（发酵工程专业论文）微孢根霉华根霉变种cicim+f0088生淀粉酶系的研究.pdf

1 j a a a m p a t p s b l a s t b p c d n a g a i p t g l t s k b l a k m l b n c b i o d 6 0 0 o r f p d a r t p c r s b d s m l f s s f x g a l 缩略词表 0 【。a i n y l a s e a m p i c i l l i n a q u e o u st w o - p h a s es y s t e m b a s i cl o c a la l i g 脚e ms e a r c ht o o l b a s e p a i r c o m p l e m e n t a d ，d n a g l u c o a m y l a s e i s o p r o x y l - p d 一i h o g a l a c t o p y a n o s i d e i n t e m a lt r a i l s c 抽e ds p a c e r k i l ob a s e k i l od a l t o n k a n a m y c i n l u r i a b e n a l l im e d i u m n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o m a t i o n o p t i c a ld e n s i t ) ，a t6 0 0 砌 o p e nr e a d i n gf r 锄e p o t a t od e x t r o s ea g a rm e d i 啪 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r s t a i c hb i n d i n gd o m a i n s u b m e r g e df e 咖e n t a t i o n s o l i ds t a t ef e m e n t a t i o n 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 3 - i n d o l y l p d g a l a c t o s i d e 0 【淀粉酶 氨苄青霉素 双水相 基本局部联配搜索工具 碱基对 互补d n a 葡萄糖淀粉酶 异丙基b d 硫代半乳糖苷 内部转录间隔区 千碱基对 千道尔顿 卡那霉素 l u r i a b e n a n i 培养基 国家生物信息中心 6 0 0 嘲波长下的光密度 开放阅读框 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 反转录聚合酶链式反应 淀粉结合区域 液态发酵 固态发酵 5 - 溴4 - 氯- 3 吲哚一d - d - 半乳糖苷 摘要 摘要 本研究从各类样品中分离得到3 6 5 株具有淀粉水解能力的丝状真菌并保藏于江南大 学中国高校工业微生物资源与信息中心，建立了一个丝状真菌资源库。从该资源库中筛 选出一株具有较强生淀粉水解能力的混合淀粉酶系产生菌株c i c i mf 0 0 8 8 。结合形态学 观察以及i t s 序列同源性分析，确认该菌株为微孢根霉的华根霉变种( r 办拓印姗 m f 盯。印。厂材sv a r 幽f 刀p 瑚括) 。研究发现c i c i mf 0 0 8 8 菌株在固态和液态发酵时所产生的淀 粉酶量和淀粉酶系的组成均存在差异。 本文首次对尺办拓印淞垅f 仃d 印d ，淞v a r 如f 聆p 珊括在固态和液态两种发酵方式下所产 生的淀粉酶系进行系统的研究和比较。经过硫酸铵沉淀、双水相分离、离子交换层析、 制备电泳和凝胶过滤层析等五种纯化方法，从c i c i mf 0 0 8 8 菌株的固态发酵产物中分离 得到三个电泳纯的酶蛋白g a a ，g a b 和a a ，酶蛋白的分子量依次为5 3 、5 2 和5 5l a ； 采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和制备电泳等三种纯化方法，从液态发酵产物中分离得 到两个电泳纯的酶蛋白g a c 和g a d ，酶蛋白分子量分别为5 3 和5 2l ( d a 。 对从c i c i mf 0 0 8 8 菌株分离纯化得到的5 个淀粉酶的酶学性质进行了研究，发现 固态发酵时产生的葡萄糖淀粉酶g aa 和g ab 的温度耐受范围、p h 耐受范围以及生 淀粉水解能力均优于液态发酵产生的g ac 和g ad ；上述四个葡萄糖淀粉酶都具有一 定的生淀粉水解能力，而固态发酵时产生的a 淀粉酶a a 不具有该能力。 结合r 厅拓印淞属来源的葡萄糖淀粉酶氨基酸保守序列及尺办忍印郴聊伽印d ，姗密码 子偏好性等信息设计简并引物，利用p c r 技术扩增得到c i c i mf 0 0 8 8 菌株葡萄糖淀粉 酶编码基因的部分d n a 序列，再通过反向p c r 获得己知序列的侧翼序列，最终获得完 整的编码基因“e 。以此为基础，通过i m p c r 的方法扩增出了该基因完整的c d n a 序 列。通过比较咖e 基因的d n a 和c d n a 序列发现，幽厄基因全长2 7 6 3b p ，内部存在 四个内含子；该基因的c d n a 全长1 8 1 8b p ，其中信号肽编码区8 lb p ，成熟肽编码区共 编码5 7 9 个氨基酸残基。将成熟肽的氨基酸序列与g e n b a l l l ( 中其他微生物来源的葡萄糖 淀粉酶一级结构进行同源性比对分析发现，该酶与所有已知葡萄糖淀粉酶的最高同源性 为8 0 ，是一种新的葡萄糖淀粉酶。 将葡萄糖淀粉酶基因“e 的c d n a 序列连入p e t 2 8 “+ ) 表达载体，构建了重组质 粒p e t - 2 8 a - g ，征，在西f 办p ，砌砌，f b l 2 1 ( d e 3 ) 中成功实现了异源活性表达。利用h i s 砌g 亲和层析分离纯化了表达后的重组酶蛋白g ae ，对重组酶的酶学性质进行了研究，发 现其具有水解生淀粉的能力。 关键词：微孢根霉的华根霉变种，生淀粉酶，a 淀粉酶，葡萄糖淀粉酶，分离纯化， 固态和液态发酵，混合酶系，基因克隆 a b s t r a c t a b s t r a c t a 1 1 e w l yi s o l a t e da c t i v ep r o d u c e ro fr a w s t a r c h d i g e s t i n ga m y l o ”i ce m 可m e s ，c i c i m f 0 0 8 8 ，w a si s o l a t e df 硒mm es t r a i l l sl i b r a 巧i n c l u d i n g3 6 5f h g i a b l et od i g e s ts t a r c h ，a i l dw a s i d e n t m e db ym o 印h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dm o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ca i l a j y s e s t 1 1 i s 如n g u s w a sk e p ti nt l l ec u l t u r ea i l di n f o 唧a t i o nc e m e ro fi n d u s t r i a lm i c r o o r g a i l i s mo fc h i n a u i l i v e r s i 哆( h t t p ：c i c i m c u j i a i l g i l 锄e d u c n ) a tj i a l l g n a j lu i l i v e r s 时船只办级矽淞朋f c r d 印d ，螂 v a r 砌f 玎p ，z s 括c i c i mf 0 0 8 8 t h e 锄o u n to fe n 2 = ) ，m e sp r o d u c t i o na l l dt h e i rc o m p o s i t i o n sw e r e d i 丘e r e n tb e t 、e e ns o l i d s t a t ef e n n e n t a t i o n ( s s f ) a n ds u b m e r g e df e m e n t a t i o n ( s m f ) f o rt h ef i r s tt i l l l e ，c o m p a r a t i v er e s e a r c ho f 锄y l o ”i ce m m e sp r o d u c e di ns s fa n ds m f 、) ，a sc a 币e do u ti n 缸l g u sr 砒：印螂历f c 阳印d ，姗t w o9 1 u c a o m y l a s e sn 锄e da sg aa a n dg a b ，a n do n e0 【锄y l a s en 锄e da sa a 仃o ms s fw e r ep u r i f i e d t oh o m o g e n e i t ) rt h r o u g h a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ，a q u e o u s似o p h a s es y s t e m s ，t o y o p e 砌 d e a e 一6 5 0 m c h r o m a t o g r 印h y ，p r e pc e ua n dt o y o p e a r lh w 一5 5 fg e l f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r 印h y t l l e m o c u l a rw e i g h t so ft h r e ep r o t e i n sw e r e53 ，5 2 ，a n d55 如a ，r e s p e c t i v e l y i na d d i t i o n ，t 、0 a m y l o y t i ce 1 1 2 = y m e s 丘d ms m fw e r ea l s op u r i f i e d t 0 h o m o g e n e i 够b yt l l ep r o c e d u r e so f a m m o m u ms u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ，t o y o p e a r l d e a e - 6 5 0 mc h r o m a t o 铲a p h y ， p r e pc e l l ， s e p a r a t e l yn 锄e da sg aca n dg a d t h em o c u l a rw e i g h t so ft w op r o t e i i l sw e r e5 3 ，a 1 1 d5 2 l ( d 如r e s p e c t i v e l y g l u c o 锄y l a s e sp r o d u c e d 丘o ms s fw e r em u c hm o r et h e 肌o s t a b l ea 1 1 dp ht o l e r a t et h a l l e n z y m e sp r b d u c e d 丘d ms m f r a 、v s t a r c h - d i g e s t i n g a b i l i t i e s 、e r ef o u n di na l lt l l ef o u r g l u c o 锄y l a s e se x c e p tt h e0 【锄y l a s e b a s e do nt h ea i l a j y s i so fc o n s e e d 锄i n oa c i ds e q u e n c e sf r o mr j l z 忍9 p 螂s p ，a n dm e c o d o np r e f e r e n c eo fr 办忍d p 淞聊f c 加印。厂螂，【) n as e q u e n c eo f 以w a s 锄p l i f i e d ，a n dt h e n t h ec d n as e q u e n c eo f 征w a s 锄p l i f i e d b yr t - p c r r e s u l t ss h o w e da2 7 6 3b p 地g e n e i n c l u d i n g4i n t r o n sw a sc l o n e d n l ed e d u c e du n p r o c e s s e d9 1 u c o 锄y l a s en d mc i c i mf 0 0 8 8 w a s5 7 9 锄i n oa c i d sl o n ga 1 1 ds h o w s8 0 i d e n t i t yt 0t h e 尺，z 扬叩搬g l u c o 锄y l a s e i tw a st h e f i r s tt i m eo fg l u c o a m y l a s eg e n ec l o m n gf r o mr 办i z 印 s 聊f c ，d 点p d r s g a ec d n a 触g m e n te n c o d i r 培m a t u r ep e p t i d ew a si n s e i r t e di n t ot h ep l a s m i dp e t 二2 8 a ( + ) a i l de x p r e s s e di nec o 以b l 21 t h ep 谳f i e dr e c o m b i n a n te n z y m ed i s p l a y e dr a wg t a r c h d i g e s t i n ga b i l i t y k e y w o r d s ：尺办扬印姗聊f d 印d r 珊v a r 幽加p 玎j 括；r a w - s t a r c h d i g e s t i n ge n z y m e ；q 。锄y l a s e ； g l u c o 锄y l a s e ；s s fa n ds m f ；m i x e de n z y m es y s t e m ；g e n ec l o n i n g i i 一-_-_-_- 目录 目录 独创性声明i 摘要i a b s n a c t i i 目j 录i 第一章绪论1 1 1 淀粉1 1 1 1 淀粉的性质和形态l 1 1 2 淀粉的用途及其深加工2 1 2 淀粉酶2 1 3 生淀粉酶3 1 3 1 生淀粉酶的定义及水解原理3 1 3 2 生淀粉葡萄糖淀粉酶的研究进展5 1 3 3 生淀粉葡萄糖淀粉酶的应用及其优势7 1 4 混合酶系水解的优势与应用7 1 5 不同发酵方式对酶系组成的影响8 1 6 本课题研究目的与意义l o 1 7 本课题研究思路与内容l o 第二章生淀粉酶产生茵的筛选及固态发酵产酶条件的优化1 2 2 1 弓i 言1 2 2 2 材料与方法1 2 2 2 1 主要仪器设备1 2 2 2 2 主要试剂13 2 2 3 实验方法13 2 3 结果与分析1 5 2 3 1 微生物资源库的建立及菌株筛选结果1 5 2 3 2 菌株鉴定结果1 6 2 3 3 利用单因素法确定固态发酵主要参数17 2 3 4 利用响应面法设计确定培养基组成1 9 2 3 5n a t i v e p a g e 活性染色法初步确定酶系组成2 1 2 4 本章小结2 2 第三章固、液态发酵所产生淀粉酶系的分离纯化2 3 3 1 引言。2 3 3 2 材料与方法。2 3 目录 3 2 1 主要仪器设备2 3 3 2 2 主要试剂2 4 3 2 3 菌种2 4 3 2 4 溶液配制2 4 3 2 5 研究方法_ 2 5 3 3 结果与分析2 8 3 3 1 固态发酵淀粉酶系的纯化2 8 3 3 2 液态发酵淀粉酶系的纯化3 5 3 3 3 固、液态发酵产生淀粉酶系纯化方法的比较3 7 3 4 本章小结3 8 第四章固、液态发酵产生淀粉酶系酶学性质的比较3 9 4 1 弓i 言3 9 4 2 材料与方法3 9 4 2 1 主要仪器设备。3 9 4 2 2 主要试剂。4 0 4 2 3 实验方法。4 0 4 3 结果与分析4 1 4 3 1 最适反应p h 及p h 稳定性的测定4 1 4 3 2 最适反应温度及温度稳定性的测定4 2 4 3 3 金属离子和化学试剂的影响4 4 4 3 4 薄层层析分析酶水解产物4 4 4 3 5 苯酚硫酸法测定糖含量4 6 4 3 6 对生淀粉底物的水解效果4 6 4 3 7 质谱分析及蛋白质鉴定4 7 4 4 本章小结。5 0 第五章葡萄糖淀粉酶基因咖e 的克隆和序列分析5 2 5 1 弓i 言5 2 5 2 材料与方法。5 2 5 2 1 主要仪器设备5 2 5 2 2 工具酶和试剂5 3 5 2 3 菌株、培养基及培养条件5 3 5 2 4p c r 引物的设计与合成5 3 5 2 5 基因组d n a 和总r n a 的抽提5 4 5 2 6 地基因d n a 序列和c d n a 序列的扩增5 4 5 2 7d n a 核苷酸序列测定5 6 5 2 8 氨基酸序列分析及三维结构预测5 6 i l 目录 5 3 结果与分析5 6 5 3 1c i c i mf 0 0 8 8 基因组d n a 和总r n a 的抽提5 6 5 3 2g ，“ed n a 序列和c d n a 序列的扩增5 7 5 3 3 葡萄糖淀粉酶g ae 的系统进化树分析6 1 5 3 4g a e 与来源于毛霉科的葡萄糖淀粉酶一级结构的同源性比较6 2 5 3 5 葡萄糖淀粉酶g a e 二级结构的预测与分析6 3 5 3 6 葡萄糖淀粉酶g a e 淀粉结合区和催化区的三维结构预测6 3 5 4 本章小结6 5 第六章葡萄糖淀粉酶基因咖e 在大肠杆菌中的异源表达及功能分析“ 6 1 弓i 言6 6 6 2 材料与方法“ 6 2 1 菌株与质粒6 6 6 2 2 培养基及培养条件6 7 6 2 3 目的基因的扩增及大肠杆菌重组表达载体的构建6 7 6 2 4 诱导产酶及重组酶的纯化6 7 6 2 5 重组酶的性质研究6 8 6 3 结果与分析6 8 6 3 1 大肠杆菌表达载体的构建和础店基因的表达6 8 6 3 2 重组酶在大肠杆菌中表达条件的优化7 1 6 3 3 重组酶的纯化7 3 6 3 4 重组酶的性质研究7 3 6 3 5 重组酶的l t q 质谱分析及蛋白质鉴定7 5 6 4 本章小结7 6 论文结论与展望7 7 论文创新点7 9 j 目t 谢8 0 参考文献8 2 附录一作者在攻读博士学位期间发表( 含待发表) 的论文8 9 附录二附图9 0 l i i 第一章绪论 第一章绪论 1 1 淀粉 1 1 1 淀粉的性质和形态 淀粉是植物中碳水化合物的储藏体，以不同含量存在于植物的果实、叶片、块根和 种子中，尤以种子、果实和块根中的含量较高【。天然淀粉可分为直链淀粉( 锄y l o s e ) 和 支链淀粉( 锄y l o p e c t i n ) 两类。直链淀粉主要位于淀粉颗粒的内部，而支链淀粉主要位于 淀粉颗粒的外部【2 j 。 生淀粉是由直链淀粉、支链淀粉以及少量的矿物质和脂肪酸等混合形成的颗粒状的 淀粉。生淀粉不溶于冷水和有机溶剂，颗粒内部有着复杂的结晶组织，在扫描电镜的观 察下，不同原料来源的淀粉颗粒具有不同形状和大小。 如图1 1 所示，生淀粉颗粒的形状可分为球形、椭球形和多面形三种。一般水分含 量高、蛋白质含量少的植物淀粉颗粒比较大，形状比较整齐，大多数呈球形或椭球形， 如土豆淀粉和小麦淀粉；而水分含量低、蛋白质含量高的植物淀粉颗粒比较小，形状比 较不规则，大多数呈多面形，如大米淀粉和玉米淀粉。同种植物来源的生淀粉颗粒，大 小也是不均一的【3 l 。生淀粉颗粒的表面覆盖着一层外膜，其化学组成与淀粉内部是相同 的，但由于外层较低的水分含量和紧密的胶粒结构，其物理性质和内部的淀粉不尽相同。 谷类淀粉的外膜坚固性较差，易被淀粉酶分解；土豆淀粉颗粒的外膜较坚固，酶的作用 较为困难，因而较难水解。 图1 1 生淀粉颗粒在电子显微镜下的形烈3 】 f i g 1 一ls c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y0 f r a ws 眦hg r a n u l e s ( a ) 大米淀粉；( b ) 玉米淀粉；( c ) 小麦淀粉；( d ) 土豆淀粉；( e ) 甘薯淀粉 本文得到了国家高技术研究发展计划重点项目( 8 6 3 计划) ( 2 0 0 6 a a 0 2 0 2 0 4 ) ，科技部国家自然资源科技平台 ( 2 0 0 5 d 嘘1 2 0 8 ) 和教育部科技基础条件平台( 5 0 5 0 0 6 ) 的资助。 江南大学博上学位论文 1 1 2 淀粉的用途及其深加工 淀粉作为医药、食品、化工、造纸、纺织、饲料等行业的重要原辅料和添加剂，在 国民经济中有着重要的作用。我国是世界淀粉生产大国，目前淀粉年产量超过1 3 0 0 万 吨，居世界各国之首。近年来我国的淀粉工业发展较快，据统计2 0 0 5 年我国淀粉深加 工产品( 包括变性淀粉、结晶葡萄糖、液体淀粉糖和糖醇等) 的总产量达到4 7 0 0 7 万吨， 其中结晶葡萄糖1 1 2 9 8 万吨、液体葡萄糖2 5 7 7 6 万吨、山梨醇4 3 4 7 万吨。 淀粉除了可直接作为食物外，对淀粉进行加工还可生产葡萄糖、果糖等，以淀粉质 原料及其水解产物为基质经过发酵可生产乙醇、啤酒、味精、有机酸等食品与化工产品。 采用酶制剂改良传统工艺，合理开发利用淀粉质原料对于提高农产品的附加值、提高农 民收入、充分合理利用资源具有十分重要的意义。 淀粉工业中最初是通过强酸强碱的作用使淀粉分解成小分子的寡糖，但这种方法存 在设备要求高、生产过程需排放大量酸碱废水、劳动强度大等诸多弊端。目前在工业中 大多使用淀粉酶在较为温和的条件下水解淀粉，其过程分为淀粉的加温糊化、0 【淀粉酶 液化和葡萄糖淀粉酶糖化三步【2 】。具体过程如下： ( 1 ) 淀粉的糊化 当淀粉加水调成淀粉乳后，加热达到一定温度时( 一般超过6 5 ) ，淀粉颗粒会突然 膨胀，淀粉乳变成粘稠的胶体溶液，这种现象即为淀粉的糊化。糊化是淀粉颗粒( 生淀 粉) 转变成链状淀粉( 熟淀粉) 的必经过程，经过该过程，淀粉颗粒被打开，其内部结构完 全暴露，有利于水分子的结合和后续酶的催化。 ( 2 ) 淀粉的液化 淀粉的液化是利用0 【淀粉酶催化已糊化的淀粉，快速将其水解成糊精及少量低聚糖 的过程。液化后的淀粉粘度下降，流动性增强。 ( 3 ) 淀粉的糖化 淀粉的糖化是利用葡萄糖淀粉酶( 俗称糖化酶) 进一步将糊精及少量低聚糖完全水解 成葡萄糖的过程。生成的葡萄糖作为最容易被微生物利用的底物，可用于后续生产各种 产物。 1 2 淀粉酶 淀粉酶是具有水解淀粉和糖原能力酶类的统称，广泛存在于动植物和微生物中【4 ，5 1 。 淀粉酶是迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种之一，占据了全球酶制剂生产量约 2 5 3 0 的份额6 1 。全球范围内商品化的淀粉酶制剂的年销售额超过1 1 0 0 万美元【刀。 淀粉酶可以将自然界中广泛存在的淀粉转化为单糖或低聚糖等可发酵性糖，在食品 工业、纺织工业和医药工业中有着广泛的应用。如图1 2 所示，淀粉酶按照水解糖苷键 方式的不同主要可以分为五大类【6 j ： ( 1 ) 0 【淀粉酶：以淀粉( 直链淀粉和支链淀粉) 或糖原为底物，从糖链内部水解0 【1 ，4 葡萄糖糖苷键，随机水解生成短链糊精及少量低分子量糖类，从而使淀粉糊的粘度迅速 2 第一章绪论 下降，达到淀粉液化的作用，俗称液化酶。因产物的末端残基碳原子构型为q 构型，学 名称作a 淀粉酶。a 淀粉酶不能水解支链淀粉分支点的a 1 ，6 糖苷键，也不能水解0 【1 ，6 糖苷键附近的a 1 ，4 糖苷键。 ( 2 ) p 淀粉酶：是一种外切型淀粉酶，从底物非还原性末端依次水解每间隔一个 的0 【一1 ，4 糖苷键，终产物是麦芽糖。p 淀粉酶广泛存在于一些微生物和大麦、甘薯和小麦 等高等植物中。 ( 3 ) 葡萄糖淀粉酶：又称糖化酶，从淀粉分子的非还原性末端开始，依次切下每 一个葡萄糖分子。它不仅能水解a 1 ，4 糖苷键，还能水解0 【1 ，6 糖苷键和q 1 ，3 一糖苷键， 只是水解后两者的速度较前者要慢得多，因此葡萄糖淀粉酶作用于直链淀粉和支链淀粉 时，其水解终产物全部为葡萄糖。 ( 4 ) 解枝酶或异淀粉酶：只水解糖原或支链淀粉分枝点0 【1 ，6 糖苷键，切下整个侧 枝，也称为脱枝酶。 ( 5 ) 环糊精转移酶：功能为切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子供体内部的a 1 4 糖苷键并将其转移到受体糖链上重新形成0 【1 ，4 糖苷键。环糊精转移酶具有很低的水解 活性，其转移活性体现在可使6 8 个寡糖分子环化，并形成具有高度分枝的糊精或环状 极限糊精。 葡萄糖 图1 2 淀粉酶的分类 f i g 1 2c l a s s i f i c a t i o no fa m y l y l t i ce n 巧m e s 1 3 生淀粉酶 1 3 1 生淀粉酶的定义及水解原理 生淀粉酶是指能够直接水解未经蒸煮的淀粉颗粒的酶8 1 。在a 淀粉酶、p 淀粉酶、 江南大学博士学位论文 葡萄糖淀粉酶、脱枝酶中都有部分酶种具有水解生淀粉的能力【9 】。生淀粉酶能够直接水 解未经糊化处理的生淀粉颗粒的关键在于其具有结合到淀粉颗粒表面的结构淀粉结合 区域( s t a r c hb i n d i n gd o m a i n ，s b d ) l l o 】。研究发现，没有淀粉结合区域的葡萄糖淀粉酶 对淀粉链的水解速率不变，而对生淀粉颗粒的水解能力非常低i l 。 许多种类的丝状真菌都有产生生淀粉酶的能力，1 9 8 6 年s h i n s a k u 等人【1 2 】报道了一 株么印p 曙f 7 ，淞加材聊的突变株产生的0 【淀粉酶具有水解生淀粉的能力。1 9 9 8 年q u i g l e y 等人【1 3 j 研究了致病真菌c 仫面册，f “m 即5 蔓胗f 记d 肠a t c c3 8 0 2 6 所产生的生淀粉葡萄糖 淀粉酶水解生淀粉的方式。2 0 0 0 年，m 砌i d a 等人1 1 4 j 比较来源于三个内生真菌水解生淀 粉能力的差异，发现来源于彳c 陀所d 玎f “聊s p 的生淀粉酶即能水解颗粒较大的生淀粉，也 可以水解颗粒较小的生淀粉，而g 汤6 p 陀刀白p ”，f c 订r 西和跏，z e 聊口幻螂s p 所产生的生淀粉 酶则只具有水解颗粒较小淀粉的能力。m a r l i d a 等人【”j 还优化了彳c 愆聊d ，2 f “聊s p 的培养基 组成和培养条件，将其生淀粉酶产量提高了2 2 倍。 生淀粉酶水解生淀粉颗粒与淀粉酶水解糊化后淀粉的原理是相同的，都是从非还原 性末端水解a 1 ，4 糖苷键和0 【1 ，6 糖苷键，但由于两种淀粉在水中的存在状态不同，所以 作用方式是不同的。淀粉在加热糊化后，其表面坚硬的外壳被破坏，水分子可以深入到 淀粉分子内部，淀粉分子在水中呈松散状态，酶很容易接近淀粉分子并作用其糖苷键； 而生淀粉在水中由于表面水束层的排阻和坚硬外壳的阻挡，水分子很难通过层层阻隔到 达淀粉分子内部，淀粉分子在水中由于疏水相互作用而呈相对致密的结构，使得酶分子 难以接近淀粉分子。因此，酶是否能够与生淀粉结合以及结合的程度，决定了淀粉酶是 否具有生淀粉水解能力以及水解能力的强弱。 图1 3 经生淀粉酶处理后的生淀粉颗粒在电子显微镜下的形态【3 】 f i g 1 3s c 锄i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y o f n e a t e dr a 、vs t a r c hg 啪u l e sb ye n z y m e ( a 1 ) 大米淀粉；( b 1 ) 玉米淀粉；( c 1 ) 小麦淀粉；( d 1 ) 土豆淀粉；( e 1 ) 甘薯淀粉 如图1 3 所示，经生淀粉酶处理后，淀粉颗粒的表面出现了孔洞和裂纹，表明生淀 粉酶打开了淀粉颗粒表面坚硬的外壳，进入到了淀粉颗粒的内部，而上述孔洞和裂纹出 现后，淀粉的水解速率会大大加快。生淀粉酶水解不同植物来源的淀粉颗粒的难易程度 4 第一章绪论 是不同的，对于水分含量高、蛋白质含量少的植物淀粉颗粒如土豆淀粉和小麦淀粉，水 解较为困难；而对水分含量低、蛋白质含量高的植物淀粉颗粒如大米淀粉和玉米淀粉的 水解较为容易。 1 3 2 生淀粉葡萄糖淀粉酶的研究进展 具有生淀粉水解能力的葡萄糖淀粉酶一般称为生淀粉葡萄糖淀粉酶【1 6 】，该酶具有将 淀粉制糖工艺中的淀粉糊化、液化、糖化合并为一步进行的优点，因而被众多研究者们 所关注【l7 1 8 】。丝状真菌产生的葡萄糖淀粉酶一般都具有多型性，各型之间分子量、氨基 酸组分、糖基化程度各不相刚1 9 2 0 1 。针对多型性现象的普遍存在，为了更透彻的研究各 个葡萄糖淀粉酶组分的性质，必须将它们相互分离。 1 3 2 1 生淀粉葡萄糖淀粉酶的纯化方法 分离纯化丝状真菌来源的生淀粉酶系大多使用色谱层析的方法，包括离子交换色 谱、疏水色谱和凝胶过滤色谱等，也可以采用双水相的方法将酶从细胞碎片和发酵基质 中初步分离出来【2 l j 。p a z u r 和a n d o 在1 9 5 9 年最先利用d e a e 纤维素色谱从彳印p 喇跏 嘲妒厂菌丝提取物中纯化出了两种葡萄糖淀粉酶的同功酶，并且通过电泳的方法将这两 种同功酶分离开来【驯。1 9 8 3 年s a h a 和u e d a 利用制备性等电聚焦从尺办也幻p 淞胛眦姗中 分离出了5 种葡萄糖淀粉酶，并且研究了它们的生淀粉水解能力和吸附水解方式【2 3 】。 1 9 9 4 年g o t o 等人1 2 4 j 利用葡萄糖淀粉酶i 可以有效的结合环化糊精和生淀粉的特点，采 用亲和色谱柱a 环糊精s 印h a r o s ec l 6 b 纯化了来源于彳s 邵曙f 刀螂口w 口m d ，- fv a l 砌w 口如f 的葡萄糖淀粉酶。 上述各种纯化方法因葡萄糖淀粉酶的不同来源和性质的差异而有所不同，因此具体 到某种特定生物来源的葡萄糖淀粉酶的分离纯化需要就具体情况而调整。 1 3 2 2 生淀粉葡萄糖淀粉酶的酶学性质研究 自然界中微生物的多样性决定了葡萄糖淀粉酶种类和性质的多样性，不同丝状真菌 来源的葡萄糖淀粉酶的性质存在很大差异( 见表1 1 ) 。因此虽然淀粉酶的研究已经较为深 入，人们仍然不断从自然界中筛选具有各种不同性质的产酶菌株。 丝状真菌来源的葡萄糖淀粉酶在各类微生物中最为丰富，因此关于丝状真菌葡萄糖 淀粉酶性质的研究也最为深入。已有报道的丝状真菌葡萄糖淀粉酶的分子量范围从 2 6 8 5 1 ( d a - 1 1 2 l ( d a 不等；等电点一般在p h3 7 7 4 之间【1 6 1 ，葡萄糖淀粉酶的等电点是一 个具有种属特异性的性质；最适反应温度为4 0 6 0 ，高于6 0 的反应温度易使酶失活 2 5 j ，但一些耐热菌株如砀p 删d ，砂c 船 聊昭加螂【f 3 l 】所产的葡萄糖淀粉酶最适反应温度 能高达7 0 ；大多数葡萄糖淀粉酶的最适反应p h 值为4 5 5 5 【2 6 之8 1 ，通常在偏酸性条件 下稳定，在偏碱性条件下易失去活力。 所有的葡萄糖淀粉酶都能够水解可溶性淀粉，但并不是所有的葡萄糖淀粉酶都具有 水解生淀粉的能力。一些来源于曲霉和根霉的葡萄糖淀粉酶可以水解生淀粉，但水解生 淀粉的能力有所不同【2 5 1 。 江南大学博士学位论文 表1 1 不同丝状真菌来源葡萄糖淀粉酶的酶学性质研究 t a b l e1 - lc o m p a r i s o ne n 巧m ec h a r a c t e r i z a t i o n so fg l u c o a m y l a s e s 仃o m d i 仟e r e n tf u n g i n 1t 9 94 5 - 5 u o u 4 群陀7 9 1 l n 岱聆1 9 p r 。 t t 11 24 5 5 o 6 0 + a s p e r g i l l 潞o r y z 口p a s p e r g i l l l l s 删a m o r i v 缸勋w 口c 办j i l l 6 1 肋却淞s p 【2 9 1 肋扬印嬲，l 如p 淞1 2 5 l 胁h 础c 螂p “甲“陀凇1 3 0 j i 7 64 5 6 0一 i i 3 84 5 5 0一 3 8 4 54 0一 l 2 7 4 5 5 0 一 i i 1 7 4 55 0一 5 34 5 6 0 + 1 7 44 5 4 0 + 5 8 64 5 5 o 4 0 + i 6 1 4 4 5 5 o4 0 5 5 6 0 + i 6 05 0 5 0 一 i i 8 95 0 6 5一 砌p 册d ，缈p s 塑型1 2 ：鲨： 丝 ! ：竺! ! 二- _ + 丢藩磊藉蜀两菊蕊万一= 磊鬲丽预覆磊丽疏聒r + 表示该酶具有生淀粉水解能力，一表示该酶不具有生淀粉水解能力。 1 3 2 3 生淀粉葡萄糖淀粉酶基因的克隆与表达 表1 2 是在n c b i 中登记的部分已经克隆的丝状真菌来源的葡萄糖淀粉酶基因。 表1 2n c b i 中记录的葡萄糖淀粉酶的编码基因 1 a b l e1 2t h eg e n e sc o d i n gg l u c o 锄y l a s e si nn c b i 菌株来源 序列号 基因名称 描述麓茗 0 7 6 l 9 7 舟口u i u c o a m y l a s ep r e c u r s o r o j 了 4 印p 呼盯淞驯铡o 2 4 3 2 1 a s p e r g i l l 锻奔c m 嬲 a s p e r 蛋t h s - 姗q i g d t 凇 a s p e r g i t i t l sl c c 州a c h i a s p e r 蛋l t h sn i g e p 肖1 a s p e r 酉l l 淞t e r r e 心删 ? t u c o rc i l c 汛e t l o i a e 枣4 “m 驴d r 口c ，础s 口m 1 p e m c i l t t l mc h 0 准o g e n 姗 r h i z o b i t 口nt o n 勋f z 印淞明黝p 1 4 5 1 p 6 9 3 2 7 q 1 2 5 3 7 q 6 d u y 5 q 4 w f y 4 p 2 3 1 7 6 p 6 9 3 2 8 q 6 d n h 5 p 3 6 9 1 4 q 3 h l w 7 q 5 9 8 4 6 p 2 2 8 3 2 a a n 8 5 2 0 6 p 1 4 8 0 4 q 7 6 k f 7 q 9 8 e k 2 p 0 7 6 8 3 g l u c o 锄y l 嬲eip r e c u r s 0 r g l u c o 砌y l 弱eip r e c u r s o r g l u c o 锄y l a s e g l u c o 锄y l 勰e g l u c o 锄y l a s ep r e c u r s o r g l u c o a m