（食品科学专业论文）乳酸菌胞外多糖生物合成及生理功能特性的研究.pdf

博上学位论文乳酸菌胞外多糖生物合成及生理功能特性的研究东北农业大学 摘要 具有独特生理功能的乳酸菌胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e ，e p s ) 极具研究和开发价 值。本文以筛选的唾液链球菌嗜热亚种l c x 2 0 0 1 为e p s 生物合成的生产菌株，对e p s 的 生物合成、分离纯化、结构分析及生理功能特性等进行了系统的研究主要研究结果如 下： 经比较研究发现硫酸一苯酚法较适合于乳酸菌e p s 检测，该方法的平均相对误差为 o 2 ，具有较好的准确性。 从4 3 株乳酸菌中，经发酵比较，筛选出一株高产e p s 乳酸菌一唾液链球菌嗜热亚 种l c x 2 0 0 1 。 为了研究唾液链球菌嗜热种e p s 生物合成，从常用于乳酸菌生长的合成和半合成 培养基中，选择了a t p 作为唾液链球菌嗜热亚种l c x 2 0 0 1 生物台成e p s 的基本培养 基，并对碳源、氮源、盐、培养基的初始d h 等对该菌株e p s 生物合成的影响进行了研 究。从而开发出用于唾液链球菌嗜热亚种e p s 生物合成研究的新型台成培养基( 命名为 l c x ) ，该培养基的组成为：蛋白胨，1 5 ；胰蛋白胨，1 o ；葡萄糖或乳糖2o ： k 2 h p 0 4 ，o2 ：m g s 0 4 7 h 2 0 ，o 0 2 ：m n s 0 4 4 h 2 0 ，5 0 r a g l ；t w e e n8 0 ，】n l l ，l ；醋酸 钠，05 甘油磷酸钠，1 9 。培养基初始p h 值为6 5 。 研究结果表明唾液链球菌嗜热亚种l c x 2 0 0 1 在l c x 培养基中生物合成e p s 的最适 条件为：接种量2 0 ，发酵温度3 5 0 c ，发酵时间2 0 h 。 为了进一步提高e p s 的生物台成量，比较了新型发酵技术一等口h 值发酵法和连续 流加发酵法对e p s 生物合成的影响，发现两种发酵法均能提高该菌株的e p s 生物台成 量。等p h 值发酵时，控制p h 值在5 5 时，最大合成量达到3 4 7 m g l 。而连续流加发酵 法，最大合成量达到6 3 8 m 虮。 l o g i s t i c e q u a t i o n 方程和l u e d e k i n g p i r e t 方程对唾液链球菌嗜热亚种l c x 2 0 0 1 分批 发酵生物合成e p s 过程得到了很好的理论描述，通过研究建立了细菌生长、乳酸生成和 底物消耗( 乳糖) 相关的动力学模型参数，阐述了该菌发酵的动力学特征。 采用回归正交旋转设计对利用黄浆水生产e p s 进行了研究。经研究发现实验所选择 的三因素( p h 值、温度和蛋白胨添加量) 是影响e p s 生物合成的主要因素，且回归模 型是有效的，与实际情况拟合较好。在三因素中，p h 值是影响e p s 产量的最主要因素， 其次是温度和蛋白胨添加量。回归模型对实际生产具有指导意义。 通过研究，确定乳酸菌e p s 提取条件为：发酵液在5 0 0 r p m 下，搅拌3 0 r a i n ，浓缩 至原体积的1 5 ，并调整p h 值为6 5 ，采用7 0 的乙醇浓度；在一2 5 c 下，3 h 或4 下 1 2 h 进行沉淀；离心力为10 0 0 0 9 。 经提取分离得到的粗多糖，采用凝胶色谱法进行纯化，纯化条件为：色谱柱为 s e p h a r o s ec l 一6 b ，上样体积为1 0 m l ，样品浓度为4 0 m g m l ，洗脱剂的流速为3 0 m k h 。 顾瑞霞摘要 2 0 0 0 年1 1 月 凝胶色谱法测得e p s l 和e p s 2 的分子量分别为12 1 0 6 和3 8 1 0 4 ，经硫酸水解后，用 h p l c 测得e p s 的单耱组成为葡萄糖和半乳糖，摩尔比为 ：4 ，红外光谱和核磁共振 分析表明e p s l 为d 端基差向异构体，并对结构进行了推测。 不同e p s 产生量的两种乳酸菌，用于酸乳的生产，在四种不同菌株组合形式的发酵 乳中，球、杆菌比例和乳糖消耗基本一致，但是在粘度、e p s 产生、e p s 的单糖组成、 对乳清析出的影响，以及感官等方面，均有区别。实验结果表明，在酸乳生产中，以产 e p s 的德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜熟亚种组合较好。 以四株有荚膜或无荚膜，以及荚膜大小不同的唾液链球菌嗜热亚种，它们的产酸、 抗胆汁酸盐和低p h 值耐受能力，与荚膜无关。但对有荚膜的唾液链球菌嗜热亚种 l c x 2 0 0 1 的研究发现，荚膜的破坏会使发酵速度加快，但同时对外界不良环境的抵抗 力下降。这些研究结果表明：有、无英膜和荚膜大小对同一亚种所表现出来的不同生理 特性没有决定作用：破坏荚膜，会影响细胞体与外界物质交换能力，对细胞体许多生理 功能有影响；荚膜起到阻止外界物质进入细胞和细胞内产生的乳酸向外界释放的作用。 急性毒性试验表明，e p s 安全无毒。e p s 具有明显提高小鼠的游泳耐力和抗缺氧能 力。免疫学特性研究表明，e p s 对小鼠的细胞和体液免疫功能均具有促进作用。乳酸菌 e p s 可使实验鼠全血中的s o d 活性提高5 1 ，使肝组织中的l p s 含量降低2 4 。体外 试验表明，乳酸菌e p s 对试验的几株病原菌没有抑制作用，但具有促进取歧杆菌和嗜酸 乳杆菌生长的作用，且具有调节小鼠肠道苗群作用。 关键词：乳酸菌，胞外多糖生物合成，结构分析，生理功能特性 博士学位论文乳峻菌胞外多糖生物台成及生理功能特性的研究东北农业大学 s t u d i e so ns y n t h e s i sa n dp h ) 7 1 ；i o l o g i e a lf u n c t i o n s o fe x o p o i y s a c c h a r i d e so f l a c t i ca c i db a c t e r i a a b s t r a c t s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s pt h e r m o p h i l u sl c x 2 0 0 1w a ss e l e c t e da st h es t r a i nf o rt 1 e p r o d u c t i o no fe x o d o l v s a c c h a d e s t h i ss t u d ya i m e da tf i n d i n ga no p e r a t i v ew a yl e a d i n gt o h i g hy i e l do fe x o p o l y s a c c h a r i d e sa n ds t u d y i n gp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n so fe x o p o l y s a c c h a r i d e s p r o d u c e db ys t r e p t o c o c c u ss a t i v a r i u ss u b s pt h e r m o p h i l u sl c x 2 0 0 1 t h em a i nr e s e a r c h r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： t h ep h e n 0 1 s u l p h u r i cm e t h o du s e da se p sc o n c e n t r a t i o na s s a yw i t ss t u d i e d a n dt h i s m e t h o dh a da na v e r a g er e l a t i v ee r r o ro f 0 2 n u m e r o u sl a c t i ca c i db a c t e r i ah a db e e ne x a m i n e df o rt h e i re x o p o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c t i o n c a p a c i t i e s t h er e s u l t sc l e a r l ys h o w nt h a tt h eh i g h e s ty i e l do fe p sp r o d u c e db y1 a c t i ca c i d b a c t e r i ai n3 4s t r a i n sw a ss t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i z 坷s u b s pt h e r m o p h i l u sl c x 2 0 0 1 t h ee f f e c to fc a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e ，s a l ta 1 1 dt h eo p t i m u mi n i t i a i hv a l h eo f m e d i u mo ne p sp r o d u c e db yss a l i v a r i u ss u b s pt h e r m o p h i l l u sw e r es t u d i e d f r o mm r s m 】7 a t p s l ，e i l i k e ra n ds d mw h i c hw e r eu s e da sl a c t i ca c i db a c t e r i u mb a s i cc u l t u r e m e d i a , an e wc u l t u r em e d i u m ( n a m e da sl c x ) f o rt h es y n t h e s i so fe x o p o l y s a c c h a r i d e sb y s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s pt h e r m o p h i l u sl c x 2 0 0 1w a sf o r m u l a t e dt h es u i t a b i l i t yo f t h e s e m i - d e f i n e dc u l t u r em e d i u mw a so b m i n e d ，t h em e d i u mh a df o l l o w i n gc o m p o s i t i o n s ： p e p t o n e ，1 5 ；t r y p t o n e ，】o ；g l u c o s e ，1 o ；l a c t o s e ，1 0 ；k 2 h p 0 4 ，02 ；m g s 0 4 7 h 2 0 ， o 0 2 ；m n s 0 4 4 h 2 0 ，5 0 m g l ；t w e a n8 0 ，j m l ，l ；s o d i u ma c e t a t e ，0 5 ；s o d i u m g l y c e r o p h o s p h a s 1 9 e x o p o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c t i o nw a ss t u d i e db yg r o w i n gs t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s p t h e r m o p h l 廿l c x 2 0 0 1i nl c xt h eb e s tc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rs t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u s s u b s p t h e r m o p h i l u st os y n t h e s i se p sw e r et 1 1 a tj n o c u l a t i o na r l l o u n ti s2 o fc u l t u r e sw i t h f e r m e n t a t i o na t3 5 0 cf o r2 0 h c o n s t a n t p h m e t h o da n df e d - b a t c hm e t h o df o r e x o p o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c e db y s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s pt h e r m o p h i l u sl c x 2 0 0 1w a sc o m p a r e di tw a sf o m a d 也a t t h e s et w om e t h o d sb o t hc o u l di n c r e a s ee p sp r o d u c e db ys t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s p t h e r m o p h i l u sl c x 2 0 0 1t h ec o n s t a n tp hw a s5 5 h eg r o w t ho fc e l l ss h o wm o d e r a t e l y b u t e p sp r o d u c t i o nw i t ht h ec o n s t a n tp hm e t h o du a sh i g h e rt h a nw i 血t h eb a t c hm e t h o d t h e y i e l do f e p su n d e r c o n s t a n tp h w a s3 4 7 m g l ，a n d w i t h t h e f e d b a t c h m e t h o d w a s 、3 3 8 m g l b a t c hf e r m a n t a t i o np r o c e s sa n dt h ek i n e t i c so ft h e e x o p o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c e db y s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s pt h e r m o p h i l u sl c x 2 0 0 1w e r es t u d i e d t h e m a t h e m a t i c a l k i n e t i c sm o d e l sd e s c r i b i n gt h ec o u r s eo fe p sf e r m e n t a t i o nw e r eo b t a i n e d w h i c hr e f l e c t e dt h e r e l a t i o n s h i pa m o n gg r o w t ho fc e l l ，j a c t i ca c i dp r o d u c t i o n ，e p ss y n t h e s i sa n dt h ec o n s u m p t i o n a m o u n to fs u b s t r a t e t h er e l a t i v ed e v i a t i o n sb e t w e e nt h ee x p e n m e n t a ld a t aa n dc a l c u l a t e d r e s u l t sw e r en om o r et h a n1 0 t h eq u a d r a t i cr o t a r yc o m b i n a t i o nd e s i g nw a su s e df o rs t u d y i n gt h ee p sp r o d u c e db y s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s p t h e r m o p h i l u sl c x 2 0 0 1j nt o f uw h e y t h em a t h e m a t i c s m o d e l so ft h es t u d yw e r ee s t a b l i s h e da n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w e d ： p hw a s63 ，c u l t l i r et e m p e r a t u r ew a s3 6 0 c p e p t o n ew a s20 t h ee x o p 0 1 y s a c c h a r i d e s p r o d u c e db ys t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s p历e r m o p h i l u s l c x 2 0 0 1f r o mf e r m e n t e db r o t hw e r ee x t r a c t e du n d e rt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：t h ef e r m e n t e d b r o t hw a ss t i r r e da t5 0 0r p ma n d ，c o n c e n t r a t e dt oj ，5o fi n i t ia 】v o l u m ea n d w a sa d i u s t e dt o 3 顾瑞霞 英文摘要2 0 0 0 年1 1 月 p h6 5 ，e x o p o l y s a c c h a r i d e sw e r ep r e c i p i t a t e dw i t he t h a n o la tc o n c e n t r a t i o no f7 0 ( v v ) a t 2 5 f o r 3 h ，o r a t 4 f o r l 2 ha n d w a sc e n t r i f u g e da t l 0 0 0 0 9 f o r2 0 m i n t h ee x o p o l y s a c c h a d d e sw e r ep u r i f i e do nac h r o m a t o g r a p h yc o l u m no fs e p h a r o s ec l 6 b v o l u m eo fs a m p l ew a s1 0 m l ，c o n c e n t r a t i o no fs a m p l ew a s4 0 m g m l ，e l u t e dw i t hw a t e ra ta f l o wr a t eo f4 5 m l h m o l e c u l a rw e i g h t so fe p s la n de p s 2w e r e12 1 0 6a n d3 8 1 0 4 d a l t o nr e s p e c t i v e l y t h em o n o s a c c h a r i d e sc o m p o s i t i o n so fe p s1w e r eg l u c o s ea n dg a l a c t o s e i nt h em o l a rr a t i oo fl ：4b yh y d r o l y z i n ge p s lw i t hs u l p h u r i ca c i da n dt h e na n a l y s e sw i t h h p l c t h ed a t ao fi rr e v e a l e dt h a te p slw a sc o n s t i t u t e dc h i e f l yw i t h1 3 - g l y c o s i d i cb o n d s r h e o l o g i c a la n ds e n s o r yp r o p e r t i e so fy o g u r tf e r m e n t e dw i t hr o p yc u l t u r e sa n dn o n r o p y c u l t u r e sw e r ed e t e r m i n e d t h ep r o p o r t i o no fc o c c it ob a c i l i i t h ec o n s u m p t i o no fi a c t o s ew e r e c o n s i s t e _ n tb a s i c a l l y ，b u tv i s c o s i t y ，e x o p o h y s a c c h a r i d e sy i e l d ，m o n o s a c c h a r i d ec o m p o s i t i o no f t 1 ee x o p o l y s a c c h a r i d e s s u s c e p t i b i l i t yt os y n e r e s i sa n ds c n s o r yd a t ah a dd i f f e r e n c e d a t aa l s o s u g g e s t e dt h a ty o g u r tm a d ew i t ht 1 1 ec u l t u r ec o m b i n a t i o n so fr o p ys t r a i n so fl a c t o b a c i l l u s 出l b r u e c m is u b b u l g a r i c u s a n d n o r t r o p y s t r a i n so f s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s p t h e r m o p h i l u sw a st h eb e s t s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s pt h e r m o p h i l m w e r eu s e df o ri n v e s t i g a t i n gp h y s i o l o g i c a l f u i n c t i o n si nv i t r o 1 tw a sf o u n dt h a tp o l y s a c c h a r i d ey i e l d ，a c i d i f i c a t i o na c t i v i t y a c i da n db i l e t o l e r a n c eo f t h es t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s pt h e r m o p h i l u sw e r en o ta f f e c t e db yt h ee x i s to r n o n - e x i s to fc a p s u l e w h e nt h ec a p s u l eo fs t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u ss u b s pt h e r m o p h i l u s l c x 2 0 0 1w a sd a m a g e d ，t l eg r o w t h ，a c i d i f i c a t i o na c t i v i t yw e r ep r o m o t e d ，b u tl o wp h ( 30 ， 2 0 ) a n db i l e ( 01 ，02 ) e x e r t e dag r e a t e ri n h i b i t o r ye f f e c tb a s e do nt h er e s u l t s w e c o n c l u d e d 血a tt h ed i f i e r e n t p h y s i c a l l yf u n o t i o n s o f s t r e p t o c o c c u ss a l i v a k i u ss u b s p t h e r m o p h i l u sw e r ei n d e p e n d e n to nt h ec a p s u l e w h e nt h ec a p s u l eo f s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u s s u b s p t h e r m o p h i l u sl c x 2 0 0 1w a sd a m a g e d t r a n s f e ro fm a t e r i a lb e t w e e nb a c t e r i aa n d c u l t u r el i q u i dw a sc h a n g e da n dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n so fb a c t e r i aw e r ea f f e c t e d t h ec a p s u l e a c t e da sab a r r i e rt ot h ed i f f u s i o no fs u b s t a n c e si nc u l t u r ei i q u i di n t ot h ee e l ia n dt h er e l e a s eo f l a c t i ca c i df r o mt h ec e l l e x o p o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c e db ys t r e p t o c o c c u ss a t i v a r i u ss u b s pt h e r m o p h i l u sl c x 2 0 0 1 w a so n ek i n do fn a t u r a ln o n t o x i cp r o d u c t t h ee x o p o l y s a c c h a r i d e sh a dm a n yb i o l o g i c a l f u n c t i o n s t os t u d yt h ef u n c t i o n so ft h ee x o p o l y s a c c h a r i d e s w ee x a m i n e dt h ee f f e c t so ft h e e x o p o l y s a c c h a r i d e so nt h ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no ft h em i c e t h ee x o p o l y s a c c h a r i d e sh a d a n t i - f a t i g u ee f f e c t sa n dc o u l dp r o l o n gt h es u r v i v a it i m eo fm i c ei nf l l o x i ar e m a r k a b l y i m m u n o l o g i c a la c t i v i t ya s s a y si n d i c a t e dt h a tt h ee x o p o l y s a c c h a r i d e sc o u l dr a i s et h es p e c i f i c a n dn o n s p e c i f i ci m m u n i t yt h ee x o p o l y s a c c h a r i d e sc o u l de n h a n c et h es o da c t i v i t yi nb l o o d ， d e c r e a s et h el p sc o n c e n t r a t i o no ft h el i v e ra n dp o s t p o n et h e a r i n r i nv i t r o ，t h e e x o p o l y s a c c h a r i d e sc o u l dn o ti n h i b i tt h eg r o w t ho fec o l i , a e r o b a c t e ra e r o g e n u s s a l m o n e l k e n t e r i t i d s , s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s b a c i l l u ss u b # l i sa n dc o u l ds t i m u l a t et h eg r o w t ho fl a c t i c a c i db a c t e r i a nv i v o t h ee x o p o l y s a c c h a r i d e sc o u l di m p r o v em i c r o b i a lb a l a n c ei nt h e j n t e s t i n a lt r a c t d o c t o r a t es t u d e n t ：g ur u i x i a m a j o r ：f o o ds c i e n c e t u t o r ：p r c f = l u oc h e n g x i a n g k e y w o r d s ：l a c t i ca c i db a c t e r i a ，e x o p o t y s a c c h a r i d e ，s y n t h e s i s s t r u c t u r ea n a l y s i s p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s 4 博士学位论文乳酸菌胞外多糖生物台成驶生理功能特- 洼的研究东1 t 农业大学 1 研究背景 前言 蛋白质、核酸和多( 寡) 糖是最重要的三种生物大分子，蛋白质和核酸在生命现象 中的重要性己为世人所知”j ，而糖生物学的真正崛起只是近2 0 年的事f z 。 多糖是指由二十个以上单糖组成的糖类化合物，根据来源不同，可分为植物多糖、动 物多糖和微生物多糖。根据糖类组成不同，又可分为同多糖和杂多糖。多( 寡) 糖的结构常 因单糖的构型( l 或d 型，a 或p 型) 、糖基化方式( 五或六环) 、有无分支、糖中多个羟基 是否被取代( 如氨基、硫酸基、磷酸基、酰基) 、相邻单糖基糖苷的位置等的不同而不 同，也使多糖成为最具魅力的信息载体o 。 将糖生物学推向生命科学前沿发生于1 9 9 0 年。有三家实验室几乎同时发现内皮细 胞一白血球粘附分子i ( e l a mi ) ，后来改名为e 一选凝素( e s e l e c t i o n ) 。随着糖生物 学基础研究的发展用于糖生物学研究的方法和基本技术，以及把基础研究所得的成果 进一步转化为生产技术等方面的研究也倍受重视“糖工程学”的兴起也是极其自然的 事“。 近二十年来许多国家对话生物学及工程学研究也都十分重视。1 9 8 9 年日本创刊了“ 糖科学与糖工程动态”杂志。同年日本科学技术厅箍出关于“糖工程基础与应用研究推 进战略”的咨询”j 。 美国能源部1 9 8 6 年资助佐治亚大学创建了复合糖类研究中心( c c r c ) ，建立了复 合糖数据库( c c s d ) ，相关的计算机计划也称为糖原计划口 。 欧洲也不甘落后，欧盟1 9 9 扯1 9 9 5 年的研究计划中有一项“欧洲糖类研究开发网 络”计划( e u r o p e a nc a r b o h y d r a t ep l a t f o r m ) ，其目的是推进欧洲各国的糖类研究和开 发，以加强欧洲在糖类基础方面的研究，并将研究成果转化为商品，增强与美国、日车 的竞争力“。 由于美国、日本和欧洲的重视，近年来在糖类研究方面已取得不少进展。不断积累 的证据表明，糖及其缀台物在生命活动中有着极其重要的生物功能。许多高层次奥妙的生 物现象，如受精、发育、分化、f 十经系统、免疫系统、肿瘤、抗辐射、自身免疫、炎症 等，只有用密布于细胞表面的糖及其缀合物的糖链才能得到圆满的回答叫【9 】。因此，糖 类既是通讯的信息分子，如抗原决定簇、受体分子的接受者( 激素受体、毒素受体) 以及生物活。主物质有关的信息携带者等“”：又是细胞间的识别分子，如性细胞粘着、病 原体与寄主的作用、固氮菌的共生等“：同时可作为生物机能调节分子，主要表现为免 疫增强和刺激作用，对t 细胞、巨噬细胞、n i ( 细胞、细胞毒t 细胞、b 细胞等均具有明 显的刺激作用，使这些细胞活性增强 i 】。多糖能促进巨噬细胞分泌白细胞介素i 和肿瘤细 顾瑞霞2 0 0 0 年1 】月 肿瘤细胞坏死因子，促进t 淋巴细胞产生细胞介素，激活l a k 细胞、诱导自细胞产生 干扰素m 。 因此不难看出，继基因1 = 程、蛋白质工程之后。将是糖工程。近二十多年来，有关 活性多糖的研究，空前的活跃，纵观国内外研究概况提取、制备活性多糖主要从动植 物组织和利用微生物发酵生产多糖。2 l 世纪生命科学的研究焦点是对多细胞生物的高层 次生命现象的解释，因此对生物体内细胞识别和调控信息分子一糖类的研究是必不可少 的 。 乳酸菌是一类能利用可发酵性糖产生大量乳酸的细菌总称，目前在自然界己发现的 这类细菌在分类学上至少有2 3 个属 i “。而在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要 有7 个属，包括乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属、明串珠菌属和 双歧杆菌属 1 。许多乳酸菌是人体肠道固有有益菌丛，而人类利用乳酸菌的历史可以追 溯到5 0 0 0 多年前“，上个世纪人类对其研究、应用与开发达到了空前活跃，取得了大 量的研究成果，最主要是在发酵乳和医药制剂中的应用。目前对其研究的重点是如何提 高发酵乳的品质，及其有关的医疗保健作用及机理【l “。目前已知乳酸菌发挥主要生化功 能特性的作用机理，除了定植、主要代谢产物( 乳酸等) 改善肠道内环境、有效酶活力 外【l ，一些次生代谢产物，如细菌素、胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e ，e p s ) 、s o d 等也 发挥主要作用n “；一些细胞组成，特别是完整细胞壁肽聚糖则具有抗肿瘤作用e 2 0 。其中 n i s i n 早已工业化生产，其它细菌素、s o d 也在不断研究和开发中口l 】口“。而具有理论和 实际应用价值的乳酸菌e p s 也引起了国外许多学者的研究兴趣口“。而国内这方面的研究 仍然处于一个空白，有鉴于此，我们立项开展这方面的研究工作，希望能获得一定的研 究成果，为今后的应用与开发创造一定的条件。 2 国内外乳酸菌e p s 研究现状 2 1e p s 生物合成途径 乳酸菌e p s 是由乳酸菌发酵产生的，分泌于细胞外的，常渗入培养基中的一种糖类 化合物。细菌e p s 根据其所在位置，可分为荚膜多糖和粘液多糖口。目前对荚膜多糖的 合成途径有一定的研究，但对粘液多糖的合成途径了解甚少，尤其是乳酸菌e p s d “。图 l 为嗜热链球菌e p s 分子结构举例。 e p s 在解剖学上可分为三类：a 大荚膜简称荚膜，可在光学显微镜下看到，晟低 厚度为0 2 5 a m ，有相当大的外部表面积：b 微荚膜，厚度在0 2 u m 以下，光学显微镜看 不到，可用免疫学方法检验，他是否作为细胞壁材料，还有争论：c 粘液层堆积在细胞 表面，它的多糖成分常渗入培养基中 。细胞外的合成物质，除去它对微生物生命活动 影响不大。 糖链的生物合成和肽链、多聚核苷酸的生物合成有本质的不一j 。后两类生物大分子 的生物合成基本上都是有模板的，而糖链的合成是没有模扳的糖链的生物合成是由糖 6 博士学位论文乳酸菌胞外多糖生物合成及生理功能特性的研究东北农业大学 基的供体、糖基的受体和糖基转移酶这三类分子协调完成的，三者缺一不可9 ”，其中又 以糖基转移酶占主导地位。糖基转移酶对糖基的供体和受体都有较高的专一性，同时由 于糖链，特别是糖复合物中糖链的结构的复杂性，致使糖链的生物合成需要多个糖基转 移酶的协同作用，前一个糖基转移酶的产物是后一个糖基转移酶的底物。糖蛋白的肽链 在糖基化的过程中，第一个糖基的接受体通常是肽链中的特定氨基酸残基。此后糖链延 伸时，糖基的接受体是新接上的糖基。糖链不仅能在直链上延伸，也可能产生分支，即 在某些糖基的几个羟基上都作为糖基的接受体，而游离的单糖不能作为糖基转移酶所用 的糖基供体，一定要通过活化。最常见的糖基活化方式有两种：一种是核苷酸的形成， 另一种是磷酸萜的形式，但也有报道认为维生素a 类也可和糖基结合，成为糖基的活化 形式 4 4j 。 0 一d g a t p l 6 3 ) _ a d g l q o 一( 1 + 3 ) 1 3 - d - g l c p ( i _ + 3 ) 口d g a 蚌( 1 - + 1 3 - d g a l p l l 4 2 ) 。l 砒1 妒一( 1 _ + 2 ) 吨d g a 驴( i _ + 3 ) 吨。d g l c p - ( 1 _ + 3 ) 一a g a l p 一( 1 斗3 ) 吨- 1 一r 均p ( i 一 图i 嗜热链球菌s f i 3 9 和s f i l 2 的胞外多耱( jl e m o i n ee te i 1 9 9 7 ) f i g u r ei r e p e a t i n gu n i t o fe p sp r o d u c e db y 工t h e r m o p h j u s $ 2 i 3 9a n ds f i1 2 微生物e p s 的生物合成，大多在细胞内合成的不过明串珠菌、链球菌属中的某些 种，能利用培养基中的不透过细胞膜的底物，酶促合成e p s ，而底物如何参与合成作 用，了解很少 4 5 1 。据研究，这些细菌合成e p s 可能有三种方式 ： ( 1 ) 加速扩散， ( 2 ) 活性传递， ( 3 ) 基因转移。底物进入细胞，通常先被磷酸化，用于能量代谢或同 化为细胞内多糖、脂多糖、细胞壁多糖和e p s 。在这些产物台成中，对底物的竞争，受 到细胞自身的调节控制。 肠膜明串珠菌在合成葡聚糖过程中，在葡聚糖酶的作用下，将培养基中蔗糖转移到 前体物质的非还原性末端上合成的，其合成过程如下： 葡聚糖蔗糖酶 蔗糖+ ( 1 ，6 一a d 一糖基) _ 葡聚糖( 1 ，6 一一d 一葡聚糖) 。十果糖 在葡聚糖合成过程中，属于单链反应机制，以蔗糖为唯一底物，合成所需的能量来 自于蔗糖的水解，而不是糖基一核苷酸，不需脂载体和独立的分支酶合成的分子量 肌瑞霞 前言2 0 0 0 年【1 月 大。葡聚糖蔗糖酶是一个核苷转移酶，它能将供体韵糖苜基豳转移到受体( 即正在延长 的糖基链) 上，蔗糖司启动其自身的多聚化反应。 至于其它细菌异质e p s 的生物合成，是以细胞内的低聚糖苷链为前体物，在细胞膜 上合成的“。在细胞膜上合成多糖需要活性前体，即各种高能态的单糖这些高能态的 单糖主要是核糖核苷酸，所有含葡萄糖的多聚物( 除糖原外) 均以u d p d 葡萄糖为供 体：乙酸、丙酮酸、3 一羟基丁酸等的活性形式是酰基：异戊二烯脂中间体整合多糖的重 复单位。在原核细胞多耱合成中起重要作用的是焦磷酸异戊二烯酯；酶包括己糖激酶， 糖基一核苷酸合成酶及转移酶、糖基转移酶、聚台酶等。 2 2 影响e p s 生物合成的因素 目前对乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、乳球菌属和双歧杆菌属的e p s 有一定的 研究，而其它乳酸菌e p s 研究几乎未见报道。由肠膜明串球菌生产的右旋糖酐是最早被 开发利用的乳酸菌e p s ，也是f d a 批准的第一种可用于食品的微生物e p s 。 从现有的研究结果来看，e p s 生物台成得到研究的乳酸菌主要有：德氏乳杆菌保加 利亚亚种” 、瑞士乳杆菌口、米酒乳杆菌】、干酪乳杆菌：a 2 - 3 4 、嗜酸乳杆菌1 “、嗜 热链球菌3 6 - 3 9 j 、乳酸乳球菌乳脂亚种j j 、肠膜明串珠菌h 2 ：等。此外片球菌也能产生 e p s 。 乳酸苗e p s 生物合成过程中，不仅要考虑细菌的生长，而且要提高酶的分泌，以及 酶对糖底物的作用等。荚膜多耱的化学结构是多样的，在荚膜生成过程中，受到培养基 的物理条件和营养物的影响，例如唾液链球菌，只有在含有蔗糖的培养基中才能产生左 旋糖酐，同时也能产生其它荚膜多糖。两歧双歧杆菌产生一种由半乳糖、葡萄糖和岩藻 糖组成的异质多糖“”。f g a n c e l 等人”“比较了蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖作为碳源对唾 液链球菌嗜热亚种发酵生产e