（食品科学专业论文）食品中百草枯残留免疫学分析方法的研究与应用.pdf

摘要 摘要 百草枯( p a r a q u a t ，p q ) 是一种广谱、灭生性有机杂环类除草剂。由于百草枯的广 泛应用，造成食品原料和水体污染，对人体健康产生潜在危害。目前百草枯检测方法大 多需要专门的仪器设备并且操作繁琐，已无法满足现场快速检测的要求。因此，研究和 建立一种方便、安全和快速的检测方法具有重要意义。本文以多克隆抗体和胶体金合成 标记技术为基础，建立了百草枯的酶联免疫( e l i s a ) 和金标免疫层析( g i c a ) 检测方 法，并将其应用于食品中的检测。 首先以4 ，4 联吡啶和碘甲烷为起始原料，经三步反应合成了百草枯半抗原n 一甲基 - n 戊酸基二吡啶二溴化物，经l c m s 、1 h n m r 和i r 鉴定结果表明，所得产物即为百 草枯半抗原( 简称p q - h ) ，其纯度为9 6 ，得率为6 9 。通过混合酸酐法偶联大分子 蛋白载体牛血清白蛋白( b s a ) 和卵清蛋白( o v a ) 制备免疫抗原( p q h b s a ) 和包 被抗原( p q h o v a ) ，并进行结构鉴定。利用分光光度法测定百草枯半抗原与b s a 的 偶联比为6 ：l 。 通过免疫新西兰大白兔，获得特异性多克隆抗体，效价为5 1 2 0 0 。建立了p q 检测 的间接竞争e l i s a 方法，经过多次棋盘试验，最终确立最适包被抗原浓度为o 3 肛g m l ， 抗体最佳稀释度为l ：5 0 0 0 。该方法的半数抑制率i c 5 0 为5 1 3n g m l ，最低检出限为0 0 0 5 n g m l 。百草枯与敌草快的交叉反应率小于o 1 。大豆样品的加标回收率在7 0 - 8 0 之间，相对标准偏差( r s d ) 低于l o 。 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，通过研究胶体金与抗体蛋白作用过程，确定稳 定标记1m l 胶体金需8 1p g 抗体蛋白，标记体系的最佳p h 为8 5 。以金标抗体作为分 析探针，p q h o v a 作为竞争抗原，以羊抗兔i g g 为控制抗体，构建直接竞争胶体金标 免疫层析检测体系。确定膜上包被抗原和羊抗兔二抗的最佳包被浓度分别为o 5m g m l 和0 1 1m g m l 。金标目测检出限为1 0n g m l ，检测时间约5m i n 。方法的重复性和稳定性 较好，经推测，该试纸条在室温下至少可以保存5 个月。对大豆进行加标回收试验，回 收率较好。 本研究所建立的检测食品中p q 残留的间接e l i s a 法和g i c a 法，快速、方便，具 有较好的实用价值，为e l i s a 检测试剂盒和金标试纸条检测食品中p q 的进一步研究提 供了重要的实验依据。 关键词：百草枯；食品；多克隆抗体：酶联免疫；胶体金试纸条 a b s t r a e t a b s t r a c t p a r a q u a t ( p q ) i sab i s q u a t e r n a r ya m m o n i u mc o m p o u n du s e da sa h e r b i c i d ew o r d - w i d e l y t h e r ei sap o t e n t i a lf o rh u m a ne x p o s u r et op qi ng e n e r a lp o p u l a t i o nt h r o u g hr e s i d u e so nf o o d m a t e r i a l sa n dw a t e r h o w e v e ra c t u a lm e t h o d s ，s u c ha sh p l c ，g ca n du va r et i m e c o n s u m i n ga n dn e e de x p e n s i v ei n s t r u m e n t s t h u s ，d e v e l o p m e n to far a p i da n dc o n v e n i e n t d e t e c t i o nm e t h o df o rl o c a lp qa n a l y s i si se x t r e m e l yd e s i r a b l e i nt h i sp a p e r , e n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) a n dg o l d - i m m u n o c h r o m a t o g r a p h ya s s a y ( g i c a ) i n v o l v i n gt h e u s eo fc o l l o i d a lg o l d l a b e l e dp o l y c l o n a la n t i b o d y ( p c a b ) s p e c i f i ct op q 觞t h em a r k e rw e r e d e v e l o p e df o rt h ea n a l y s i so fp qi nf o o d s f i r s t ，n 一( 4 一c a r b o x y b u t y l ) 一n - m e t h y l b i p y r i d i l i u m ( p q - h ) w a ss y n t h e s i z e db yu s i n g 4 ，4 一b i p y r i d i n er e a c t e dw i t hi o d o m e t h a n eb yt h r e es t e p s 7 n l i se x p e r i m e n tw a sc o n d u c t e di n d a r ku n d e rt h ep r o t e c t i o no fn i t r o g e na n dt h ep r o d u c t sw e r ei d e n t i f i e dt h r o u g hl c m s ， 1 h n m ra n di r ，s h o w i n gt h ep u r i t ya n dy i e l do ft h ep q - hw e r e9 6 a n d6 9 ，r e s p e c t i v e l y t h e n ，i m m u n o g e n ( p q h b s a ) a n dc o a t i n ga n t i g e n ( p q - h o v a ) w e r ep r e p a r e da c c o r d i n gt o t h em e t h o do f m i x e da n h y d r i d e t h er a t i oo fp q h a p t e nt ob s aw a s6 ：1 n e x t ，t h ep c a bt op q h - b s aw a sp r o d u c e db yi m m u n i z i n gn e wz e a l a n dr a b b i t s ，a n d t h et i t r eo ft h ea n t i s e r u mw a s512 0 0 t h e n ，a ni n d i r e c te l i s af o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp q w a sd e v e l o p e da n dt h eo p t i m a lw o r k i n gc o n c e n t r a t i o n so ft h ec o a t i n ga n t i g e na n da n t i s e r a w e r ed e t e r m i n e dt ob e0 3p g m la n dl ：5 0 0 0r e s p e c t i v e l ya f t e rs e v e r a lc h e s sb o a r dt e s t s 。t h e i c s 0a n dl o do ft h i sm e t h o dw e r e5 13n g m la n d0 0 0 5n g m l ，r e s p e c f i v e l y ，a n dt h ec r o s s r e a c t i v i t yb e t w e e np qa n dd i d q u a tw a sl e s st h a n0 1 b e s i d e s ，t h er e c o v e r i e so fp qi n s o y b c a nw e r er a n g e df r o m7 0 t o8 0 a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) w a sw i t h i n l o f i n a l l y , c o l l o i d a lg o l dw a sp r e p a r e dt h r o u g hr e d u c i n gh a u c h 。3 h 2 0b ys o d i u mc i t r a t e a n dp c a bs p e c i f i ct op qw a sc o n ju g a t e dt ot h eg o l dn a n o p a r t i c l e su n d e rf r i e n d l ya n do p t i m a l c o n d i t i o na sf o l l o w s ：o p t i m u mp hf o rc o n j u g a t i o nw a sd e t e r m i n e dt ob e8 5a n dt h el e a s t s t a b l ec o n t e n to fp c a bt oc o l l o i d a lg o l dw a s8 1 烬p e rm i l l i l i t e rg o l ds o l u t i o n t h e n ，ar a p i d ， s i g n a l s t e pa n ds e n s i t i v ec o l l o i d a lg o l dl a b e l e di m m u n o c h r o m a t o g r a p h i c ( g i c a ) t e s tf o r d e t e c t i o no fp qi nf o o d sw a sd e v e l o p e da n dt h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no fc o a t i n ga n t i g e na n d a n t i r a b b i t i g gw e r g0 5m g m la n do 1 1m g m l ，r e s p e c t i v e l y sm e t h o di s r a p i d ， c o n v e n i e n ta n dw i t hh i g hr e p e a t a b i l i t ya n ds t a b i l i t y , a st h et e s t i n gt i m ei sa b o u t5m i n ，t h e 1 0 w e s tv i s u a lo b s e r v a t i o nl i m i tw a sl0n g m la n dt h es h e l f - l i f eo fi m m u n o s t r i p sw a s a tl e a s tf i v e m o n t h sa tr o o mt e m p e r a t u r e b e s i d e s ，t h er e c o v e r i e so fp qi ns o y b e a nw a sg o o d i nc o n c l u s i o n ，t h ee l i s aa n dg i c ad e v e l o p e dt od e t e r m i n ep qr e s i d u e si nf o o d sh a v e g o o dp r a c t i c a lv a l u ea n dp r o v i d ea ni m p o r t a n te x p e r i m e n t a lb a s i sf o rt h ef u r t h e rs t u d yo n e l i s a t e s t i n gk i t sa n di m m u n o c h r o m a t o g r a p h yt e s t i n gp a p e r k e y w o r d s ：p a r a q u a t ；f o o d s ；p o l y c l o n a la n t i b o d y ；e l i s a ；c o l l o i d a lt e s t i n gs t r i p 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江 南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 盘缝遘 导师签名： 日期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 百草枯简介 百草枯( p a r a q u a t ，p q ) 又名克无踪、对草快，化学名为l ，l 一二甲基- 4 ，4 - 联吡啶阳 离子盐，纯品为白色晶体，蒸汽压 9 8 5 ) 敌草快标准品 碳酸钠 碳酸氢钠 氯化钠 磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 t w e e n 2 0 3 2 2 主要仪器 紫外可见光分光光度计s p e c t r o n i c1 7 0 t g l - 4 0 b 台式低速离心机 p b 4 0 0 1 e 型精密电子天平 1 8 北京生物制品研究所 上海华美生物工程有限公司 北京博奥森生物技术有限公司 上海安谱科学仪器有限公司 上海安谱科学仪器有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 意大利g b c 公司 上海安亭科学仪器厂 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 第三章抗百草枯抗体的制备及间接e l i s a 方法的建立 w h 2 微型旋涡混合仪 m u l t i s k a nm k 3 酶标仪 9 6 孔8 1 2 可拆酶标板 可调试移液器 上海沪西仪器分析厂 上海智理科学仪器有限公司 上海春博生物实验仪器有限公司 t h e r m ol a b s y s t e m s 公司 其他为实验室常用仪器设备。 3 2 3 主要溶液 ( 1 ) 包被缓冲液( 0 0 5m o l l 一，p h9 6 的碳酸盐缓冲液) ：0 3 1 5gn a 2 c 0 3 ，0 5 8 8g n a h c 0 3 ，加超纯水至1 0 0m l 。 ( 2 ) p b s ( 0 0 1m o l l 一，p h7 4 的磷酸盐缓冲液) ：8 7gn a c i ，o 2 5gn ah 2 p 0 4 ，3 0 9 n a 2 h p 0 4 - 1 2 h 2 0 ，溶于8 0 0m l 超纯水中，加热搅拌，待全部溶解后，加超纯水至 1 0 0 0m l 。 ( 3 ) 封闭缓冲液：3 b s a p b s 溶液。 ( 4 ) 洗涤缓冲液( p b s t ) - 含0 0 5 t w e e n 2 0 的p b s 溶液。 ( 5 ) 抗体及二抗稀释液：0 1 b s a p b s 溶液。 ( 6 ) 显色液：a 液( o 1m o l l 柠檬酸水溶液) ：柠檬酸2 1 0 1g ，双蒸水定容至1 0 0 0m l ； b 液( o 2m o l ln a 2 h p 0 4 ) ：7 1 6gn a e h p 0 4 1 2 h e o ，双蒸水溶解后，定容至1 0 0 0m l ， 保存备用。使用时，2 4 3m la 液与2 5 7m lb 液混合，加入5 0m l 双蒸水及 3 0 h 2 0 21 8 3 “l 。 ( 7 ) t m b - 4 2m gt m b 溶于1 0m l 乙二醇。 ( 8 ) 终止液：2m o l l 的h 2 s 0 4 溶液。 ( 9 ) 饱和硫酸铵溶液的配制：称( n h 4 ) 2 s 0 44 0 0 - 4 2 5g ，以5 0 - 8 0 。c 的双蒸水5 0 0m l 溶解，搅拌2 0m i n ，趁热过滤。冷却后用1 5m o l l 浓氨水调p h7 0 。调好的 饱和硫酸铵瓶底有结晶，4 。c 保存备用【2 1 。 ( 1 0 ) 萘氏试剂的配制：称h g i1 1 5g ，k i8g ，加双蒸水5 0m l ，搅拌完全溶解 后，再加入2 0 n a o h 溶液5 0m l ，常温避光保存【4 6 1 。 3 3 试验方法 3 3 1 抗血清的制备 取雄性新西兰大白兔2 只，健康，体重1 5 2 蚝。免疫前一周从耳缘静脉采血作阴 性对照。称取lm gp q h b s a ，用5m lo 1m o l l 的生理盐水溶解，然后取o 5m l 溶解 的抗原与o 5m l 完全福氏佐剂充分混合，乳化后供首次免疫用。初次免疫在新西兰大 白兔背部进行多点皮下注射，1m l 只。一个月后进行第一次加强免疫，采用四肢内部 肌肉注射，剂量与首次免疫相同，与等量不完全福氏佐剂混合充分乳化。共加强免疫4 次，每次间隔2 周。具体免疫程序见表3 1 。最后2 次加强免疫前从兔耳静脉采血，采 用间接e l i s a 法测定抗血清的效价。效价合格后，兔颈动脉放血，将采集的血液于室 温下静置，待血液凝集后放入3 7 。c 保温箱静置lh ，4 。c 静置过夜后，4 。c 、3 0 0 0r p m 离 1 9 江南大学硕士学位论文 心2 0m i n 后，得上清液即为抗血清。每只兔子的血清量大约在3 5m l 。 表3 1 实验动物免疫程序 t a b 3 - 1t h ei m m u n i t yp r o c e d u r e 3 3 2 抗血清的纯化 采用饱和硫酸铵盐析法纯化抗体m 。 1 ) 取1 0m l 血清于5 0m l 离心管中，加1 0m lp h7 0p b s ，于冰上轻轻振荡下逐 滴加入4 预冷的饱和硫酸铵2 0m l ，于4 冰箱中静置过夜，此时硫酸铵的终浓度为 5 0 。 2 ) 于4 4 0 0 0r m i n 离心2 5m i n ，弃上清，以6m lp h7 0p b s 溶解沉淀，再逐滴 加饱和硫酸铵4m l ，4 静置lh ，此时硫酸铵的终饱和度为4 0 。 3 ) 重复步骤2 ) 离心，用6 7m lp h7 0p b s 溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵3 3m l ， 4 静置lh ，此时硫酸铵的终饱和度为3 3 。 4 ) 重复步骤2 ) 离心，沉淀用6m lp b s 溶解，装入透析袋中。 5 ) 于4 。c 冰箱中，对2 0 倍以上的p b s 透析，期间换液数次，直至用萘氏试剂检测 透析液无黄色为止。 6 ) 将透析好的溶液冷冻干燥后分装，于2 0 保存备用。 3 3 3 纯化后抗体含量的测定 采用紫外分光光度法测定1 4 6 1 。核酸类物质在2 6 0n l n 的光吸收比2 8 0n l n 更强，而蛋 白质正相反。因此，可以利用2 8 0n l l l 与2 6 0n l n 的吸收差来计算蛋白质浓度。取o 5m l 纯化后的抗血清，加4 5m lp b s ( p h 7 o ) ，分别测定其在2 6 0n i n 和2 8 0n n l 的吸光值， 依据经验公式即可求出蛋白质浓度：蛋白质浓度( m g m 1 ) = 1 4 5 a 2 8 0 0 7 4 a 2 6 0 。 3 3 4 间接e l i s a 法测定抗血清的效价 采用方阵滴定法初步确定包被抗原和抗体的工作浓度，同时测定抗体效价。 1 ) 用碳酸盐缓冲液将包被抗原( p q h o v a ) 稀释成系列浓度，横向包被9 6 孔酶 标板，其中留一排用碳酸盐溶液包被，作为空白对比，1 0 0 “l 孔，分别设置平行，密封 后4 冰箱过夜； 2 ) 倒去包被液，每孔注入2 5 0p , l 洗涤液，浸泡lm i n ，如此洗涤2 次； 3 ) 拍干酶标板，加入封闭液封闭酶标板，2 5 0p l 孔，3 7 。c 温育1 5h ； 4 ) 如步骤2 ) 洗板3 次，分别加入一系列稀释度的阳性血清，设置平行；留一排加 阴性血清；1 0 0l a l 孑l ，3 7 温育1h 。 5 ) 加入1 ：5 0 0 0 稀释的羊抗兔i g g h r p ，1 0 0 “l 孔，3 7 温育o 5h ； 第三章抗百草枯抗体的制备及间接e l i s a 方法的建立 6 ) 加入显色液，3 7 反应1 5m i n ； 7 ) 加入2m o i lh 2 s 0 4 终止反应，5 0 刖孔，酶标仪测定4 5 0n n l 的吸光度值( a 4 5 0 ) 。 阳性血清的5 它阴性对照孔的2 1 倍并且5 0 大于o 1 ，此时的抗体稀释倍数即是 该抗血清的效价。 选定阳性血清的5 0 值在1 0 左右，同时与阴性血清的5 0 值差距最大的抗原包被 浓度、抗体稀释度为初步筛选的工作浓度【5 2 】。 3 3 5 最佳包被抗原浓度及抗体稀释度的筛选 1 ) 取酶标板，以不同浓度的p q 。h o v a 稀释液进行包被，1 0 0 肛l 孔，4 冰箱保存 过夜。次日取出酶标板回升至室温，倾去未吸附的抗原，洗涤液洗涤2 次，1m i n 次， 拍干。 2 ) 以含3 b s a p b s 溶液封闭，2 5 0p l 孔，3 7 温育1 5h 。洗涤液洗涤2 次，1m i n 次，拍干。 3 ) 加入不同浓度的标准品，5 0 肛l 孔：再加入待选浓度的稀释抗体，5 0p l 孔，3 7 温育1h 。洗涤液洗涤2 次，1m 耐次，拍干。 4 ) 加入1 ：5 0 0 0 稀释的酶标二抗( 羊抗兔i g g h r p ) ，1 0 0p l 孔，3 7 c 温育o 5h 。 洗涤3 次，lm i n 次，拍干。 5 ) 加入显色液，1 0 01 t l 孔，3 7 反应1 5m i n 。 6 ) 力1 1 终止液( 2m o l l 1 硫酸) ，5 0p l 孔。于酶标仪上测定4 5 0n i i l 处的吸光值( a 4 5 0 ) 。 选择阳性血清的5 0 值在1 0 左右时，抑制率高的抗原包被、抗体稀释度为最佳工 作浓度。 3 3 6 竞争e l i s a 标准曲线的制作 1 ) 取酶标板，以最佳包被浓度的p q h o v a 稀释液进行包被，1 0 0i l t l ：y l ，4 c 冰箱 保存过夜。洗涤液洗涤2 次，1m i r d 次，拍干。 2 ) 以含3 b s a p b s 溶液封闭，2 5 0 肛l 孔，3 7 温育1 5h 。洗涤液洗涤2 次，1m i n 次，拍干。 3 ) 加入0n g m l ，0 0 0 1n g m l ，o 0 1n g m l ，0 1n g m l ，0 5n g m l ，1n g m l ，2 5 n g m l ，5n g m l ，1 0n g m l ，2 0n g m l ，5 0n g m l ，1 0 0n g m l 的p q 标准品，5 0p l 孔；再加入最佳稀释度的抗体，5 0 “l 孔，3 7 。c 温育1h 。洗涤液洗涤2 次，lm i r d 次， 拍干。 4 ) 加入1 ：5 0 0 0 稀释的酶标二抗( 羊抗兔i g g h r p ) ，1 0 0 | i l 孔，3 7 温育0 5h 。 洗涤3 次，lm i n 次，拍干。 5 ) 加入显色液，1 0 0p l 孔，3 7o c 反应1 5m i n 。 6 ) 加终止液( 2m o l l 硫酸) ，5 0p l 孑：l 。于酶标仪上测定4 5 0b i l l 吸光值( a 4 5 0 ) 。 以a ，a o 为纵坐标，以1 0 0 倍的标准溶液浓度的对数值为横坐标在e x c e l 上作图， 即得p q 的竞争标准曲线。对标准曲线的范围进行截取，并拟合标准曲线方程。 2 l 泼落大学疆士学位论文 3 3 7 半数抑制浓度i c s o 的确定 取不同浓度的标准溶液按照竞争e l i s a 进行测定。以r 值接近5 0 时的混合溶液 中的p q 标准浓度作为i c 5 0 【5 3 1 。r 值的计算方法见公式( 3 1 ) 。 删= 竿则 3 3 8 特异性的测定 公式( 3 1 ) 抗血清的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性高，它 的识别能力就强。衡量特异性通常以交叉反感率( c r o s sr e a c t i v i 移) 来表示。交叉反应率 可用竞争抑制试验测定。 以不同浓度的p q 结构类似物敌草快( d i q u a t ，d q ) 替代p q ，按照竞争e l i s a 进 行测定，分别得至l 各自的半数撺制浓度l e 5 0 ，用公式( 3 2 ) 计算交叉反应率。根据交叉 反应率的大小反映抗血清的特异性。 交叉反应率e ，= 蟊鞲高等t 3 4 结果与分析 3 4 1 纯化后抗体含量的测定结果 公式( 3 2 ) 根据经验公式计算抗体蟹自质浓度： 抗体蛋白质浓度( m g m l ) = 1 4 5 a 2 8 0 0 7 4 a 2 6 0 _ 1 4 5 x 0 2 6 2 ，0 7 4 x 0 1 6 2 = 0 2 6 即纯化后抗体蛋自含量为0 2 6m g m l x l 0 = 2 。6m g m l 。 3 4 2 抗血清效价及工作浓度的确定 由于不弱个体产生的抗体质量有所差异，采用间接e l i s a 法分别测定2 只新西兰 大臼兔( 1 号和2 号) 抗血清的效价：将p q h o v a 作为包被抗原，用碳酸盐缓冲液作 系列稀释使其浓度分别为1 0g g m l 、lp g m l 、o ，lp g m l 、o 0 1g t g m l ，抗血清用o 1 b s a p b s 溶液稀释为1 ：1 6 0 0 、l ：3 2 0 0 、1 ：6 4 0 0 、l ：1 2 8 0 0 、l ：2 5 6 0 0 、l ：5 1 2 0 0 。用方阵滴 定法确定包被抗原、抗血清的工作浓度及效价，结果如表3 2 和表3 3 。 表3 - 21 号兔抗血清效价的测定 t a b 3 2d e t e r m i n a t i o no ft h en o 1r a b b i t sa n t i s e r u mt i t r e 第三章抗百草枯抗体的制备及间接e l i s a 方法的建立 表3 - 32 号兔抗血清效价的测定 t l b 3 3d e t e r m i n a t i o no f t h en o 2r a b b i t sa n t i s e r u mt i t r e 根据e l i s a 检测的要求，选择吸光值在1 o 左右时的抗原抗体浓度为最适工作浓度， 则1 号兔包被抗原浓度为1 0i t g m l ，抗体稀释度为1 1 6 0 0 ；2 号兔包被抗原浓度为11 t g m l ， 抗体稀释度为l ：3 2 0 0 。若以阳性血清的5 记阴性对照的2 1 倍作为抗血清的效价，由测 定结果可知，2 号兔的抗血清抗p q 抗体的效价较高，为5 1 2 0 0 ，最终我们选用2 号兔抗血 清为以后实验用。 3 4 3 包被抗原及抗体稀释度的确定 1 、棋盘试验粗筛： p q 标准品浓度分别为0n g m l 、5 0n g m l 、5 0 0n g m l ； 包被抗原浓度分别为0 0 0 1p g m l 、o 0 1l x g m l 、0 1r t g m l 、1p g m l ； 抗体稀释度分别为1 ：2 x 1 0 3 、1 ：2 x 1 0 4 、1 ：2 x 1 0 5 。 棋盘试验数据如表3 4 ，由表3 4 可以计算出不同抗原抗体浓度组合所对应的抑制 率，见表3 5 。 袁3 - 4 棋盘试验结果 仉山3 - 4r e s u l t so fc h e s sb o a r dt e s t 抗体稀释度 1 ：2 x 1 0 1：2x10l：2x103 表3 - 5 各种组合得出的抑制率( ) t l b 3 5i n h i b i t i o no fd i f f e r e n tc o m b i n a t i o n s 抗体稀释度l ：2 1 0 3 1 ：2 1 0 41 ：2 1 0 5 标准晶浓度( n g m l ) 55 0 055 0 055 0 0 抗0 0 0 1 肛g m l 一- - 擐 o 0 1p g m l - 5 5 - - 一 誉 o 1l a g m l3 1 13 7 21 4 31 6 81 6 73 3 9 1p g m l8 2 51 4 22 6 33 1 9-81 _-_-_一_-_-_一_-_-_-_-_-一 2 3 江南大学硕士学位论文 由表3 4 和表3 5 可以看出，抑制率相对较高的抗原抗体浓度组合为0 1 l l g m l + 1 ：1 ：2 1 0 3 、o 1i - l g m l + l ：2 x 1 0 5 、和lg t g m l + 1 ：2 x 1 0 4 ，但是结合表3 - 4 ，o 1 i t g , m l + 1 ：2 x 1 0 5 这个组合虽然抑制率高，但是吸光值太低，可信度不高；所以决定选取 抗原浓度在o 1 li l g m l 之间，抗体稀释度在1 ：2 x 1 0 3 - 1 ：2 x 1 0 4 之间，继续做棋盘实验， 将各个浓度细化。 2 、棋盘实验第二步筛选： p q 标准品浓度分别为0n g m l 、5 0n g m l 、5 0 0n g m l ： 抗原浓度分别为o 1i 上g m l 、0 2 肛g m l 、0 5l a g m l 、1i t g m l ： 抗体稀释度分别为l ：5 0 0 0 、1 ：1 0 0 0 0 、l ：2 0 0 0 0 、l ：4 0 0 0 0 。 棋盘试验数据如表3 - 6 ，由表3 - 6 可以计算出不同抗原抗体浓度组合所对应的抑制 率，见表3 7 。 表3 - 6 棋盘试验结果 t a b 3 6r e s u l t so fc h e s sb o a r dt e s t 袁3 7 各种组合得出的抑制率( ) m l b 3 7 i n h i b i t i o no fd i f f e r e n tc o m b i n a t i o n s 由表3 - 6 和表3 7 可以初步判断，抗原浓度在o 2 t g m l , 4 ) 5 t g m l 之问，抗体稀释 度在l ：5 0 0 0 - 1 ：1 0 0 0 0 之间比较好，因为这之间数值适宜，抑制率处于正常范围内，而且 抗原浓度尽量越低越好。 3 、棋盘实验第三步筛选： 2 4 第三章抗百草枯抗体的制备及间接e l i s a 方法的建立 表3 - 8 棋盘试验结果 t a b 3 8r e s u l t so f c h e s sb o a r dt e s t 表3 - 9 各种组合得出的抑制率( ) t a b 3 9i n h i b i t i o no fd i f f e r c n tc o m b i n a t i o n s 标准品浓度分别为0n g m l 、0 0 0 1n g m l 、o 0 1n g m l 、o 1n g m l 、0 5n g m l 、1 n g m l ； 抗原浓度分别为o 2i - t g m l 、0 - 3i t g m l 、0 4l x g m l 、0 51 t g m l ； 抗体稀释度分别为1 ：5 0 0 0 、l ：1 0 0 0 0 。 棋盘试验数据如表3 8 ，由表3 8 可以计算出不同抗原抗体浓度组合所对应的抑制 率，见表3 - 9 。 经过多次的棋盘试验，最终确立最适包被抗原浓度为o 3l 上g m l ，抗体最佳稀释度 为l ：5 0 0 0 。 江南大学硕士学位论文 3 4 4 竞争e l i s a 标准曲线的制作 o 一2一l0jzj45 l o g ( 1 0 0 p q ) 图3 - 1p q 的抑制率曲线 f i g 3 1i i n h i b i t i o nc u r v eo fp q 以a ，a o 为纵坐标，以1 0 0 倍的标准溶液浓度的对数值为横坐标在e x c e l 上作图， 得到p q 的竞争标准曲线，如图3 一l 所示，在0 0 1n g m i _ 严2 0n g m l 范围内具有较好的线 性关系，最低检测限( l o d ，1 0 抑制率对应的浓度) 为0 0 0 5n g m l ，其线性回归方程 为：y = 0 1 3 1 5 x + 0 8 5 6 4 ，r = 0 9 9 5 6 。 3 4 5 半数抑制浓度i c s o 的确定 以r 值接近5 0 时的混合溶液中的p q 标准浓度作为i c 5 0 ，本实验中，当p q 浓度 为5n g m l 时，r 值为4 9 2 ，相对其它r 值，4 9 2 最接近5 0 。初步确定本实验方 法的半数抑制浓度i c 5 0 为5n g m l ；经回归方程) ，= 0 1 3 1 5 x + 0 8 5 6 4 ( r - - 0 9 9 5 6 ) 计算， 得i c 5 0 为5 1 3n g m l 。 3 4 6 特异性的测定 间接竞争e l i s a 检测方法的特异性由交叉反应试验来反映，本实验研究了p q 的结 构类似物敌草快( d q ) 对p q 的交叉反应率，结果如表3 1 0 所示，当d q 浓度为 1 0 0n g m l 时，抑制率仅为1 ，因此d q 与p q 的交叉反应率小于0 1 ，说明该方法 对于p q 检测特异性很好。 图3 2 百草枯和敌草快的结构图 f i g 3 - 2t h es t r u c t u r e so fp a r a q u a ta n dd i q u a t 2 6 第三章抗百草枯抗体的制备及间接e l i s a 方法的建立 表3 1 0 交叉反应率的测定 t a b 3 - 10d e t e r m i n a t i o nt h ec r o s s - r e a c t i v i t y 反应物交叉反应率( ) 百草枯( p q ) 敌草快( d q ) 1 0 0 9 8 5 ) 敌草快标准品 p e g 2 0 0 0 0 t w e e n 2 0 4 2 2 主要仪器 d f 1 0 1s 型集热式磁力搅拌器 t u 一1 9 0 0 双光束紫外可见分光光度计 5 8 0 4 r 台式高速冷冻离心机 上海第一化学试剂厂 中国医药集团上海化学试剂总公司 北京博奥森生物技术有限公司 上海华美生物工程有限公司 中国医药集团上海化学试剂总公司 上海安谱科学仪器有限公司 上海安谱科学仪器有限公司 中国医药集团上海化学试剂总公司 中国医药集团上海化学试剂总公司 江苏省金坛市正基仪器有限公司 北京普析通用仪器有限责任公司 上海艾本德生物技术国际贸易有限公司 江南大学硕士学位论文 b i o d o tx y z 3 0 0 0 金标点样仪 b i o d o tc m 4 0 0 0 金标切条机 旋转蒸发仪 d l 5 低速大容量离心机 可调试移液器 s h b 一3 循环水多用真空泵 1 0 1 一型电热鼓风干燥箱 其他均为实验室常用仪器。 4 2 3 试纸条材料 硝酸纤维素膜 w h a t m a ni m m u n o p o r er p ( 2 5c m x 3 0e m ) s a r t o r i u sc n1 4 0 ( 2 5c m x 3 0c m ) m i l l i p o r e1 3 5 ( 2 5c m x 3 0c m ) 玻璃纤维膜 h 8 吸水纸 j - b 8 底板 美国b i od o t i = v = lj d p i u - u u 公司7 a ”j 美国b i od o t d i u - u u 公司大譬鼍 ah j 上海贝凯有限公司 上海安亭科学仪器厂 t h e r m ol a b s y s t e m s 公司 郑州杜甫仪器厂 上海浦东荣丰科学仪器有限公司 w h a t m a n 公司 s a r t o r i u s 公司 m i l l i p o r e 公司 德国s c h l e i c h e r & s c h u e l l 公司 上海捷宁生物科技有限公司 上海捷宁生物科技有限公司 4 3 主要溶液的配制 4 3 1 抗原稀释液 o 0 5m 、p h 9 6 的n a 2 c 0 3 - n a h c 0 3 缓冲液( c b s ) ：o 3 1 5gn a 2 c 0 3 ，0 5 8 8gn a h c 0 3 ， 加1 0 0m l 超纯水溶解。 4 3 2 抗体稀释液 o 0 1 m o l l 、p h 7 4 磷酸盐缓冲液( 含i b s a ) ：3 ogn a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，0 2 5g n a h 2 p 0 4 。2 h 2 0 ，8 7gn a c l ，1 0gb s a ，1 l 超纯水。 4 4 试验方法 4 4 1 胶体金的制备 4 4 1 1 制备前玻璃器皿的清洁 所有使用的玻璃器皿先用自来水流水冲洗干净，用酸液( 重铬酸钾1 0 0 0g ，浓硫酸 2 5 0 0m l ，加水至1 0 0 0 0m l ) 浸泡4 8h ，取出后用大量自来水冲洗，然后用洗洁剂洗涤， 自来水洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗3 4 次，再用去离子水洗3 4 次，烘干备用。 4 4 1 2 柠檬酸钠还原法制备胶体金 ( 1 ) 由于氯金酸极易潮解，因此使用小剂量包装的氯金酸时，必须一次配完。将1g 的 氯金酸一次溶解于双蒸水中配成l 的水溶液，于4 冰箱内避光保存。 ( 2 ) 用新制双蒸水配铝l j l 0 0m l0 0 1 氯金酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器 加热至沸( 1i o * c 左右) ，在1 0 0r m i n 磁力搅拌下，迅速加入预先在3 7 c 保温的1 3 0 第p q 章百草枯金标免疫层析检测方法的建立 柠檬酸三钠溶液4 5m l ，保持温度和转速不变，继续搅拌加热1 5 曲左右，直至溶 液呈现清亮的酒红色i ，7 1 。室温冷却，4 冰箱保存备用。 4 4 2 胶体金的质量鉴定 采用紫外扫描鉴定，将胶体金溶液在4 0 0 - - 7 0 0n l n 波长下进行扫描，确定最大吸收波 长及峰宽。彭剑淳纠5 8 】通过对胶体金进行扫描，并通过透射电镜观察其粒径分布，将两 者比较，得出胶体金颗粒粒径x ( 姗) 与最大吸收峰波长y ( 蛐) 之间的直线回归方程： y = 0 4 2 7 1 x + 5 1 4 5 6 ( n = 6 ，r = 0 9 7 4 ，尸 p i ) 时，吸附力最大，制备的胶体金一蛋白质复合物最稳定。蛋白 质用量则取决于金溶胶颗粒的大小。金颗粒的直径越小，颗粒的总表面积就越大，能被 标记的蛋白质量也越大1 40 。因此，在制备中，首先测定出使胶体金蛋白质复合物稳定形 成的最小蛋白质浓度和标记体系的最适p h 值。 4 4 3 1 标记前抗体的准备 一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面 而减弱胶体金对蛋白质的吸附。标记