（环境工程专业论文）生物饲料添加剂及其资源开发的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 论文题目：生物饲料添加剂及其资源开发的研究 研究生姓名：陈曦 导师姓名：赵建国教授 学校名称：江南大学 本课题对以废弃物糟渣黄酒糟、啤酒糟和农副产品下脚料豆粕、麸皮为发酵基质生 产蛋白饲料、饲用复合酶的发酵工艺，以及在玉米芯水解液中生产酵母蛋白的工艺进行 研究，旨在解决农业废弃资源的环境问题，同时开辟纤维素资源再利用的新途径。 菌种在发酵过程中起至关重要的作用。原始菌株m 一4 1 1 以中性蛋白酶、纤维素酶为 主，经热处理及6 0 c o 诱变处理后筛选出两支突变菌株m 4 l 和m 4 6 2 ，其中菌株m _ 4 1 的蛋白酶酶活可达2 3 8 0 u g 干曲，增幅为3 7 ；菌株m 一4 6 2 的纤维素酶酶活可达1 0 6 8 u g 干曲，增幅为4 5 。通过对两支突变菌株混株固态发酵工艺优化进行研究，得出较佳的 培养基( g l ) - 豆粕3 3 3 ，麸皮5 0 0 ，尿素5 ，硫铵5 ，k h 2 p 0 48 ，m g s 0 4 7 h 2 00 4 ， p h 5 0 ，在3 0 下培养4 0 h ，重复试验测得发酵产物蛋白酶酶活平均可达3 1 3 5u g 干曲， 纤维素酶酶活平均可达1 5 4 3u 儋干曲。并对其酶系进行了酶学性质的研究，得出对于蛋 白酶，最佳的浸提温度为4 5 c ，在4 0 下最佳浸提时间为1 h ，当底物浓度低于o 8 时， 酶反应速度与底物浓度呈正比关系；当底物浓度为1 0 时蛋白酶已被底物所饱和，反应 速度不再增加，最适反应p h 为6 2 - 7 2 ，在p n 6 8 7 8 酶活比较稳定，最佳的反应温度 范围为4 0 4 5 ，在3 0 4 0 酶活可保持在8 0 以上；对于纤维素酶，最佳的浸提温度 为5 0 。c ，在4 0 c 下最佳的浸提时间2 h ，当底物浓度低于1 o 时，酶反应速度与底物浓 度呈正比关系；当底物浓度高于1 2 时，酶开始被底物所饱和，最适反应p h 为2 2 - 5 0 ， 在p h 3 o 6 0 比较稳定，最佳的反应温度范围在3 5 4 5 ，在3 0 6 0 酶活可保持在 8 0 以上，基本上能满足饲用的要求。 米曲霉、酵母混株固态发酵来生产含酶蛋白饲料，得出较佳培养基配比( g r l ) ：啤 酒糟2 2 2 ，黄酒糟5 5 ，豆粕5 5 ，麸皮2 2 2 ，硫酸铵1 1 ，k h 2 p 0 45 ，初始p h 值为4 ，酵 母接入1 6 h 后接入米曲霉再培养6 8 h ，测得酵母数为2 6 6 亿个幢干曲，几乎为单一酵母 发酵酵母数的三倍；粗蛋白最高可达3 7 2 2 ，平均粗蛋白3 6 0 8 ，将基质粗蛋白提高了 9 5 0 ，增幅3 5 7 4 。产品有浓郁的酵母香味，且含有一定酶活的蛋白酶( 9 0 1u g 干曲) 及纤维素酶( 1 8 2 4 u g 干曲) 。 采用稀酸法水解玉米芯，通过正交试验得到一较为经济理想的水解条件，即料液比 1 ：2 0 ，酸浓度1 ，水解压力0 1 m p a ，水解时间3 h 。在此条件下木糖得率5 3 9 0 ，还原糖 平均得率4 1 3 9 。采用响应面分析法对培养基碳源、氮源及磷酸盐进行优化，得到发酵 产率的回归方程，预测出培养基中添加( g r l ) 尿素1 0 、硫酸铵1 0 、k h 2 p 0 41 4 、酵母 江南大学硕 学位论文 膏1 0 、m g s 0 4 7 h 2 00 5 时，产量最高。经试验表明，3 0 。c 培养1 8 2 0 h ，酵母发酵产率 可达2 0 9 l 。再以不同配比的玉米芯渣、黄酒糟、豆粕和麸皮为基质固态发酵，粗蛋白分 别提高了7 6 0 和7 7 0 ，增幅分别为5 0 0 3 和3 8 7 3 。 关键词固态发酵酵母蛋白饲用复合酶酶学性质玉米芯 a b s t r a c t a b s t r a c t f o rp r o d u c i n gf e e d i n gp r o t e i n sa n df e e d i n gm u l t i e n z y m e ，f e r m e n t a t i o nw i t h d i s t i l l e r sg r a i n ( s u c ha sy e l l o ww i n el e e sa n db e e rl e e s ) a n df a r mp r o d u c ed r e g s ( s u c ha sb e a nc a k ea n db r a n ) a n dt o mc o bh y d r o l y s i sw a ss t u d i e d t h ea i mi st od e a l w i t ht h ee n v i r o n m e n tp r o b l e mi n d u c e db yd i s t i l l e r sg r a i na n dr e u s et h ec e l l u l o s e r e s o u r c e t h ek e yp o i n ti sp r o d u c e r t h ei n i t i a ls t r a i n ，m a i n l yp r o d u c i n gp r o t e a s ea n dc e l l u l a s e ， w a sm u t a g e n i z e db yh e a tt r e a t m e n ta n d6 0 c or a d i a l t w om u t a n t sw e r eg a i n e d o n ei s m - 4 1p r o d u c i n gp r o t e a s e ( 2 3 8 0 u gd r ym a s s ) w h i c hw a se n h a n c e db y3 7 ，a n dt h e o t h e ro n ei sm - 4 6 2p r o d u c i n gc e l l u l a s e ( 10 6 8u gd r ym a s s ) w h i c hw a se n h a n c e db y 4 5 t h e nf e r m e n t a t i o nw i t ht h e s et w os t r a i n sw a ss t u d i e d a n dt h ep r e f e r a b l e f e r m e n t a t i o nt e c h n i c sw a st h a t ( 班) b e a nc a k e2 2 2 ，b r a n5 0 0 ，u r e a5 ，( n h 4 h s 0 4 5 ， k h 2 p 0 48 ，m g s 0 4 7 h 2 00 4 ，d r ym a s s w a t e re q u a l1 ：1 2 ，p h 5 0 ，a t3 0 w a s c u l t i v a t e df o r4 0 h t h ep r o t e a s ea n dc e l l u l a s eo f p r o d u c tw e r e3 1 3 5u gd r ym a s sa n d 15 4 3u gd r ym a s sr e s p e c t i v e l y e n z y m ep r o p e r t yw a sa l s os t u d i e d i ti sf o u n dt h a t ，t op r o t e a s e ，t h eo p t i m u md i g e s t i o n t e m p e r a t u r ew a s4 5 c ，w h e nd i g e s t i o nw a sc a r r i e da t4 0 。c ，t h eb e a e rt i m ew a s l h w h e ns u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw a sl o w e r0 8 e n z y m er e a c t i o nv e l o c i t yw a sd i r e c t r a t i ot os u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n w h e ns u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw a sa b o v e1 o e n z y m er e a c t i o nv e l o c i t yi n c r e a s e dl i t t l ea n de n z y m ew a ss a t u r a t e d 1 1 1 eo p t i m u m t e m p e r a t u r ea r r a n g eo fe n z y m er e a c t i o nw a s4 0 4 5 c ，e n z y m ea c t i v i t yc o u l dh o l d 8 0 b e t w e e n3 0 4 0 。c a n dt h eo p t i m u mp ha r r a n g eo fe n z y m er e a c t i o nw a s 6 2 - 7 2 ，e n z y m ea c t i v i t yk e p ts t a b l ea tp h 6 8 7 2 t oc e l l u l a s t h eo p t i m u md i g e s t i o n t e m p e r a t u r ew a s5 0 c w h e nd i g e s t i o nw a sc a r r i e da t4 0 c ，t h eb e t t e rt i m ew a s2 h w h e ns u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw a sl o w e r1 o e n z y m er e a c t i o nv e l o c i t yw a sd i r e c t r a t i ot os u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n w h e ns u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw a sa b o v e1 2 e n z y m ew a ss a t u r a t e d 1 1 1 eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea r r a n g eo fe n z y m er e a c t i o nw a s 3 5 4 5 c ，e n z y m ea c t i v i t yc o u l dh o l d8 0 b e t w e e n3 0 6 0 a r i dt h eo p t i m u mp h a r r a n g eo f e n z y m er e a c t i o nw a s2 2 - 5 o ，e n z y m ea c t i v i t yk e p ts t a b l ea tp h 3 o - 6 0 1 1 1 es o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o nw a sc a r r i e dw i t hb l e n d i n ga s p e r g i l l u so r y z a ea n dy e a s tt o p r o d u c tp r o t e i n e n r i c h e df e e di n c l u d i n ge n z y m e 1 1 1 ep r e f e r a b l ec u l t u r em e d i u mw a s ( g l ) b e e rl e e s2 2 2 ，y e l l o ww i n el e e s5 5 ，b e a nf l o u r5 5 ，b r a n2 2 2 ，( n h 4 ) 2 s 0 41 1 ， k h 2 p 0 45 ，p h 4 0 u n d e rt h ec o n d i t i o nt h a ta s p e r g i l l u so r y z a ew a si n o c u l a t e da f t e r 1 1 1 江南大学硕+ 学位论文 y e a s tw a si n o c u l a t e df i r s ti n1 6 h ，a n dt h e nw a sc u l t i v a t e df o r6 8 h ，t h ey e a s ta m o u n tw a s2 6 6 b i l l i o n gd r ym a s s ，w h i c hw a sa l m o s tt h r e e f o l d sh i g h e rt h a nt h a tb yu n i q u es t r a i n , a n d t h ec r u d ep r o t e i nw a s ( e n h a n c e dt o3 5 7 4 ) 9 5 0 h i g h e rt h a nt h a to r i g i n a lm e d i u m m o r e o v e r , t h ef e e d s t u f fh a ds t r o n ga r o m af r o my e a s ta n dc o n t a i n e dp r o t e a s ea n d c e l l u l a s e sw i t ht h ea c t i v i t i e so f9 0 1a n d18 2 4u gd r ym a s s ，r e s p e c t i v e l y s t u d yo nc o r nc o bh y d r o l y z e db yd i l u t e dv i t r i o lw a sc a r r i e di no r t h o g o n a ld e s i g n o p t i m u mh y d r o l y s i sc o n d i t i o nw a st h a ts o l i d ：d i l u t e dv i t r i o le q u a l s1 ：2 0 ：d i l u t e d v i t r i o lc o n c e n t r a t i o nw a sl ：h y d r o l y s i sp r e s s u r ea n dt i m ew e r eo 1 m p aa n d3 h x y l o s ea n dr e d u c i n gs u g a rw e r eo b t a i n e d5 3 9 0 a n d4 1 3 9 t h ec o m p o s i t i o no f f e r m e n t a t i o nm e d i u mo p t i m i z e d 州t hr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sw a s ( 班) ：u r e a1 0 ， a m m o n i u ms u l f a t e1 0 ，k h 2 p 0 41 4 f e r m e n t a t i o np r o d u c t i v i t yw a s2 0 o g ( s c p ) l a f t e r2 0 h a t3 0 ci no p t i m i z e dm e d i u m a f t e rt h a ts o l i df e r m e n t a t i o nw a sc a r r i e d 谢t lh y d r o l y z e dd r e go fc o r nc o ba td i f f e r e n tr a t i oa n do t h e rc o m p o n e n t s t h ec m d p r o t e i nw a se n h m a c e db y7 6 0 a n d7 7 0 k e yw o r d s ：s o l i df e r m e n t a t i o ny e a s tp r o t e i nf e e d i n gm u l t i - e n z y m ee n z y m o l o g y p r o p e r t y c o r nc o b i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：堕亟日期：磁岁月纱侣 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：琏亟导师签名：三幽 日期：加2 7 年，月w 日 第一章绪论 1 1 研究背景 第一章绪论 1 1 1 概述 我国是世界上饲料生产大国，有l 万5 千家饲料生产厂家。2 0 0 5 年我国饲料总产 值2 4 0 0 亿元，产量首次突破l 亿吨大关，达到了1 0 3 亿吨，稳居世界第二位。但随 着人民生活水平的提高和人口迅速增长，对粮食和畜产品的需求量迅猛增长，对饲料 的需求量越来越大，畜牧业的发展与饲料短缺的矛盾十分突出。蛋白饲料资源尤为紧 缺，2 0 0 4 年累计进口饲用鱼粉1 0 4 0 8 万吨，进口豆粕5 5 4 5 万吨。2 0 0 4 2 0 0 5 年度饲 用豆粕消费量估计达到2 0 5 0 万吨，豆粕供应日趋紧张已成为制约养殖和配合饲料成 本的重要因素之一。因此饲料资源开发与饲料添加剂的开发及其产业化已成当务之 急。2 0 0 0 年分别暴发于比利时的二恶英事件和英国的疯牛病等，在欧洲大陆引起强烈 震动，消费者对畜产品的消费信心出现严重危机。人们开始强烈呼唤绿色饲料添加剂， 提出“用健康饲料创建健康食品”、“饲料是人类的直接食物”等口号。 生物饲料添加剂是指利用某些特殊的有益微生物与原、辅料混合发酵，经干燥或 制粒等特殊工艺加工而成的含有活性菌的安全、无污染、无药物残留的饲料添加剂， 包括酵母s c p 蛋白饲料、菌体蛋白饲料( m b p ) 、饲用酶制剂、益生菌微生态制剂、 大豆多肽及低聚糖等。这些具有原料来源广泛、投资少、发酵周期短、营养丰富、应 用范围广、成本低、收益高等特点，增加畜禽采食量，利于吸收，提高免疫力，节省 饲料，降低养殖成本，增加农民收入，构成可持续发展的新农业，是具有发展潜力和 无限前景的领域。国外生物饲料的研究起步于2 0 世纪8 0 年代，发展于9 0 年代，我 国在这方面的研究已有l o 余年，并且把“生物饲料添加剂的研究开发”课题列入“十 五”国家科技攻关计划1 2 1 。随着养殖业、畜牧业和饲料工业的发展，生物饲料添加剂 越来越备受瞩目，成为研究热门的课题。以发酵工程、基因工程和酶工程等高新技术 为手段，开发新型的饲料资源和生物饲料添加剂是绿色饲料生产的一条新途径。 1 1 2 产品特点及其生理功能 在养殖业中，饲料添加剂用量虽小，但作用却很大。应用饲料添加剂的主要目杯 是提高动物的营养利用水平以及补充足够的营养。前营养素作为饲料添加剂以多种不 同的方式影响健康状况和营养的利用，这些前营养素主要在消化道发挥活性，如：有 机酸能促进消化过程，特别是对单胃动物效果更明显，通过调节p h 值，上消化道中 一些小理想的微生物群可被抑制。甘露寡糖，可以促进有益菌的增殖，还能吸附病原 菌，提高免疫功能，在饲料中添加少量甘露寡糖( ：豆粕3 3 3 ，麸皮5 0 0 ，尿素5 ， 硫铵5 ，k h 2 p 0 48 ，m g s 0 4 7 h 2 00 4 ，p h 5 0 ，在3 0 ( 2 下培养4 0 h ，重复试验测发 酵产物酶活，中性蛋白酶酶活平均可达3 1 3 5u g 干曲，纤维素酶酶活平均可达1 5 4 3 u 倌干曲。在发酵过程中，两株突变菌株未见显著的抑制，可知二者可作为饲用复合 酶的生产菌株。 第三章饲用复合酶酶学性质的研究 3 1 引言 第三章饲用复合酶酶学性质的研究 饲用酶制剂作为一种绿色环保型饲料添加剂己越来越受到关注，但酶制剂提高日 粮养分消化率和畜禽生产性能的作用机制尚未完全清楚，部分酶的作用机制还处于 推测或假说阶段，仍缺乏直接而有力的证据。探明酶制剂的作用机制对饲用酶在饲 料工业中的应用具有重要意义。只有弄清各种酶活是通过何种方式使得畜禽生产性 能和健康状况得以改善，才能针对畜禽品种、日龄阶段及其日粮类型等选择不同的 酶活与添加剂量，达到酶与底物、畜禽之间真正意义上的吻合，从而进一步提高酶 制剂的应用效果i ”】。 饲用酶制剂，它不仅要经受饲料加工过程中的高温处理、经受动物胃肠道胃酸的 影响，而且还要受饲料中的部分金属离子的影响，而在这些过程中，其酶活极易受 损，从而影响其作为饲用酶制剂的特性【3 研。大多数饲用酶在饲料中的应用以干粉的 形式在饲料加工调制和制粒之前添加，然而饲料制粒是一个高温高湿的过程，绝大 多数生物酶热稳定性比较差，在高温制粒的条件下容易失活。各种禽畜都有其特定 的体内生理环境，例如猪和家禽消化道内消化温度为4 0 。c 左右，胃p h 在1 5 3 5 之问， 小肠为p h 5 7 ，大肠p h 为中性，因此必须维持酶在进入动物消化道内仍保持活性， 才能发挥酶的功效。为此，本课题对酶的一些特性作了研究，以便了解酶的最适作 用条件。 3 2 材料与方法 3 2 1 材料 3 2 1 1 菌种 米曲霉m - 4 1 和m - 4 6 2 ，本实验室分离保存。 3 212 培养基与培养条件 同上一章。 3 2 1 3 试剂 同上章。 2 1 江南大学硕士学位论文 3 2 14 主要仪器 同上一章。 3 2 2 实验方法 3 2 2 1 粗酶液的制备 同上一章。 3 2 2 2 缓冲液的制备 ( i ) 不同p h 磷酸缓冲液的制备：按手册( 删配制p h 为5 8 、6 2 、6 8 、7 2 、7 8 1 懒 缓冲液。 ( 2 ) 不同p h 磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液的制备：按手册1 5 6 1 配制p h 为2 2 、3 0 、4 0 、 5 0 、6 0 、7 0 的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液。 3 2 2 3 蛋白酶、纤维素酶测定 同上一章。 3 3 结果与讨论 3 3 1 浸提温度对酶活的影响 用相当十倍物料重的蒸馏水在不同温度下浸泡捣碎后的发酵产物1 h 后，用滤纸 过滤得粗酶液，以4 0 。c 浸提时所测酶活为1 0 0 ，测定相对酶活。由图3 1 可知，对于 蛋白酶，最佳的浸提温度为4 5 c ，酶活显著升高；对于纤维素酶，浸提温度对它的 影响不大，最佳的浸提温度为5 0 。 1 4 0 1 2 0 莲1 0 0 蝗 譬6 0 是4 0 2 0 0 3 0 3 5 4 04 5 5 05 5 镘提温度一 + 蛋白酶+ 纤维素酶 图3 1 浸提温度对酶活的影响 f i g 3 le f f e c to f s o a k i n gt e m p e r a t u r eo ne n z y m ea c t i v i t y 2 2 第三章饲用复合酶酶学性质的研究 3 3 2 浸提时间对酶活的影响 用相当十倍物料重的蒸馏水在4 0 。c 下浸泡捣碎后的发酵产物，于不同时间取出 过滤得粗酶液，进行酶活测定，以6 0 m i n 浸提时所测的酶活为1 0 0 。由图3 2 可知， 蛋白酶浸提1 2 0 m i n 后，酶活力迅速下降到8 0 ，1 5 0 m i n 时己下降到7 0 ，说明浸 提时问越长，蛋白酶失活的就越多。纤维素酶酶活表现的很稳定，1 5 0 m i n 后酶活下 降到8 7 。总之，浸提时间越长，酶失活越多。 述 ! 荽 避 鸳 霉 3 09 01 2 01 5 u 浸提时间r r d n + 蛋白酶+ 纤维素酶 图3 - 2 浸提时间对酶活的影响 f i g 3 - 2e f f e c to f s o a k i n gt e m p e r a t u r eo ne n z y m ea c t i v i t y 3 3 3 底物浓度对酶活的影响 用相当十倍物料重的蒸馏水在4 0 ( 2 下浸泡捣碎后的发酵产物1 h 后取出，过滤得 粗酶液，进行酶活测定。 3 3 3 1 底物浓度对蛋白酶反应速度的影响 配制不同浓度的酪蛋白溶液，将酶液稀释一定倍数，按酶活分析方法进行酶反 应，测定酶反应速度，结果如图3 3 所示。当酶液浓度不变时，底物浓度与酶反应速 度关系曲线是二相现象。当底物浓度低于0 8 时，反应速度基本上与底物浓度呈正 比关系，表现为一级反应；随着底物浓度的增加，曲线表现为零级反应，当底物浓 度超过1 o 时酶已被底物所饱和，反应速度不再增加。 柏0 江南大学硕士学位论文 0 00 20 40 6n 81 o1 21 41 6 底物浓度 图3 3 底物浓度对蛋白酶反应速度的影响 f i g 3 - 3e f f e c to f r e a c t a n tc o n c e n t r a t i o no np r o t e a s er e a c t i o nv e l o c i t y 3 3 3 2 底物浓度对纤维素酶反应速度的影响 配制不同浓度的c m c 溶液，将酶液稀释一定倍数，按酶活分析方法进行酶反应， 测定酶反应速度，结果如图3 4 所示。当底物浓度低于1 o 时，曲线表现为一级反应， 酶反应速度与底物浓度呈正比关系；当底物浓度高于1 2 时，曲线开始表现为零级 反应，酶反应速度趋于一个极限，酶开始被底物所饱和。 o oo 2o 4o 60 81 ol 2l a 底物浓度 图3 - 4 底物浓度对纤维素酶反应速度的影响 f i g 3 4e f f e c to f r e a c t a n tc o n c e n t r a t i o no hc e l l u l a s e sr e a c t i o nv e l o c i t y 3 3 4 最适反应p h 的确定 3 3 4 1 蛋白酶最适反应p h 的确定 本研究中的蛋白酶为中性蛋白酶，故在中性范围内进行反应。用不同p h 的磷酸 缓冲液配制不同的酪蛋白溶液，并按此p h 将酶液稀释一定倍数，按酶活测定方法进 行测定，以p h 7 2 所测的酶活为1 0 0 作对照。由图3 5 可知，在p h 6 2 7 2 之i b j 蛋白酶 姗姗舢撇姗姗瑚。 鲁r上i_嚣-n蜒避黯正糍 斓 嘲 蜘 咖 跏 o 2 2 l l 复卜。印rv蜒嚣避懈桀矗 第三章饲用复合酶酶学性质的研究 失活仅5 ，由此可确定蛋白酶的最佳反应p h 范围为6 2 一7 2 。 1 4 0 1 2 0 1 0 0 莲 楚8 0 避 簧6 0 晕4 0 2 0 0 5 葛 6 2 6 67 o7 4 7 ，g p h 图3 5 蛋白酶的晟适反应p h f j 9 3 5o p t i m u mr e a c t i o np ho f p r o t e a s e 3 34 2 纤维素酶最适反应p n 的确定 用不同p h 的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液配制不同的c m c 溶液，并按此p h 将酶液 稀释一定倍数，按酶活测定方法进行测定，以p h 5 0 所测的酶活为1 0 0 作对照，结果 见图3 6 。由图可知，纤维素酶酶活在p n 为3 0 时出现最高值，纤维素酶酶活随p h 的 升高而降低。中性、碱性环境对纤维素酶不利，p h 为7 0 时，酶活降到2 7 9 。纤维 素酶的最适反应p h 在2 2 5 0 之间。 1 4 0 1 2 0 莲1 0 0 崾舳 霉6 0 幂柏 2 0 o 234567 p h 图3 6 纤维素酶的最适反应p h f i 9 3 - 6o p t i m u mr e a c t i o np ho f c e l l u l a s e s 江南大学硕i 学位论文 3 3 5 酶活的p h 稳定性 3 3 5 1 蛋白酶的p h 稳定性 将粗酶液用不同p h 的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液和磷酸氢二钠一磷酸二氢钠 缓冲液稀释十倍，在4 0 c t 保温l h ，然后将p h 回调到7 2 进行酶活测定，以p h 7 2 所测酶活为l o o 作对照，结果见图3 - 7 。结果表明酸性环境会使蛋白酶失活，p h 为 4 时酶活仅保留1 5 ；在p h 5 o 7 8 酶活基本没有损失，酶活保持在9 5 以1 - ，故 在p h 5 o 7 。8 酶活比较稳定。 1 4 0 1 2 0 l o o 莲 蝗8 0 避 兹6 0 器 4 0 2 0 0 4 5678 p h 图3 - 7p h 对蛋白酶稳定性的影响 f i g 3 7p hs t a b i l i t yo f p r o t e a s e 3 3 5 2 纤维紊酶的p h 稳定性 将粗酶液用不同p h 的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液稀释十倍，在4 06 c 下保温1 h ， 然后将p h 回调到5 0 进行酶活测定，以p h 5 0 所测酶活为l o o 作对照，结果见图 3 8 。从图中可以看出纤维素酶在p h 3 0 7 0 比较稳定，酶活基本没有损失，维持在 8 0 以上。 第三章饲用复合酶酶学性质的研究 1 2 0 l 莲8 0 忸 避6 0 露 霹柏 2 0 0 23 4567 p h 图3 8p h 对纤维素酶稳定性的影响 f i g 3 8p hs t a b i l i t yo f c e l l u a s e s 3 3 6 酶的最适反应温度 将酶液稀释一定倍数于不同温度中反应后进行酶活测定，以酶活最高的为i 0 0 对照，结果如图3 - 9 所示。由图可知，对于蛋白酶，最佳的反应温度范围为4 0 4 5 ，酶活保持在9 6 以上，纤维素酶最佳的反应温度范围在3 5 4 5 c ，酶活保持在 9 7 以上。 莲 烬 避 驾 晕 3 03 5帅，u 温度 c + 蛋白酶+ 纤维素酶 图3 - 9 酶的最适反应温度 f i g 3 - 9o p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r e 3 3 7 最适反应温度的确定及酶的热稳定性 3 3 7 1 蛋白酶的最适反应温度及热稳定性 将粗酶液稀释一定倍数，在3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 c 下保温，于不同时间取出， 进行酶活测定，以未处理的粗酶液的酶活作为1 0 0 ，结果见图3 1 0 。从图中可以得 砷 o 江南大学硕七学位论文 知，3 0 、4 0 。c 时，酶活损失不大，酶活基本维持在8 0 以上；升高至* j 5 0 、6 0 、7 0 。c ， 酶开始严重失活，5 0 。c 时，酶活下降到4 0 以下，6 0 * 2 时，酶活仅剩1 0 左右，7 0 时已测不出酶活。可见此蛋白酶不耐高温，在高温下容易失活。随着保温时间的 增长，酶活都开始略有所下降。蛋白酶在3 0 4 0 。c 下温度稳定性较佳。 莲 蝗 嚣 露 晕 1 53 04 56 0 时问m i n + 3 0 + 4 0 + 5 0 - - x - 6 0 1 2 图3 - 1 0 蛋自酶的温度稳定性 f i g 3 1 0t e m p e r a t u r es t a b i l i t yo f p r o t e a s e 3 3 7 2 纤维素酶的最适反应温度及热稳定性 将粗酶液稀释一定倍数，在3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 c 下保温，于不同时间取 出，进行酶活测定，以未处理的粗酶液的酶活作为1 0 0 ，结果见图3 1 1 。在3 0 、4 0 、 5 0 、6 0 。c 下，纤维素酶酶活保持在8 0 以上。在7 0 、8 0 c 下，酶活降低至u 7 0 左右。 从图中可以看出纤维素酶表现出良好的热稳定性。 莲 烬 避 复 晕 一 一哼 1 53 04 56 0 时间m i n + 3 0 + 4 0 + 5 0 一6 0 卜7 0 + 8 0 图3 - l l 纤维素酶的温度稳定性 f i g 3 1 1t e m p e r a t u r es t a b i l i t yo f c e l l u a s e s 2 8 鲫 0 加 舳 o 第三章饲用复合酶酶学性质的研究 3 4 本章小结 对突变菌株混合固态发酵合成的酶进行酶学性质的研究，得出对于蛋白酶，最 佳的浸提温度为4 5 ，在4 0 下最佳浸提时间为l h ：对于纤维素酶，浸提温度对它 的影响不大，最佳的浸提温度为5 0 ，在4 0 c 下最佳的浸提时间2 h 。当底物浓度低 于1 时，蛋白酶反应速度与底物浓度呈正比关系；当底物浓度为1 o 时蛋白酶己 被底物所饱和，反应速度不再增加。当底物浓度低于1 o 时，纤维素酶反应速度与 底物浓度呈正比关系；当底物浓度高于1 2 时，酶开始被底物所饱和。蛋白酶的最 适反应p h 为6 2 7 2 ，在p h 6 8 7 8 酶活比较稳定，最佳的反应温度范围为4 0 4 5 ，在3 0 4 0 相对酶活可保持在8 0 以上。纤维素酶的最适反应p h 为2 2 5 0 ， 在p h 3 o 6 0 比较稳定，最佳的反应温度范围在3 5 4 5 ，在3 0 6 0 酶活可保持 在8 0 以上。蛋白酶热稳定性较差，纤维素酶有良好的热稳定性，在制粒过程中， 蛋白酶可能会部分失活，纤维素酶能保留在8 0 以上。纤维素酶有较好的温度稳定 性，说明孢子经过热处理后的作用比较明显，提高了纤维素酶的耐热性。 江南大学硕十学位论文 第四章混株固态发酵生产含酶酵母蛋白饲料工艺的研究 4 1 引言 目酶大量资料表明多种菌株混合发酵的结果要好于单一菌株发酵结果。通常将酵 母同丝状真菌混合培养，常用的酵母有面包酵母、酿酒酵母、产朊假丝酵母、热带 假丝酵母等；丝状真菌有米曲霉、黑曲霉、白地霉等。霉菌可利用分解纤维素和淀 粉，而酵母菌主要利用糖源，利用菌种的协同作用提高对底物的利用效率，提高产 品的蛋白质含量和营养功能。这样生产出的蛋白饲料不但有较高的酵母数和粗蛋白， 还含有一定酶活的酶，帮助动物消化，提高饲料的利用率。 本实验室通过热处理及卯c o 诱变处理，筛选到两株突变菌株：产中性蛋白酶较高 的米曲霉m 4 1 和产纤维素酶较高的米曲霉m 4 6 2 。并对其二者混株固态产酶发酵进 行了研究，结果表明二者之间无相互抑制作用，蛋白酶酶活平均可达3 1 3 5u g 干曲， 纤维素酶酶活平均可达1 5 4 3u g 干曲。现采用这两支菌株与同化淀粉、六碳糖能力强 的假丝酵母、卜c t 作为供试菌株，对其三者混株固态发酵生产含酶酵母蛋白饲料的工 艺进行研究。产品中的酵母数量是衡量发酵结果好坏和产品质量的一个重要指标， 在混株发酵过程中不但要注重酵母的数量，还要兼顾酶活的高低。 4 2 材料与方法 4 2 1 材料 4 2 1 1 菌种 假丝酵母y - c t ，米曲霉m - 4 1 和m 4 6 2 ，本实验室分离保存。 4 2 12 培养基与培养条件 米曲霉斜面培养基：同第二章。 麦芽汁琼脂培养基( g ，l ) ：5 0 波美度麦芽汁，琼脂2 0 0 ，自然p n 值。0 1m p a 灭菌 1 5m i n 。3 0 恒温培养2 4 h 。 麦芽汁液体培养基( g i ，) ：5 0 波美度麦芽汁，k h z p 0 41 0 ，( n h 4 ) 2 s 0 41 0 ，酵母膏 1 2 ，自然p h 值。o 1m p a 灭菌1 5m i n 。2 5 0 m 1 三角瓶装2 5 m l ，接x 2 环斜面酵母，3 0 f2 0 0 r m i n 摇瓶培养2 4 h 。 发酵培养基( g l ) ：啤酒糟2 2 2 ，黄酒糟5 5 ，豆粕5 5 ，麸皮2 2 2 ，硫酸铵1 1 ，k h 2 p 0 4 5 ，p h 4 ，o 1m p a 灭菌3 0 m i n 。 3 0 第四章混株崩态发酵生产含酶酵母蛋白饲料t 艺的研究 4 2 1 3 试剂 啤酒糟 黄酒糟 麦芽粉 n a 2 h p 0 4 1 2 h z o m n s 0 4 h 2 0 k c l f e s 0 4 z n s 0 4 1 2 1 4 主要仪器 同第二章。 4 2 2 实验方法 取自某酒厂 取自某酒厂 外购 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a r 上海化学试n - - 厂 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 4 2 2 1 孢子悬液的制备 分别挑取斜面上米曲霉m 4 1 和m 一4 6 2 的孢子于盛有玻璃珠的0 8 5 的生理盐水 中，充分振荡，打散孢子，使孢子浓度为1 1 1 8 x1 0 9 个m l 。 4 2 2 2 粗酶液的制备 同第二章。 4 2 2 3 蛋白酶、纤维素酶测定 同第二章。 4 2 2 4 酵母数测定 取发酵产物0 5 9 ，溶于2 5 0 m l 容量瓶中，定容至刻度，充分振荡，吸取一滴于血 球计数板上测定。 4 3 结果与讨论 4 3 1 混株发酵培养基优化 4 3 1 1 培养基成分确定 啤酒糟富中含大量的粗纤维类物质谷壳，添加到培养基中，可使培养基较疏松， 有良好的通透性，利于酵母的生长。黄酒糟中富含大量的淀粉，是酵母转化为酵母 蛋白的有利成分。现采用这两种酒糟混合作为主要成分，再辅以其它配料作为菌种 江南大学颐十学位论文 的发酵基质。啤酒糟、黄酒糟、豆粕、稻草粉按一定比例添加，辅以麸皮作为发酵 培养基( 以1 0 克计) ，进行试验，结果见表4 1 。 表4 一i 不同培养基成分发酵结果 1 h b l e 4 - lr e s u l t sw i t hd i f i e r e n tc u l t u r em e d i u m 在各种培养基中，结果最好的培养基成分为啤酒糟+ 黄酒糟+ 豆柏+ 麸皮。在培 养基中添加稻草粉并不能诱使菌株合成纤维素酶。从经济角度考虑，豆粕的价格比 较高，所以豆粕的添加量停留在1 0 的水平上。通过改变啤酒糟和黄酒糟的含量来考 察其对酶活及酵母数的影响。考虑到黄酒糟一是为糟渣中较贵的，二是添加量过多 会导致发酵基质粘连，不利于菌体的通氧，所以选择添加量不超过3 0 。 采用b ( 3 4 ) 正交试验表进行实验，啤酒糟、黄酒糟的添加量按因素水平表添加， 豆粕添加量固定在1 0 的水平上，培养基以1 0 9 计，不足的以麸皮补足。因素水平表 4 2 及试验结果见表4 3 。 表4 2 因素水平表 t a b l e 4 - 2f a c t o r sa td i f i e r e n tl e v e l s 因素 水平 啤酒糟( a )黄酒糟，( b ) 第册章混株崩态发酵生产含酶酵母蚩白饲料工艺的研究 由正交表结果及极差分析可知：对于蛋白酶，啤酒糟为主要影响因素；对于纤 维素酶和酵母数，黄酒糟为主要影响因素。所以啤酒糟和黄酒糟比较好的水平组合 为a l b l ，虽然纤维素酶略低于对照组，但蛋白酶和酵母数都高于对照组( 尤其蛋白 酶显著高于对照组) ，综合考虑各指标，与对照组相比，此水平组合也为较好的。故 确定出培养基的成分为啤酒糟4 0 ，黄酒糟1 0 ，豆粕1 0 ，麸皮4 0 。 4 3 1 2 初始料水比对酶活和酵母数的影响 培养基中初始水分的多少对霉菌的生长和酵母的数量都会有不同程度的影响，霉 菌对初始水分的添加量要低于酵母。现以初始料水比为1 ：1 4 ，1 ：1 5 ，1 ：1 6 ，l ：1 8 ， l ：2 五个水平来考察初始水分对酶活及酵母数的影响，结果见图4 1 。 江南大学硕十学位论文 魍 h - 己 霜