（生物化学与分子生物学专业论文）黄精多糖的提取工艺及其纯化、分离.pdf

黄精多糖的提取工艺及其纯化、分离 摘要 本论义主要是对黄精多糖的提取工艺遴行参数盼优化，并对摄取的黄糖多 糖进行纯他、分离，其研究缩果如下； 1 ) 荧壤多禳熬热水漫提浚忑艺优傀； 通过对温度、瑚液比、提取时间、p h 假、提取次数的单因素实验，确定了 瓣多糖提取影穗较大豁锺令困素( 暇度、瑟滚邃、撵驳时麓、p 珏簸) 帮稳瘫戆 水平，进行难交实验，对提取工艺参数进行丁优化筛选，确斑了黄耩多糖热水浸 提法的最佳王艺条伟；温度为8 0 c ，谲液比为1 ：1 5 ，提取时蠲为4 h ，p 珏值为7 ， 提取次数1 次 2 ) 浸提液浓缩比和乙醇加最的考焱： 在多耱憋乙醇沉淀过载中，逶避毙较攀弱豹浚提液浓缭毙跌袋不霹懿乏醇 加擞对多稽沉淀的影响，得出：浸掇液浓缩比为l ，6 倍，乙醇加量为浓缩液体积6 嫠鲢，多耱瓣沉淀豢浸大。 3 ) 黄精多糖的纯化； 蛋自蕨的去除；透过魄较三氯乙酸法、s c r a g 法、酶法- i - s e v a g 法静去除蛋 白质效果，褥出最镶的去除骚自质方法为：酶法+ s e v a g 法。 色素的去除；通过比较不同粉末状活饿炭的加入量及不同沸腾时间对脱色 效果媳影响，褥出；粉末状瀵性炭翅量必l s 蛭，沸腾畦阗必i s m i n 即可达至理 想的脱色效果。 ， 把经残蛋鑫、瓣毪蜃黪黄耩多糖溶滚遴辑去除夺势予凝矮，浓络，黪滚震 真空冷冻干燥，即可精制得纯度为8 5 1 6 的黄精多糖。 4 ) 黄稽多糖静分离： 通过比较d e - 3 2 、d e - 5 2 、d e a e - s e p h a d e x a - - 5 0 对黄耩多糖的分离效果， 得醯j ；用d e a e s e p h a d e xa - - 5 0 对黄精多糖的进行分离，效果较为理想，w 将 黄糕多糖分为p s p l 、p s p 2 、p s p 3 篡个维分。 5 ) 黄精多糖的理化性质分析 逶过分子量测定，p s p i 、醛、p s p 3 携分子鬣努裂势2 3 2 莠、2 6 万、2 7 8 万。 黄精多精的提取工艺及其纯化、分离 通过薄层色谱( 1 1 ) 和气相色谱( g i c ) 分析，褥出p s p i 、p s p 2 、p s p 3 均由 蓣馥糖、酋露糖、攀乳糖醚酸组成，组成魄先：麓萄糖：曹露糖：拳嚣耱醛黢= 6 ：2 5 4 ：1 组成。 关键词：黄精；多糖；提取_ i 艺；优化；藏交实验；纯化；分离；理化性质 2 ， 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分离 a b s t r a c t t h em a i nj o bo ft h i se a s s yi st oo p t i m i z et h ee x t r a c t i o np r o c e s so fp o l y g o n a t u m s i b i r i c u mr e dp o l y s a c c h a r i d e sa n dt op u r i f ya n di s o l a t et h ep o l y g o n a m ms i b i r i c u m r e d p o l y s a c c h a r i d e s t h e 砧飘d t so f r e s e a r c ha r es h o w n a st h ef o l l o w i n g ： 1 ) t h eo p t i m i z a t i o n o f e x t r a c t t i n gp r o c e s so fp o l y g o n a t u m s i b i r i c u mr e d p o l y s a c c h a r i d e sw i t hw a n n tw a t e rd i f f u s i o n ： t h r o u g ht h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t , f i n dt h a tt h eb e s tc o n d i t i o n sf o rp r o c e s so f e x t r a c t t i n gp o l y s a c c h a r i d e sf r o mp o l y g o n a t u ms i b i r i c u mr e d i s8 0 c , s a m p l e ：w a t e r = 1 ：1 5 ，4 h o u r s ，p h 7 。o n et i m e 2 ) t h ee x a m i n a t i o no nt h ec o n c e n t r a t i o nr a t i oo f l e a c h i n gl i q u o ra n dn e e d e da l c o h o l q u a n t i t y ： i nt h ep r o c e s so fe t h a n o lp r e c i p i t a t i n g ，t h r o u g he x a m i n i n gt h eq u a n t i t yo f p o l y s a c c h a r i d e ss e d i m e n t e di nt h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nr a t i oo fl e a c h i n gh q u o ra n d n e e d e da l c o h o lq u a n t i t y , f i n dt h a tt h eb e s tc o n c e n t r a t i o nr a t i oo fl e a c h i n gl i q u o ra n d n e e d e da l c o h o lq u a n t i l yi s1 6t i m ea n d6t i m e s 3 ) t h ep u r i f i c a t i o no f p o l y g o n a t u ms i b i r i c u mr e d p o l y s a c c h a r i d e s ： t h r o u g hc o m p a r i n gt h et r i c h l o r o a c e t i ca c i dm e t h o d ，s e v a gm e t h o da n dt h e c o m b i n a t i o no fe n z y m i cm e t h o da n ds e v a gm e t h o d s m dt h a tt h eb e s tw a yt or e m o v e p r o t e i nf r o mp o l y g o n a t u ms i b i r i c u mr e dp o l y s a c c h a r i d e si s ：t h ec o m b i n a t i o no f e n z y m i cm e t h o da n ds e v a gm e t h o d i nt h ep r o c e s so fr e m o v i n gp i g m e n t ，c o m p a r i n gt h ee f f e c to fq u a n t i t yo fa c t i v e c a r b o np o w e ra n db o i l i n gt i m et or e m o v i n gp i g m e n t , f i n dt h a t ：w h e nt h ed o s a g eo f a c t i v ec a r b o np o w e li s1 5 a n dt h eb o i l i n gt i m ei s1 5r a i n ，t h ee f f e c to fr e m o v i n g p i g m e n ti lt h eb e s l t h r o u g hr o m v i n gw o m i n 。p i g m e n ta n ds m a l lm o l e c u l a rs u b s t a n c e ，t h ep u r i t yo f p o l y g o n a t u ms i b k i c u mr e dp o l y s a c c h a r i d e sc a n b er e a c h e d8 5 1 6 4 1t h ei s o l a t i o no fp o l y g o n a t u ms i b i r i c u mr e d p o l y s a c e h a r i d c s ： c o m p a r i n gt h ee f f e c to f p a r a t i n gp o l y g o n a t u ms i b i r i c u mr e dp o l y s a c c h a r i d e s w i t hd e - 3 2 。d e - 5 2a n dd e a e - s e p h a d e xa - - 5 0 , f i n dt h a tu s i n gd e a e - s e p h a d e xa 一 3 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分离 5 0t o p a m t ep o l y g o n a t u ms i b i r i c u mr e dp o l y s a c c h a r i d e si st h eb e s tw a ya n d p o l y g o n a t u ms i b i r i c mr e dp o l y s a c c h a r i d e sc 瓶b e p a m t e dp s p l 、p s p 2 、p s p 3 5 ) a n a l y z i n gp h y s i c o - c h e m i c a lp r o p e r t y o f p o l y g o n a t m n s i b i r i c u mr e d p o l y s a c c h a r i d e s ： h a v i n gd e t e r m i n e dm o l e c u l m m a s s , f o u n d m a tt h em o l e c u l a rm a s so fp s p l , p s p 2 a n dp s p 3i s 2 3 2 x 1 0 5 。2 6 0 x t 0 5 a n d2 7 8 ： 2 0 0 万) 上同一条柱，求出柱的空体积v o ，根据v e v o 与l g m 之间 存在着线性关系。可绘制标准曲线。最后，将待测样品按上述不变的条件上柱， 求得待测多糖的v e 。通过标准曲线上的v c v o ，查得待测多糖的分子量对数， 便可求出m 。每次缓冲液均需相同，否则会产生较大的误差。 1 3 5 - 2 多糖的单糖组分的测定【张翼伸。1 9 8 3 】 常用的方法是用硫酸或盐酸i - 3 n ，8 0 1 0 0 c ，3 - 8 小时封管将多糖完全水解。 水解后中和即是单糖的混合溶液，用纸色谱，薄层色谱、液相色谱或气相色谱进 行分析 1 4 黄精多糖的研究 1 4 1 生物活性研究 黄精始载于明医别录。为百合科黄精属( l i l i a c e a e ) 多年生草本植物，有黄 精( p o l y g o n a t u ms i b i r i c u mr e d ) 、滇黄精( p o l y g o n a t u mk i n g i a n m nc o l l e th em s l ) 和 1 7 黄精多塘的提取工艺及其纯化、分离 多花黄精( p o l y g o a a t a m cy ! e t o n e 姒h 岫等。黄精属植物在全球分布很广，大约有 4 0 余种【现代适用本草i v ，1 9 9 7 】，但适应性较差、生境选择性强。中华人民共和 国药典2 0 0 0 一部规定：以百合科植物黄精、多花黄精、滇黄精的干燥根茎入 药。根据形状来分，称“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”。以块大、肥润、色 黄白、断面透明者为优，昧苦者不可入药李时珍【李时珍，1 9 7 8 】日：“黄精为服 食要药”别名为“仙人余粮”、。救命草”、“老虎姜”等，体现其药食两用性。汉朝 的神农本草经、明朝的本草纲目和清朝的青阳县志也均有其作为药 膳食补功效的记载。黄精作为一种传统名贵中药，具有宽中益气，益肾填精，滋 阴润肺，生津补脾之功效。主治肺燥干咳、体虚乏力、心悸气短、久病津亏口干、 糖尿病、高血压等病症。现代药理学研究表明其化学成分主要有：黄精多糖，体 皂昔、蒽醌类化合物、生物碱、强心苷、木脂素，维生素和多种对人体有用的氨 基酸等化合物。 黄精多糖是黄精化学组成的一个重要部分，是黄精的主要生物活性成分之 一。黄精多糖的药理研究表明，其具有增强免疫功能、抗衰老、降血糖降血脂、 延长实验动物寿命、提高学习记忆再现能力、抗炎作用，抗病毒等多种生物学活 性。 1 4 1 1 增强免疫功能【石林等，1 9 9 2 f 黄瑶等，2 0 0 2 1 黄精租多糖( p s c p ) 4 0 0 m g k g i 击1 灌胃小鼠，连续给药7 d ，对照组为等两 生理盐水，结果表明：黄精粗多糖能明显促进正常小鼠胸腺和脾脏的重量增加， 可明显增强小鼠静脉注射胶体碳粒的廓清速率，对小鼠网状内皮系统吞噬功能， 有明显的激活和增强作用。黄精粗多糖1 0 0 、2 0 0 ，4 0 0 m g k g t d - 给小鼠连续灌 胃给药4 d ，可明显对抗环磷酸胺所致小鼠外周血白细胞减少，也能使小鼠的脾脏 重量增加，提示黄精多糖的升白细胞作用可能使通过促进脾脏问质细胞的增生， 发挥代偿性髓外造血功能所致。小鼠皮下注射黄精多糖l o d 可明显对抗曩c 吖射 线所致的血细胞数减少、白细胞及血小板总数升高达正常的8 6 和8 9 ，并能 使照射小鼠外周红细胞c b 受体花环率及免疫复合物花环率升高。 1 4 1 2 抗衰老作用【石林等，1 9 9 8 儿黄瑶等，2 0 0 2 黄精多糖分5 0 m g k g t d 1 和1 0 0 m g 1 【g _ t d - 1 ，灌胃老龄大鼠，蒸馏水作对照。 连续给药l m o n 测定与衰老有关的指标，结果表明：黄精多糖对老龄大鼠a n a e 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分离 活性淋巴细胞百分率，红细胞、晶体核、晶体皮质超氧化物歧化酶( s o d ) 活性， 肝脏核肾脏脂褐质含量，心脏过氧化脂质( 曲o ) 含量，脑中b 型单胺氧化酶 ( m a o - b ) 活性均有明显改善作用，与对照相比有显著性差异。用黄精多糖制 备的古鹤松保健白酒( 含黄精低聚糖0 1 5 ) ，经果蝇生存试验及抗衰老石岩表 明具有延长果蝇寿命作用( p 0 0 5 ) ，亦能使老龄大鼠血s o d 活性升高( p o 0 1 ) ， 肝，肾脏脂褐质含量下降( p o 0 1 ) ，心脏l p o 含量降低( p o 0 1 ) ，脑组织中b 型单胺氧化酶( m a o b ) 活性明显被抑制( p o 0 1 ) 。 1 4 1 3 降血糖、降血脂( 石林等，1 9 9 8 1 【王西龙等，2 0 0 6 王红玲将正常小鼠及高血糖模型小鼠随机分为五组；黄精多糖大剂量组， 1 0 0 0 m g c k g d ) 灌胃；黄精多糖中剂量组，5 0 0 m g c k g d ) 灌胃；黄精多糖小剂量组， 2 5 0 m g ( k g d ) 灌胃；正常对照组给予等体积生理盐水灌胃，每天1 次，每次0 s m l 只，连续7 天。分别测定各组小鼠的血糖值及高血糖模型小鼠肝脏c a m p 的含 量。结果：黄精多糖对正常小鼠血糖水平无明显影响；但可显著降低高血糖模型 小鼠的c a m p 含量肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值，剂量5 0 0 m g ( k g d ) 降血糖作用最为显著，同时降低肾上腺素模型小鼠肝脏中c a m p 的含量等。李 友元以黄精多糖为研究对象，探讨其对高脂血症实验兔血脂及其主动脉内膜泡沫 细胞形成的影响。采用终点法( 氧化酶法，直接测定法、免疫比浊法) 测定血脂， 光镜观察主动内膜粥样硬化形成情况。结果：黄精 1 6 m l ( k g d ) 】能显著降低高脂 血症实验动物的血清t c 、l d l - - c 和l p ( a ) 浓度和减少主动脉内膜泡沫细胞的形 成。 1 4 1 4 延长实验动物寿命【石林等，t 9 9 8 l 用含量9 6 2 5 的黄精多糖，分高、中，低3 种浓度哺养果蝇，连续给药6 0 d ， 实验表明，均明显延长雄、雌两性果蝇的平均寿命和最高寿命。实验结果经统计 学处理均有显著差异。 1 4 1 5 提高学习、记忆再现能力【石林等，1 9 9 8 黄精多糖高、中、低剂量灌胃老龄大鼠，连续给药1 5 d ，喜得镇作阳性对照、 阴性对照为等量蒸馏水在给药后第1 5 d 和3 0 d 用y 型迷宫进行学习测试，结 果表明，黄精多糖能显著改善老龄大鼠学习记忆及记忆再现能力，降低错误次数。 与阳性对照相比，黄精多糖高，中、剂量组和阳性组差异均极显著( p 0 0 1 ) ， 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分离 低剂量组差异显著( p o 0 5 ) 。给药组可明显缩短迷宫测试中大鼠得潜伏时间。 1 4 1 6 抗炎作用【石林等，1 9 9 8 彭成等人用家兔眼结膜、角膜炎症模型，口服黄精多糖眼药水，视察黄精多 糖得抗炎药理研究结果表明，黄精多糖眼药水能消除兔模型结膜充血、水肿、 分泌物增加、角膜混浊、睫状充血等局部表现i 能明显抑制小鼠耳廓肿胀、大鼠 足趾肿胀；降低大鼠肉芽肿得重量，减少肉芽肿内渗出；对治疗大鼠免疫性关节 炎得原发病灶和继发病变有显著疗效，提示黄精多糖具有良好得抗炎作用。 1 4 1 7 抗病毒作用【王西龙等，2 0 0 6 黄瑶等，2 0 0 2 1 辜红梅等对黄精多糖的抗单纯疱疹病毒作用研究表明；黄精多糖对非洲绿猴 肾细胞( v e t oc e i l ) 的最大无毒浓度为1 6 m g m l ，在对v e t o 细胞无毒性的浓度下 对单纯疱疹病毒1 型( s t o k e r 株) 和2 型( 3 3 3 株和s a y 株) 均有显著的抑制作 用。对s t o k e r 株的半抑制浓度i c 5 0 为3 9 5 m g m l ，最小有效浓度m i c 为1 0 m g m l ， 对3 3 3 株的i c 5 0 为8 0 m g m l ，m i c 为8 0 m g m l ：对c a w 株的i t 5 0 为7 7 2 r a g r i d ， m i c 为4 0 m g m l 。m t t 染色的结果表明，黄精多糖能显著提高病毒感染的v e t o 细胞的活力，对细胞有保护作用。曾庆华等用o 2 黄精多糖滴眼液，2 m g m l 黄 精多糖注射液及o 5 黄精多糖口服液三种黄精多糖制剂治疗家兔实验性单纯疱 疹病毒性角膜炎，与无环鸟苷治疗组及氯霉素组进行对照，结果表明：各种黄精 多糖制剂组与氯霉索组比较，疗效均有统计学意义( p o 0 5 ) ；黄精多糖滴眼液 配合黄精多糖注射液结膜下注射和黄精多糖滴眼液配合黄精多糖口服液2 组疗 效优于无环鸟苷组( p 0 0 5 ) 。含2 0 黄精多糖的奥得福尔外用软膏剂，临床每 日两次体外涂搽治疗生殖器疱疹，连续7 d ，经临床6 0 例应用观察，对生殖器疱 疹( g h ) 安全有效，显效率为9 2 o ，总有效率为9 8 0 1 4 1 8 其他作用【石林等，1 9 9 8 | 另有研究表明黄精多糖对化学性肝损伤有保护作用，对保肝抗衰均有益；黄 精多糖对糖尿病鼠心肾组织糖基化终产物受体m r n a 表达的起到调节作用。 1 4 2 化学研究 杨明河等( 1 9 8 0 ) 报导，黄精多糖均由葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸缩合而 成，8 分子果糖与1 分子葡萄糖缩合而成黄精低聚糖甲，4 分子果糖与1 分子葡 萄糖缩合而成黄精低聚糖乙，2 分子果糖与1 分子葡萄糖缩合而成黄精低聚糖丙。 2 0 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分离 黄芳、蒙义文等报导黄精多糖( p p d 溶解于水。不溶于高浓度的乙醇、丙酮、乙 醚等有机溶剂，a 一萘酚、硫酸苯酚、硫酸蒽酮反映呈阳性，具有糖的一般通性。 t ic 、红外光谱、1 h n m r 、1 3 c n m r 等表明，由葡萄糖和果糖组成，且果糖有a 和b 两种端基差向异构体，糖链以2 6 线性连接为主链【杨明河等，1 9 8 0 。 1 4 3 研究概况 关于黄精多糖的研究。目前主要涉及以下几个方面： 一、不同地区黄精多糖含量的比较 据黄赵刚【黄赵刚等, 2 0 0 3 1 等报道：不同产地的黄精其多糖含量差异较大，他 们以硫酸蒽酮比色法( 线性范围4 1 2 2 0 6 0 i l g ，m l ，r 细9 9 8 8 ) 测定多糖含量，以 葡聚糖计，安徽九华山、贵州、湖南、河南周口、云南、河南济源、河北等地黄 精中多糖含量分为：t 7 3 9 嚷, ，1 3 1 9 ，8 2 5 ，1 1 4 7 。1 0 9 9 , 4 a 7 , 9 9 1 ，其中以安 徽九华山产黄精中多糖的含量最高。 。 二、黄精多糖的提取分离 杨文远【杨文远等，1 9 9 7 等以宁夏黄精为原料，用石油醚于6 0 9 0 回流脱 脂2 次，每次l h ，回收石油醚，药渣挥于溶剂后用8 0 乙醇浸渍过夜，于8 0 9 0 c 回流提取2 次，每次2 小时，过滤后药渣用蒸馏水9 0 c 提取两次，合并滤 液，减压浓缩后用氯仿萃取多次去除蛋白质，再加l 活性炭脱色2 次，抽滤， 滤液加入9 5 乙醇使乙醇含量达8 0 ，静置过夜，过滤，残渣依次用9 5 乙醇、 无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，真空干燥，即可得精制黄精多糖。 三，黄精多糖的药理研究 吴粲荣【吴粲荣等，2 0 0 4 1 等的研究表明黄精多糖能抑制糖尿病鼠心、肾组织 r a g e m r n a 表达。对高血糖及糖基化终产物( a g e ) 造成的组织损伤具有保护作 用。 任汉阳【任汉阳等。2 0 0 4 1 等用黄精粗多糖对温热药致阴虚模型小鼠进行实验， 用药共3 0 d ，设空白对照组、模型组、黄精粗多糖大、中、小剂量组。用六味地黄 丸作阳性对照。结果表明黄精粗多糖能明显提高阴虚模型小鼠的体重增长率及痛 阙o ， a c d ，即：固液比 温度 提取时间p h 值。 表7 ：方差分析表 一一! ! 堂! ! ! 鲤型! 竺! ! z ! ! ! ! 误差来源平方和 自由度方差f 值 显著性 a2 0 0 8 6 36 6 9 5 9 4 9 6 b 4 9 1 1 2 3 1 6 3 7 12 3 2 2 1 c 1 3 2 8 53 4 a 2 8 6 2 8 1 d l o 6 5 9 3 s e 2 1 1 43 3 5 5 3 5 0 4 0 o 7 0 5 总误差9 5 2 5 61 5 f 0 以3 ，3 ) - - 9 2 8 f o m ( 3 ，3 ) - - 2 9 4 6 表7 方差分析结果表明，温度和固液比对黄精多糖得率的影响均达到显著水 平，且从f 值看，固液比的显著性要比温度大的多，而提取时间和p h 值对黄精多 m rmh h “ ，u m 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分离 糖提取得率无显著影响。 2 3 3 3 浸提液浓缩比和乙醇加量的考查 乙醇为最常用的多糖沉降剂，在用乙醇沉淀多糖时，浸提液的浓度和乙醇用 量对多糖的沉降率起着关键的作用。多糖在低浓度低级醇中溶解度较好，随着溶 液中低级醇的浓度加大后，多糖的溶解度降低，慢慢的从溶液中析出，而随着多 糖进一步从溶液中沉淀出来后，溶液中的多糖浓度又进一步下降，这样，多糖溶 液中溶解的多糖便不易被进一步沉降。因此，如何选择浸提液的浓度即控制浸提 液的浓缩比以及乙醇的加量，便直接影响到多糖的沉降率。现通过实验以确定最 佳的多糖浸提液浓缩比及乙醇的加量。本实验取黄精渣l o o g ，在温度为8 0 c ， 固液比为1 ：1 5 ，提取时间为4 h ，p h 值为7 的条件下浸提一次，过滤，取滤液。 把滤液均分成6 份，分别浓缩成浓缩比为1 ，5 6 ，4 6 ，3 6 , 2 6 ，1 6 的六份，然后把 浓缩好的6 份浓缩液各均分成6 份，依次加入该浓缩液体积1 ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 倍的无水乙醇，静置过夜后，离心干燥所得的多糖沉淀，通过每份多糖沉淀的量 的多少来考查浸提液浓缩比和乙醇的加量，多糖沉淀量最多时对应的浸提液浓缩 比和乙醇加量为最佳浸提液浓缩比和乙醇加量实验见袭7 表8 浸提液浓缩比和乙醇加量对多糖沉降率的影响 ( t a b s c f l e e to f c o n c e n t r a t i o n t i m e sa n dq u a n t i t yo f e t h a n o lt o ：璺1 2 2 墅塑! 12 1 巴! ! 1 2 1 塾! 生! ! ! 浓缩比 1 5 64 63 6 2 61 6 乙醇加量 由表8 可知，当浸提液浓缩比为1 6 倍，乙醇加量为6 倍时，多糖得沉降率 最大。 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分离 2 3 4 黄精多糖的纯化 2 3 4 1 除蛋白质方法的选择 除蛋白的方法通常有盐析法、s e v a g 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶 法+ s e v a g 法等，这里选取三氯乙酸法、s e v a g 法，酶法+ s e v a g 法做对比实验， 把三氯醋酸、s e v a g 、酶+ s c r a g 方法去除蛋白质后的粗多糖分别配制成浓度为 6 0 p g m l 的样品液，测定它的紫外吸收值( a 拗、a 瑚) 及在4 8 8 n m 处的吸光度， 计算溶液中，萤自质浓度、蛋白质含量及多糖浓度、多糖含量。结果见表9 。 表9 ；除蛋白质方法及结果的比较 盟! ! 竺：婴! ! 竺2 坚堕墨! ! 塾鲤! 翌壁堡翌垡堕堂翌2 墅曼巴望i 曼! 去蛋白方法蛋白质浓度蛋自质含量多糖浓度多糖含量 (pgm1)(pgm1) 由表9 可知，酶法+ s c v a g 法除蛋白质效果较好，故选用酶法+ s e v a g 法去 除蛋白质。 2 3 4 2 除色素方法的选择 经过对比实验发现，双氧水、颗粒活性炭都难以达到脱色要求，粉末状活性 炭的加入量及沸腾时间均对脱色效果有显著的影响。因此考察粉末活性炭的用量 及沸腾时间脱色的影响见表1 0 、表l l 。 表1 0 ：活性炭用量对脱色效果的影响 ( t a b l 0 ：e f f e c to f a c t i v ec a r b o nd o s a g eo nd e c o l o r ) 活性炭加量510 1 5 2 0 脱色后溶液的颜色橙黄黄浅黄浅黄 表1 l ：沸腾时间对脱色效果的影响 ! 婴! ! ：墼! 堕垒鲤垫g 鲤竺墅业! 沸腾时间( m i n ) 51 01 5 脱色后溶液的颜色黄浅黄淡黄 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分离 由表1 0 和表l l 可知，当活性炭粉末用量为1 5 。沸腾时间为1 5 r a i n 即可 达到脱色效果。 2 3 4 3 小分子杂质的去除 把脱色过的黄精多糖溶液倒入一定规格的透析袋，两头扎紧，放入去离子水 中，每隔2 小时换一次水，换水3 ，4 次后，可静置过夜，收集袋中多糖溶液进 行浓缩，醇沉后真空干燥，即得精制的黄精多糖。 2 3 4 4 精制黄精多糖中多糖含量的测定 精密称取精制的黄精多糖2 0 m g ，置5 0 0 m l 容量瓶中，加少量蒸馏水溶解并 稀释至刻度，摇匀做贮备液。精密量取贮备液l m l ，照苯酚一硫酸法标准曲线项 下的方法测定吸光度值，从回归方程中求出多糖供试液中葡萄糖浓度，按下式计 算精制黄精多糖中的多糖含量。 多糖含量( ) = 【c x d x 0 9 ( w x l 0 0 0 ) 】x i 0 0 式中w 为多糖的重量( m g ) ，c 为多糖稀释液中葡萄糖浓度( t i g m 1 ) ，d 为 多糖的稀释倍数，d = 5 0 0 1 = 5 0 0 ，0 9 为葡萄糖的校正系数。实验测得a = 0 2 7 4 ， 代入回归方程a = 0 0 0 7 3 c 0 0 0 2 5 中，求得c = 3 7 s s 0 i i g m l 。 则多糖含量( ) = 【4 3 5 0 x 5 0 0 ( 2 0 x 1 0 0 0 ) x 1 0 0 = 8 5 1 6 2 3 5 黄精多糖的分离 2 3 j 1 树脂的选择 多糖的分离用的最多的是阴离子交换树脂，常用的有d e a e 纤维素、d e - 3 2 、 d e - 5 2 、d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w 、c m s e p h a r o s ef a s tf l o w 等阴离子交换树脂。 由于黄精多糖是属于酸性多糖，而纤维素阴离子适用于分离各种酸性、中性多糖 和粘多糖，故本实验选取d e - 3 2 、d e - 5 2 、d e a e - s e p h a d e xa 5 0 三种纤维素阴离 子交换树脂来分离黄精多糖，以获得分离黄精多糖的最理想的树脂。 d e - 3 2 阴离子交换层析 取适量的d e - 3 2 ，用蒸馏水浸泡至溶涨，用0 5 nn a o h 处理3 0 m i n ，抽干 后用蒸馏水洗至中性，再用0 5 nh c i 处理3 0 r a i n ，用蒸馏水洗至中性，最后再 用0 5 nn a o h 处理3 0 m i n ，用蒸馏水洗至中性，然后脱气，装柱( f 2 6 2 3 c m ) ， 用p h 7 6 的n a h 2 p o , - n a 2 1 - i p 0 4 洗脱，洗脱体积大约为柱体积的3 - - 5 倍，流速控 制在i m l m i n 。 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分离 称取精制过的黄精多糖5 0