（无机化学专业论文）钴（Ⅱ）卟啉胰岛素衍生物的制备和表征.pdf

华中科技大学硕士学位论文 表明，在p h 8 2 的条件下，钴卟啉胰岛素保留时间比胰岛素长，因为钴卟啉胰岛 素衍生物的极性强于胰岛素。圆二色谱显示在碱性条件下钴卟啉胰岛素中a 螺旋 和无规卷曲的含量减少，b 一转角和0 一折叠的含量增加。我们研究了钴卟啉胰岛 素及胰岛素在0 0 2 m o i l n h 4 h c 0 3 缓冲溶液中的衰减全反射光谱，经处理获得差 谱、去卷积谱和二阶导数光谱。这些光谱都进一步证明在p h 6 9 条件下钴卟啉胰 岛素的结构没有显著变化，而在p h 8 2 条件下钴卟啉胰岛素的结构发生较大改 变。新的酰胺键的介入以及钴卟啉同胰岛素的配位作用使差谱中的酰胺i 带和i i 带的峰均发生分裂，在去卷积光谱和二阶导数光谱中同样显示了钴卟啉胰岛索结 构的改变。 这些结果说明在p h 6 9 的条件下，由于胰岛素的h i s 侧链上的咪哗基质j 化， 妨碍了胰岛素与钴卟啉之间的配位等相互作用，不易使其结构发生变化；f 嗵舀： p h 8 2 的条件下胰岛素的h i s 侧链上的咪哗基去质子化，钴卟啉与胰岛素之蚓的 相互作用可使其结构发生较大变化，表现在u 一螺旋和无规卷曲的减少，b 转角、 1 3 一折叠的增加。 我们还设计了钴卟啉脱锌胰岛素并用紫外一可见吸收光谱，体积排阻色谱， 高效液相色谱对其进行了表征。结果表明脱锌胰岛素与钴卟啉之间通过酰胺键结 合后，结构变得紧密，分子极性减小。 钴卟啉作为结构模板，与胰岛素共价和配位结合之后，在一定程度上破坏了 肽链原有的相互作用网络，诱导肽链变构，形成新的弱相互作用网络。j 关键词 胰岛素：原卟啉i x 钻卟啉胰岛素；钴卟啉脱锌胰岛素? 表碜 a b s t r a c t m e t a l l o p r o t e i n s u t i l i z ea r e l a t i v e l y s m a l ln u m b e ro fm e t a l b a s e d p r o s t h e t i c g r o u p st o s e r v en u m e r o u sa n dd i v e r s ec h e m i c a lf u n c t i o n s t h eh e m e - p r o t e i nt a m i l y r e p r e s e n t saf a s c i n a t i n ge x a m p l e i nt h i sr e s p e c ta l a r g en u m b e rm i n i a t u r a t i o nm o d e l s o f h e m e p r o t e i n sh a v eb e e nd e v e l o p e du s i n gd i f f e r e n ts t r a t e g i e si no r d e rt ou n d e r s t a n d t h es t r u c t u r e f u n c t i o nr e l a t i o n s h i pi nh e m e - p r o t e i n s i n s u l i ni sas p e c i a ld r u gf o rt r e a t i n gd i a b e t e st h ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o no f i n s u l i na t t r a c t sa ni n t e n s i v ei n t e r e s ti np r o t e i n d e s i g n w h i l em e t a l l o p o r p h y r i n i sa c r i t i c a lc o f a c t o ri nt h e h e m e p r o t e i n st h e r e f o r e 、c o ( i i ) p r o t o p h y r i n l x i n s u l i n d e r i v a t i v ew a sd e s i g n e da n dc h a r a c t e r i z e di no r d e rt or e v e a l t h er o l e s p l a y e d 1 1 j m e t a l l o p o r p h y r i n i nf o r m a t i o no fh e m e p r o t e i ns t r u c t u r e sa n df u n c t i o n t h ec o ( i i ) p p i x i nd e r i v a t i v e sw a so b t a i n e db yl i n k i n gt h e c o o hg r o u pi nt h e p p i xt o 一n h zg r o u po fb 2 9 - l y si ni n s u l i nt h es t e p si nf o r m a t i o no ft h ea m i d o b o n d si n c l u d et h et r a n s f o r m a t i o n so fp p i xi n t op p i x d m e p p i x d m ei n i o c o ( i i ) p p i x d m e ，c o ( i i ) p p i x d m e i n t o c o ( i i ) p p i x d a h ，c o ( 1 1 ) p p i x d a h i n t o c o ( i i ) p p i x d a a ，r e s p e c t i v e l y p p i x d m e ，c o ( i i ) p p i x d m e ，c o ( i i ) p p i x d a h a n dc o ( i i ) p p i x d a aw e le c h a r a c t e r i z e db ye l e m e n t a la n a l y s i s ，a t o m i ca b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y u l t r a v i o l e t - 、i s i b l e ( u v - v i s i b l e ) s p e c t r a a n di n f r a r e d a b s o r p t i o ns p e c t r a t h e d a t as h o w e dt h a tt h e a c t i v a t i o no f p p i xi ss u c c e s s f u i t h ec o ( i i ) p p i x i nd e r i v a t i v e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yu v - v i s i b l es p e c t r a s i z e e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y , r e v e r s e p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p - h p l c ) ，c i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) a n d a t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t i o ns p e c t r a ( a t r ) t h ec o ( i i ) p p i x i nd e r i v a t i v e s p r o d u c e ac h a r a c t e r i s t i cb a n da t 2 7 6 n mi n u v - v i s i b l e s p e c t r a t h e s o r e tb a n dr e d s h i f t e dt o4 2 5 n mw a s a t t r i b u t e dt h e i i i 华中科技大学硕士学位论文 c h r o m o p h o r e e x t e n s i o nm e d i a t e db yt h ec o v a l e n tl i n k a g eo f c o ( i i ) p p i xt oi n s u l i n s e c s h o w e dt h a tac o o r d i n a t i o ni n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ec o ( i i ) i o ni np p i xa n dh i ss i d e c h a i ni ni n s u l i ni sc o n c o m i t a n tw i t ht h ec o v a l e n tm o d i f i c a t i o na r o u n dp h 82 7 f h i sw a s s u p p o r t e db y r p h p l cd a t ai n d i c a t i n gt h a tt h er e t e n t i o nt i m eo ft h ed e r i v a t i v e si sm o r e t h a nt h a to fi n s u l i na l o n ea r o u n dp h8 2b e c a u s et h ed e r i v a t i v e sa r em o r ep o l a rt h a n i n s u l i na l o n e c dd e m o n s t r a t e dt h a tc o n t e n to ft h eq h e l i xa n dr a n d o mc o i ls t r u c t u r e s w e r ed e c r e a s e db u tt h e 1 3 - l o o pa n d 0 一s h e e ts t r u c t u r e si n c r e a s e du n d e rt h ea l k a l i n e c o n d i t i o n s w ed e t e r m i n e dt h ea t rs p e c t r ao ft h ec o ( i i ) p p l x - i nd e r i v a t i v e sa n d i n s u l i na l o n ei no 0 2 m o l l n h 4 h c 0 3b u f f e ra tp h - 6 9a n d8 2r e s p e c t i v e l yt h e s ed a t a i n d i c a t e dt h a tt h ei n s u l i ns t r u c t u r ei nt h ed e r i v a t i v e si sd i f f e r e n tf r o mt h ei n s u l i na l o h e a r o u n dp h8 2 t h ef o r m a t i o no fn e wa m i d ob o n da n dt h ec o o r d i n a t i o no fp o r p h y r i nt o i n s u l i nl e dt on e wp e a k si na m i d eia n da m i d ei i s u p p o r t e db yt h es e l 二d e c o n v o l l l t i o l l a n ds e c o n d - d e r i v a t i v es p e c t r a t h e s er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h el i g a t i o nb e t w e e nt h ec o ( i i ) i o ni nt h ec o ( i i ) p p i x a n dt h eh i si m i d a z o l y lg r o u p so fi n s u l i na tp h 8 2r e s u l t si na no b v i o u sa l t e r a t i o ni n t h ei n s u l i ns t m c m r e ，i n c l u d i n gad e c r e a s ei n0 一h e l i xa n dr a n d o mc o i ls t r u c t u r e sa n da n i n c r e a s ei n b l o o pa n d 1 3 - s h e e ts t r u c t u r e s o nt h eo t h e rh a n d t h el i g a t i o nd o e sn o t o c c u ra tp h 6 9 ，a n dt h ec h a n g e si nt h ei n s u l i ni sn o t s i g n i f i c a n t t h e r e f o r e ，t h em e t a l l o p o r p h y r i na sat e m p l a t ec a nl e a dt oa na l l o s t e r i ce f f e c tt h a t r e a r r a n g e st h ep e p t i d ec o n f o r m a t i o n sa r o u n dt h et e m p l a t e k e yw o r di n s u l i n ，p r o t o p o r p h y r i n l x c o ( i i ) p r o t o p o r p h y r i n l xi n s u l i n ，c o ( i i ) p r o t o p o r p h y r i n i xz i n c d e p l e t e di n s u l i n ，c h a r a c t e r i z a t i o n i v 华中科技大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 卟啉与金属卟啉 生物体系中的过氧化氢酶，过氧化物酶，细胞色素及虹红蛋白，肌红蛋白等 一系列生物活性分子所含的卟啉和类卟啉辅基是重要的生物活性中心，与生命过 程密切相关。因而有关卟啉配合物的合成及其功能的研究已成为配位化学研究的 重要领域之一。 1 1 1 卟啉 通常的卟啉是由2 0 个碳和4 个氮原子组成的共轭大环，碳和氮彼此之问均 采用s p 2 杂化，剩余的一个p 轨道被单电子或孤对电子占有( 碳和毗咯型的氮都提 供单个z 电子，同氢连接的氮原子提供2 个月电子) ，形成2 4 中心2 6 电子的大 键。 卟啉和类卟啉化合物是生命体系中重要的结构单元，一般具有很深的颜色， 由于共轭大环的存在，这类化合物在3 8 0 4 2 0 r a n 之间出现强的吸收带。通常称 为s o r e r 带( 亦称为b 带) ，b 带是卟啉环的 a l 。( n ) - b l 。( n ) 允许跃迁。卟啉化合物除了有一个 强吸收的s o r e r 带以外，在可见区还有弱吸收0 带， 它们是卟啉环的a 2 。( ) - 。g ( n ) 准允许跃迁，中性 卟啉的q 带通常含有四个峰，并根据这四个峰的 相对强度而分四种不周类型的谱带，即原初( e t i o ) 型，玫红( r h o d o ) 型，氧化玫红( o x o r h o d o ) 型和叶 了拓葫r 一 v ( p h y l l o ) 型。几乎所有的天然卟啉都具有原初型谱 带，q 带强度比为 i i i 如图1 1 。其它图l l 原初型卟啉的电子光谱 华中科技大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 卟啉与金属卟啉 生物体系中的过氧化氢酶，过氧化物酶，细胞色素及虹红蛋白，肌红蛋白等 一系列生物活性分子所含的卟啉和类卟啉辅基是重要的生物活性中心，与生命过 程密切相关。因而有关卟啉配合物的合成及其功能的研究已成为配位化学研究的 重要领域之一。 1 1 1 卟啉 通常的卟啉是由2 0 个碳和4 个氮原子组成的共轭大环，碳和氮彼此之问均 采用s p 2 杂化，剩余的一个p 轨道被单电子或孤对电子占有( 碳和毗咯型的氮都提 供单个z 电子，同氢连接的氮原子提供2 个月电子) ，形成2 4 中心2 6 电子的大 键。 卟啉和类卟啉化合物是生命体系中重要的结构单元，一般具有很深的颜色， 由于共轭大环的存在，这类化合物在3 8 0 4 2 0 r a n 之间出现强的吸收带。通常称 为s o r e r 带( 亦称为b 带) ，b 带是卟啉环的 a l 。( n ) - b l 。( n ) 允许跃迁。卟啉化合物除了有一个 强吸收的s o r e r 带以外，在可见区还有弱吸收0 带， 它们是卟啉环的a 2 。( ) - 。g ( n ) 准允许跃迁，中性 卟啉的q 带通常含有四个峰，并根据这四个峰的 相对强度而分四种不周类型的谱带，即原初( e t i o ) 型，玫红( r h o d o ) 型，氧化玫红( o x o r h o d o ) 型和叶 了拓葫r 一 v ( p h y l l o ) 型。几乎所有的天然卟啉都具有原初型谱 带，q 带强度比为 i i i 如图1 1 。其它图l l 原初型卟啉的电子光谱 华中科技大学硕士学位论文 三类卟啉的谱带和卟啉环上存在的吸一推电子基团的性质相关 1 “。 1 1 2 金属卟啉 卧啉环周边上的各种取代基减弱了它的电子特征，促进了这类重要化合物与 金属结合的能力，蛋白质与金属卟啉可以通过吡咯环上取代基共轭直接结合在：+ 起，也可以通过配位作用结合到大环平面上下两个配位位置。这两种键都存舀：于 含有卟啉的蛋白质中。金属进入卟啉环内以后，对称性增强，q 带峰数减少。令 属卟啉在o 带具有两个较弱的谱带。 金属卟啉( m p ) 一般具有d 4 h 对称，卟啉配体( h 2 p ) 为d 2 h 对称，它们的骨架和 周边取代基在2 0 0 4 0 0 0 e m 。范围内都有红外吸收光谱，但是两者有明显不m ( 1 ) 卟啉配体h 2 p 有n h 的伸缩振动和面内、面外弯曲振动。( 2 ) 金属卟啉的埘称 性比相应卟啉高，因此吸收峰数目减少而峰形比较尖锐。由j ：卧啉坏的变形n 1 1 5 0 ，1 0 6 0 ，9 9 0 ，7 6 0 和一7 0 0c m 。( 面内振动) ；在8 5 0 ，8 4 0 和8 0 0c m 。1 ( 晴】 外振动) 表现出强吸收。卟啉大环周边的取代基也有较强的红外吸收，不同的墩 代基常表现出特征的吸收峰，可用来确认卟琳中某种取代基的存在。卟啉骨架的 振动常密集在7 0 0 1 4 0 0c m 。范围之间，周边取代基只有非常强的吸收才能在这 个区域反映出来。 金属卟啉在hn m r ( 6 、。一5 ，6 ，。t1 0 ) 中表现出大的环流效应。反磁一r 卟啉的特征1 h n m r 谱：内部位移为6t 4 ，周边质子信号6 。州。1 0 、6 ，h m 9 ；在化学位移分别为1 4 5 1 5 0 ( c 。) ，1 3 0 1 4 0 ( c ，) 和9 5 1 2 5 ( c 。) 处可观察到cn m r 信号。 金属离子是否可进入卧啉配体的环中形成 平面配合物，取决于金属离子的尺寸，直径为 0 6 0 6 5 a 之间的金属离子，可进入n 4 一环中， 形成平面配合物。卟啉环可通过s t 型畸变缩小 环的孔径，再与小直径离子配位。对于直径略大 n 图1 2 金属卟啉的结构( d ：金属 与平面中心之间的距离) 2 洲。、 。) c ： h 察一态 华中科技大学硕士学位论文 三类卟啉的谱带和卟啉环上存在的吸一推电子基团的性质相关 1 “。 1 1 2 金属卟啉 卧啉环周边上的各种取代基减弱了它的电子特征，促进了这类重要化合物与 金属结合的能力，蛋白质与金属卟啉可以通过吡咯环上取代基共轭直接结合在：+ 起，也可以通过配位作用结合到大环平面上下两个配位位置。这两种键都存舀：于 含有卟啉的蛋白质中。金属进入卟啉环内以后，对称性增强，q 带峰数减少。令 属卟啉在o 带具有两个较弱的谱带。 金属卟啉( m p ) 一般具有d 4 h 对称，卟啉配体( h 2 p ) 为d 2 h 对称，它们的骨架和 周边取代基在2 0 0 4 0 0 0 e m 。范围内都有红外吸收光谱，但是两者有明显不m ( 1 ) 卟啉配体h 2 p 有n h 的伸缩振动和面内、面外弯曲振动。( 2 ) 金属卟啉的埘称 性比相应卟啉高，因此吸收峰数目减少而峰形比较尖锐。由j ：卧啉坏的变形n 1 1 5 0 ，1 0 6 0 ，9 9 0 ，7 6 0 和一7 0 0c m 。( 面内振动) ；在8 5 0 ，8 4 0 和8 0 0c m 。1 ( 晴】 外振动) 表现出强吸收。卟啉大环周边的取代基也有较强的红外吸收，不同的墩 代基常表现出特征的吸收峰，可用来确认卟琳中某种取代基的存在。卟啉骨架的 振动常密集在7 0 0 1 4 0 0c m 。范围之间，周边取代基只有非常强的吸收才能在这 个区域反映出来。 金属卟啉在hn m r ( 6 、。一5 ，6 ，。t1 0 ) 中表现出大的环流效应。反磁一r 卟啉的特征1 h n m r 谱：内部位移为6t 4 ，周边质子信号6 。州。1 0 、6 ，h m 9 ；在化学位移分别为1 4 5 1 5 0 ( c 。) ，1 3 0 1 4 0 ( c ，) 和9 5 1 2 5 ( c 。) 处可观察到cn m r 信号。 金属离子是否可进入卧啉配体的环中形成 平面配合物，取决于金属离子的尺寸，直径为 0 6 0 6 5 a 之间的金属离子，可进入n 4 一环中， 形成平面配合物。卟啉环可通过s t 型畸变缩小 环的孔径，再与小直径离子配位。对于直径略大 n 图1 2 金属卟啉的结构( d ：金属 与平面中心之间的距离) 2 洲。、 。) c ： h 察一态 华中科技大学硕士学位论文 # = = = ；= ；= = = # = = = # = = = = ；= = = = ；= = = 口 的离子卟啉分子可对它进行变形配位，通过电子云重叠来扩大孔径形成平面配 合物。大部分金属卟啉均以平面结构存在，而一些大直径离子，不能进入卟啉环， 只能在n 4 - - 环平面外形成配合物【1 ，5 6 j ( 见图1 2 ) 。 1 2 血红素蛋白质模型化合物的设计及表征 在所有天然蛋白质中，至少三分之一必须以金属离子或含金属小分子作为辆 因子，在分子水平上理解金属辅因子与肽链的相互作用及其对蛋白质结构与功能 的影响是非常必要的7 卅，因此人们已经设计出多种蛋白质模型 9 硒1 来研究蛋f i 质的结构与功能的关系。血红素蛋白是一类极为重要的金属蛋白，其主要功能包 括双氧运输、贮存及活化，电子转移和催化作用等。人们采用不同方法设计厂多 种血红素蛋白缩微仿生模型来理解血红索蛋白结构功能的关系，模拟天然l 雌l 素蛋白的结构及反应活性。 设计血红素蛋白缩微仿生模型通常有两种思路【2 6 j ：( 1 ) 由金属卟啉与寡肽配f i 使肽链折叠自组装成寡聚物，如螺旋柬蛋白质；( 2 ) 由卟啉与肽链共价结合形成缀 合物，如具有夹心结构的螺旋血红素螺旋蛋白质。这些模型都具有c 2 对称的结 构特点，倾向于形成准对称结构。这种结构特点简化了设计，减少了合成步骤， 也易于表征。由此构建的血红素蛋白模型可有效地模拟天然血红素蛋白的化 、 区域及立体专一性 9 1 。 12 1 由非共价作用设计血红索蛋白模型化合物 非共价血红素蛋白模型主要基于a 螺旋肽与血红素的自组装，能很好地解 释稳定天然血红素蛋白结构的各种相互作用。螺旋束血红素蛋白模型是其中重要 的一类，包括单血红素模型化合物，多血红素模型化合物及含有其它辅因子的血 红素模型化合物等。这里主要介绍单血红素模型化合物。 m i h a r a 等【2 7 埘】设计了一系列非共价结合的双n 螺旋束血红素蛋白模型， 如图1 3 所示，其主要特征为：( 1 ) 肽链具有两亲的a 螺旋，( 2 ) 两条相同的肽链由 二硫键连接且两个a - 螺旋相互平行，( 3 ) h i s 残基位于肽链序列的中间位置，并与 华中科技大学硕士学位论文 # = = = ；= ；= = = # = = = # = = = = ；= = = = ；= = = 口 的离子卟啉分子可对它进行变形配位，通过电子云重叠来扩大孔径形成平面配 合物。大部分金属卟啉均以平面结构存在，而一些大直径离子，不能进入卟啉环， 只能在n 4 - - 环平面外形成配合物【1 ，5 6 j ( 见图1 2 ) 。 1 2 血红素蛋白质模型化合物的设计及表征 在所有天然蛋白质中，至少三分之一必须以金属离子或含金属小分子作为辆 因子，在分子水平上理解金属辅因子与肽链的相互作用及其对蛋白质结构与功能 的影响是非常必要的7 卅，因此人们已经设计出多种蛋白质模型 9 硒1 来研究蛋f i 质的结构与功能的关系。血红素蛋白是一类极为重要的金属蛋白，其主要功能包 括双氧运输、贮存及活化，电子转移和催化作用等。人们采用不同方法设计厂多 种血红素蛋白缩微仿生模型来理解血红索蛋白结构功能的关系，模拟天然l 雌l 素蛋白的结构及反应活性。 设计血红素蛋白缩微仿生模型通常有两种思路【2 6 j ：( 1 ) 由金属卟啉与寡肽配f i 使肽链折叠自组装成寡聚物，如螺旋柬蛋白质；( 2 ) 由卟啉与肽链共价结合形成缀 合物，如具有夹心结构的螺旋血红素螺旋蛋白质。这些模型都具有c 2 对称的结 构特点，倾向于形成准对称结构。这种结构特点简化了设计，减少了合成步骤， 也易于表征。由此构建的血红素蛋白模型可有效地模拟天然血红素蛋白的化 、 区域及立体专一性 9 1 。 12 1 由非共价作用设计血红索蛋白模型化合物 非共价血红素蛋白模型主要基于a 螺旋肽与血红素的自组装，能很好地解 释稳定天然血红素蛋白结构的各种相互作用。螺旋束血红素蛋白模型是其中重要 的一类，包括单血红素模型化合物，多血红素模型化合物及含有其它辅因子的血 红素模型化合物等。这里主要介绍单血红素模型化合物。 m i h a r a 等【2 7 埘】设计了一系列非共价结合的双n 螺旋束血红素蛋白模型， 如图1 3 所示，其主要特征为：( 1 ) 肽链具有两亲的a 螺旋，( 2 ) 两条相同的肽链由 二硫键连接且两个a - 螺旋相互平行，( 3 ) h i s 残基位于肽链序列的中间位置，并与 华中科技大学硕士学位论文 # = = = ；= ；= = = # = = = # = = = = ；= = = = ；= = = 口 的离子卟啉分子可对它进行变形配位，通过电子云重叠来扩大孔径形成平面配 合物。大部分金属卟啉均以平面结构存在，而一些大直径离子，不能进入卟啉环， 只能在n 4 - - 环平面外形成配合物【1 ，5 6 j ( 见图1 2 ) 。 1 2 血红素蛋白质模型化合物的设计及表征 在所有天然蛋白质中，至少三分之一必须以金属离子或含金属小分子作为辆 因子，在分子水平上理解金属辅因子与肽链的相互作用及其对蛋白质结构与功能 的影响是非常必要的7 卅，因此人们已经设计出多种蛋白质模型 9 硒1 来研究蛋f i 质的结构与功能的关系。血红素蛋白是一类极为重要的金属蛋白，其主要功能包 括双氧运输、贮存及活化，电子转移和催化作用等。人们采用不同方法设计厂多 种血红素蛋白缩微仿生模型来理解血红索蛋白结构功能的关系，模拟天然l 雌l 素蛋白的结构及反应活性。 设计血红素蛋白缩微仿生模型通常有两种思路【2 6 j ：( 1 ) 由金属卟啉与寡肽配f i 使肽链折叠自组装成寡聚物，如螺旋柬蛋白质；( 2 ) 由卟啉与肽链共价结合形成缀 合物，如具有夹心结构的螺旋血红素螺旋蛋白质。这些模型都具有c 2 对称的结 构特点，倾向于形成准对称结构。这种结构特点简化了设计，减少了合成步骤， 也易于表征。由此构建的血红素蛋白模型可有效地模拟天然血红素蛋白的化 、 区域及立体专一性 9 1 。 12 1 由非共价作用设计血红索蛋白模型化合物 非共价血红素蛋白模型主要基于a 螺旋肽与血红素的自组装，能很好地解 释稳定天然血红素蛋白结构的各种相互作用。螺旋束血红素蛋白模型是其中重要 的一类，包括单血红素模型化合物，多血红素模型化合物及含有其它辅因子的血 红素模型化合物等。这里主要介绍单血红素模型化合物。 m i h a r a 等【2 7 埘】设计了一系列非共价结合的双n 螺旋束血红素蛋白模型， 如图1 3 所示，其主要特征为：( 1 ) 肽链具有两亲的a 螺旋，( 2 ) 两条相同的肽链由 二硫键连接且两个a - 螺旋相互平行，( 3 ) h i s 残基位于肽链序列的中间位置，并与 华中科技大学硕士学位论文 铁卟啉配位。该体系中存在两个f e h i s 配位键，在h i s 残基周围有大量的疏水残 基，构建成疏水的血红素结合部位。 第一代双螺旋束血红素蛋白模型h 2 a ( 1 4 残基) ，h 2a ( 1 7 残基) 和h 2a ( 2 l 残基) 分别含有不同数量的l e u ，两条肽 链通过c 末端c y s 残基形成二硫键，h i s 分别位于h 2 ( 1 4 ) ，h 2d ( 1 7 ) 及h 2q ( 2 1 ) 的6 位，9 位和1 4 位。这三个模型是以七 元规则( h e p t a dr u l e ) ( a b c d e f g ) n 4 1 来设计的。 疏水的残基l e u 分别位于a 和d 位，g l n 图1 3由m i h a r a 等设计的血红素蚩f 模掣 位于f 位，e 位的g l u 和g 位的l y s 形成盐桥，a l a 在b 和c 位。它i f 4 具有稳 定的血红素结合部位，而是由三氟乙酸的溶剂化作用促进模型自组装。第二代模 型以两亲的a 螺旋为基础，在缓冲液中。螺旋与血红素有很高的亲和力。两代 模型不同之处在于后者的l e u 排列不以七元规则为基础，研究结果证明肽链l l e u 数目及其相对距离是形成血红素结合部位和稳定肽链的重要因素。模型的高 亲和力会导致催化活性的降低，因为双h i s 与血红素配位导致肽链在血红素周围 形成紧密的口袋，阻止了外源配体与血红素作用，可见血红素与肽链松散结合有 助于增加柔性并提高反应活性。 为了获得以寡肽为基础的简单氧化还原蛋白模型，揭示生物分子结构功能 的关系，人们还通过渐近过程( i n c r e m e n t a lp r o c e s s ) 设计了四a 螺旋束蛋白模型 ：( 1 ) 由四条单螺旋肽链自组装成一个q 螺旋四聚体，即4 al n4 ；( 2 ) 由两条 双螺旋肽链聚合成四螺旋束，即2 o2 一( n2 ) 2 ；( 3 ) 由单链肽链折叠形成四螺旋束 蛋白质。这些四螺旋束结构紧密，在热力学上具有高度稳定的二级结构。然而， 大部分设计的蛋白质都缺乏稳定的三级结构，因为它们的折叠是由非专一性的疏 水相互作用形成的，内部侧链缺乏紧密堆积的空间互补结构和专一性氢键结合等 相互作用。 c h r i s t i n 等o o l 设计了一种四a 螺旋束血红素蛋白模型，其肽链在电解质溶液 ，2 亨f 孓弓 嗷 华中科技大学硕士学位论文 中自动折叠形成一个包含双h i s 配体的血红素结合部位，见图1 4 。f r a n c e s c 等 2 9 1 设计的模型具有一个血红素结合口袋，配位点为肽 链的两个h i s 侧链咪唑基，其专一性已得到证实。蛋白 质四条肽链自组装成互相平行的结构，并与原卟啉环 平面平行。结合口袋性质和配体取向的缩微变化都会 极大地影响蛋白质分子的性质。在f r a n c e s c 等设计的 两个蛋白模型中，铁( i i i ) 离子的自旋状态不同，其中一 个铁原子以高低自旋共存的形式存在，而另一个则以 低自旋为主，正是这种低自旋血红素蛋白质的e p r 谱 显示双咪唑基为配位基团。人们可以利用这样的仿生 蛋白模型构建人工电子转移系统和人工催化系统。 图1 4 四a 螺旋束血 红素蚩白模型 j u l i a 等也设计了种四n 一螺旋束蛋白模型，两条相同的含3 1 个残基的 肽链，通过n 末端c y s 形成二硫键而结合。h i s 位于肽链序列的l o 位，双h i s 提供f e p p i x ( f e 原卟啉i x ) 的轴向配体。其中金属卟啉的还原等电点电位 4 3 5 m v ，有别于天然细胞色素( 一8 0 0 m v ) 。该电位的调幅受以下几个因素的影响： 金属卟啉与肽链的配位，蛋白质侧链和其它辅因子的相互作用及相邻氨基酸的 质子化状态等。此外他们还设计了多血红素模型【3 1 1 。 1 2 2 以共价键结合的血红素蛋白模型化合物的设计 天然蛋白与血红素共价结合只出现在细胞色素c 中：卟啉与肽链通过硫醚键 相连，每条肽链有一个h i s 残基与f e ( i i ) 配位，从而形成夹心结构，导致松弛的 肽链出现5 0 - - - 6 0 的螺旋。目前，尚未发现天然体系中肽链与卟啉的丙酸基通 过酰胺键共价结合。很多人致力于金属卟啉与肽链以共价酰胺键结合的血红素 蛋白模型的研究。包裹血红素的肽链能很好地再现天然体系的结构和功能，可 有效地调节血红素的性质，从而更好地模拟酶的功能。 b e n s o n 等【珏3 6 1 设计了一系列相似的- - n 治夹心蛋白质( p e p t i d es a n d w i c h e d m e s o h e m e ，p s m s ) ，即两个相同的q 一螺旋共价结合于铁中卟啉环上，如图1 f i 所 华中科技大学硕士学位论文 中自动折叠形成一个包含双h i s 配体的血红素结合部位，见图1 4 。f r a n c e s c 等 2 9 1 设计的模型具有一个血红素结合口袋，配位点为肽 链的两个h i s 侧链咪唑基，其专一性已得到证实。蛋白 质四条肽链自组装成互相平行的结构，并与原卟啉环 平面平行。结合口袋性质和配体取向的缩微变化都会 极大地影响蛋白质分子的性质。在f r a n c e s c 等设计的 两个蛋白模型中，铁( i i i ) 离子的自旋状态不同，其中一 个铁原子以高低自旋共存的形式存在，而另一个则以 低自旋为主，正是这种低自旋血红素蛋白质的e p r 谱 显示双咪唑基为配位基团。人们可以利用这样的仿生 蛋白模型构建人工电子转移系统和人工催化系统。 图1 4 四a 螺旋束血 红素蚩白模型 j u l i a 等也设计了种四n 一螺旋束蛋白模型，两条相同的含3 1 个残基的 肽链，通过n 末端c y s 形成二硫键而结合。h i s 位于肽链序列的l o 位，双h i s 提供f e p p i x ( f e 原卟啉i x ) 的轴向配体。其中金属卟啉的还原等电点电位 4 3 5 m v ，有别于天然细胞色素( 一8 0 0 m v ) 。该电位的调幅受以下几个因素的影响： 金属卟啉与肽链的配位，蛋白质侧链和其它辅因子的相互作用及相邻氨基酸的 质子化状态等。此外他们还设计了多血红素模型【3 1 1 。 1 2 2 以共价键结合的血红素蛋白模型化合物的设计 天然蛋白与血红素共价结合只出现在细胞色素c 中：卟啉与肽链通过硫醚键 相连，每条肽链有一个h i s 残基与f e ( i i ) 配位，从而形成夹心结构，导致松弛的 肽链出现5 0 - - - 6 0 的螺旋。目前，尚未发现天然体系中肽链与卟啉的丙酸基通 过酰胺键共价结合。很多人致力于金属卟啉与肽链以共价酰胺键结合的血红素 蛋白模型的研究。包裹血红素的肽链能很好地再现天然体系的结构和功能，可 有效地调节血红素的性质，从而更好地模拟酶的功能。 b e n s o n 等【珏3 6 1 设计了一系列相似的- - n 治夹心蛋白质( p e p t i d es a n d w i c h e d m e s o h e m e ，p s m s ) ，即两个相同的q 一螺旋共价结合于铁中卟啉环上，如图1 f i 所 p s m 衍生物卟啉肽链r 1 m e s o p o r p h y r i n i x a c a k e a a h a e a a e a a 0 0 n h 2 2 m e s o p o r p h y r i n l x a c 。a a e a a e a h a a e k a c o n h 二 3 m e s o p o r p h y r i n d ( a c 。a k e a h a a e a a e a a c o n h l 4 m e s o p o r p h y r i n l a c 。a a e a a e a a h a e k a c o n h 2 5 m e s o p o r p h 3 7 r i n i x a c a a h a e a a e a k e a a c o n h l 6 m e s o p o r p h y r i n l x a c a a e a a e a h a a e k a c o n h 二 7 m e s o p o r p h y r i n i i a c a a e f a e a h a a e k a c o n h 一, !坚! ! ! p ! 1 2 1 z ! i ! ! !垒! ：垒垒! 婴垒! 垒翌垒垒兰坠垒兰2 魁望： 图1 5 夹心血红素蛋白的化学结构模型( p s m s ) ( m 代表金属原子) 该类夹心化合物的制备只有少数几个步骤：合成肽链，其中l y s 的e 一氨基 可以与活性酯( 如铁( i i i ) 中卟啉的对二硝基苯酯) 进行快速专一反应，生成目 ，j 、 产物。电子光谱表明，在乙醇共溶剂中f e 以高自旋为主，主要有6 2 0 n m 处的 n 电子电荷迁移谱带，4 9 5 n m 处的1 3 带和3 9 1 n m 处的s o r e t 带等特征吸收。f e 浓度越高，分子间咪唑基铁配位越多，但可能存在一些低自旋双咪唑配位的f e 卟啉。高自旋f e 卟啉的可见光谱不受铁的配位环境的影响，因此不能用r 验 证咪唑基与f e 是否配位。圆二色谱( c d ) 是蛋白质二级结构的有效检测方法之 ，完整螺旋肽链c d 谱的特征包括：酰胺n n + 跃迁的2 2 0 2 2 2 n m 负吸收峰， 酰胺一跃迁的2 0 8 n m 负吸收峰和】9 0 r m a 正吸收峰。自由伸展肽链c d 谱的 主要特征是2 0 0 h m 以下的一个强负吸收峰。只要知道全螺旋肽链和自由伸展肽 链在一定波长下的平均残基椭圆度( m r e ) ，肽链的螺旋度可通过2 2 0 2 2 2 n m 区 的m r e 估测出来。c d 研究表明，上述产物在电解质溶液中有5 2 的螺旋度， s o r e t 带出现在4 0 3 n m ，a ，b 带在5 0 0 6 0 0 n m 之间。加入h c i 可导致咪唑基 铁配位键断裂，特征峰消失，与自由伸展构象的c d 谱图一致。加入乙醇等共溶 华中科技大学硕士学位论文 剂能增加肽链的螺旋度，表现为s o r e t 带强度减小。4 0 3 n m 处的s o r e t 带特征吸 收则是双h i s 配位的低自旋f e “导致的。 通过一定的侧链侧链相互作用可诱导不同的肽链产生螺旋。根据这一原理 设计的一系列水溶性铁中卟啉蛋白模型化合物中，两条相同的1 3 残基肽与铁中 卧啉通过l y s 的氨基和丙酸基形成酰胺键，从而得到对非对映异构体夹心蛋白 质和a 。紫外可见光谱表明h i s 的咪唑基与低自旋的中卟啉f e 配位诱导肽链 产生螺旋。通过c d 发现，距h i s 四个残基处的t r p 能提高肽链的螺旋度，这町 能是由“边对面芳环稳定化作用( e d g e t of a c ea r o m a t i ci n t e r a c t i o n ) ”导致的。可 一 通过e p r 光谱和p h 滴定等方法测定各个化合物的相对稳定性，并用紫外可见 光谱检验和测定不同溶剂中各个化合物的折叠程度。现己证实这些化合物中h i s 和l y s 的距离对肽链螺旋构象的稳定性有很大影响。为了使t r p 与卟啉面接触， 必须限制氨基酸侧链的角度。c d 数据表明色氨酸残基上的吲哚卧啉相互作用较 强，可克服由于构象限制造成的熵减少。 f l a v i a 等口7 】用缩微化( m i n i m a l i s t ) 方法设计了一种叫做微色素( m i m o c h r o m e ) 的低分子量蛋白质金属卟啉共轭分子。r o b e r t o 38 1 和g a b r i e l l a 等【3 9 】用核磁共振 ( n m r ) 和u v - 光谱，c d 谱等对其进行了结构分析。次卟啉的两个丙酸基与两 条c 末端和n 珠端被保护的短肽l y s 侧链氮基形成酰胺键，再将短肽继续合 成为所设计的肽链，即得到目标产