（食品科学专业论文）一株红曲霉的三类聚酮体代谢产物研究.pdf

l 西华大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 嚣紫雾等铽强 日期： lf 乡多 西华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，在校 攻读学位期间论文工作的知识产权属于西华大学，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，西 华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。( 保密的论文在解 密后遵守此规定) 学位论文作孝签名爿惑强 日期：f f c ：岁 篙 师签名| ：象限 嗍，f 1 ：芦u 西华大学硕士学位论文 摘要 红曲霉在我国的利用已经有一千多年的历史。红曲霉代谢过程中不仅会产生多种酶 类、有机酸等初级代谢产物，还会产生多种具有生物活性的次级代谢产物。聚酮类次级 代谢产物主要有红曲色素、洛伐他汀( 1 0 v a s t a t i n ) 和桔霉素。红曲色素主要被用于食品 着色和防腐，洛伐他汀具有降血脂等多种生理活性，而桔霉素对脊椎动物包括人体有肾 毒性。因此如何在提高红曲色素和洛伐他汀产量的同时，降低桔霉素的含量成为红曲霉 发酵研究的重要内容。本文的目的就是研究红曲霉a s 3 5 3 l 在不同发酵方式和培养条件 下，红曲色素、洛伐他汀和桔霉素的产出规律，以及三者的代谢关系，以实现提高红曲 色素和洛伐他汀的产出，降低桔霉素的含量，提高该菌株的使用价值。实验主要由五部 分组成。 第一部分，建立了以双波长紫外分光光度法测定红曲霉发酵产物中洛伐他汀的方 法。结果表明，采用稀释提取液后测定吸光值的方法，稀释倍数对加标回收率有显著影 响，但稀释倍数大于一定值后，红曲色素对洛伐他汀测定结果的影响减小。使用1 0 0 2 0 0 目中性氧化铝先对提取液进行脱色，提取液的上样量为l m l ，以7 5 的乙醇溶液进行洗 脱，收集第3 - 8 m l 洗脱液，测2 4 6 n m 和2 5 4 n m 波长下的吸光值，进而得出洛伐他汀的 含量。该方法的平均加标回收率为9 8 8 ，变异系数为1 6 2 。 第二部分，建立了高效液相色谱测定桔霉素含量的方法。采用s h i m a d z u s h i m p a c kv p o d sc 1 8 色谱柱，在荧光检测波长为a , e x = 3 3 l n m 和l e m = 5 0 0 n m ，柱温2 8 ， 流动相为乙腈：甲醇：水( p h 2 5 ) = 7 0 ：1 0 ：2 0 ，流速为1 m l m i n ，自动进样2 0 9 l 条件 下，桔霉素得以有效分离。桔霉素在0 0 5 5 m l 范围内线性关系良好( r = 0 9 9 9 6 ) ，平 均保留时间为1 8 4 8 2 m i n ，最低检测限为5 肛l ，平均加标回收率为9 8 1 7 ，r s d = i 8 。 第三部分，对红曲霉a s 3 5 3 1 固态发酵产洛伐他汀的培养条件进行了优化。通过正 交实验得到的最佳培养条件是：温度2 8 ，p h 5 0 ，含水量6 0 ，此时洛伐他汀的最大 含量为9 0 3 3 x 1 0 一g g 。 第四部分，对红曲霉a s 3 5 3 1 液态发酵红曲色素与桔霉素的培养条件及培养基成分 进行了优化。单因素实验的结果表明红曲色素的合成与桔霉素的合成有相同的趋势，即 在色素色价高时，桔霉素的含量也较高。而响应面实验的结果却与单因素实验的结果有 差异。通过响应面优化，得到的最佳培养条件为培养温度3 2 、初始p h 为自然p h ( 5 7 ) 、 摇床转速1 5 0 r p m ，在此条件下，红曲色素的色价为6 5 5 9 u m l ，桔霉素为1 4 5 4l ag m l 。 培养基的成分和比例对红曲色素和桔霉素合成的影响很大，其中一定量的甘油和蛋白胨 利于红曲色素的产出，而蔗糖和硫酸铵则更利于桔霉素的合成。通过对碳源和氮源的正 含水量6 0 的条件下，桔霉素的含量最少，为0 0 3 7 7l ag g ，此时色素的色价为1 3 5 8 u g 。 关键词：红曲霉；红曲色素；洛伐他汀；桔霉素 西华大学硕士学位论文 a b s t r a c t m o n a s c u sh a sb e e nu s e df o ro n et h o u s a n dy e a r si no u rc o u n t r y d u r i n gm e t a b o l i s m ， m o n a s c u sc a ns y n t h e t i z en o to n l yp r i m a r ym e t a b o l i t e s ，s u c ha se n z y m ea n do r g a n i ca c i d ，b u t a l s os o m eb i o a c t i v es e c o n d a r ym e t a b o l i t e s m o n a s e u sp i g m e n t s 、l o v a s t a t i na n dc i t r i n i na r e t h r e ek i n d so fp o l y k e t i d e s m o n a s c u sp i g m e n t sa r eu s e da ss t a i n i n ga n da n t i s e p t i c ，a n d l o v a s t a t i nc a nr e d u c ec h o l e s t e r o ll e v e li nb l o o d ，h o w e v e rc i t r i n i ni sn c p h r o t o x i ct oh u m a n s o h o wt op r o m o t et h ep r o d u c t i o no fp i g m e n t sa n dl o v a s t a t i n ，w h i l er e d u c i n gc i t r i n i nl e v e l ，i s t h ef o u e u so fm o n a s c u sf e r m e n t a t i o n t h eo b j e c t i v eo ft h i se x p e r i m e n ti st or e s e a r c ht h e p r o d u c t i o np a t t e r na n dr e l a t i o n s h i po fm o n a s c u sp i g m e n t s 、l o v a s t a t i na n dc i t r i n i no fm o n a s c u s a s 3 5 31u n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s ，i no r d e rt op r o m o t et h ep r o d u c t i o no fp i g m e n t sa n d l o v a s t a f i n ，w h i l er e d u c i n gc i t r i n i nl e v e l t h er e s e a r c hi sc o m p o s e db yf i v ep a r t s i nt h ef i r s t p a r t ，t h e d e t e c tm e t h o do fl o v a s t a t i n b y d o u b l ew a v e l e n g t hu v s p e c t r o p h o t o m e t r yw a se s t a b l i s h e d t h er e s u l ts h o w e dt h a td i l u t i o nl e v e lh a ds i g n i f i c a n t e f f e c t i o nt ol o v a s t a t i nr e c o v e r yr a t e w h e nt h ed i l u t i o nl e v e lw a ss u f f i c i e n t ，t h ee f f e c t i o no f p i g m e n tt ol o v a s t a t i nd e t e c t i o nw a sr e d u c e d 1m le x t r a c t i o nw a su s e dt od e c o l o r a t eb ya 1 2 0 3 ， a n de l u t e db y7 5 e t h a n 0 1 t h e3 - 8 m le l u e n tw a su s e dt od e t e c tl o v a s t a t i nc o n t e n tu n d e r 2 4 6 n ma n d2 5 4 n m t h ea v e r a g er e c o v e r yr a t eo fl o v a s t a t i ni s9 8 8 ，a n dc o e f f i c i e n to f v a a t i o ni s1 6 2 i nt h es e c o n dp a r t ，ad e t e c t i o nm e t h o do fc i t r i n i nw a se s t a b l i s h e db yh p l c u n d e rt h e c o n d i t i o no fs h i m a d z u s h i m p a c k v p o d sc 18 c o l u m n ，f l u o r e s c e n tl i g h tw a v e k e x = 3 3 l n ma n dl e m = 5 0 0 n m ，c o l u m nt e m p e r a t u r e2 8 ，a c e t o n i t r i l e ：m e t h a n o l ：h 2 0 = - 7 0 ：1 0 ：2 0 ， f l o wr a t el m l m i n ，s a m p l es i z e2 0 i t l ，c i t r i n i nh a sg o o dl i n e a r i t yb e t w e e n0 0 5 5 m g l ，a n dt h e a v e r a g er e t e n t i o nt i m ei s 18 4 8 2 m i n t h el o w e s td e t e c t i o ni i m i ti s5i lg l ，a n dt h ea v e r a g e r e c o v e r yr a t ei s9 8 17 r s d - - 1 8 i nt h et h i r dp a r t ，t h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so fl o v a s t a t i np r o d u c t i o nb ys o l i df e r m e n t a t i o n w e r eo p t i m i z e d o r t h o g o n a le x p e r i m e n tr e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m i z ec o n d i t i o n sw e r e 2 8 ，p h 5 0 ，w a t e rc o n t e n t6 0 ，u n d e rt h i sc o n d i t i o n s ，t h ep r o d u c t i o no fl o v a s t a t i nw a s 9 0 3 3 x1 0 6 9 g i nt h ef o u r t hp a r t ，t h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sa n dm e d i u mc o m p o s i t i o no fp i g m e n ta n d c i t r i n i nl i q u i df e r m e n t a t i o nw e r eo p t i m i z e d t h er e s u l to fs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ts h o w e dt h a t t h ep i g m e n ta n dc i t r i n i nh a dt h es a m ep r o d u c t i o nt r e n d b u tt h er e s u l to fr e s p o n s es u r f a c e d e s i g ni sd i f f e r e n tf r o ms i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t b ym e a n so fr e s p o n s es u r f a c ed e s i g n ，t h e o p t i m i z e dc o n d i t i o n sa r e3 2 c ，p h 5 7a n dr o t a t er a t e1 5 0 r p m u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h e p i g m e n tv a l u ei s6 5 5 9 u m l ，a n dc i t r i n i ni s 1 4 5 4l ag m l t h ec o m p o s i t i o na n dr a t i oo f i i i i m o o r t a n tf a c t o rt oa f f e c tp i g m e n tp r o d u c t i o n ，b u tf o rt h ec i t r i n i ni t sp h w h o r lt h em e d i u m c o n t e n t sm o r et h a n5 0 w a t e r , t h ey e l l o wp i g m e nw i l lb em o r et h a nr e dp i g m e n t u n d e rt h e f o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：r i c e6 0 9 ，3 7 ，p h 5 5 ，w a t e rc o n t e n t6 0 ，t h ey i e l do fp i g m e n ti s 2 9 7 0 u g ，a n dc i t r i n i ni s o 14 6 5pg g w h e nt h ec o n d i t i o n sa r ca sf o l l o w i n g ：r i c e4 0 9 ，3 2 c ， p h 5 0 ，w a t e rc o n t e n t6 0 ，t h ey i e l do f c i t r i n i ni s0 0 3 7 7 | lg 岛a n dp i g m e n ti s1 3 5 8 u g k e yw o r d s ：m o n a s c u s , p i g m e n t ；l o v a s t a t i n ；c i t r i n i n 西华大学硕士学位论文 目录 摘j 1 2 9 ：i a b s t r a c t i i i 1绪论l 1 1红曲色素1 1 1 1红曲色素的种类和提取1 1 1 2 红曲色素的稳定性3 1 1 3 红曲色素产量提高的方法5 1 1 4小结7 1 2洛伐他汀7 1 2 1 洛伐他汀的理化性质7 1 2 2 洛伐他汀的生理活性8 1 2 3洛伐他汀的生物合成9 1 2 4 提高洛伐他汀产率的途径1 1 1 2 5 小结1 3 1 3 桔霉素1 4 1 3 1桔霉素的性质。1 4 1 3 2 桔霉素的毒性1 4 1 3 3桔霉素的生物合成1 5 l - 3 4 控制桔霉素合成的方法1 6 1 3 5 小结l7 1 4 展望。1 7 2 洛伐他汀检测方法的建立1 8 2 1 材料与仪器18 2 1 1材料与试剂18 2 1 2 主要仪器1 8 2 2 结果与分析1 8 2 2 1 洛伐他汀标准品的紫外扫描结果1 8 2 2 2 标准曲线的绘制1 9 2 2 3红曲色素对测定结果的影响2 0 2 2 4 柱层析对测定结果的影响2 l 2 2 5 方法回收率测定2 2 v 一株红曲霉的二类聚酮体代谢产物研究 2 3 结论2 2 高效液相色谱法测定桔霉素2 3 3 1 材料与方法2 3 3 1 1 试剂与主要仪器2 3 3 1 2 菌株与培养基2 4 3 1 3 红曲霉的液态培养2 4 3 1 4 样品前处理2 4 3 1 5 液相色谱条件的确定2 4 3 2 结果与分析2 4 3 2 1 色谱柱的选择2 4 3 2 2 流动相及其比例对分离效果的影响2 6 3 2 3 桔霉素标准曲线的测定2 8 3 2 4 桔霉素最低检出限。2 8 3 2 5 重现性实验2 8 3 2 6 加标回收率试验2 9 3 3 结论2 9 洛伐他汀的发酵工艺研究。3 0 4 1实验材料3 0 4 1 1 材料和主要仪器。3 0 4 1 2 菌株与培养基3 0 4 2 实验方法3 1 4 2 1 料层厚度对洛伐他汀产率的影响。3 1 4 2 2 温度对洛伐他汀产率的影响3 1 4 2 3 培养周期对洛伐他汀产率的影响。3 1 4 2 4 初始p h 对洛伐他汀产率的影响3 1 4 2 5 初始含水量对洛伐他汀产率的影响3 1 4 2 6 培养条件对洛伐他汀产率影响的正交实验3 l 4 3 结果与讨论3 2 4 3 1 料层厚度对洛伐他汀产率的影响结果。3 2 4 3 2 温度对洛伐他汀产率的影响结果3 2 4 3 3 培养周期对洛伐他汀产率的影响结果3 3 v i 两华大学硕士学位论文 4 3 4 初始p h 对洛伐他汀产率的影响结果3 3 4 3 5 培养基初始含水量对洛伐他汀产率的影响3 4 4 3 6 正交实验优化培养条件结果3 5 4 4 结论与讨论3 6 5 液态发酵过程中红曲色素与桔霉素的变化3 7 5 1 材料和仪器3 7 5 1 1 试剂3 7 5 1 2 主要仪器3 7 5 1 3 菌株和培养基3 7 5 2 实验方法3 8 5 2 1培养方法3 8 5 2 2 样品处理3 8 5 2 3 红曲色素色价的测定3 8 5 2 4 桔霉素含量的测定。3 8 5 3 结果与讨论3 8 5 3 1 培养温度对红曲色素与桔霉素合成的影响3 8 5 3 2 培养基初始p h 对红曲色素及桔霉素合成的影响3 9 5 3 3 摇床转速对红曲色素及桔霉素合成的影响4 0 5 3 4 红曲霉产色素与桔霉素培养条件的响应面优化4 1 5 3 5 不同碳源对红曲色素和桔霉素合成的影响5 0 5 3 6 不同氮源对红曲色素和桔霉素合成的影响5 l 5 3 7 碳源与氮源的正交试验一5 2 5 4 结论5 3 6 固态发酵条件对红曲色素与桔霉素生物合成的影响5 4 6 1 材料和仪器5 4 6 1 1 试剂5 4 6 1 2 主要仪器5 4 6 1 3 菌株和培养基5 5 6 2 实验方法5 5 6 2 1 样品处理5 5 6 3 实验结果与讨论5 5 6 3 1培养温度对色素色价和桔霉素的影响5 5 v i l 一株红曲霉的二类聚酮体代谢产物研究 6 3 2 培养基的p h 对色素色价和桔霉素的影响5 6 6 3 - 3 培养基初始含水量对色素色价和桔霉素的影响5 7 6 3 4 料层厚度对色素色价和桔霉素的影响5 8 6 3 5 培养条件的正交试验5 9 6 4 结论6 1 结论6 2 参考文献6 4 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果7 1 致谢7 2 两华大学硕士学位论文 1绪论 1 1红曲色素 1 1 1 红曲色素的种类和提取 红曲色素是由红曲霉属的丝状真菌在次级代谢过程中产生的一系列聚酮类色素的 混合物，是一类优良的食用天然色素。1 9 3 2 年，n i s h i k a w a 最早从一株紫红曲霉的培养 物中分离出黄色色素和红色色素晶体，之后的一些学者用有机溶剂提取红曲色素，得到 了黄色片状、红色和紫色的针状结晶。红曲色素中已被确定化学结构且应用较广的为以 下6 种色素，分别是：两种红色色素红斑红曲胺( 梦那玉红胺) ( m o n a s c o r u b r a m i n e ) 和 红曲玉红胺( 潘红胺) ( r u b r o p u n c t a m i n e ) ；两种橙色色素红斑红曲素( 潘红) ( r u b r o p u n c t a t i n ) 和红曲玉红素( 梦那玉红) ( m o n a s c o r u b r i n ) ；两种黄色色素红曲素( 梦 那红) ( m o n a s c i n ) 和红曲黄素( 安卡黄素) ( a n k a f l a v i n ) 。以上6 种色素的化学结构见图 1 1 。 ( 5 )6 ) 图1 1 六种红曲色素化学结构1 】 f i g 1 1 c h e m i c a ls l l - u c t u r eo fs i xk i n d so fm o n a s c u sp i g m e n t s ( 1 ) 红曲黄素；( 2 ) 红曲素：( 3 ) 红斑红曲素；( 4 ) 红曲玉红素： ( 5 ) 红斑红曲胺；( 6 ) 红曲玉红胺 日本学者广井忠夫等研究认为，除以上六种色素外，还有5 6 种色素存在于红曲 色素中。1 9 9 3 年郭东川【2 】等分离得到两种新的红曲色素，其可能的分子式分别为 一株红曲霉的三类聚酮体代谢产物研究 c 2 3 h 2 7 0 5 n 和c 2 5 h 3 1 0 5 n 。2 0 0 4 年，连喜军等【3 】用喷雾质谱法分析了两种红曲霉所产橙 色素的组成，结果表明，菌株代谢产生红曲色素的种类与菌株的特性有关，实验所用红 色红曲霉代谢产生的是两种未知的橙色红曲色素，而烟色红曲霉产生的橙色红曲色素与 已有的文献报道相同。研究还认为，在一定条件下，橙色红曲色素可以向红色红曲色素 和黄色红曲色素转化；红曲色素中黄色色素和红色色素会形成二聚体的结构，但形成二 聚体的过程是否为生物转化的过程还未确定。2 0 0 8 年屈炯1 4 等采用不同的展开剂对红曲 色素进行薄层层析，得到2 种橙色素，4 种黄色素，7 种红色素，共1 3 种色素组分，但 并没有确定其化学结构。 红曲色素有脂溶性和水溶性色素两大类，脂溶性色素不易溶于水中，但水溶性色素 有一部分可溶于有机溶剂中。红曲霉发酵所产红曲色素有2 0 - - 3 0 分泌到发酵液中( 即 胞外色素) ，7 0 - - 8 0 在菌体内( 胞内色素) 。胞内色素多为醇溶性色素，而胞外色素 多为水溶性色素。其中在7 8 的醋酸溶液或8 2 的乙醇溶液中，红曲色素的溶解性最好， 在中性或碱性水溶液中，溶解性较好【5 】。根据红曲色素的以上性质特点，很多学者对红 曲色素的提取开展了研究。2 0 0 4 年，石鹤等【6 】对红曲霉发酵液及菌体中红曲色素的提取 进行了研究，研究发现对菌体进行烘干处理后进行色素提取的效果更好，菌体烘干后有 机溶剂对色素的浸提速度明显高于湿菌体，浸提液色价高，且缩短了浓缩时间，避免了 红曲色素发生部分聚合反应，以及提取液的沉淀变性。对提取剂的研究发现，丙酮和乙 醇都拥有较高的提取率，且丙酮的提取率更高，但从毒性和经济方面考虑，乙醇更为适 宜。以6 0 的乙醇，于6 0 恒温处理l h 获得了最大的菌体色素提取率。在用乙醇提取 菌体色素的同时，加入一定量的钠盐、钙盐或其混合物，均可以提高提取效果，但其机 理尚不清楚，可能是这两种金属离子的存在改变了细胞膜的通透性，而使色素提取率提 高。对于发酵液中红曲色素的提取，研究了活性炭吸附法和沉淀法。活性炭吸附法是 先用活性炭吸附发酵液中的色素，然后用乙醇进行洗脱。研究发现以粉状活性炭吸附后， 以9 5 的乙醇在5 0 洗脱3 0 r a i n 效果较好，但活性炭吸附的色素不易洗脱，色素回收 率较低。共沉淀法是通过调节发酵液的p h 值到豆蛋白的等电点，从而使与豆蛋白结合 的水溶性色素一起沉淀下来，然后将发酵液离心沉淀，浓缩后获水溶性红曲色素。该方 法在p h 3 1 3 5 范围内沉淀效果较好，对色素的提取率较活性炭吸附法较高。邵伟等1 7 】 通过分析7 0 乙醇提取红曲色素过程中的色价一时间的变化关系，结合经典的数学传质 模型，运用m a t l a b 软件，建立了红曲色素提取过程中提取时间一色价的动力学模趄，且 该模型能较好地反映色素提取过程中浓度与时间之间的关系。近几年，一些先进的技术 手段也被应用到红曲色素的提取中。2 0 0 9 年，乐超银【8 】等以红曲米为原料，对超临界 c 0 2 流体萃取红曲色素的最佳工艺条件进行了研究。结果表明，以7 0 乙醇为携带剂、 了研究【9 ，l o 】，研究表明，通过优化工艺条件，色素提取率比传统的乙醇浸提法有了很大 提高。超声波的作用主要是使细胞破碎，或增加菌体的通透性，因此，超声波辅助提取 的方法，主要用来提高菌体中红曲色素的提取率。2 0 1 0 年，明红梅等【l l 】对微波辅助法 提取胞内红曲色素进行了研究，试验结果表明，在液固比2 0 ：1 ，微波功率6 0 0 w 时，用 4 5 的乙醇，在7 0 处理7 0 s ，能有较好的提取效果，与传统的乙醇浸提法相比提高了 7 2 2 。通过以上方法提取的红曲色素多为醇溶性色素，其应用领域有一定的局限性。 而水溶性色素更便于提取与食品工业中的应用，为改善红曲色素的水溶性，很多方法被开 发出来，例如在橙色素分子上构造一个易与氨基发生缩合反应的羧基，再以化学方法将 含有氨基的化合物，加入到橙色素分子中，增加色素分子的极性，从而提高其水溶性。如 何提高红曲色素中水溶性色素的比例或者使醇溶性的红曲色素转化为水溶性色素成为 红曲色素生产中需要解决的问题。 1 1 2 红曲色素的稳定性 红曲色素较其他色素，具有着色力强，色调柔和，性质稳定，耐性强等优点。但有 很多因素会对红曲色素的稳定性产生影响，其中p h 值是主要的影响因素。研究发现在 一定的p h ( 3 0 - 9 5 ) 范围内，红曲色素的最大吸收波长和色调变化都较小，色泽没有 发生肉眼可见的变化。但在极酸( p h 1 0 0 ) 的条件下，红曲色素的色调会发 生变化，黄色和红色组分的含量会发生明显的变化【1 2 】。赖建平等【1 3 】研究发现，在不同的 p h 值及不同的波长下测定的吸光值是不同的，p h 值为5 6 8 3 对色调的影响较小，调 节色素液的p h 值在中性左右，有利于保持红曲色素的红色状态。而红曲黄色素在酸性 条件下黄色较为鲜艳，在中性或碱性条件下则不稳定，逐渐变为红褐色。根据红曲色素 在不同p h 值条件下的这种变化性质，我们可以通过调节p h 来实现红曲色素的不同呈 色，从而满足我们对色调的不同需求，扩大红曲色素的应用范围。 红曲色素与合成色素相比，具有更高的安全性，红曲色素在避光条件下是相当稳定 的，避光存放6 0 天，色素保存率仍在9 2 以上。但其光稳定性较差，受光照的影响会发生 变色或退色。嵇豪【1 4 】等研究发现，波长越短的光对色素的降解作用越强，蓝色光的作用 接近于太阳光。k i m 掣1 5 】的研究发现，红曲色素对短波长的紫外线很稳定。 红曲色素的褪色过程，是在有氧条件下，红曲色素受到羟自由基、超氧阴离子、脂 肪族侧链断裂产生的自由基等三种自由基作用，而发生氧化，发色团被破坏，色素发生 分解的过程。连喜军【l6 】等人研究了红曲红色素的褪色机理，认为红曲色素在在紫外线的 作用下，其分子中的脂肪族侧链首先在q 碳原子处发生n o r r i s h 型断裂，产生自由基， 一株红曲霉的三类聚酮体代谢产物研究 然后在第七位甲基上发生相同反应。随后色素分子发生双键转换和电子转移，水溶液中 产生羟基自由基，与色素分子中的双键加成，共轭双键消失，色素褪色。而王昌禄等l l j 对红曲红色r u b r o p u n c t a m i n e 和m o n a s c o r u b r a m i n e 在日光照射下的稳定性研究发现，红曲 色素光降解符合一级动力学反应，其褪色反应与溶解氧无关，而是由光能量导致的光化 学反应。随着褪色反应的进行，色素溶液的色饱和度减小，而色相角保持稳定， r u b r o p u n c t a m i n e 和m o n a s e o m b r a m i n e 光照后降解形成新的无色物质，初步推测是由于两 种色素分子中最不稳定的脂肪族侧链首先发生断裂，成为相同的分子结构，同时，分子 中的发色基团q ，1 3 一不饱和酮体系和多个共轭键遭到破坏，导致色素褪色。红曲色素 见光易分解的性质，大大限制了红曲色素的应用范围，如何提高红曲色素的光稳定性成 为广大学者研究的重点。根据红曲色素的分子结构和褪色机理，可以通过添加色素稳定 剂在红曲色素的成品中，或在发酵过程中添加氨基酸、多肽等物质，使红曲霉分泌聚酮 酶时将护色物质结合到色素结构上【r 7 1 8 】，以提高其稳定性。发酵培养基中添匀d v a l 、l y s 或a r g 生产红色素的光稳定性最强，分别达到了9 1 9 、8 9 0 和8 8 5 ，比空白对照提 高1 0 以上【1 9 】。常用的色素稳定剂有：槲皮素、1 ，4 ，6 一三羟基萘、芝麻酚林衍生物、 多酚、黄酮等物质。又有研究发现，抗坏血酸能有效防止红曲色素组分中的红色素发 生光褪色，而加入b h t 能提高红曲色素中黄色素的光稳定性【2 吆。这些物质都是抗氧化 剂，其羟基与红曲色素分子上的酮基形成化学键，稳定其结构，在光的作用下不会因能 量跃迁发生结构变化。另一类色素稳定剂是在不影响色素分子助色团和发色基团的情况 下，与色素形成结构稳定的物质，从而实现对色素的保护。乔华【2 2 】等研究了b 一环糊精 对红曲红色素的保护。将红曲红色素与b 一环糊精形成的包合物置于室内，经过1 0 天自 然光照后，游离红曲色素的残存率为2 8 7 ，而包合物的残存率为4 9 3 ；紫外光照射1 5 0 分钟之后，游离色素的残存率为5 2 2 ，而包合物的残存率为7 2 3 。这是由于1 3 环糊精 将红曲色素分子包入其结构的空腔之内，降低了色素分子结构被破坏的几率，也降低了 其降解速率。 红曲色素的耐热性较强，常温下保存色价较高。其乙醇溶液在1 0 0 加热1 5 小时 或1 2 0 加热o 5 小时，色素保存率在9 2 以上。在1 2 0 加热1 5 小时或在1 0 0 加热 3 小时，色素保存率在8 4 以上【2 3 】。嵇豪等【1 4 】对红曲色素的热降解动力学进行了研究， 结果表明红曲色素的热降解分别与零级、一级、二级动力学方程有着很高的相关性。色 素随着温度的升高半衰期下降，稳定性也降低。高浓度的色素具有更强的热稳定性。红 曲色素的耐热性，对其在食品工业的应用有着重要的实际意义。 金属离子会对红曲色素的稳定性产生影响。杨玲等【2 4 】发现，钾、钙、钠、铜离子对 红曲色素的稳定性影响不大，而亚铁离子对黄色素有严重影响。而孙春禄【z 副的研究发现， 4 两华大学硕士学位论文 铜离子对红曲色素色价的稳定性干扰最大，其次是镁离子。螯合剂e d t a 对色素的保存 效果最佳。 1 1 3 红曲色素产量提高的方法 红曲色素的色价、稳定性以及产量等方面，与菌种的特点有直接的关系，因此，选 育出性质优良的红曲霉菌种，对于红曲色素的生产有着重要的意义。红曲霉菌种的选育， 主要是诱变育种。王玮萍【2 6 】等以紫红曲霉( m o n a s c u sp u r p u r e u s ) n 0 1 为出发菌株，以紫外 线诱变，得到制各原生质体的出发菌株n 0 1 8 ，该菌株的色素产量比n o l 提高了一倍。 再以紫外线诱变原生质体，筛选获得一株有遗传稳定性的红曲色素高产菌株n 0 1 5 4 ，其 红色素产量是n o l 的3 倍。梁智嫦等【27 】以红曲霉m o n a s c u sa n k a 为出发菌株，通过紫外 线、酸、以及高温处理，经过定性筛选，选育出一株色价高，稳定性高的菌株，该菌株 所产色素色调紫红，色价水平明显高于原出发菌株。孙文红【2 8 】对一株红色素高产紫红曲 霉进行紫外诱变2 5 m i n ，所得突变株进行液态和固态发酵，红曲色素色价分别比出发菌 株提高了6 1 9 0 和4 5 1 0 ；色调与出发菌株相比分别提高了1 6 4 7 和1 3 0 4 。所得 突变株有良好的遗传稳定性，液态发酵和固态发酵的红色素色价分别稳定在1 7 5 u m l 和1 5 0 0 u m l 。邓静等【2 9 】对一株紫红曲霉进行紫外、微波、超声波、氯化锂进行了单独 的或复合诱变。经紫外照射9 0 s 和超声波( 4 0 l m z ，5 0 0 w ) 处理3 0 r a i n 联合诱变，得到 的一株突变株其红色素色价增加了3 9 7 。研刭2 9 3 0 】还发现，两种不同的诱变方法对诱 变效果具有协同作用，但并不是越多种诱变方法复合处理，越有利于正向突变。针对红 曲色素中，黄色素含量较少的问题，周波等【3 l 】对产红曲黄色素的菌株进行选育，利用紫 外线、硫酸二乙酯、氯化锂和亚硝基胍复合诱变，选育到一株黄色素高产菌。该菌株稳 定性好，液态发酵产黄色素色价达1 0 0 u m l 以上，色调达3 5 左右，色调水平高于之前 学者的研究结果【3 2 1 。 红曲色素一般采用固态发酵或深层液态发酵法进行生产，但其合成机理及生物合成 的代谢途径仍有待迸一步阐明。2 0 0 0 年，h a j j a j 等【3 3 】研究了红色红曲霉中红曲玉红胺的 合成途径。在p k s s 的作用下，l m o l 乙酰辅酶a 和5 m o l 丙二酸单酰辅酶a 生成六酮聚 酮化合物，然后经过反式酯化反应与中度或长度的脂肪酸结合，生成红曲玉红素( 与己 酸反应生成红斑红曲素) ，这些橙色色素还原后产生黄色的红曲黄素和红曲素，氨化则 生成红色的红曲玉红胺和红斑红曲胺。2 0 0 6 年，朱雷【3 4 】等对红曲色素的合成机理进行 了初步研究。试验采用刺激实验法确定了缬氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、异亮氨酸等氨基酸， 以及乙酸、丙酸等短链脂肪酸可以作为红曲色素的前体。色素开始大量合成时补加适当 浓度的前体，有利于色素的合成。这些前体物质主要是通过形成聚酮合成的活性前体甲 基丙二酰辅酶a 、乙酰辅酶a 、丙酰辅酶a 和丙二酰辅酶a 掺入红曲色素的碳架中， 5 酶也受 到培养条件的影响，因而，培养基和培养条件的优化对红曲色素的牛产也至为重要。传 统的红曲霉发酵方式是固态发酵。张红梅等p 6 j 研究了发酵温度，发酵时间、接种量、翻 曲次数及烘干温度对红曲色素和桔霉素的影响。研究发现恒温培养时的色价高于变温培 养，且变温培养的桔霉素产量较高；色素的产量随着接种量的增加而增加，在1 2 达最 大：减少翻曲次数会同时降低色素和桔霉素的产量，而烘干温度的提高会同时使色素和 桔霉素的量减少。最终确定的最大色素产量和最小桔霉素产量的发酵控制条件为：3 4 恒温培养9 6 h 以内，接种量1 2 ，翻曲一次，烘干温度为5 0 。季宏飞1 3 7 】采用b o x b e h n k e n 设计和响应面分析，对同时影响色素和橘霉素产量的三个关键因素发酵温度、发酵时间、 初始水分进行了优化。研究发现，要提高红曲米的色价，必须将初始水分和发酵温度分 别严格控制在3 7 3 8 5 、2 6 5 2 9 0 。c 之间，否则即使延长发酵时间红曲米色价也难以 提高。通过优化培养条件，获得的红曲米色价为2 9 4 5 3 2 u g ，此时橘霉素的含量为1 5 6 0 |