（环境工程专业论文）剩余污泥中蛋白质的分离及其性质分析.pdf

摘要 为了深入认识污泥中蛋白质提取过程机理，了解不同的蛋白质提取与分离方 法特点，以及考察分离得到的蛋白质性质，探索污泥中蛋白质资源化方法，本研 究以纪庄子污水厂剩余污泥为研究对象，主要进行了以下工作。 污泥中蛋白质溶出机理的研究。依据污泥中优势细菌结构特点、污泥颗粒性 质以及蛋白质结构特点，采用微生物细胞壁水解原理、污泥吸附脱附机理以及 蛋白质水解理论，建立了关于污泥浓度、温度、酸或碱浓度以及操作时间对提取 蛋白质浓度影响的1 3 参数动力学模型。通过实验，采集了大量的不同条件下的 蛋白质浓度数据。利用非线性优化技术获得了动力学模型参数。最后，利用动力 学模型及其参数，分析了各影响因素对蛋白质浓度的影响规律。结果发现：本研 究建立的蛋白质溶出动力学模型效果良好；适当增加污泥浓度、温度以及酸或碱 浓度有利于污泥中蛋白质的提取，但必须选择最佳操作时间，否则，蛋白质提取 效果可能适得其反。 污泥中蛋白质提取方法、蛋白质结晶工艺探索及蛋白质产品性质分析。主要 考察了盐酸处理方法对污泥中无机物的溶解效果，盐酸或氢氧化钠提取污泥中蛋 白质过程特点和现象，探索了提取液中蛋白质的结晶方法，并对蛋白质产品进行 了紫外( u v ) 光谱分析、蛋白质含量分析、傅立叶红外( f t i r ) 分析以及x 一 射线荧光分析。结果表明：盐酸预处理可以降低污泥中无机物的含量，有利于提 高污泥中有机物含量；碱法存在美德拉反应，而且固液分离困难，提取液质量较 差等问题；高温下盐酸提取法不仅蛋白质提取效果较好，而且有利于固液分离， 提取液黏度小，颜色较好；高温酸法提取液中的金属离子沉淀后，在等电点下加 入2 倍体积的无水乙醇，蛋白质收率可达7 8 5 ，蛋白质含量达1 0 3 8 ，而且 产品中未检出饲料卫生标准( g b l 3 0 7 8 2 0 0 1 ) 所规定的5 种重金属；蛋白质 干燥需在4 0 。c 以下进行，否则，容易变性，溶解性能较差；傅立叶红外( f t i r ) 数据证明，无论碱法还是酸法提取，最终得到的蛋白质主要为q 螺旋结构。 通过对污泥中蛋白质提取机理、蛋白质结晶方法以及蛋白质产品性质的研 究，认为污泥中蛋白质具有作为饲料用途的潜在可能性。本研究可为加热条件下 盐酸或氢氧化钠提取污泥中蛋白质提供动力学模型指导，同时对蛋白质分离提纯 具有良好的参考价值，有利于促进我国剩余污泥中蛋白质的资源化研究。 剩余污泥蛋白质 动力学模型结晶重金属傅立叶红外 x 一射线荧光 a b s t r a c t t os t u d yt h ep r o c e s so fp r o t e i ne x t r a c t i o nf r o me x c e s ss l u d g e ，t h ec h a r a c t e r i s t i c s a m o n gd i f f e r e n tp r o t e i ne x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o nm e t h o d s ，t h ep r o p e r t i e so f i s o l a t e d p r o t e i n s ，a n dp r o t e i nr e s o u r c e sm e t h o d s ，t h ef o l l o w i n gw o r kw a sd o n eb a s e do nt h e e x c e s ss l u d g ef r o mj i z h u a n g z iw a s t e w a t e rp l a n t t h ep r o t e i nd i s s o l u t i o nm e c h a n i s mf r o ms l u d g ew a sr e s e a r c h e d t h ed y n a m i c m o d e l ，w i t ht h i r t e e np a r a m e t e r sa n df o u rf a c t o r si n c l u d i n gs l u d g ec o n c e n t r a t i o n ， t e m p e r a t u r e ，a c i do ra l k a l ic o n c e n t r a t i o na n do p e r a t i n gt i m e ，w a sb u i l tb yu s i n gt h e p r i n c i p l eo f m i c r o b i a lc e l lw a l lh y d r o l y s i s ，s l u d g ea d s o r p t i o n d e s o r p t i o nm e c h a n i s m a n dt h et h e o r yo fp r o t e i nh y d r o l y s i s ，w h i c ht o o kt h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h em a i n b a c t e r i as t r u c t u r a l ，s l u d g ep a r t i c l ea n dp r o t e i ns t r u c t u r ei n t oc o n s i d e r a t i o n ac e r t a i n a m o u n to ft h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o nd a t aw a sc o l l e c t e db y e x p e r i m e n t s t h e p a r a m e t e r so fk i n e t i cm o d e l w e r eo b t a i n e dt h r o u g hn o n l i n e a ro p t i m i z a t i o nt e c h n i q u e s a n dc o u l db eu s e dt o i n v e s t i g a t e t h ee f f e c t so fv a r i o u sf a c t o r so nt h ep r o t e i n c o n c e n t r a t i o n t h er e s u l t sc o n f i r m e dt h ed y n a m i cm o d e la n dc o n c l u d e d t h a t a p p r o p r i a t ei n c r e a s eo fs l u d g ec o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r ea n dc o n c e n t r a t i o no f a c i do r a l k a l ic o u l df a c i l i t a t et h ep r o c e s so f p r o t e i ne x t r a c t i o n t h ep r o t e i ne x t r a c t i o nm e t h o di n s l u d g e ，p r o t e i nc r y s t a l l i z a t i o np r o c e s sa n d p r o t e i np r o d u c t sn a t u r ea n a l y s i sw e r ec a r r i e do u t 。i n o r g a n i cs l u d g ed i s s o l u t i o nb y h y d r o c h l o r i ca c i d ，p r o t e i ne x t r a c t i o np r o c e s sc h a r a c t e r i s t i c sa n dp h e n o m e n au s i n g h y d r o c h l o r i ca c i d o rs o d i u mh y d r o x i d e ，a n dp r o t e i np r o d u c t sa n a l y s i si n c l u d i n g u l t r a v i o l e t ( u v ) s p e c t r o s c o p y , p r o t e i nc o n t e n ta n a l y s i s ，f o u r i e rt r a n s f o r m i n f r a r e d ( f t i r ) a n a l y s i s ，a n dx r a yf l u o r e s c e n c ea n a l y s i s w e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a t ：h y d r o c h l o r i ca c i dp r e t r e a t m e n tc o u l dr e d u c et h ei n o r g a n i cc o n t e n to ft h e s l u d g e ，a n di tc o u l dh e l pi m p r o v e t h eo r g a n i cc o n t e n t a l k a l im e t h o dp o s s e s s e dm a n y p r o b l e m ss u c ha sm a i l l a r dr e a c t i o n ，t h ed i f f i c u l t yo fs o l i d - l i q u i ds e p a r a t i o na n dp o o r q u a l i t yo fe x t r a c t h y d r o c h l o r i ca c i de x t r a c t i o nm e t h o du n d e rh i g ht e m p e r a t u r e c o u l d n o to n l yp r o m o t et h ep r o t e i ne x t r a c t i o n ，b u ta l s ob e n e f i tt h es o l i d - l i q u i ds e p a r a t i o n ， w h e nt h ee x t r a c tv i s c o s i t yw a ss m a l l ，a n dt h ec o l o rc o u l db eb e t t e r a f t e rp r e c i p i t a t i o n o fm e t a li o n sf r o mt h ee x t r a c t e dh y d r o c h l o r i ca c i da th i 【g h - t e m p e r a t u r e ，t w ot i m e s v o l u m eo fe t h a n o lw a sa d d e di n t os o l u t i o na ti s o e l e c t r i cp o i n t t h ep r o t e i ny i e l da n d p r o t e i nc o n t e n tw e r e7 8 5 a n d 10 3 8 r e s p e c t i v e l y , w h i l et h ef i v eh e a v ym e t a l s l i m i t e di n ”f e e dh y g i e n es t a n d a r d s ”( g b13 0 7 8 2 0 011w a sn o td e t e c t e di nt h ep r o d u c t s p r o t e i n sp r o d u c t sn e e dt ob ed r i e du n d e r4 0 。c ，o t h e r w i s ep r o t e i nw o u l db ee a s i l y d e n a t u r e da n di t ss o l u b i l i t yw o u l db ep o o r f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e d ( f t i r ) d a t a p r o v e dt h a tt h eo b t a i n e dp r o t e i nw a sm a i n l y 仪- h e l i c e sw h e t h e ru s i n ga l k a l i n eo ra c i d e x t r a c t i o nm e t h o d t h es l u d g ep r o t e i ns h o w st h ep o t e n t i a lp o s s i b i l i t yt ob eu s e da sf e e db ys t u d y i n g t h em e c h a n i s mo fs l u d g ep r o t e i ne x t r a c t i o n ，p r o t e i nc r y s t a l l i z a t i o nm e t h o d sa n d p r o t e i np r o d u c t sp r o p e r t i e s t h ew o r kc o u l dp r o v i d ek i n e t i cm o d e lg u i d a n c ef o rt h e p r o t e i ne x t r a c t i o n f r o ms l u d g eb yh y d r o c h l o r i ca c i do rs o d i u mh y d r o x i d eu n d e r h e a t i n gc o n d i t i o n sa n dc o u l dh a v ec e r t a i nr e f e r e n c ev a l u ei np r o t e i n ss e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o n ，w h i c hi sa l s oc o n d u c i v et op r o m o t i n gs t u d i e so nt h ep r o t e i nr e s o u r c e f r o mt h ee x c e s ss l u d g ei nc h i n a k e yw o r d s ：e x c e s ss l u d g e ，p r o t e i n ，d y n a m i cm o d e l ，c r y s t a l l i z a t i o n ，h e a v y m e t a l ，f t i r ，x r f 第一章绪论 第一章绪论帚一旱瑁比 1 1 剩余污泥的现状及其处理 随着社会的发展，各地城市化的加大，排水系统的建立和完善已加入到各地 城市规划当中。为了加大污水处理和污水资源化的工作力度，污水处理厂的数量 和规模都有了突飞猛进的发展。截至2 0 1 0 年9 月，我国已建成城镇污水处理厂 2 6 3 0 座，日污水处理能力1 2 2 亿立方米，在建污水处理厂1 8 4 9 座，日污水处理 能力4 9 0 0 万立方米。 然而，高速发展的污水处理产业也带来了一系列的问题，污泥带来的污染问 题尤为严重。目前每处理1 万m 3 污水约产生l o t 含水率8 0 的泥饼，而随着污 水处理量和处理标准的提高，污水处理的副产物污泥的产量将进一步攀升u 】。污 泥中含有大量的有毒有机物，致病微生物，若不加以处理进入环境，将会产生极 大的危害。因此，污泥的处理应受到广泛重视。 传统处理污泥的方法主要有填埋、焚烧、农业土地利用、以及远洋倾倒或深 海抛投处理。这几种处理方法都有其难以改善的局限性：填埋要占用大量土地， 填埋不当或者由于填埋地质条件等因素，将造成沥滤液的渗出而污染地下水层， 影响给水水质。焚烧过程能耗高，要消耗大量能源，运行成本高；同时污泥焚烧 会产生大量废气，若不严格处理也会造成二次污染。剩余污泥中含有比污水中数 量更多的有害物质，污泥中的这些有害物质不仅能残留在土壤中，还能被农作物 吸收，有毒有机物会积累并影响人体健康【2 】。远洋倾倒或深海抛投处理污泥是一 种简便、经济的处理方法，但投海会污染海洋，对海洋生态系统和人类食物链造 成威胁，因此已被国际公约明令禁止【3 1 。在此背景下，探索污泥新的处理方法有 着极为深远的意义。 污泥的处理遵循减量化、无害化、稳定化和资源化的原则。近年来有很多关 于污泥减量的研究，在参与研究的同时，发现污泥减量的过程中产生的一系列产 物可以作为一种再生资源，能够得到应用。这样在减量化的同时，能够达到资源 化的目的。 第一章绪论 1 2 污泥的主要成分 1 2 1 污泥中的微生物 活性污泥是由大量的细菌、霉菌、藻类、原生动物和后生动物等微观生物组 成，组成活性污泥的这些生物之间相互吸附，形成一个个的小颗粒，称为菌胶团。 每一个菌胶团内部的微生物都能通过微生物的代谢反应形成一个食物链，菌胶团 吸附废水中的有机污染物或其它营养成分，然后通过一系列的生物化学反应，将 这些物质转化为c 0 2 和水，同时合成新的微生物细胞，从而使污水得到净化。 通过以上对污水生化处理过程的描述可知，微生物是参与污水净化的功能性物 质，并且通过在污水处理过程中的生命活动得到繁殖。而生命活动的最基本特征 就是蛋白质的存在，因此活性污泥中含有蛋白质成分应该是不容质疑的。微生物 是较低级的生命物质，不像其它高级生命那样必须具备各种完善的生命功能，微 生物的生命活动，实质上就体现在蛋白质的合成与分解上。微生物个体中的蛋白 质含量，与其它生命物质相比要高得多，据有关资料介绍，一般微生物中的蛋白 质含量可达到5 0 - 6 0 l 引。 1 2 2 胞外聚合物 剩余污泥胞外也含有大量的蛋白质。活性污泥的细菌大多包埋在胶质中，以 菌胶团的形式存在。胶质是菌胶团生成菌分泌的蛋白质、多糖及核酸等胞外聚合 物( e p s ) 。胞外聚合物( e p s ) 是带负电荷、高含水的凝胶状基质，能较长时间 地固存微生物，利于形成稳定的微生物菌落，相对分子质量处于几千到几百万范 围内。e p s 是生物絮体的主要组成部分，其成分与微生物细胞内的成分类似，它 主要是一些高分子物质如多糖、蛋白质、核苷酸等聚合物。这些聚合物可以产生 粘性力，形成带负电的凝聚体，将微生物包在里面。m o n i q u e 掣5 j 和p a r k 等1 6 j 的研究结果表明胞外蛋白质含量至少为1 6 0 m g g 挥发性固体。 由以上可知微生物的胞内和胞外都含有大量的蛋白质。污泥活性絮状体的存 在使胞内蛋白质处于e p s 和细胞体的双重保护之下【7 】；而e p s 具有比细菌更大 的表面积，带有负电荷，具有巨大的吸附能力，污泥e p s 中带负电荷的配合基 ( 如多聚糖、蛋白质等的羧基官能团) 与重金属间相互作用而逐渐吸附重金属离 子【8 1 。因此，要将剩余污泥中的蛋白提取出来，需要对污泥进行预处理。肖本益 等嘲研究认为预处理之后，蛋白质、碳水化合物和挥发性脂肪酸占s c o d ( 溶解 性化学需氧量) 的8 0 一9 0 。并且通过碱处理，污泥的溶解蛋白质最多，达 2 0 5 8 6 m g l 。此外，蛋白质产品还是很多行业的重要原料，因此，具有非常好的 第一章绪论 市场前景。 1 3 污泥中提取蛋白质的方法 目前文献己报道一些污泥中蛋白质的提取方法。为了充分提出污泥中的蛋白 质，往往需要对污泥进行溶胞处理。通常的溶胞方法包括各种物理( 高压喷射法 【1 0 】、热解法【1 1 、超声破碎法【1 2 1 等) 、化学( 碱法、酸法【9 1 以及臭氧处型1 3 1 等) 、 生物等方法。 1 3 1 物理法 物理溶胞主要是利用机械剪切力破坏细菌的细胞壁，实现污泥细胞的溶解。 1 3 1 1 高压喷射法 高压喷射法是利用高压泵将污泥循环喷射到一个固定的碰撞盘上，通过该过 程产生的机械力来破坏污泥内微生物细胞的结构，使得胞内物质被释放出来，从 而显著提高污泥中蛋白质的含量，促进水解的进行。n a h 掣1 5 】通过试验发现，经 过高压喷射法预处理污泥的s c o d ，s t o c ( 溶解性总有机碳) 和蛋白质浓度能 由处理前的1 0 0 2 1 0 m g l ，8 0 1 3 0 m g l 和6 3 8 5 m g l 分别升高至7 6 0 9 4 7 m g l ， 5 6 0 9 2 0 m g l 和12 0 210 m g l 。 然而，高压喷射法处理污泥过程的机械能损失较大，当所用设备的能耗为 1 8 x10 4 k j k g s s 时细胞裂解程度仅为2 5 ，所以该方法在实际的工程应用中难以 推广【】6 1 。 1 3 1 2 超声波法 超声波是指频率从2 0 k h z 到1 0 m h z 这个波段范围内的声波。超声波法是将 生物化学领域用以破碎细胞的超声波技术应用到污泥的预处理上来，破坏微生物 细胞的细胞壁，使得细胞内的有机质释放出来，从而促进污泥水解和消化的进行。 不同波段的超声波在污泥中可以产生不同的作用。超声波在低频范围内 ( 2 0 k h z 1 0 0 k h z ) 尤其适合处理污泥。低频作用下的污泥不断被压缩和膨胀， 内部可产生共振空化气泡，随着超声波作用时间的增长，在微观环境里空化气泡 渐渐长大。当长到一定极限时，最终共振“内爆”，内部产生超高温( 5 0 0 0 ) 、 高压( 5 0 0 b a r ) ，同时污泥絮体结构与污泥中微生物细胞壁被产生的强力水喷射 流形成巨大的水力剪切力所破坏【1 7 】。并且有文献证实这种水力剪切力在频率 1 0 0 k h z 以下最为有划1 8 】。p e t r i e r 掣1 9 】通过试验证明4 1 k h z 超声波对污泥的分解 第一章绪论 效果最好。 吴臣军等【2 0 】发现在低声能密度下，超声波处理污泥4 5 m i n 可以使s c o d 溶 出率超过1 0 。有研究表明，超声波对污泥脱氮具有较好的效果。王晓霞等【2 l 】 通过实验证实超声波处理和热处理( 除热处理温度为5 0 外) 后，污泥上清液 中的t n 均以有机氮为主，n h l - n 次之。 超声波技术具有无污染、能量密度高、分解速度快等特点，与其他方法相比， 具有在短时间内有迅速释放细胞内物质的优势。但在促进细胞破碎后固体碎屑的 水解却不如添加碱和加热方法，同时，超声波的作用受到液体的许多参数( 温度、 粘度、表面张力等) 和超声波发生设备的影响，在短时间内还难以投入大规模的 工程化应用【2 2 1 。此外，超声波的输入能量较高，关于声能密度对污泥破解效果影 响的报道大多集中在0 2 w l 以上，甚至有的达到1 w l 以上，这在实际工程中 会使得超声波发生装置的功率大的惊人，所需能耗很大，同时高功率的超声波发 生器价格也十分高昂，这是这一技术不能迅速推广的主要原因【2 0 】。 1 3 1 3 热解法 水解预处理的温度范围一般从4 0 1 8 0 c ，是一种高效的污泥预处理技术。污 泥的固体有机物在热水解过程中经历溶解和水解2 个过程：首先是微生物絮体的 离散和解体，细胞内的有机物质被释放出来不断溶解。其次是溶解性有机物不断 水解：脂肪水解成甘油和脂肪酸；碳水化合物水解成小分子的多糖和单糖；蛋白 质水解成多肽、二肽和氨基酸；氨基酸进一步水解成低分子有机酸、氨及二氧化 碳【2 3 】。王治军等口4 1 研究了热水解预处理对剩余污泥性质的影响，研究结果发现 在2 1 0 。c 、7 5 m i n 的热水解条件下，挥发性悬浮固体( v s s ) 和蛋白质的溶解率 分别达到6 0 0 2 和4 7 21 。 与超声、机械破碎和化学预处理等手段相比，热水解在实现细胞破碎、释放 胞内有机物的同时将大分子有机物水解【2 5 1 ，是一种很好的污泥处理方法。 微波处理污泥是热处理技术的一个延伸，微波加热由于内外一体加热，可以 实现系统快速升温，而被广泛应用在热处理相关领域，这弥补了污泥热水解工艺 存在热效率低、停留时间长的缺点。l i a o 等【2 6 j 发现在微波处理过程中加入n 2 0 2 能较大幅度地提高污泥预处理效果。 1 3 2 化学法 1 3 2 1 碱处理 加碱处理法就是在常温条件下，通过加碱( n a o h 、k o h 或c a ( o h ) 2 ) 来促 进污泥中一些纤维成分溶解的方法。碱的作用是在抑制细胞活性的同时，溶解细 4 第一章绪论 胞壁，释放细胞内物质，这包括蛋白等有机物。目前有很多关于加碱处理污泥提 取蛋白的研究。 l e r c h 等【2 7 】分别采用水、曲拉通x 1 0 0 以及l m o l l 的氢氧化钠溶液从干污 泥中进行了蛋白质的提取研究，发现污泥中蛋白质更容易被碱性物质所提取出 来。c h i s h t i 等【2 8 】在19 9 2 年对氢氧化钠和氯化钠单独或联合使用时对污泥蛋白质 的溶解情况进行了研究。l a u 2 9 】对几种类型污泥进行了蛋白质提取研究工作。碱 法处理由于其对污泥的溶胞效率高，因此，研究较多。但单纯采用碱进行溶胞处 理时速率相对较慢，因此，为了提高污泥碱溶胞的速率人们往往采用碱与热的联 合作用进行污泥溶胞处理。 1 3 2 2 酸处理 用酸处理污泥，使其水解，使不易分解的物质转化为较易分解的物质。由于 污泥微生物的胞外聚合物中含有一些两性物质，这些两性物质在酸性条件下会溶 解，转化为溶解性物质，从而对污泥的絮体结构有一定破坏作用，从而达到溶胞 的效果9 1 。 陈玉辉等【3 0 】采用酸循环水解制备剩余污泥中的蛋白质，在1 2 1 下经单次酸 水解所得蛋白的浓度为4 5 4 4 2 9 l ，而采用酸循环水解工艺水解蛋白浓度可达 7 5 3 7 9 9 l 。赵顺顺等【3 i j 也采用酸水解法提取蛋白，通过试验获得的提取污泥蛋 白质的最优工艺条件是水解温度为1 2 1 ，水解时间为5 h ，反应体系p h 为1 2 5 ， 固液比为1 ：3 0 。并且在上述条件下，剩余污泥蛋白质提取率可达6 2 7 l 。以上 两者都是采用了化学法与热处理法相结合的处理工艺。 1 3 2 3 臭氧处理 臭氧氧化污泥的过程包括：对微生物的破壁、溶解和对有机物的矿化三个阶 段。臭氧首先作用于污泥细胞的细胞壁和细胞膜，促使细胞死亡溶解；细胞溶解 后胞内的物质( 如蛋白质、核酸和多糖等) 被释放出来；臭氧进一步氧化大分子 有机物质，使其变为小分子物质或者直接转变为二氧化碳和水 3 2 , 3 3 。这对污泥减 量来说，是一种比较不错的方法，但不适于蛋白质的提取。 1 3 3 生物法 生物酶技术是指向污泥中投加能够分泌胞外酶的细菌，或直接投加溶菌酶等 酶制剂( 抗菌素) 水解细菌的细胞壁，以此达到溶胞的目的。但是，同时这些细 菌或酶还可以将不易生物降解的大分子有机物分解为小分子物质，随着溶菌酶量 的增加，污泥中蛋白质和多糖浓度随之降低，这与本实验提取蛋白质的宗旨是相 第一章绪论 违背的。 此外，还有人进行了多种方法联合的方式进行污泥溶胞提取蛋白质，包括上 面所提到的热酸法和热碱法，以及肖本益的微波+ 过氧化氢法。m o n i q u e 掣5 】采 用超声波，e d t a 和吐温联合的方式从剩余污泥中提取蛋白，发现此种方法可以 取得1 9 1 2 6 4 m g ( e q u i v b s a ) g ( v s s ) 。由此可见多种方法联合也是一种不错的提取 蛋白的方法。 1 4 蛋白质的分离方法 污泥溶胞液是多糖，蛋白质和脂肪等有机物以及重金属等多种物质组成的混 合溶液，将目标蛋白质从其中分离纯化出来，才是我们的终极目标。将蛋白质从 混合溶液中分离纯化出来，主要是依据蛋白质本身的性质来实现的。 蛋白质分子中的主要化学键是氨基酸中的羧基和氨基形成的酰胺基。蛋白质 分子同时拥有疏水基和亲水基两种基团。蛋白质分子中，极性基团分布在分子的 表面，而大部分非极性基团被包埋在分子的内部。极性基团容易与水分子作用， 而非极性基团则有助于将分子聚集在一起，使蛋白质分子表现出表面活性【3 4 】。 蛋白质的分离和纯化主要是通过溶胞液的浓缩和浓缩液的结晶来实现的。传 统浓缩法主要有减压蒸馏法和泡沫法分离蛋白质。近年来随着膜工业的发展，膜 法也开始渐渐兴起。蛋白质结晶方法主要有沉淀法，传统沉淀法包括盐析沉淀法， 有机沉淀分离法，等电点分离法等。 1 4 1 蛋白质浓缩方法 1 4 1 1 减压蒸馏法 沸点是液体饱和蒸气压等于外压时的温度。因此，液体的沸点是根据外压的 改变而改变的，当外界的压力变小时，沸点便会降低。这便是减压蒸馏的依据原 理，借助真空泵来降低系统内的压力，这便可以在低温下对溶液进行蒸发浓缩。 它特别适用于那些在常压蒸馏时未达沸点即己受热分解、氧化或聚合的物质。 在分离可提纯的有机物时，很多研究人员应用的此法。孙墨珑等【3 5 采用超声 波辅助浸提和减压蒸馏法提取核桃楸树皮中的胡桃醌。曹庆荣等【3 6 】采用多段精密 减压精馏法得到了符合异构化要求纯度的乙烯基降冰片烯，并确定了最适宜的工 艺条件。 蛋白产品在高温下容易变性，因此在污泥提取蛋白的工艺中，首先考虑到温 度等对其变性产生的影响。常温蒸馏要求的温度较高，可能会对蛋白产生影响， 而减压蒸馏可以解决这方面问题。同时，减压蒸馏产生的能耗较低，是一种较好 第一章绪论 的浓缩方法。 1 4 1 2 泡沫法浓缩 泡沫分离蛋白质是利用蛋白质的表面活性对其进行分离的一种方法，分离过 程中的条件温和，对蛋白质的活性影响较小，是一种成本较小、有着很好应用前 景的分离方法。国内有很多关于泡沫法分离蛋白的研究，谢继宏【3 刀用泡沫精馏塔 来分离大豆蛋白质溶液中的蛋白，王立新等【3 8 】采用此种方法分离明胶。在王学创 1 3 4 的实验中，我们发现泡沫分离对于蛋白质来说，是一种有效的、成本较低的( 主 要能耗为循环泵与空压机) 、容易实现的一种分离方法，而且对蛋白质的生物活 性没有明显的影响。在某些特定条件下可以得到较高的回收率，说明用泡沫分离 的方法可以纯化蛋白质。 泡沫分离法的主要优势在于它的低能耗，并且在它的操作过程中，不需要投 加任何试剂，这就保证了蛋白质的洁净。同时，该操作是在室温条件下进行，操 作条件较为温和，分离的蛋白质不会发生变性。该法也有一定的缺陷，因为该法 是基于蛋白质与其他组分的表面活性的差异进行分离，因此当溶液中含有组分活 性相近的物质时，分离效果较差。另外，分离过程中，表面富集会有一个上限， 对于较高浓度的溶液，溶液主体浓度高于上限，分离效率便会降低，分离效果较 差。 1 4 1 3 膜浓缩法 天然的或人工合成的膜，以外界能量或化学位差作为推动力，对双组分或多 组分溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和富集的方法，统称为膜分离法。微滤、 超滤、反渗透和电除盐是目前水处理领域中最为常用的四种膜分离技术【3 9 】。 蛋白质的尺寸范围约为5 1 0 n m ，分子量可高达几十万以上，属大分子物质， 故可应用主要截留高分子溶质或固体颗粒的超滤膜将大分子的蛋白质的溶液进 行浓缩纯化。膜的孔径大小决定能透过膜的分子大小，分子量在某一界限( 膜截 留分子量) 以上的分子会被截留，而分子量小的分子与水溶剂一起透过膜，从而 将大于某一相对分子量和小于某一相对分子量的蛋白质分开，达到了分级目的。 若要浓缩一种蛋白质溶液，可以选用微孑l q ：l 径小于溶液中最小蛋白质分子的膜， 能使需要的蛋白质全部截住，而让溶剂分子和其余不需要的无机盐类等透出，这 样使蛋白质溶液得到了浓缩。 徐林【4 0 】通过实验证明机械过滤一微滤一反渗透集成膜技术用于活性污泥水 解蛋白液的处理是可行的。m o f 5 0 3 微滤膜能够有效截留排污水中的悬浮物和固 体颗粒等。水解蛋白液经过机械过滤处理后进入微滤膜组件，微滤膜的进料浊度 第一章绪论 远大于3 0 n t u ，而微滤膜的透过液浊度一直保持在0 2 n t u 以下，s d i 小于3 。 微滤处理后的蛋白液能满足反渗透膜的进料要求，反渗透膜u l p l 812 7 5 对蛋白 截留率在9 9 9 以上，透过液蛋白浓度低于0 0 0 6 。 1 4 2 蛋白质结晶方法 1 4 2 1 盐析沉淀法 盐析沉淀是蛋白质提纯工艺中最早采用，而且至今仍为广泛应用的方法。其 原理是在高浓度蛋白溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，蛋白质水化膜被破坏，其 溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可以利用不同 浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。盐析沉淀中常用的盐为硫酸铵和硫酸钠。 硫酸铵有腐蚀性，水解后使溶液的p h 值降低：并且在高p h 易下释放氨，而生 成的硫酸氨临床医疗有毒性。因此为使生成的蛋白产品具有广泛的用途，应避免 使用此种方法【4 l 】。 傅翠娥等【4 2 】采用5 0 的硫酸铵沉淀弓形虫粗抗原，获得了高特异性蛋白， 研究表明此法操作简便，蛋白损失较少。并且适当增加离心速度，可以去除杂蛋 白，提高抗原质量。 1 4 2 2 有机沉淀法 有机沉淀剂法是向蛋白质溶液中加入类似乙醇、丙酮等水溶性有机溶剂，降 低水的活度，随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基 团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而 使蛋白质凝聚和沉淀。 有机沉淀剂分离法的选择性较高，沉淀后所得产品不需脱盐，残留的沉淀剂 通过挥发即可除去。而有机沉淀剂对具有生物活性的蛋白质、酶类具有失活作用， 因而常需在低温下进行操作。而且此法中有机溶剂的溶解度很低，对温度、p h 值等环境条件下变化很敏感。因此使蛋白质的分离工作有很大的困难。 1 4 2 3 等电点法 等电点沉淀法是通过调节溶液的p h 值，削弱或破坏分子表面的双电层及水 化膜，分子间引力增加，使两性电解质的溶解度下降而沉淀析出。蛋白质是多价 的两性电解质，通常在偏酸性溶液中带正电，在偏碱性溶液中带负电。一般蛋白 质的等电点多在偏酸性范围内，故在等电点沉淀操作中，大多通过加入无机酸如 盐酸、磷酸和硫酸等调节p h 值。 石彦国等【4 3 】采用等电点冷沉法分离，以l m o l l 的h c i 调节蛋白质浸出液的 第一章绪论 p h 值。当搅拌速度为3 0 r m i n 时，将p h 值凋至6 2 ，然后在4 下冷沉1 0 h ， 2 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，此时取得的蛋白质量最大。该实验分离1 1 s 球蛋白的纯 度达7 6 1 4 ，得率4 0 8 。p h = 6 2 就是该大豆1 1 s 球蛋白的等电点。 在赵顺顺等m j 的实验中，对剩余污泥溶胞液进行处理，发现在p h 值为5 5 时，溶液中蛋白质的浓度最低，此p h 值为污泥蛋白的等电点。在该点下j 蛋白 的沉淀率为7 2 3 8 。由上看出，溶胞液中的蛋白质并未全部沉淀析出，这可能 是因为溶胞液中含有多种蛋白质，其中大多数种类的等电点在p h = 5 5 左右，在 此p h 值下可从溶液中析出并沉淀，析出率大于7 0 ；而少数几种蛋白质的等电 点并不是在p h = 5 5 附近，致使近3 0 的蛋白质无法沉淀，仍然存在于上清液中。 1 5 污泥蛋白质的应用前景 从污泥中提取出来的蛋白质，只有作为一种产品被人们广泛应用才能体现出 它的资源化。有很多人对该蛋白质的用途进行了研究。这主要集中在蛋白质的饲 料用途和泡沫灭火器用途。 1 5 1 蛋白质的饲料用途 生物蛋白质经过提取后，可作为动物饲料的添加剂，是价值较高的可利用资 源【4 5 1 。但需注意所制备的蛋白质产品作为饲料添加剂的安全性。c l e v e n g e r 4 6 】研 究发现，污泥中7 0 的粗蛋白质以氨基酸形式存在，各氨基酸之间相对平衡。赵 顺顺等【4 4 】则通过实验发现污泥提取蛋白质纯度较高，可检测到7 种必需氨基酸( 色 氨酸测定时被破坏) 和8 种非必需氨基酸，且含量很高：沉淀物中重金属含量非 常少，符合g b1 3 0 7 8 2 0 0 1 和n y 9 2 9 2 0 0 5 标准中的相关规定。从营养性和安全性 两方面考虑，污水处理厂剩余污泥蛋白质提取分离后作为动物饲料添加剂可行。 1 5 2 蛋白质的泡沫灭火器用途 李亚东等【4 7 】就水解剩余活性污泥并提取其水解蛋白质用于制备蛋白质泡沫 灭火剂这一课题进行了研究，并申请了相关的发明专利。 关于灭火剂，目前国内石油、化工、油库、飞机场等场所的灭火主要是用 n a h c o ，和n a c i 干粉灭火剂、植物蛋白灭火剂。而曾经所用动物蛋白灭火剂的 蛋白质是用动物毛发、碲、角等物用碱、盐酸水解而成。在水解过程中对环境污 染较重，且在灭火过程中会产生大量毛发烧焦味和难闻的臭味。由于对环境、空 气的污染，此产品即将被禁用。对于植物蛋白质由于国内饲料蛋白源馈乏，导致 价格较高，即使用于生产蛋白质灭火剂，消防部门也难以接受。到目前为止，此 第一章绪论 种污泥中提取的蛋白质作为灭火剂是唯一可以被生物降解的纯天然环保型泡沫 灭火剂。事实上，现在国内外还没有一种合成泡沫灭火剂可以被生物10 0 降解。 但就实际应用市场来说，市场对于灭火器的需求量远远小于对饲料的需求， 单靠制造灭火器远不能够解决污水处理厂产生的大量剩余污泥。因此，污泥蛋白 的用途应把重点放在动物饲料或化工原料方面。 1 6 研究内容和主要目的 本课题主要是以剩余污泥的资源化为目标，从污泥中提取出蛋白质产品。这 既解决了剩余污泥的无害化处理问题，同时又实现了污泥蛋白质的资源化问题， 该研究对于我国产量巨大的城市污泥问题具有良好的指导作用。 本文采用热碱法和热酸法从污泥中提取蛋白质，以此建立蛋白质提取过程动 力学数学模型，并得到较佳实验条件，并在较佳实验条件下，通过一定的工艺， 产生蛋白产品。目前关于从剩余污泥中提取蛋白质的研究很多，不少人也对于实 验条件进行了正交实验，确定相对较优的实验方案，但由于酸或碱提取污泥中蛋 白质过程的复杂性，目前还未有有关过程动力学模型的公开报道。所以建立污泥 中提取蛋白质的模型尤为重要。同时，通过设计工艺流程提取、析出蛋白质产品， 并分析蛋白质产品的性状，可以为蛋白质的用途做很好的指导作用。 基于研究背景，展开了以下几方面的研究： ( 1 ) 蛋白质生成动力学数学模型研究。依据反应条件下的圃液反应理论、 蛋白质水解动力学、以及污泥颗粒对蛋白质的吸附脱附原理，建立剩余污泥中 蛋白质的溶出过程数学模型；分别采用试管实验测定加热和盐酸法以及加热和氢 氧化钠碱法处理剩余污泥时不同条件( 如温度、污泥浓度、酸或碱浓度以及时间) 下的蛋白质浓度数据，利用动力学模型，采用m a t l a b 软件的非线性优化技术得 到模型参数，并分析模型参数效果以及各参数对蛋白质浓度的影响规律。 ( 2 ) 蛋白质提取工艺探索。采用盐酸法或氢氧化钠碱法在一定温度下提取 污泥中蛋白质，随后对提取液进行离心分离，上清液采用结晶技术获取蛋白质固 体，烘干后以各性质分析。 ( 3 ) 蛋白质产品性质分析。主要包括u v 光谱分析、蛋白质含量的f o l i n 酚法测定、金属的x 射线粉荧光分析、傅立叶变换红外分析等。为了解不同工 艺方法得到的固体产品性质提供理论依据，以指导污泥中蛋白质提取与分离工艺 的改进和优化。 l o 第二章实验内容与方法 2 1 实验材料与仪器 2 1 1 实验材料 第二章实验内容与方法 本论文所有实验污泥均为天津市纪庄子城市污水剩余污泥，实验前进行重力 浓缩、絮凝和脱水处理，脱水后污泥( 本研究中称为脱水污泥) 平均含水率为 8 1 6 7 ，凯氏定氮方法测得的干污泥中粗蛋白质质量平均含量为4 2 4 1 。氢氧 化钠( 分析纯) ，浓盐酸( 分析纯) ，无水乙醇，蒸馏水，牛血清白蛋白( b s a ) ， f o l i n 酚试剂盒( 鼎国生物科技) 。 2 1 2 实验仪器 实验仪器及主要性能参数如表2 1 所示： 仪器名称主要性能参数 e m s 3 0 恒温水浴 温度：温度环境1 0 0 湘仪h 1 6 5 0 离心机 离心容量6 x 5 0 m l ，最大转速1 4 0 0 0 r p m 离心机离心容量1 2 x 2 5 m l ，最大转速4 0 0 0 r p m 真空泵 真空抽滤装置 m e t t l e r a b l 0 4 一s 电子天平精确度1 1 0 0 0 0 ，最大称重1l o g 日本d 5 l 精密p h 计 测量范围：0 1 4 0 0 马弗炉最高温度1 2 0 0 ，最大功率2 5 k w d g g 1 0 1 0 型电热鼓风干燥箱 温度范围：室温1 0 3 0 0 ，最大功率l k w u v 7 6 5 紫外可见分光光度计波长范围：2 0 0 1 1 0 0 r i m 凯氏定氮装置 减压蒸馏装置 0 1 j 2 0 0 3 0 4 型立式压力蒸汽灭菌筒设定温度1 2 1 2 2 实验内容与方法 2 2 1 热碱法提取蛋白正交实验 碱对污泥的处理主要是通过与生物菌体细胞膜的化学反应，释放出胞内的有 机物。王雅丽【4 8 】主要以c o d 和b o d 为指标来评价污泥溶胞的效果，而在郭幸 第二章实验