（分析化学专业论文）染料与生物大分子作用的研究及其分析应用.pdf

京 开. 大 学 俘 创 匕 学 位 论 文 立 了 依 波 西 隆 蓝 用 于 蛋 白 质 分 析 的 共 振 光 散 射 方 法 。 介 于 合 成 样 品 和 实 际 样 品 的 分 析 ， 结 果 满 意 少 一。 - 关键词:核酸，蛋白 质， 光谱探针，结合模式， 敏化作用 按耍 s t u d y o n t h e i n t e r a c t i o n o f d y e c o mp o u n d s w i t h b i o ma c r o mo l e c u l e s a n d i t s a n a l y t i c a l a p p l i c a t i o n wu h u i l i n g s p e c i a l i t y : a n a ly t i c a l c h e m i s t ry s u p e r v i s o r : p r o f e s s o r h e x i w e n ab s t r a c t a d e e p r e s e a r c h w as m a d e o n t h e i n t e r a c t i o n o f 勿e c o m p o u n d s w i t h n u c l e i c a c i d s a n d p r o t e i n s a n d i t s b i o a n a l y t i c a l a p p l i c a t i o n . t h e re a c t i o n b e t w e e n p i n a c y a n o l c h l o r i d e 口 c ) a n d n u c l e i c a c i d s w a s s t u d i e d u s i n g t h e a p p r o a c h e s o f s p e c t r o s c o p y a n d e l e c t r o p h o r e s i s . t h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e b i n d i n g o f p c t o n u c l e i c a c i d s o c c u r r e d b y a n o u t s i d e b i n d i n g , a n d h - a g g r e g a t e o f p c w as f o r m e d o n t h e n u c l e i c a c i d s m o l e c u l e . a n e w ass a y f o r n u c l e i c a c i d s w as t h u s e s t a b l i s h e d b y t h e h y p o c h r o m i s m e ff e c t o f p c i n t h e p r e s e n c e o f n u c l e i c a c i d s . t h e n o n c o v a l e n t b i n d i n g o f t h e c a t i o n i c r e a g e n t l u c i g e n i n ( l c ) t o d n a w as i n v e s t i g a t e d . t h e r e s u lt s d e m o n s t r a t e d t h a t l c c o u l d i n t e r c a l a t e i n t o t h e h e l i x o f d n a . t h e b i n d i n g c o n s t a n t w as o n th e o r d e r o f 1 0 0 m o l l i n d n a b as e p a ir . t h e e x p e r i m e n t a l s o s h o w e d t h a t e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n p l a y e d a s i g n i f i c a n t r o l e i n t h e i n t e r c a l a t i o n o f l c w i t h d n a . i t w as s u p p o s e d t o b e b e c a u s e o f b e i n g a t t r a c t e d fi r s t b y a n i o n i c d n a t h a t l c c o u l d b e i n t e r c a l a t e d i n t o t h e i n t e r i o r o f t h e d na d o u b l e h e l i x . t h i s r e s e a r c h o ff e r e d a n e w i n t e r c a l a t i o n f u n c t i o n a l g r o u p t o d n a - t a r g e t e d d r u g d e s i g n . t h e fr e e q u i n a l d i n e r e d ( q r ) a l o n e h as n o fl u o re s c e n c e i n s o l u t i o n . b u t i t b e c o m e s fl u o r e s c e n t a ft e r b i n d i n g t o n u c l e i c a c i d s , w h i c h g i v e s m a x i m u m e m i s s i o n a t 6 0 7 n m w i t h ma x i m u m e x c i t a t i o n a t 5 5 7 n m . b ase d o n t h e fl u o r e s c e n t r e a c t i o n , a n o v e l fl u o r o m e t r i c 之价 沁 洲 片 3 f a 学 仁 阵 t 学 位 论 文 m e t h o d w a s d e v e o p e d f o r r a p i d d e t e r m i n a t i o n o f n u c l e i c a c i d s u s i n g q r a s t h e fl u o r e s c e n t p r o b e . t h e fl u o r e s c e n c e s p e c t r a a n d b i n d i n g r e a c t i o n o f n e u t r a l r e d w i t h n u c l e i c a c i d s w e r e e x a m i n e d , a n d a n e w m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t r a c e n u c l e i c a c i d s b y fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g m e a s u r e m e n t w a s e s t a b l i s h e d . s y n t h e t i c s a m p le s a n d r e a l s a m p l e s w e re a n a l y z e d s a t i s f a c t o r i l y . a s e n s i t i v e p r o c e d u r e w as p u t f o r w a r d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f n u c l e i c a c i d s b a s e d o n t h e b i n d i n g r e a c t i o n o f r h o d a m i n e 6 g w i t h n u c l e i c a c i d s . t h e m e t h o d w as a p p l i e d t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f n u c l e i c a c i d s i n s y n t h e t i c s a m p l e w i t h s a t i s f a c t o ry r e s u lt s . i t w as p r o v e d t h a t t h e b i n d i n g o f n i g h t b l u e ( n b ) w i t h n u c l e i c a c i d s i n v o l v e s t h e j - a g g r e g a t i o n o f n b m o l e c u l e s o n t h e s u r f a c e o f n u c l e i c a c i d s b y s p e c t r o s c o p i c m e t h o d s . t h e a g g r e g a t i o n w as e n c o u r a g e d b y t h e e l e c t r o s t a t i c a t t r a c t i o n o f t h e c a t i o n i c n b w i t h p o l y a n i o n s n u c l e i c a c i d s , i n w h i c h n u c l e i c a c i d s s e r v e d f o r a c t i n g t e m p l a t e s . i n t h i s c o n n e c t i o n , a n o v e l as s a y o f n u c le i c a c i d s w i t h s e n s i t i v i ty a t n a n o g r a m l e v e l w as p r o p o s e d . s y n t h e t i c a n d r e a l s a m p l e s w e r e a n a l y z e d w i t h s a t i s f a c t i o n r e s u l t s . t h e s e s t u d i e s w i l l f a v o r t h e d e s i g n o f n u c l e i c a c i d s - t a r g e t e d m o l e c u l e . t h i s w a s t h e f i r s t s t u d y o f t h e s e n s it i z i n g e ff e c t o f e t h a n o l o n t h e e n h a n c e d r e s o n a n c e l i g h t s c a t t e r i n g ( r l s ) r e s u l t e d fr o m t h e i n t e r a c t i o n o f t i t a n y e l l o w w i t h p r o t e i n s . t h e i n t e r a c t i o n o f t i t a n y e l l o w w i t h p r o t e in s r e s u l t s i n e n h a n c e d r l s s i g n a l s . i t w a s f o u n d t h a t t h e i n t e r a c t i o n w as s e n s i t i z e d b y t h e p r e s e n c e o f e t h a n o l . p r o t e i n s c o u l d b e d e t e c t e d w i t h l o w d e t e c t i o n l i m i t s b y t h e s e n s i t i z i n g e ff e c t . s y n t h e t i c s a m p l e s a n d r e a l s a m p l e s w e r e a n a l y z e d s a t i s f a c t o r i l y . a n o v e l m e t h o d w as d e s c r i b e d f o r t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f p r o t e i n s , w h i c h w as b as e d o n a n e n h a n c e d r l s r e a c t i o n b e t w e e n e p s i l o n b l u e a n d p r o t e i n s t o f o r m c o m p l e x e s . t h e m e t h o d w a s f e a t u r e d b y s t a b i l i ty , s i m p l i c i ty , r a p i d r e a c t i o n , h i g h l y s e l e c t i v i ty a n d g o o d r e p r o d u c ib i l i ty a n d a p p l i e d t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f p r o t e in s i n h u m a n s e r u m s a m p l e s w it h s a t i s f a c t o ry r e s u l t s . k e y w o r d s : n u c l e i c a c i d , p r o t e i n , s p e c t r o s c o p i c p r o b e , b i n d i n g m o d e , s e n s i t i z i n g e ff e c t i v _蒸p 氰i , . .a., 第 幸前言 第一章前言 1 . 1 小分子与核酸相互作用的研究进展 小分子与核酸相互作用的研究不仅对阐明抗肿瘤、抗病毒及致癌物的作用机理， 而且对进一步指导人工核酸酶及核酸高级结构的 研究等方面的工作都具有重要意义。 小分子与核酸的结合区位于核酸的碱基、磷酸骨架以及戊糖环部分。核酸由平行堆积 的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条核昔酸链形成的大沟、小沟组成了小分子的 识别位点。作用方式主要有三种:非共价键结合、共价键结合和剪切作用。非共价键 结合又可分为表面结合 ( o u t s i d e b i n d i n g ) 、 沟槽结合 ( g r o o v e b i n d i n g ) 和嵌插结合 ( i n t e r c a l a t i o n b i n d in g ) 三种模式( 图1 ) 1 ,2 。 一 般认为表面结合的小 分子作 用于d n a 双螺旋结构的外壁，没有选择性。沟槽结合是与核酸的大沟或小沟的碱基对边缘直接 作用， 大分子蛋白 质结合于d n a的大沟槽中， 而大多数小分子则是在小沟槽区作用。 小沟槽内是a t富集区，小分子通过与胸腺啥睫碱基 c - 2上的拨基氧或腺嗓吟碱基 n - 3 上的氮形成氢键与a t 碱基结合。 嵌插结合是小分子中的平面成分嵌入核酸的碱 基之间。 基于小分子结构的不同， 嵌插作用又可细分为单链嵌插和双链嵌插作用 3 . 与非共价键结合作用相比，小分子与 d n a的共价键结合的序列特异性识别能力要强 的多。共价键结合的小分子多表现为链内交联或链间交联，与特定碱基作用形成加和 物，使核酸双链解旋且产生弯曲。核酸切割剂中，金属配合物占了相当大的比例，大 环配合物等多种类型的单核配合物利用金属的氧化还原活性，通过氧化和自由基等途 径， 进攻核酸的 磷酸二醋键、 核糖、 碱基等位点， 使d n a或r n a发生断 裂 4 . b a r t o n 等 5 合 成的r h z n 双核配 合 物， 左 边的r h ( i i i ) 的 配体 插 入d n a大 沟区 6 ， 右 边的 锌肤起水解酶的作用 7 ，使超螺旋的p b r 3 2 2 d n a断裂变成切口 和线状两种形式. 铜( 1 1 ) 的邻菲咯琳类配合物在琉基化合物和过氧化氢存在下可使d n a于小沟槽区断 裂 8 . t h o r p 等 9 发展了 一种双核铂( i i ) 阴 离 子d n a光裂解试剂， 在光照下可脱 去 d n a核糖上的所有氢原子，最终导致d n a链断裂。 南 开 大 学 俘 士 学 位 论 文 复哥 o u t s i d e b i n d i n gg r o o v e b i n d i n g i n t e r c a l a t i o n b i n d i n g 图1 小分子和d n a的作用模式 f i g . l t h e b i n d i n g m o d e s b e t w e e n s m a l l m o l e c u l e a n d d n a 人们采用多种现代实验手段如紫外可见吸收光谱、线二色光谱、圆二色光谱、荧 光光谱、 拉曼光谱、傅立叶转换红外光谱、核磁共振、质谱、电 化学、微量热、电 泳 及粘度等方法从不同角度对小分子与核酸之间的作用进行了广泛的研究，得到了许多 有益的结论。 1 .1 . 1紫 外 可 见 吸 收 光 谱法 紫外可见吸收光谱是研究小分子与核酸相互作用的一种最方便、 小分子与核酸的相互作用会引起吸收带的红移 ( 蓝移)现象或增色 最常用的技术。 根发 ( 减色)效应。 据l o n g 1 0 理论， 吸光 度减小、 吸收带 红移以 及等吸 收点的形成是小 分子与d n a 生 嵌插作用的光谱标志。凌连生等人 1 1 - 1 5 研究了r u ( b i p y ) 尹、 r u ( p h e n ) 3 z + . r u ( b i p y ) z ( d p p z ) z + . r u ( p h e n ) z ( d p p z ) z + , r u ( b ip y ) 2 ( d p p x ) 2 + 及r u ( p h e n ) z ( d p p x ) 2 + 与d n a 作 用前后的紫外可见吸收光谱，发现与 d n a作用后这六种配合物在不同峰位发生不同 程度的减色效应，其中前两种配合物的吸收光谱受 d n a的影响很小，无减色效应和 红移现象，表明这两种配合物与 d n a之间只存在静电作用，后四种配合物存在严重 的 减色效 应， d p p z 和d p p x 对应的 吸收峰所产生的 减色效 应远大于p h e n 和b i p y 带 所对 应的 吸收峰，由 此初步证明 后四 种配合物通过d p p z 和d p p x 嵌插进d n a的 双螺旋结 构中。 d n a是双链螺旋结构， 热和碱的作用可破坏其结构.使双链变成单链， 此时吸光 z 第 一 幸前言 度a 2 6 0 增大，因此通过a 2 6 0 的测定可以 研究d n a的变性过程。小分子与d n a结合 后 会给这种 变性带来影响， 进而可考察小分 子与d n a的 作用方 式 1 6 , 1 7 。 嵌插作用 对 d n a的双螺旋结构起稳定作用，可导致 t m值增大 5 -8 0 c ，而非嵌插作用的小分 子不 会使t m值增大如 此明 显【 1 8 - 2 0 . g a n e s h 等 人 2 1 报道了 阳离 子表面 活性剂与寡 聚 核 昔 酸作 用后a 2 6 0 随 温度的 变 化曲 线为 双s i g m a 曲 线，由 此 推断阳 离 子 表面 活 性 剂 首先通过静电作用与寡聚核昔酸结合，然后在疏水力的驱动下以协作方式结合于相同 的寡聚核昔酸上，从而使溶液中同时存在两种寡聚核普酸，即自由和与表面活性剂结 合的寡聚核昔酸， 最终导致出 现两个熔链温度。 跟踪小分子与d n a作用前后a 2 6 。 随 p h值的 变化情况， 也可判断小分子与d n a之间的 作用方式. 文献【 2 2 研究了g e - 1 3 2 与d n a的 相互作 用， 在g e - 1 3 2 不 存在的 情况下， d n a碱变 性的p h b 为1 2 .2 7 ， 变 性后增色2 6 %; 而在g e - 1 3 2 存在下， d n a碱变性的p h b 增大为1 2 .9 0 ， 变性后增色 1 4 %，因此初步判断g e -1 3 2 以嵌插方式与d n a发生了作用。 1 . 1 .2 线二色光谱和圆二色光谱 线二色光谱 ( l d) 采用与固定光轴方向平行或垂直的平面偏振光，能快速区分经 典的嵌入结合、沟槽结合和表面结合模式，并能获得小分子结合在 d n a上的准确方 向 信息及动力学数据 2 3 ,2 4 . 圆二色光谱 ( c d ) 以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光， 为有机化合物的 绝对构型、构象和反应机理的研究提供了很多信息，是研究有机化合物和生物大分子 的构型、构象和三维空间结构强有力的工具。一方面根据d n a在2 6 0 n m处的吸收提 供有关结构信息，另一方面对一些本身没有 c d信号，但与 d n a结合后能产生诱导 c d信号的分子， 可获得一定的有关其结构的间 接信息。 f i e l 等人 2 5 - 2 8 研究了叶琳配 体与 d n a之间的相互作用，圆二色光谱技术为二者之间的嵌插、和非嵌插作用提供 了 有利的证据。 彭小彬等人 2 9 通过圆二色光谱等手段研究了手性苏氨酸叶琳锌配合 物的 超分子聚集体与小牛胸腺d n a构建的 新超分子， 依据叶琳与d n a作用时c d光 谱的 外型来判断叶 琳与d n a的 结 合模式 3 0 ， 提出了 具有 不同 构型的 手性苏 氨酸叶 琳 锌配合物聚集体与d n a构建新的超分子时不同的构建方式. 1 . 1 .3 荧光光谱法 南 开 大 学 俘 t 学 位 论 文 荧光光谱法是研究小分子与核酸相互作用的主要手段。 澳化乙锭 ( e b ) 是应用最 早，也是应用最广的荧光探针，被应用于抗癌药物的筛选和小分子与 d n a作用的研 究中 3 1 - 3 4 。 文 献 3 5 , 3 6 研究了 小 分 子 和澳 化乙 锭 对d n a的 竞 争 结 合作 用，以 此 可 判断 小分子是否与d n a发生了 类似于澳 化乙 锭的 嵌插作用。 而y g u e r a b i d e 等人 3 7 则以 澳 化乙 锭为 荧光探针研究了 大 肠杆菌 和) ,- ux菌体中d n a 和p o l y ( i - p o l y ( c ) 的 杂 交动力学特性. d n a三螺旋结构的发现， 扩展了澳化乙锭的应用范围， 在检测三螺旋 d n a和研究其与 三螺旋d n a作用等方面的 工作取得了 一定的 进展 3 8 - 4 0 . k i 和k 4 f e ( c n ) 6 为典型荧光碎灭剂， 通过考察其对小分子荧光的碎灭作用可以 判 断小分子与d n a之间的作用方式. 与纯水介质相比， 当小分子与d n a属于嵌插作用 时 ， i 一 或f e ( c n ) 6 4 一 的 n 灭 作 用 减 弱 4 1 ; 而 当 小 分 子 与d n a属 于 沟 槽 作 用时 ， 碎灭 作用增强 2 0 . 小分子与d n a作用后荧光偏振的变化情况是判断小分子是否与d n a发生嵌插作 用的又一标准。通常当小分子嵌插到碱基中时，其转动受阻，荧光偏振会随之变大， 而非嵌插作用不 会引 起荧光偏振的 增大 4 2 , 4 3 。 文献 3 5 ,4 4 利用荧光偏振方法 研究了 小分子与d n a之间的相互作用，在d n a存在下，小分子的荧光偏振随着d n a浓度 的增加而增大，由 此推断小分子与d n a发生了嵌插作用。 花青染料分子中间为多次亚甲基桥，当其与 d n a发生嵌插或沟槽作用时，因次 亚甲基键的扭转受到限制，可导致其荧光强度的增强，据此可判断花青染料是否以嵌 插或沟槽作用方式与d n a结合 4 3 ,4 5 - 4 7 0 1 . 1 .4 拉曼光谱法 拉曼光谱作为一种生物医药和生化分析技术最近十年才应用于常规临床检验。虽 然标准、灵敏的荧光和免疫分析技术一直在生化分析领域中占有重要地位，但二者的 最大缺陷是所提供的信息量有限。拉曼光谱是一种富含信息的分析技术，这种特定技 术与共振和表面增强现象相结合使其逐渐成为一种极具诱惑力的生物医学分析技术。 c a r e y等 4 8 论述了 拉曼和共振拉曼光谱的 应用， 但对于表面增强拉曼部分仅简单述 及。 i s o l a 等 4 9 对h i v d n a进行标记， 并与表面增强拉曼技术相结合， 使拉曼信号显 著增强， 其灵敏度与荧光标记法相当， 但却比 后者能 提供更多的 结构信息. 文 献 5 0 , 5 1 利 用共振拉曼 光谱 研究了 抗癌药物a m s a c r i n e . a d r i a m y c i n 及 l 1-d e o x y c a r m i n o m y c i n 第 一 幸前宫 与d n a之间的相互作用， 结果表明它们均以 嵌插方式与d n a结合; 而s a v o i e 等人 5 2 借 助 拉 曼 光 谱 对c a 十 、 m 广、 z n 2 + 和c d 2 + 与 小 牛 胸 腺d n a相 互 作 用的 构 象 变 化、 结 合位点进行了研究。研究表明，金属离子浓度较低时，金属离子与 d n a上的磷酸基 团结合， 并导致聚核昔酸结构的 微小变化。 当c d 2 十 和z n 2 + 与g c 碱基对结合时， 二者 的 亲和力相当， 而当与a t 碱基对结合时， c d 2 十 比z n 2 + 表现出 更强的亲和力。 1 . 1 . 5红外光谱法 近年来，傅立叶转换红外光谱法在药物小分子与 d n a相互作用的研究中得 到了广泛应用，为从分子水平上了解药物- d n a复合物的结构信息提供了有利工具 5 3 - 5 7 。 文献 5 8 研究t致癌物质d i e t h y l s t i l b e s t r o l ( d e s ) 与小牛胸腺d n a之间的作 用模式、结合常数、序列选择性以 及d n a结构和构象的变化情况。当d e s 浓度较低 时， a t 富集区是d e s 与d n a发生嵌插作用的主要位点， 伴随着这种嵌插结合过程， d n a逐渐由b型向a型转变;当d e s 药物浓度较高时， d e s 与g c碱基发生作用， 并 削弱了d n a双螺旋结构的 稳定 性。 文献 5 9 报道了d e s 与 酵母r n a之间的 相 互作 用，傅立叶转换红外光谱实验表明d e s 与r n a之间存在嵌插和表面结合两种作用方 式。 n e a u l t 等 6 0 利用傅立叶转换红外光谱技术研究了叶绿酸( c h l n ) 及叶绿素( c h l ) 与d n a之间的相互作用，并对c h l n - d n a . c h l - d n a以及金属叶琳- d n a三种 加 合 物的 性 质 进 行了 比 较. d u p u i s 等 6 1 利 用 傅 立叶 转 换 红 外 光 谱 和 拉 曼 光 谱 对c d z + 与 d n a之间的相互作用进行了 研究，证明其结合位点为磷酸基团和碱基。通常硬离 子主 要与 核 酸 分 子的 磷 酸 基团 结 合， 软 离 子与 碱 基结 合 6 2 - 6 4 。 按 照l e w i s 理 论， c d z + 是介 于硬离子和软离子 之间 的 一种交 界离子， 因 此c d z + 既 可与 磷酸 基团 作 用， 又 可与 碱基作用。 1 . 1 . 6 核磁共振分析法和质谱法 核磁共振 ( n m r )分析法可以定量确定结合位点的化学变化，并且对长距离驰豫 效应更为准确。 n mr中的s a r是最早报道的用n mr方法筛选靶向r n a小分子的方 法，并且可以 通过靶向 蛋白 质的二维 h - 1 5 n光谱筛选附近亚结合位点的小分子物质 6 5 . z h o u 等【 6 6 的n m r研究结果证明 抗癌药物放射菌素d以 嵌插方式与寡聚核昔 酸 d ( a t c g a t ) 2 作用。 y a n g 等 6 7 利用核磁共振方法研究二氯二茂钦与单核昔酸成键 南 开 大 学 博 士 学 位 论 文 特点时发现，二氛二茂钦与核普酸的成键方式不同于顺铂，因此怀疑二氯二茂钦的抗 肿瘤机理可能与顺铂不同. 随着软电离技术的发展， 质谱法在小分子与d n a加合物的结构分析中发挥着独特 的 作用 6 8 - 7 1 ， 该方法能 灵敏快速地获 得小 分 子与d n a作用的结 合区 域、 结 合位点 数、亲和力以及非共价键结合方式等信息。 1 . 1 . 7 电化学方法 在研究小分子与核酸的相互作用中，虽然电化学方法在一定程度上受分子电活性 与否的限制，但对于一些吸收光谱比较弱，或与核酸作用前后光谱无明显变化，而无 法用诸如紫外可见、荧光等光谱手段来研究的分子，却有可能用直接或间接伏安法方 便地进行研究 7 2 - 7 5 . b a r d 等人 7 6 - 7 8 将电 化学方法应用于研究溶液中d n a与电活 性金属配合物之间的相互作用。其缺点是d n a用量大、背景信号干扰强。基于d n a 修饰电极发展起来的表面电化学方法将有助于此类问 题的解决 7 3 , 7 4 。具有分子识别 功能的d n a修饰电极为电化学d n a传感器的设计、研究d n a与小分子的相互作用 奠 定了 基 础 7 9 。 方禹 之 等 人 8 0 - 8 4 将 人 工 合成的s s d n a - 1 共 价固 定 在 石墨电 极 表 面，以盐酸阿霉素、 澳化乙 锭、道诺霉素、 h o e c h s t 3 3 2 5 8 作为杂交指示剂， 采用循环 伏安法， 通过杂交指示剂的氧化还原峰电 流可识别和测定了 溶液中 互补链s s d n a - 2 . 庞代文等人 8 5 , 8 6 建立了 一种制备 d n a修 饰金电 极和 玻碳电 极的 简便方 法， 通过这 种方法能方便地获得稳定、重现的双链及单链 d n a修饰电极。修饰电极表面固定的 d n a与电活性分子因相互作用而产生表面放大效应，可方便地研究d n a与小分子的 相互作用，且灵敏度高【 7 3 , 7 9 ,8 5 。计亮年等 8 7 将旋转环盘电极法用于研究 c o 印 h e n ) 2 t a t p 3 + 与d n a相 互 作 用， 为 探 讨 其 作 用 机 理 提 供了 非 常 有 用的 信 息 。 李 启 隆等 8 8 用离子注入技术研制了一种新的 修饰电极， 并用于研究博莱酶素与d n a相互 作用的电化学行为及其应用，这种电极稳定性和重现性比一般的化学修饰电极优越得 多， 而且 灵敏度也比 较高。 彭图治等 8 9 利用循环伏安法、 示差脉冲伏安法、 计时库 仑法、整体电解法和扫描电化学显微镜研究了具有抗癌活性的双苯并咪哇衍生物 ( b b i d)不可逆电化学行为及b b i d与d n a的相互作用，实验发现b b i d主要以沟 槽作用方式与天然鱼精子 d n a结合，其中也存在序列作用因素;基于实验现象推导 了适用于研究不可逆电活性分子与 d n a相互作用的电化学公式，该公式可简便、快 布 一 幸，汀宫 速地侧定靶向 分子与 d n a的结合常数和结合位点。 陈洪渊等 9 0 将r 一 环糊精的包络 作用引入到小分子与 d n a作用研究体系中，利用光谱电化学方法研究了染料分子被 p 一 环糊精包络前后与d n a作用性质的 变化，阐述了 染料与d n a的作用机制。 1 . 1 .8微量热法 微量热法是一种近年来发展起来的研究生物热力学与生化过程动力学的重要 方法，该方法在测定过程中不会干扰生物体系的正常活动与代谢，对反应体系的光谱 性质、电 学性质及溶剂性质等无任何限制条件，因而有许多独到之处 9 1 。微量热法 已先后被用于一些抗肿瘤药物、生物染料以及金属配合物与 d n a相互作用的研究， 包括热力学 性质、结 合位点 及键合 模式的 研究 9 2 - 9 5 . 1 . 1 . 9能量转移方法 一些染料与核酸结合时，光谱特性往往允许从染料到核酸或在染料之间进行 有效的长距离能量转移。所谓的能量转移现象，即荧光碎灭和荧光敏化现象。发生有 效能量转移的条件是苛刻的，主要包括: 给体分子本身能发荧光; 给体的 荧光光谱和 受体的吸收光谱有相当程度的重叠;给体与受体之间的距离必须足够接近，根据理论 计算大约在7 n m以内， 共振能量转移的 可能性较大 9 6 。 此外， 对于合适的给体、受 体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。能量转 移方法被广泛应用于生物大分子结构、功能、反应机理以及核酸杂交分析等方面。对 于生化分析者来说，能量转移现象的 重要意义在于转移效率是发生转移的两个基团 距 离的函数，因此由转移效率可以测定分子之间的距离。 能量转移技术对生物大分子结构的分析在溶液中进行，无需复杂的结晶等样品处 理步骤，因而快速、灵敏，与 x ， 射线晶体衍射法相比，其测定结果更能反映生物大 分子结构与功能之间的关系。 c l e g g 等 9 7 通过给体、 受体标记适当的d n a链3 端， 观察能量转移， 研究结果表明， 在高、 低盐的浓度下过渡态分别为重叠式x构型和非 重叠式伸展构型. 文献 9 8 利用时间 分辨共振能 量转移技 术研究了 不同 臂末端之间 距 离的分布情况，发现重叠区域间距离分布较窄，说明这些部分具有相对刚性。能量转 移技术还可用于d n a点 突变的 探测 9 9 、 跟踪记录分子结构的 动态变化从 而对反 应机 理的 研究提供大量宝贵信息【 1 0 0 。 此外， 能量转移技术利用普通的荧光仪还可以 进行 洲 片 日 干 口 气学 体 d巴 学 t 比 士 仑大 灵敏、快速的核酸杂交测定，与放射分析相比具有相当的灵敏度，却避免了繁琐的分 离手续。核酸杂交测定的原理非常简单:当分别带有给体和受体标记物的核酸探针单 链发生杂交时，给体和受体之间的距离发生变化，就会引起荧光强度的变化。s i x o u 等人 1 0 1 以 能量转移技术在活细胞内 进行了核酸杂交实验， 他们分别在 5 和 3 端 标记了寡聚核昔酸单链及其互补链，并将二者的杂交物注入活细胞中，观察其降解反 应，发现注入细胞的寡聚核昔酸可以与胞浆中及核内非同源的互补链杂交。 1 . 1 . 1 0 凝胶电泳方法 凝胶电泳方法是生物学中最常用的分离、纯化、鉴定、制备 d n a片段以 及研究 d n a分子结构、 构象和断链的重要手段 1 0 2 。 共价结合的 加和物， 采用引物延伸法; 非共价键结合的， 则用d n a足迹法; 剪切作用的要用高分辨率聚丙烯胺凝胶电 泳 6 8 . f i e l 等 1 0 3 认为 嵌插作用可导致小分子 一 d n a复 合物电 泳 迁移率明 显降 低， 而仅仅静 电作用不会对迁移率产生大的影响，据此可初步判断小分子是否与 d n a发生了嵌插 作用。 文 献 1 0 4 比 较了 耐尔蓝 一 d n a , e b - d n a和d n a电 泳迁移率的 大小， 得出 耐 尔蓝以 嵌插方式与d n a发生作用。 文献 1 0 5 通过琼脂糖凝胶电泳技术研究了二茂钦 二甘氨酸盐与p b r 3 2 2 d n a的作用，发现它与p b r 3 2 2 d n a之间不存在任何嵌插作 用， 而且也不会引 起d n a链的缺刻。 文献 1 0 6 报道了二价金属离子对平阳酶素与d n a 作 用的 影响。 电 泳实 验表明， 当f e 2 + 浓度 较低时， 其作用主要是 促进平阳 酶素对x - d n a 的降解;当f e 2 + 浓度较高时，一方面起促进作用， 另一方面它本身也会降 解x - d n a . 随 着f e z + 的 浓度增大， 产生 平阳 酶素严重降 解d n a的 现象。 而 在人体内， 金属离子 属 微 量 元 素 ， 因 此 猜 想f e e + 主 要 起 促 进 作 用 。 王 玉 琦 等 1 0 7 利 用 生 化 分 离 流 程 及 琼 脂 糖凝胶电泳从铁芒其叶中提取出纯度比较高的稀土元素- d n a复合物， 并证明稀土元 素与d n a的结合是紧密的。 文献 1 0 8 1 比 较了r u n i 异金属双核配合物 ( 配合物1 ) 和 r u ( b p y ) z ( b p y - c y c l a m ni ) 4 + ( 配 合 物2 ) 与d n a 的 相 互 作 用， 电 泳 结 果 表明 ， 两 个 配 合物在光照下均有断裂d n a的功能， 但配合物2 对d n a的切割活性明显强于配合物 1 。 1 . 1 . 1 1 其它方法 l e r m a ri 1 0 9 1 认为 粘度增大、 沉降系数减小是小分子与d n a发生嵌插作用的主要 节 一 幸前宫 标志之一。f i e l等 2 7 研究了叶琳 t m a p ( m e s o - t e t r a ( p a r a - n - m e t h y l p y r i d y l ) p o r p h i n e ) , t 2 m p y p ( m e s o - t e t r a ( 2 n - m e t h y l p y r i d y l ) p o r p h i n e ) , t 3 m p y p ( m e s o - t e t r a ( 3 - n - m e t h y l p y r i d y l ) p o r p h i n e )及 t 4 m p y p ( m e s o - t e t r a ( 4 n - m e t h y lp y r i d y l ) p o r p h i n e ) 与d n a之间的 相互 作用， 粘 度数据表明t 3 m p y p 和t 4 m p y p 以 嵌 插方式与 d n a发生了作用， 而t 2 m p y p 和t m a p 与d n a以 非嵌插方式作用。 h a q 等 1 1 0 用粘 度 法 检 验了 a - r u ( p h e n ) 2 ( d p p z ) 2 + 和 a - r u ( p h e n ) 2 ( d p p z ) 2 + 对d n a 的 流 体 动 力 学 特 性的 影 响，发现它们均能使 d n a的杆状链伸展，并使溶液的粘度增加，为插入键合模式提 供了有利证据。 此外还有许多种方法如平衡渗析、 原子力显微镜( a f m) 、 扫描隧道显微镜( s t m) , 亲和色谱法、x 一 射线晶体衍射法等可用于小分子与d n a相互作用机理的研究。其中 x - 7 射线晶体衍射法结合分子动力学模拟计算可获得非常详细的小分子与d n a结合位 点及结构变化的信息，以及一定的动力学数据，是研究小分子与 d n a相互作用的有 利工具。总之，对于小分子与 d n a复杂体系的研究，仅仅用单一方法不可能得到比 较可靠的结论，必须综合运用各种方法和手段进行全方位、多层次的深入研究以确保 对其作用方式获得准确理解。 1 . 2 定量分析法测定核酸的进展 1 . 2 . 1 化学发光法 化学发光法具有灵敏度高、仪器简单及线性范围宽的特点，在生物学、医学、环 境检测等领域得到了 广泛应用。 叮 iq酷、 鲁米诺和 光泽精 作为 经典化学发光 试剂【 1 川， 为生 物大分子和有机化合 物的 分析钡 烤提供了 灵 敏检测方法【 1 1 2 , 1 1 3 。目 前， 化学 发 光技术逐渐应用于 d n a的 分 析测定中 【 1 1 4 - 1 1 8 ， 但 这些方 法往往 存在耗时、 背景干 扰高 的 缺点 。 何 治 柯 1 1 9 等 人 基 于c e ( i v ) 和r u ( b i p y ) 3 2 + 在 硫 酸 介 质中 的 氧 化 还 原 反 应 建立了一种检测 d n a的化学发光法，这种直接化学发光法不仅克服了背景干扰高的 缺点，而且也缩短了分析时间. 南 升. 大 学 博 - l - 学 位 论 文 1 .2 . 2 光度分析法 传统的核酸分析法是建立在碱基共扼双键在 2 6 0