕的利用效率。 以双低菜籽饼粕为原料，采用碱提酸沉法制备了菜籽分离蛋白，再用碱性 蛋白酶和中性蛋自酶水解得到复合氮基酸，研究了其最佳制备条件。孬以复合 氨基酸为原料，对复合氨基酸螯合铜的合成条件进行了初步探讨。探讨了p h 值、反应时间、反应温度对螯合反应的影响，研究的主要结论如下： ( 1 ) 采用分步酶解法制备复合氨基酸，确定了使用碱性蛋自酶和中性蛋自 酶的分步酶水解工艺参数。结果表明在液料比l5 ：1 ，温度5 0 ，p hl0 5 条件 下，先用3 2 5 0u g 的碱性蛋白酶水解2 小时，灭酶后再调节温度至4 5 ，p h 至9 ，添加4 5 0 0 u g 的中性蛋皇酶水解2 小时，水解效果较好。 ! 导到的复合氨 基酸水解度和氮收率分别为4 5 8 3 和8 2 7 5 。在p h 3 9 范围内，氮溶解指数 高于7 5 4 3 三氯乙酸氮溶解指数达9 1 7 1 。 ( 2 ) 制备的复合氨基酸中单宁、硫苷、植酸等有害物质和抗营养因子含量 较原料有暌显降低，釜氨基酸种类较多，必需氨基酸含量较高，通过适量添加 个别氨基酸可使其配比接近人乳模式，因此可应用于饲料或食品添加剂中，提 高了其使用价值。 ( 3 ) 分别使用n a 2 s 化学鉴定法和红外光谱分析法对复合氨基酸和铜螫合后 产物进行检测，结果表臻生成了具有稳定结构的螯合物复合氨基酸螯合镊。 ( 4 ) 对复合氨基酸螫合铜的合成工艺进行了初步探讨，研究了反应温度、 反应时间、p h 值、配位比对螯合反应的影响。复合氨基酸妈铜螯合的主要影响 因素为p h 值和配位比，虽配位比达到极显著水平。确定了复合氨基酸与铜螯合 的最适反应条件为反应时间5 0 m i n ，反应温度5 0 ，配位比2 ：l ，p h 值为9 在 该条件下得到的复合氨基酸螯合铜的螫合率为9 4 5 9 ，氨基酸含量为3 0 2 。 关键词：菜籽粕菜籽分离蛋自碱性蛋蛊酶中性蛋自酶复合氨基酸 复合氨基酸螫合铜 s t u d yo np r e p a r a t i o no fs y n t h e s i z i n gc u ( 1 i ) 一c o m p o u n d a m i n oa c i dc h e l a t ef r o mr a p e s e e dm e a l a b s t r a c t r a p e s e e dm e a li s ab y - p r o d u c to fo i le x t r a c t i o n ，w h i c hi sf o r m e da f t e rt h e s q u e e z i n ga n dd e f a t t i n gp r o c e s s t h ec o n t e n to ft o t a lp r o t e i nr e a c h e s2 8 - 4 0 a n dc a nb ee x p l o i t e da sf o o da d d i t i v eb e c a u s eo fi t sg o o dq u a l i t y h o w e v e r ，t h e m e a lh a s n tb e e nu t i l i z e dc o m p l e t e l y i ti so n l yu s e df o ra n i m a lf e e da n df e r t i l i z e r ， i t sv a l u ei nu s ei sn o th i g h t h e r e f o r e ，i t ss i g n i f i c a n tt ow o r ko nt h ev a l u e a d d e d p r o c e s so fr a p e s e e dm e a l o nt h eb a s i so fa l k a l i e x t r a c t i o na n da c i d p r e c i p i t a t i o nc o m b i n i n g ，t h e r a p e s e e dp r o t e i ni s o l a t e ( r p i ) f r o md o u b l e l o wm e a lw a so b t a i n e d ，t h e nc o m p l e x a m i n oa c i d sw a so b t a i n e df r o mr a p e s e e dp r o t e i ni s o l a t eh y d r o l y z e db yt w ok i n d so f e n z y m e ( a l c a l a s ea n dn e u t r a lp r o t e a s e ) a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d t h es y n t h e t i cc o u d i t i o n so fc o m p o u n da m i n oa c i dc h e l a t e dc o p p e rf r o mc o p p e ra n d c o m p o u n da m i n oa c i dw e r es t u d i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h es y n t h e s i sw e r e f o u n d t h em a i nc o n c l u s i o n so ft h ee x p e r i m e n t sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s tc o n d i t i o n so fa l c a l a s eh y d r o l y z ew e r e w h e np hw a s10 5 ，t h el i q u i d ：s o l i dr a t i ow a s15 ：1 ，t h et e m p e r a t u r ew a s5 0 c ，t h e t i m eo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sw a s2h o u r s ，t h ee n z y m ec o n c e n t r a t i o nw e r e3 2 5 0 u p e rg r a mo fs u b s t r a t e a n dt h eb e s tc o n d i t i o n so fn e u t r a lp r o t e a s eh y d r o l y z ew e r e w h e np hw a s9 ，t h et e m p e r a t u r ew a s4 5 ，t h et i m eo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sw a s2 h o u r st h ee n z y m ec o n c e n t r a t i o nw e r e3 2 5 0 up e rg r a mo fs u b s t r a t e i nt h i s c o n d i t i o n ，t h ed ho fc o m p o u n da m i n oa c i dw a s4 5 8 3 a n dt h en i t r o g e ny i e l dw a s 8 2 7 5 ：w h e nt h ep r o d u c t i o ni np h3 - 6 ，t h en s l w a si nt h ea b o v eo f7 5 4 3 t h e t c a n s io fp r o d u c t i o nw a s91 71 ( 2 ) t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h ec o n t e n to ft a n n i n 、g l u c o s i n o l a t ea n d t h ein o s i t o l h e a p h o s p h o r i ca c i di nt h ee n z y m a t i cp r o d u c t i o nw e r el o w e rt h a nr a p e s e e dm e a l ，i t c o n t a i n st o om a n yk i n d so fa m i n oa c i d a n dt h ee s s e n t i a la m i n oa c i d t h em o d eo f t h eh u m a nm i l kc o u l db ea p p r o a c h e db yi n c r e a s i n gs o m ek i n d so fa m i n oa c i d s i t c a nb ea p p l i e dt ot h ef e e d i n g s t u f fo rf o o da d d i t i v e s t h u si t sv a l u ei nu s ew i l lb e i m p r o v e d ( 3 ) t h ep r o d u c tw a st e s t i f i e db yn a 2sc h e m i c a lm e t h o da n di r ，i tm a k e so u t c o m p o u n da m i n oa c i dc h e l a t e dc o p p e rw a s o b t a i n e d ( 4 ) t h ee x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a ti t sm a i nf a c t o r sw e r ep ha n d t h em o l a rr a t i o o ：t n g a n qo fc o m p o u n da m i n oa c i dt oc o p p e rc a t i o ni nt h er e a c t i o n ，a n dt h em 0 1 a r 稳1 1 0o f | l g a n do fc o m p o u n da m i n oa c i da f f e c tt h er e a c t i o np r o m i n e n t l y 裁m e 鑫建曩 t e m p e r a t u r eo ft h er e a c t i o na f f e c t e d v e r yl i t t l e b e s i d e s ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o no f s y n t h e s i z i n gc u ( i i ) c o m p o u n da m i n oa c i dc h e l a t ew a sg o tt h r o u g ht h e l 16 ( 4 5 ) e x p e r i m e n t ：t h a tt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e i s5 0 。c ，t i m e5 0 m i n ，t h em 0 1 a rr a t i oo f i l g a n do fe o m p o u n da m i n o a c i dt oc o p p e r c a t i o n2 ：1a n d p h 9 i nt h i sc o n d i t i o 廷s ， t h ec h e l a t l o nr a t i oo fc o m p o u n da m i n oa c i d w i t h c o p p e rw a s9 4 5 9 ，a n dt h ec o n t e n t o f c o m p o u n da m i n or e a c h e du pt o3 0 2 0 k e y w o r d s ：r a p e s e e dm e a l ；r p i ；c o m p l e xa m i n oa e i d s ；a 1 c a l a s e ；n e u t f a l p r o t e a s ec o m p l e xa m i n oa c i d s ；c u ( i i ) - - c o m p o u n da m i n o a c i d c h e l a t e 插图清单 图2 1 硫苷标准曲线1 6 图2 2 单宁酸标准曲线17 图2 3 酪氨酸标准溶液曲线一1 9 图2 4 菜籽粕氨基酸分析图谱2 1 图2 5 不同蛋白酶对菜籽蛋白水解度的影响2 2 图2 6 不同温度预处理对水解度的影响2 2 图2 7 不同时间预处理对水解度的影响2 3 图3 1 不同p h 对碱性蛋白酶水解菜籽蛋白的水解度的影响2 9 图3 2 不同温度对碱性蛋白酶水解菜籽蛋白的水解度的影响一3 0 图3 3 液料比对碱性蛋白酶水解菜籽蛋白的水解度的影响一3 0 图3 4 加酶量对碱性蛋白酶水解菜籽蛋白的水解度的影响31 图3 5 反应时间对碱性蛋白酶水解菜籽蛋白的水解度的影响一3 1 图3 6 碱性蛋白酶水解度与各因素水平的直观分析图3 3 图3 7 不同温度对中性蛋白酶水解菜籽蛋白的水解度的影响一3 4 图3 8 加酶量对中性蛋白酶水解菜籽蛋白的水解度的影响3 4 图3 9 不同p h 对中性蛋白酶水解菜籽蛋白的水解度的影响3 5 图3 1 0 反应时间对中性蛋白酶水解菜籽蛋白的水解度的影响3 5 图3 1 1 中性蛋白酶水解度与各因素水平的直观分析图3 7 图3 1 2 酶解产物在不同p h 值溶液中氮溶解指数( n s i ) 趋势图3 8 图3 13 水解产物氨基酸分析图谱3 9 图4 1p h 值与吸光度的关系一4 4 图4 2 反应温度的影响4 5 图4 3 反应时间的影响4 5 图4 4 配位比的影响4 6 图4 5 复合氨基酸的红外光谱图一4 9 图4 6 复合氨基酸螯合铜的红外光谱图4 9 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得 金目墨王些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签字：罗荔荔 答字目如：1 叫胁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 金目巴工业太堂 有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权 金肥工业太堂可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名： 罗磊毪 签字嗍：1 ”肿日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名 签字日期力产月堋 ， 电话： 邮编： 致谢 本课题的研究和论文的完成是在我的导师姜绍通教授的悉心指导下进行 的。姜老师不仅给我提供了宽松的实验环境，而且在论文的选题及实验安排方 面都做了大量的工作，倾注了大量心血。姜老师鼓励我大胆创新和尝试，培养 了我独立进行试验、分析和解决问题的能力，导师严谨的治学态度一直深深影 响着我，使我深感荣幸和自豪，在此，向姜老师表示衷心的感谢和崇高的敬意! 在试验过程中，感谢潘丽军教授、郑志副教授、孙汉巨副教授、罗水忠老 师、李兴江老师、雷红老师、操丽丽老师、韩卓老师、潘牧博士、吴学风博士、 刘模博士、张福建博士等诸位老师和同学给予我的指导和帮助，也感谢实验室的 聂慎德、张丽、胡燕红、蔡静、罗炳华、冯丽桦、刘靖、桂蕾同学，在试验中他们给 予我许多帮助。有了他们，我的论文才得以顺利完成。同时研三十二班的同学在 学习和生活上对我的关心令我十分感激! 我还要向我的父母及亲朋好友表示感谢，他们的支持是我不断前进的动 力。 回首在工大三年的研究生生活，感触非常多。学校的悉心培养，老师的谆 谆教诲。同学的关心帮助，历历在目，令我永生难忘。在此，我要向敬爱的老师 和友善的同学致敬! 作者：罗蕾蕾 2 0 0 9 年2 月 第一章前言 1 1 菜籽粕的开发利用进展 油菜籽是我国重要的油料作物之一，年产量达到10 0 0 万吨以上，种植面积 超过1 亿亩，均居世界首位。由于双低油菜籽大大降低了硫代葡萄糖甙的含量， 同时蛋白质含量高，氨基酸组成合理，富含赖氨酸，几乎不存在限制性氨基酸， 接近联合国粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 的推荐值，所以我国大 力推广种植双低油菜，目前，种植面积己占油菜总种植面积的近8 0 。农业部 启动实施的2 0 0 3 2 0 0 7 年优势农产品区域布局规划中，双低油菜籽被列为1 1 个优势农产品作物之一。双低菜籽粕中蛋白质含量一般为3 5 - - 一4 0 ，可消化 蛋白达到2 7 8 ，硫苷比传统油菜籽少9 8 ，脱除硫苷、植酸等抗营养因子后的 双低菜籽蛋白质量优于大豆粕，添加比例可达8 0 ，是一种优质蛋白资源。但 是，目前我国对菜籽饼粕的利用价值较低，仅用作肥料或按少量比例添加作反 刍动物和淡水鱼养殖饲料。双低菜籽粕、普通菜籽粕和豆粕的成分比较见表1 1 。 表1 1 双低菜籽粕、普通菜籽粕和豆粕的部分组分含量【3 】 t a b l e i 1c o n t e n t so f t h en u t r i e n ti n g r e d i e n t si nd o u b l e l o wm e a l ，c o m m o nm e a la n ds o y b e a nm e a l 双低菜籽粕和普通菜籽粕有毒有害物质见表1 2 。 表1 2 双低籽粕和普通菜籽粕有毒有害物质组成【3 j t a b l e l 2c o n t e n t so ft h et o x i ca n dn o x i o u si n g r e d i e n t si nd o u b l e 1 0 wm e a l c o m m o nm e a l 项目双低菜籽粕普通菜籽粕 oztmgg00590 0 1 2 9 9 t i c m g g 。1 硫苷u m 0 1 g 。1 植酸 单宁 0 4 0 3 2 7 2 0 1 9 3 1 6 8 1 1 1 菜籽蛋白及其国内外应用和研究现状 1 1 1 1 菜籽蛋白 菜籽蛋白是一种优质蛋白质，其最大的特点是含硫氨基酸和赖氨酸的含量 高，菜籽蛋白的氨基酸组成符合f a o w h o 的推荐模式值1 4 j ，菜籽蛋白效率比值 ( p e r ) 为3 - 3 5 ，而酪蛋白p e r 值为2 5 ，且其蛋白质净利用率( n p u ) 、蛋白质生 物价( b v ) 均高于其它植物蛋白l s l 。与各油料蛋白质、禾谷类蛋白质相比具有明 显营养互补优势，一些功能指标优于大豆蛋白【6 | 。有研究表明纯菜籽蛋白的利 用率为8 7 9 0 ，动物试验表明其适口性好于酪蛋白，仅次于牛排。因此， 菜籽蛋白是一种非常优良的蛋白质。但是，菜籽蛋白作为一种食物蛋白仍然由 于一些抗营养成分，如植酸、多酚类物质等的存在而受到限制 7 1 。 我国是蛋白质资源比较缺乏的地区，将大量廉价的菜籽蛋白转化为人类优 质的食品蛋白源具有重要的社会和经济意义。菜籽分离蛋白具有其它蛋白应有 的共性，即菜籽分离蛋白具有多功能性的特性，采用不同方法，对菜籽分离蛋 白进行功能性的调整，可充分发挥菜籽分离蛋白的功能特性，扩展其在食品加 工业中的应用范围1 8 1 。利用菜籽蛋白不同功能特性，可改善传统食品的加工性 能，提高食品风味、品质，降低成本，而在模拟食品、食品保鲜等方面的应用， 更扩展了菜籽蛋白的应用领域。同时具有产量大、价格便宜、不含胆固醇等优 点。随着对菜籽分离蛋白功能特性研究的进一步深入，菜籽蛋白资源的综合利 用及开发，将会取得更大的进展。 1 1 1 2 菜籽蛋白的应用 菜籽蛋白应用非常广泛，目前主要应用于以下领域： 在食品加工中的应用： ( 1 ) 利用菜籽蛋白稳定乳化性和保持水分的功能特点，可减少制品在加工 过程中水分的损失和脂肪的溢出，使口味、品质和得率提高，如作为脂肪替代 物、增味剂、乳化剂和组织改良剂，用于火腿肠或传统香肠、午餐肉和肉脯等 的生产。 ( 2 ) 利用其特殊结构质地能赋予制品咀嚼感，减少蒸煮损失，降低脂肪 含量，增加弹性，延长产品货架期，如生产肉丸。 2 o o) 8 6 “俐渊 l 熨2 0 ( 3 ) 利用植物蛋白与动物蛋白能达到营养平衡互补的优势，在碎肉中添加 3 3 的菜籽蛋白，可将其生物价由7 6 3 提高到8 6 3 。 ( 4 ) 将菜籽蛋白添加到食品中，可制成复合高蛋白食品；将菜籽蛋白添加 到谷物蛋白或其他油料蛋白中，可起到补充或强化营养的作用，可提高蛋白制 品的营养价值。 在食品保鲜中的应用： 菜籽分离蛋白特别是改性菜籽分离蛋白具有良好的成膜性，在一定条件下， 添加适量的助剂( 如甘油) 可制成具有良好隔绝氧能力和抵抗水分迁徙性能的安 全无毒的天然食用保鲜膜，此类膜可广泛地应用于糕点、水果、蔬菜和肉制品 等的保鲜，以及应用于糖果制造和医药领域 9 1 。 其它应用：菜籽分离蛋白的多功能特性使之在许多食品领域都有广泛的应 用，如可替代大豆粉生产酱油。在乳制品方面，菜籽分离蛋白可作为添加剂或 生产类似乳制品的替代物，可降低动物脂肪量，增加植物蛋白含量，提高营养 价值，降低成本。 1 1 1 3 菜籽蛋白提取分离的研究现状 目前从饼粕中提取菜籽蛋白主要有以下几种方法：( 1 ) 水相法：采用不同 水相将蛋白萃取出来，在蛋白等电点附近将蛋白沉淀，再分离干燥制取菜籽分 离蛋白。最常用萃取水相是稀碱、水、稀酸、n a c i 水溶液及六偏磷酸钠溶液等。 此方法具有工艺简单、成本低等优点，容易得到实际应用，存在的主要问题是 蛋白质损失大，原因在于菜籽蛋白组成非常复杂，其等电点和分子量相差很大， 部分蛋白质( 2 0 4 0 ) 等电点p h 高达约1 1 ，分子量仅l3 0 0 ，而其余部分蛋白质 等电点在p h 4 8 。a g r i c u l t u r ec a n d sf o o dr e s e a r c h l n s t i t u t e 和k a r l s h a m n s 公司开 发了菜籽浓缩蛋白制取工艺：将破碎了的菜籽用沸水或干热使芥子酶失活、硫 苷用水洗脱除，脱毒粕经取油、脱溶、磨细得到浅黄色浓缩蛋白。用上述方法 得到的浓缩蛋白中蛋白质含量达到6 0 6 5 ，植酸含量偏高，达到5 7 i l 。 何再庆等l 采用1 ：2 0 料液比经三级对流萃取，蛋白得率在8 0 以上，浓缩蛋白 的蛋白质含量为5 9 。e 1n o c k r a s l y 采用n a o h 溶液四级逆流萃取，萃取出粕中 9 4 氮，然后在p h 6 0 $ 1 p h3 6 下二次沉淀，总收率可达原始饼粕中7 2 氮。李 顺灵【1 2 】等采用水剂法与六偏磷酸钠浸出法( s h m p ) 结合工艺，得到1 0 s h m p 蛋 白浸出液( p h 7 0 ) ，经超滤浓缩、离子交换，得到高品质菜籽分离蛋白，蛋白含 量为8 7 5 ，产品无硫苷，低植酸，味淡色浅。( 2 ) 水相酶解法：水相酶解法 主要是利用蛋白酶将菜籽粕中蛋白质充分溶出，改善植物蛋白质的溶解性、乳 化性和起泡性，提高蛋白质的营养价值及蛋白质得率，消除油料饼粕中有害成 分对人体和动物的不良影响，但是存在植物蛋白质经酶水解后产生苦味的问题 【13 1 。刘志强【1 4 】等将水酶法和超滤( u f ) 结合同时提取菜籽油和菜籽蛋白过程中， 按固液比1 ：5 ，添加纤维素酶、果胶酶复合酶，经搅拌、反应、碱提、离心分离 得出菜籽蛋白水提液，超滤制备出菜籽蛋白粉。菜籽蛋白含量及得率达9 0 以 上，产品中粗脂肪、粗纤维及植酸低于酸沉法，异硫氰酸醋、嗯哇烷硫酮均未 检出，达到食用标准，并且蛋白质功能特性得到很大改善。( 3 ) 有机溶剂法： 用醇、酮等有机溶剂液萃取蛋白是常用的去除粕中毒性物质的方法。醇类不光 对去毒除硫苷的效果好，还有除去粕中残油、酚、色素等因子，提高产品风味， 改变色泽的特殊功效。但因工艺复杂，成本高及溶剂对蛋白质营养价值有一定 影响，工业化生产困难较大。严奉伟l l5 j 通过7 0 丙酮和其它溶剂依次提取菜籽 饼粕中多酚和植酸后得到含7 0 2 3 蛋白质粕。( 4 ) 双液相萃取法：利用饼粕 中籽皮和籽仁在密度等性质上存在的差异，王车礼等【l6 j 采用c a c l 2 ：水溶液和二 氯乙烷为液选剂处理菜籽粕，从菜籽粕粒度小于0 2m m 饼粕得到含量大于5 8 蛋白质，有少量籽皮。( 5 ) 超滤、渗滤法：利用超滤膜对分离组分选择性，截 留分子量较大( 一般菜籽蛋白质大小范围为8 ，0 0 0 6 0 0 ，0 0 0u 之间) 各种蛋白质分 子或相当粒径胶体物质，可将蛋白质浓缩和分离并保留在截留物中，产品蛋白 具有较佳氨基酸组成。缺点为膜容易被阻塞，分离效率下降。m a u b o i s 等在1 9 7 6 年首先采用了超滤法生产菜籽分离蛋白，得到的产品含7 6 蛋白质。j k r o l 1 。7 j 等人在菜籽饼粕的实验中发现：通过超滤在所有的透过物中，采用2 0 三氯乙酸 溶液来检测，均未检出蛋白质。s i y 和t a l b 0 1 1 18 1 19 8 2 年报道用4 n a c i 溶液浸提， 以l ：3 透滤比率，利用超滤和渗滤处理盐溶球蛋白，使球蛋白沉淀，同时溶液中 植酸盐含量大幅降低，经喷雾干燥得到蛋白质含量为8 5 6 。加拿大多伦多大 学开发出一系列菜籽分离蛋白提取过程1 6 1 ，主要包括：碱萃取与洗涤以提取粕中 蛋白质、等电点沉淀以回收沉淀蛋白( p p d 、超滤浓缩和渗滤纯化得到可溶性蛋 白( s p i ) 四个步骤，该工艺具有高蛋白质得率、高产品质量的特点。在有活性碳 情况下，a n n a d u r a i g l 阳j 将浸提、超滤和透滤相结合，用强碱阳离子交换树脂处 理透滤截留物能产出蛋白含量约为9 0 分离蛋白，且无硫代葡萄糖苷及其裂解 物，植酸盐含量较低，成品色浅味淡。2 0 0 4 年法国s b e r o t 等 2 0 1 提出利用纳滤、 阳离子交换与分子排阻层析结合可以大规模纯化菜籽蛋白，产物中杂质含量小 于5 。2 0 0 5 年日本东京大学y u m i k oy o s h i e s t a r k 等1 2 i 】对经蒸煮过和未蒸煮的菜 籽粕中提取的蛋白进行对比研究发现前者相比后者吸油性、起泡性、溶解性下 降，但代替干酪素加入香肠明显提高味道、香味和组织结构等属性。两者水解 后对a c e 抑制能力、d p p h 清除能力、胆酸结合力明显提高，且两者区别不大。 目前比较适用的食用菜籽蛋白提取方法主要是有机溶剂法和水相法。前者 因工艺复杂、成本高及溶剂对蛋白质营养价值和食用安全性有一定影响，工业 化生产困难较大。而后者即碱提酸沉法，其工艺简单、成本低，易于工业化生 产。 1 1 2 菜籽蛋白水解 植物蛋白的结构大都十分紧密，分子量很大，人体摄入后，低分子量的含 4 氮产物不易释出，不易消化吸收，吸收率往往低于动物蛋白，植物蛋白经过水 解后，分子量减少，结构松疏，便于人体内酶的作用，吸收率大大提高【2 2 1 。此 外，通过水解改性可改变分子空间构象，并将分子量降到一个适当的范围，获 得表面活性较为理想的水解蛋白。在食品行业中，水解动物蛋白( h a p ) 和水解 植物蛋白( h v p ) 由于其营养丰富，风味独特，己经成为一种很好的调味基料和 营养强化剂。在医药工业中，容易消化吸收的肽和氨基酸可作为处于特殊状况 人群的营养强化剂。在化妆品行业中，水解蛋白具有良好的表面活性、乳化性 和润滑性，是护肤和护发品的优质基料之一。 目前，菜籽蛋白的水解方法主要有( 1 ) 酸或者碱水解法：此法水解彻底， 水解度较高，水解产物一般是单个氨基酸和各种短肽。但反应过程较难控制， 不易确定水解位点，产物的相对分子量分布较宽，水解液的风味色泽不好，采 用酸水解时，组成蛋白质的氨基酸中色氨酸被破坏，丝氨酸、苏氨酸也有部分 被破坏。碱法水解时虽然不破坏色氨酸，但是其它氨基酸如精氨酸、半胧氨酸 等被破坏的相当厉害，氨基酸残基还容易产生外消旋作用，降低了产物的营养 价值。( 2 ) 酶一酸两步水解法：先用蛋白酶对菜籽饼粕进行初步酶解，再用盐 酸进行彻底的水解。在酸水解之前进行酶解的主要目的是将大分子的蛋白质初 步酶解成多肽、寡肽及少量氨基酸等物质，以使蛋白质的分解反应更温和，同时， 蛋白酶可将菜籽细胞壁、细胞膜上的蛋白释放出来。酸对蛋白的水解比较快速 彻底，作用强烈，但随着水解时间的延长，己生成的氨基酸脱氨、脱羧反应也越来 越强，并产生大量异味物质，这种负反应在高浓度酸解时表现更为剧烈，当超过水 解终点时氨基酸损失严重。( 3 ) 酶水解法：随着生物技术和酶制剂工业的不 断发展，酶法水解蛋白质，对蛋白质进行改性的应用越来越普遍，利用酶水解 法制备的酶水解蛋白质技术己经成功应用于多种水解植物蛋白和水解动物蛋白 的生产。现今，此技术己经发展到相当的水平，能够控制水解过程和水解程度， 得到期望链长范围的肽，能控制酶解所断裂的肽键位置，得到含有期望结构和 期望功能性质的肽。 1 2 微量元素螯合物及其国内外应用和研究现状 1 2 1 复合氨基酸微量元素螯合物 1 9 7 3 年w h o 确认人体必需的微量元素为1 4 种：f e ，z n ，c u ，m n ，c r ， m o ，c o ，s e ，n i ，v ，s n ，f ，i ，s i 。最初人类使用的是微量元素的无机盐 如硫酸盐和氧化物，以及一些简单的有机酸盐，在应用中它们存在生物学利 用率低、生化功能不稳定等缺点。自从美国a l b i e n 实验室成功研制微量元素 氨基酸螯合物以来，由于其具有显著的营养效果，就把微量元素氨基酸螯合 物的应用推上了新台阶。微量元素氨基酸螯合物被称为继无机盐及简单有机 态矿物盐之后的第三代微量元素添加剂，在饲料加工、饲养和环保中具有众 多优点。美国饲料管理官方协会( a a f c o ，1 9 9 6 ) 正式确定微量元素氨基酸 螯合物的概念为：可溶性金属盐中的金属离子与氨基酸按一定摩尔比( 1 ：l 或 l ：3 ，较理想的1 ：2 ) 反应形成的配位共价键结合而成，水解氨基酸的平均分 子量为1 5 0 左右，所形成的螯合物的分子量不应超过8 0 0 。际生产中根据微 量元素和氨基酸构成来划分螯合物的种类。以配位体氨基酸分类：蛋氨酸系 列、赖氨酸系列、甘氨酸系列等。以微量元素分类：铁螯合物、锌螯合物、 铜螯合物等等。还有由非氨基酸配位体制成的络合物，虽然结构上与氨基酸 螯合物有别，但对动物的微量元素营养效果却是相似的，故生产中也把它们 归属螯合物范畴，如羟基酸螫合物( 烟酸吡啶铬) 、多糖和糖苷的络合物、水解 蛋白的螯合物等。 1 2 2 氨基酸微量元素螯合物的特点 1 2 2 1 稳定的化学性质，吸收利用率高 第一代的无机微量元素添加剂由于带有结晶水，吸湿性强、易结块、易氧 化、流动性差，在存放和使用过程中易受饲料中的p h 值、脂类、纤维、草酸、 维生素或胃酸等物质的作用，使一部分金属元素与其他物质发生化学反应，形 成机体不能或难以吸收的物质，生物学利用率低。第二代的简单有机盐，虽然 稳定性好，但与部分营养物质仍会发生拮抗作用。在消化吸收过程中受影响的 因素也较多，生物学利用率仍较低，而微量元素氨基酸鳌合物因其金属离子与 氨基酸分子通过配位键结合后，使其分子内电荷趋于中性，形成了较稳定的化 学结构，使金属离子免受日粮中其他成分和胃肠中胃酸等不良作用，保护了金 属离子的理化性质，不仅稳定性好、流动性好，拮抗作用少，而且消化过程中 受影响的因素小，便于机体对金属离子的充分吸收和利用，从而提高了微量元 素的生物学利用率。2 0 0 0 年邵建华等研究发现，氨基酸鳌合铜的吸收率比碳酸 盐大5 8 倍，比硫酸盐大4 1 倍；氨基酸鳌合锌比硫酸盐大2 3 倍；鳌合镁比碳酸 盐大1 8 倍，比硫酸盐大2 6 倍1 2 3 。 1 2 2 2 较高的生物学效价 第一代和第二代微量元素添加剂被动物吸收后，必须借助于辅酶的作用， 与氨基酸和其他物质形成螯合物后，才能穿过细胞膜，吸收后的金属元素在血 液中必须与某些蛋白结合后才被运输到机体所需的部位，才能产生功效。而微 量元素氨基酸螯合物它既是机体吸收金属离子的主要形式，又是动物体内合成 蛋白过程中的中间物质。并且微量元素氨基酸螯合物稳定常数适中，需要时金 属离子又可有效地释放出来供机体利用。因而直接供给微量元素氨基酸螯合物 吸收速度比无机盐快2 - 6 倍。2 0 0 0 年周桂莲等通过研究不同铁源生物学效价的 结果也显示，赖氨酸鳌合铁和甘氨酸螯合铁的生物学效价分别比硫酸亚铁高 1 7 3 4 8 3 1 和2 7 5 4 7 1 9 1 2 4 j 。1 9 9 9 年滕冰等以鸡体锌沉积率或锌表观代 谢率为判定指标，以硫酸锌1 0 0 ，各种锌源综合平均生物效价相对值：蛋氨酸 锌为1 5 5 和3 1 7 ，乙二胺四乙酸锌1 4 1 和2 6 0 ；而硫酸亚铁的利用率为1 0 0 6 【25 1 。 1 2 2 3 双重营养作用和抗病抗应激作用 动物在摄入时，同时摄入了动物所必需而饲料中往往缺乏的两种营养物质 一微量元素和氨基酸，因而具有双重营养作用。另外，微量元素氨基酸螯合物 具有增强抗菌能力、提高免疫应答反应、促进动物细胞和体液免疫力的功效， 对某些肠炎、皮炎、痢疾和贫血有治疗作用，同时可以增强体内酶的活性，提 高蛋白质、脂肪和维生素的利用率。微量元素氨基酸螯合物还具有良好的抗应 激功能。 1 2 2 4 毒副作用小，适口性好 无机微量元素不仅因其有特殊的味道，影响动物的适口性而且应用过量会 造成动物的中毒。试验证明，微量元素氨基酸螯合物的半致死量远远大于无机 盐，毒副作用小，安全性好，且具有较好的适口性，易为动物采食吸收。 1 2 2 5 使用方便，对饲料成分破坏作用小 微量元素被氨基酸螯合后，生成稳定常数适中的螯合物，具有与其他添加 剂混合贮存无配合禁忌等优点。据报道，微量元素氨基酸螯合物与维生素、抗 生素等配合使用，与使用无机盐相比可分别提高维生素a 和c 的存留率2 0 和 4 5 。同时，由于用量少，还可避免使用高铜等微量元素所造成的环境污染。 1 2 3 国内外研究概况 随着研究日渐深入，人们对氨基酸螯合物的营养作用和代谢方式的认识也 不断提高。由于畜牧业生产的发展导致饲料添加剂的出现和广泛应用，国内外 关于螯合物的研究报道也与日俱增。19 8 9 年美国饲料监察局的官方出版物中， 载入了多种金属元素氨基酸螯合物以及被称为”金属元素蛋白盐”的复合物。 1 9 7 7 年a s h m e a d 博士报道铁螯合物可以预防仔猪缺铁性贫血。美国a l b i o n 公司、 z i n p r o 公司和a l h e c h 公司也有各种商品微量元素螯合物投放市场1 2 引。各高等院 校和研究机构陆续发表不少文章。1 9 7 9 年我国台湾省立屏东农业专科学校，华 南农业大学也曾报道用进口的”铁血粒”等螯合物添加剂预防仔猪贫血。8 0 年代 末，东北农学业大学滕冰等在实验室合成并制备了高纯度蛋氨酸螯合锌( i i ) ， 并通过红外分析证实其结构为螯合物。阎立新论证了各种锌源的综合平均相对 生物效价。螯合锌在锌的利用方面明显优于硫酸锌，表现出显著的抗植酸和高 钙的不良影响。进入9 0 年代，我国动物营养和饲料界对微量元素氨基酸螯合物 的兴趣明显升温。先后有王彩彬等多人发表综述和翻译文章，介绍微量元素氨 基酸螯合物的饲料和营养功效。也有人自行合成螯合物或申报专利，或提供材 料用于动物试验。1 9 9 7 年唐豫顺等人合成稀土氨基酸螯合物用于畜禽生产和水 产养殖试验【2 。2 0 0 0 年前后美国的a l l t e c h 和z i n p r o 两家饲料公司进入中国，在 北京和广州设有办事机构或联络处。近年来，这种新型添加剂的研究得到了迅 速发展，国内的研究集中于开发、应用效果、产品检测等方面。目前主要的产 7 品有蛋氨酸铁、蛋氨酸铜、蛋氨酸钴、赖氨酸铁、赖氨酸铜、甘氨酸铁等，以 及一些复合微量元素氨基酸螯合物添加剂，主要还是应用于畜禽业和水产养殖 业上，用来提高动物的生长速度、降低饲料消耗、提高动物的抗病能力等。但 由于其价格昂贵，质量不一，在实际生产中并未得到广泛应用因此寻找低值蛋 白源，改进生产工艺，降低生产成本是推广应用氨基酸螯合物的关键。 在合成方法上，目前开发微量元素氨基酸螯合物的技术研究主要还是集中 在蛋白资源水解成复合氨基酸或单体氨基酸与金属盐在液相体系中合成，以及 非水体系合成法、干粉体系合成法、电解合成法、相平衡合成法等。除了水体 系合成法较为常用外，其他方法由于其自身存在的缺陷或不合理因素，故较为 少用。应用不同的蛋白原料，那么就存在不同的制备氨基酸工艺；因此由这些 蛋白原料所生成的氨基酸的质量就参差不起。目前，较多数采用成本低廉蛋白 原料如角蛋白、胶原蛋白以及发酵工业副产品等。如2 0 0 5 年冯贵颖、刘娟等 探讨了废弃羽毛水解的复合氨基酸与金属螯合的最适条件i 2 8 j 。2 0 0 6 年李亚萍以 皮革下脚料铬革屑经碱法制得的蛋白粉为复合氨基酸来源对饲料添加剂复合氨 基酸螯合物的合成工艺条件进行了研究怛引。以上报道中水解环节均采取酸碱水 解法，产生的废液、废渣量多，对环境的污染严重，同时水解生成的氨基酸质 量不高，影响了氨基酸螯合物产品的质量。以菜籽粕为原料制备氨基酸螯合物 却很少见，2 0 0 2 年刘海梅、熊善柏对脱脂油菜籽饼粕中蛋白质的碱性蛋白酶与 木瓜蛋白酶分步水解进行了研究。2 0 0 6 年杨柳等以菜籽粕为原料，以水解度为 衡量指标，确定采用碱性蛋白酶、酸性蛋白酶进行水解菜籽粕。但也只限于 水解这一步，因此探求一种以菜籽粕为原料合成氨基酸螯合物的合理工艺就迫 在眉睫。 1 2 4 复合氨基酸螯合铜 氨基酸微量元素螯合物的研究中，微量元素有c u 、f e 、c a 、z n 等金属离子， 其中，铜是作物体内各种氧化酶活化剂的核心元素，在催化生物体内氧化还原作 用方面起着重要作用。铜也是血液形成所必需的元素之一，能催化铁组合到血 红素的结构中去，并参与多种酶的合成，是许多酶的重要组成成分。氨基酸螯 合铜是由铜盐中的铜离子分别与几个氨基酸分子按比例形成配位键的不同稳定 化合物。主要种类有赖氨酸铜、蛋氨酸铜、甘氨酸铜以及复合氨基酸铜螯合物。 铜与氨基酸形成螫合物后，使分子内电荷趋于中性，氨基酸螫合铜形成的5 元环 和6 元环具有很好的稳定性，可防止其被吸附在有碍元素吸收的不溶解胶体上， 受其他无机盐或拮抗物的影响较小。 大量研究表明氨基酸螫合铜具有较高的生物学效价。d u 等研究认为，赖氨 酸铜和蛋白铜的生物学利用率显著高于硫酸铜( 以组织铜含量为衡量指标) 3 0 l 。 1 9 9 7 年w a r d 报道，1 0 0m g k g 的赖氨酸铜来源的c u 2 + 断奶仔猪的促生长效果与 2 0 0m g k g 的硫酸铜来源的c u 2 + 等效l3 1 1 。田科雄等在二元杂种去势公猪的代谢 8 试验中测得蛋氨酸羟基类似物的螫合铜( c u m h a ) 的生物学效价( 以硫酸铜为 1 0 0 计算) 为1 9 1 4 7 p 引。这主要是因为：( 1 ) 氨基酸螫合铜利用氨基酸和肽的 吸收通道被吸收，从而避免与铁、锌、锰等无机矿物元素竞争吸收通道；( 2 ) 氨基酸螫合铜可以黏附到氨基酸上，且其分子内电荷趋于中性，在体内p h 环境 下溶解度好，吸收率高。易于被小肠黏膜吸收进入血液，供给周身细胞；( 3 ) 氨基酸螫合铜受配位体的保护，不易受胃肠道内不利于铜离子吸收的理化因素 的影响。 氨基酸螯合铜与无机铜相比，除生物学利用率