（材料学专业论文）多重乳液法聚羟基丁酸酯基印迹微球的制备、结构与特性.pdf

摘要本文采用水油水多重乳液法制备了平均粒径为1 0 1 10 2 呻的聚羟基丁酸酯( p h b ) 基微球，采用光学显微技术研究了乳液形成过程及其固化成球过程，在此基础上采用包埋法制备了牛血清白蛋白( b s a ) 印迹的p 髓微球、p 耶聚乙二醇口e g ) 微球，并对微球的制备、结构和特性进行了较为详细地探讨。研究表明，多重乳液的结构和稳定性，特别是初乳液滴和复乳液滴的形态和直径是影响微球结构的重要因素，由此最终可得到坍陷、空心或类似蜂巢等不同结构的微球。制备过程中添加p e g 组分具有改善乳化效果、提高亲水性和模板致孔等多种作用，对微球结构也有重要影响。微球的最终结构还与成球过程中p 耶的结晶行为密切相关。系统研究了二次乳化搅拌速度、w i o 比例、( w i o ) 批比例等乳液形成条件，p h b 、p e g 、p 、，a 、b s a 等用量以及p h b p e g 的质量比对微球粒径大小、表面形貌、孔疏密程度的影响规律，探讨了微球结构、包埋率与溶出特性之间的关系，确定了较优化的制备工艺。吸附行为研究表明，b s a 印迹的p h b 基微球具有较高的吸附选择性和再生性。适中的模板加入量、较低的p h b 分子量以及添加p e g 组分等均可使p h b印迹微球显示出更大的平衡吸附量。讨论了p h b 作为新型分子印迹基材的原理。关键词：聚羟基丁酸酯；聚乙二醇；微球；溶出：模板；分子印迹；包埋法；牛血清白蛋白；水油水多重乳液法；蛋白质印迹微球；吸附行为a b s t r a c ti nt h i sd i s s e r t a t i o nw 栅i no i li nw a t e r ( w l o w 2 ) m u l t i p l ee m l s i o nm e 也o dw a ss e l e c t e dt 0p 肥p a r eb o v i n es 豇u ma l b u l n i n( b s a ) i t r l p 血t e dp o l y ( 3 - h y d r 0 ) 刚) 1 l t 弘l t c ) ( p h b ) l i l i c r o s p h e r e sw i 也a v e r a g ed i a m e t 盯丘o m1 0 1 p mt ol u m o p t i c a l血c r o s c o p ew a sl l s e df o ro b s e n ，a t i o nt 1 1 ec o u r s eo fs 0 1 v e n te v a p o r a t i o na n ds o l i d i 丘c a t i o no fm u h i p l ee 蛐l l s i o nr n i c r o d r o p l e t s o nm eb a s i so ft h es t u d yb s am o l e c u ki l n p 血l t e dp h bm i c r o s p h e r e s 蛆dp h b p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ( p e g ) m i c r o s p h e r e sw e r ep r 印a r e dw i t he m b e d d i n gt e c m q u e t h ep r e p a r a t i o n s 仃u c t u r e ，c h a r a c t e r i s t i c 锄1 dp r o p e n i e so ft h em i c r o s p h e r e sw e r ed e t a i l e d l yd i s c u s s e dt o o t h er e s l l l to fr e s e a r c hs h o w e dm a ts 仃u c t u r eo fm em u l t i p l ee i r m l s i o n ，e s p e c i a l l yt h en l i c r o d r o p l e t s d i a m e t e ra n dm o 印h o l o g ) ，o fi n i t i a le m u l s i o na n dm u l t i p l ee m u l s i o nw a sac m c i a lf a c t o rt 0i n n u e n c e 也es 虮l c t u r eo fm i c r o s p h e r e s ，w h i c hw o u l df o md i 丑e r e n ts 衄l c t i l r c ss u c h 雏d c n a t e d ，c l o s e d ，h o l l o wo rh o n e y c o m ba t1 2 l s t p a n i c i p a t i o no fp o l y ( 甜l y l e n eg l y c 0 1 ) ( p e g ) s 仃e n 蚰e i l e dt h ee m u l s i f i c a t i o ne 虢c t ，i m p r o v e dt h el l y d r o p h i l i cp r o p e r t i e s ，p l a y e dar o l eo fp o r e s - m a k e ra st e m p l a t e sa n dh a da ni i i l p o r t a n tm f l u e n c eo nt h es t m c m r eo fm i c r o s p h e r e s ，t h es t n j c t u r eo fm i c r o s p h e r e sh a dc l o s er e l a t i v e l yw i t l lt 1 1 ec 叫s t a l l 也洫gb e h a v i o ro fp h bd u r i n g 也ec o u r s eo ff d 】咖l i n gn l i c r o s p h e r e s -t h ef a c t o r st h a tw o r k e do nt h ed i a m e t i l r s u r f a c em o 叩h o l o g ya n dp o r o s i 秒o ft 1 1 em i c r o s p h e r e sw e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d ，i n c l u d i n gs t i r r i l l gs p e e do f 也es e c o n de 皿l l s i o n ，v o l u m er a t i oo f w l oa n d ( w i o ) 、2 ，c o n c e i l t r a t i o no f p 耶，p e gp o l y v i n y la l c o h o l ( n ，a ) ，b s aa n dm a s sr a t i oo fp h b p e g 灿s ot l l er e l a t i o n s h i pb e m e e i l 也es t r u c t u 】广eo fm i c r o s p h e r e s 加de n 仃a p m e mr a t e 姐dt h ep r o p e r t yo fd i s s o l v i n go u tw a sd i s c u s s e d t h eo p t i i n i z e dp r o c e s s e sp a r 锄e t e r sw e r ef i e da r e rt h a t t h er e s e a r c ho fa d s o 印t i o nb e h a v i o rs h o w e dt h a tm o l e c u l a ri m p r i n t e dp h bb a s e di i l i c r o s p h e r e sh a dg o o ds p e c i f i ca d s o 印t i o n ，r e c o g n i t i o na n dr e g e n e r a t i o no ft h et e m p i a t e ( 打e a t e ra b s o 印t i o nc 印a c i 妙c o u l db ea c l l i e v e da te q u i l i b r i i u 丑f o rt 1 1 et e m p l a t ea tm ep r 印a r a t i o nc o n d i t i o n so fm o d e r a t et e m p l a t ea d d i n g ，l o w e rm o l e c u l a rw e i g h to fp h ba n dt h ea d d i t i o no fp e gt h ep 血c i p l eo fp h ba san e wm o l e c u l a d yi n l d r i n t e dn l a t e r i a lw a sd i s c u s s e d k e y w o r d s ：p o l y ( 3 h y d r o x y b 奶t a t e ) ；p 0 1 y ( e 也y l e n eg l y c 0 1 ) ；b o v i n es e m ：ma l b u m i n ；w ，a t e ri no i li nw a t e rm u i t i p l ee m l s i o nm e 也o d ；m i c r o s p h e r e s ；d i s s 0 1 v e0 u t ；t e m p l a t e ；m o l e c u l a r l yi n l p 蛐g ；e 玎曲e d d i n g ；p r o t e i i li i i i p 而1 t e dm i c r o s p h e r e s ；a d s o 叩t i o nb e h a v i o r 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究：r ：作和取得的研究成粜，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论义中不包含其他人已经发表或撰。学过的研究成果，也不包含为获得苤盗盘堂或其他教育机构的学位或让i s l i 使用过的材料。与我_ l 刊j ：l 作的同志对本研究所做的任何贡献均已谯沦义中作了明确的说明并表么了谢意。l，位沦义作者签名：刃牟签h 期：z 沙彳年乙月堂h学位论文版权使用授权书本学位论义作者完全了解苤鲞叁堂有关保留、使用学位论文的规定。特授权墨盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数掘岸进行检索，并采j 影印、缩e 或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借l 蒯。同意学校向固家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论义作者签名：l4 砺红签事同期：砂谄i ，乙月r剔币虢涮。私0签字j n j ：枷j 月： ：第一章绪论1 1 高分子微球制备方法第一章绪论高分子微球( m i c r o s p h e r e s ) 是指利用高分子材料或高分子复合材料制备的直径在微米级别，形状为球形的几何体，其形貌包括实心、空心、多孔等等。1 1 1 相分离法相分离法又名凝聚法( c o a c e 九，a t i o n ) ，是指在活性物质与载体材料的混合液中，通过外界物理化学因素的影响，使载体材料溶解度发生改变，凝聚包裹活性物质从溶液中析出【卜3 1 。相分离法一般可分为三步：包覆膜材发生相分离形成凝胶粒，凝胶粒吸附在活性物质颗粒表面和微球的固化，如图1 1所示。相分离技术按照相分离的引发方法可分为非溶剂法，变温法，不相溶聚合物或盐析法，以及聚合物聚合物相互作用法。如应用可溶解的聚酯和抗原，使它们与盐、非溶剂或另一种不相容的聚合物( 凝聚剂) 混合，导致包埋抗原的聚酯相分离，在低温条件下加入大量的非溶剂( 硬化剂) 使液相的聚酯抗原去除溶剂而固体化。制各含活性物质的微球一般可用此种方法。( 1 ) 非溶剂法首先将聚合物基材溶于良性溶剂中，然后将活性物质溶解或分散于上述聚合物溶液中，再缓慢加入与聚合物溶液有机溶剂混溶但不能溶解聚合物的第一非溶剂( 凝聚剂) ，则溶液体系发生相分离过程。随着聚合物的良性溶剂逐渐被第一非溶剂抽提出去，高分子溶液被浓缩发生相分离形成凝胶粒吸附在活性物质表面。凝胶粒的大小可通过搅拌速度控制。此时，微球机械强度太差，难于收集，需倒入大量第二非溶剂( 固化剂) 来固化微球。当用聚乳酸( p l a ) 或乳酸羟基乙酸共聚物( p l g a ) 为基质材料时，常用的有机溶剂有二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈。第一非溶剂可以是低分子量液态的聚丁二烯、聚异丁烯、硅油、菜籽油或轻质石蜡油，此外庚烷、己烷或石油醚等脂肪烃也经常用作第二非溶剂。由于该方法可以提高包埋率包覆水溶性组分，所以被大量应用于对酶、蛋白质或多肽类亲水性活性物质的包埋研究。但是在微球制备过程中，常常出现由于工艺条件选择不当，使聚合物发生聚结沉淀的现象。应当指出，该方法存在着一定的缺点，在微球制各过程中，三种第一章绪论有机溶剂的使用，不利于环保及规模化，而且残留的有机溶剂较难去除，使得微球易发生聚结，从毒理学的角度也难于被病人接受。引发：非溶剂7变温不相溶聚合物或盐析滴o聚合物相分离聚合物胶粒吸附微球固化图1 1 相分离法制备微球原理示意图f i g 1 - ls c h e m a t i cd r a w i l l go f t h ep r o 鹃s t 印si nm i c r 0 8 p h e r e sp r 印鼬t i b yp h a s 印a m t i m e m o d( 2 ) 变温法适当高温下，将活性物质分散于聚合物有机溶液中，然后在搅拌作用下将含有活性物质的聚合物有机溶液进行降温，使高分子形成凝胶粒吸附在活性物质微粒表面上，进一步继续降温可固化形成微球。( 3 ) 不相溶聚合物或盐析法两种聚合物可分别溶于同一种溶剂，但两者同时溶于该溶剂时则有可能发生相分离。活性物质分散于一定浓度的聚合物a 的有机溶液中，随着聚合物b 的加入，聚合物a 发生凝聚包埋活性物质，最终形成含活性物质的微球。同理，在溶有活性物质的水溶性高分子溶液中加入盐可使高分子发生凝聚包埋活性物质，亦可析出含活性物质的微球。( 4 ) 聚合物聚合物相互作用法带相反电荷的两种聚电解质相互作用可形成不溶性复合物而导致相分离，此法不同于上述不相溶聚合物法，这两种聚合物最终都成为活性物质包覆膜层的一部分。例如p h 值低于等电点的明胶常常作为阳离子聚合物，许多天然或合成的阴离子聚合物可与之发生复合凝聚，阿拉伯树胶即是一种为第一章绪论人熟知的天然阴离子聚合物。将活性物质分散于溶有两种聚合物的水溶液中，调节聚合物溶液的温度、p h 值，则两种聚合物可发生复合凝聚制得微球。为进一步将得到的微球固化，提高微球的强度，最后常需用戊二醛交联处理。此法一般用来包埋水不溶性或水微溶性活性物质，如胰岛素等。1 1 2 喷雾干燥法将活性物质或其水溶液分散乳化于溶有聚合物的挥发性有机溶剂中，通过喷雾器的喷嘴喷洒进入干腔室，使有机溶剂在干腔室内迅速挥发，活性物质和聚合物则形成固态微球沉集于干腔室底部的收集器中。有时为使微球规整且表面光滑，常常在聚合物溶液中添加增塑剂以降低聚合物链的刚性。喷雾干燥法过程简单、快速，易于规模化，是一种极具潜力的较适宜于酶、蛋白质或多肽类活性物质的包埋技术【4 1 。喷雾干燥法的最大优点在于它的普适性，只要选择合适的溶剂，亲水及亲油性聚合物都可用来包埋活性物质。尽管喷雾干燥过程中涉及到热气流，但溶剂的快速蒸发可使微球本身保持较低的温度。因此，喷雾干燥法可用于酶、蛋白质或多肽类热敏性活性物质的包埋。喷雾干燥技术可产生与传统方法等同的粒径分布、微球形态、活性物质释放动力学，与此同时还可获得较高的包埋率。例如利用该方法可使聚酯和抗原悬浮液进行气雾化，在短暂的热空气冲击下有机溶剂在干腔室内快速挥发，包埋有抗原的聚酯固化成球。在该喷雾干燥过程中，用空气压力使水油溶液直接通过喷雾器喷嘴喷入热流空气中，使有机溶剂快速蒸发，聚合物和抗原药物产生的微球可以用分离器收集，这一方法十分简单、快速，而且药物包裹效率也较高，十分有利于大规模生产。但是，喷雾干燥法的缺点也很明显。在喷雾干燥过程中，相当多的活性物质由于粘附在干腔室内壁上而损失，而且喷雾干燥过程中经常会导致活性物质晶态的变化，聚合物的纤维化也是喷雾干燥法存在的另一个重要问题。此外，工艺过程有过多的变量，进料性质，如粘度、均一性和活性物质及聚合物的浓度，进料速度，雾化方法以及进出口温度等，均需要进行优化。1 1 3 离子对凝胶法离子对凝胶法的机理是聚电解质在配对离子的存在下发生交联作用。目前该方法已被广泛应用于细胞和活性物质的包埋研究，海藻酸盐是在该研究工作中应用最广泛的聚电解质材料之一【5 1 。海藻酸盐是由聚b 1 ，4 甘露糖醛酸盐与聚q 1 ，4 l 古洛糖醛酸盐结合的线型高聚物，分子量约为2 4 1 0 5 。二价3第一章绪论和三价的阳离子主要通过键联古洛糖醛酸链段而发生凝胶化作用。把溶有活性物质的海藻酸钠溶液滴入c a c l 2 水溶液中即可形成凝胶微球，通过c a 2 + 的扩散，离子对交联的海藻酸盐可在凝胶微球内部形成三维网络结构。为了增强凝胶微球的机械强度并减慢活性物质渗透速度，可向体系中加入带相反电荷的聚电解质以形成聚电解质复合物。如加入阳离子聚合物( 聚l 赖氨酸) 可在微球表面形成一层复合聚合物膜。该方法的最大优点是包埋条件温和，对被包埋的细胞、活性物质( 如酶、蛋白质或多肽类) 的影响很小。所有的聚电解质都是水溶性的，所以包埋过程是在无有机溶剂条件下进行，而且过程温度较低，这些条件使得被包埋活性物质不会失去活性。此外，该方法还具有简单、快速、经济的特点。但是离子对凝胶法亦存在不足，该方法制备的凝胶微球一般机械强度较差，而且通透性太强，难以达到控制释放活性物质的目的。1 1 4 超临界流体沉淀法超临界流体( s u p e r 嘶t i c a lf i u i d ，s f ) 是指高于流体临界点，以单相形式存在的流体，它的温度和压强同时超过临界值，即临界温度t 。和临界压强p 。此时气态的密度与液态的密度相同，两相的界面不存在( 图l - 2 ) 。实际应用中的超临界流体经常指那些被高度压缩，相对接近临界点状态的气体。c 0 2的临界条件容易实现( t 。= 3 1 ，p 。= 7 3 8b a r ) ，对环境友善，相对无毒，价格低廉，不可燃，而且有较好的溶解能力，是一种常用的超i 临界介质。t e m p e r a t l l r e图1 2 单组分物质温度压力相图f i g 1 2p r c s 鼬r e t 唧e 咖r ep r o j c c t i o no f m ep b a s ed j a g r 锄f o rap u 坞c o m p o n e t第一章绪论超临界流体法制备微球或微囊有两个常规路线，超临界流体溶液快速膨胀( r a p i de x p a n s i o no fs u p e r c r i t i c a ls o l u t i o n s ，r e s s ) 和超临界反溶剂结晶化( s u p e r c r i t i c a la n t i s o l v e n tc r ) r s t a l i z a t i o n ，s a s ) 。r e s s 利用超临界流体具有类似液体的溶解能力，而s a s 是以超l 临界流体作为反溶剂使用。r e s s ：在高压下，活性物质和聚合物同时溶于超临界流体中，通过快速减压( 膨胀) 使它们沉淀析出。在超临界流体中，溶质的实际溶解度远高于在相同压强和温度下理想气体中的溶解度( 1 0 6 倍) ，超临界流体的快速膨胀可导致很高的过饱和度。由于超临界流体膨胀后呈气体状态，收集的微球或微囊的纯度很高，无溶剂存在。r e s s 有许多优点，明显好于传统的包埋方法。诸如不需要表面活性剂、溶剂以及温和的工艺条件等。然而，高分子量聚合物以及酶、蛋白质或多肽类活性物质在超临界流体中较低的溶解度限制了该方法的应用，因此该方法只适用于低分子量聚合物和有限活性物质的包埋【6 】。s a s ：将活性物质颗粒分散于溶有p l a 的二氯甲烷中，通过毛细喷嘴喷入c 0 2 超临界流体相，液滴随c 0 2 快速膨胀而固化成微球【7 1 。较超临界流体溶液快速膨胀法而言，超临界反溶剂结晶化法更适用于高分子量的聚合物【8 】和药物，尤其是对酶、蛋白质或多肽类活性物质，此类活性物质可悬浮于聚合物的有机溶液中。超临界反溶剂结晶化法的缺点是c 0 2 的增塑作用使得微粒的玻璃化转变温度降低，在室温下易发生聚结【9 1 。1 1 5 界面聚合法及乳液聚合法界面聚合法也称界面缩聚法，系指在分散相( 水相) 与连续相( 有机相)的界面上发生的单体缩聚反应。例如以1 ，6 己二胺的水溶液为分散相，以对苯二甲酰氯的环己烷氯仿溶液为连续相，将互相不混溶的两相混合搅拌后，两种单体在界面处接触进行缩聚反应。由于缩聚反应的速度超过1 。6 己二胺向有机相的扩散速度，所以反应生成的聚酰胺几乎完全沉积于液滴界面，包裹水相液滴而形成微球。用该方法成球速度较快，但由于反应是在碱性介质中进行，故对碱不稳定的活性物质不宜采用，而且产品中易含有残留的有机溶剂。典型的乳液聚合法是在连续的水相中进行乳液聚合，其制各方法如下：首先，单体溶于水相进入乳化剂胶束，并且乳液中形成由乳化剂分子稳定的单体液滴，然后通过引发剂或高能辐射在水相中引发单体进行聚合。如制备含有羧基的聚合物乳胶，在其表面聚合形成硬壳，在接近壳层聚合物玻璃化第一章绪论温度( t 窖) 下用碱溶液中和聚合物乳胶核中的羧基使之溶解掉，即可获得聚合物微容器【l o q 引。近年来，利用微乳液聚合法制备微球的研究工作也引起了人们的重视。微乳液是两种相对不互溶的液体形成的热力学稳定、各向同性、透明或半透明的分散体系，体系中由表面活性剂所形成的界面膜可稳定其中的一种或两种液滴。根据分散相与连续相的不同，微乳液可分为油包水( w o ) 和水包油( o 厢) 两种类型，每种类型的微乳体系中都含有粒径大小在1 0 1 0 0 砌范围内的单分散小液滴【l3 1 。体系中液滴的平均直径和数目不随时间的改变而改变，溶解有反应物a 和b 的液滴之间相互碰撞、结合、物质交换，最后可形成a b 的沉淀颗粒，因为所合成的粒子被限定于液滴的内部，其大小和形状也反映了液滴的大小和内部形状。微乳液法制各纳米粒子的方法具有仪器设备简单、实验条件温和、粒子尺寸可控等优点。引入微乳液聚合法可获得聚合物纳米容器，如以环氧乙烷和氧化丙烯二元共聚物作为乳化剂，微乳液法制备聚甲基丙烯酸甲酯纳米乳胶，在其表面聚合苯乙烯壳层，可获得外径为1 5 3 0 衄，壳厚度为2 5 n m 的聚合物纳米容器【1 4 】。乳液聚合是制备微球的重要方法，乳液聚合方法既可适用于连续的水相，也可适用于连续的有机相。聚甲基丙烯酸甲酯，聚烷基异氰酸酯，聚丙烯酸类共聚物微球均可通过此方法制得。对于以有机相作为连续相的乳液聚合制备微球也有相关报道，但是由于使用大量的有机溶剂和有毒的表面活性剂而使其应用受到一定的限制。乳液聚合及界面聚合虽然为微球的制备提供了一种较佳的方法，但由于在聚合过程中会引入催化剂以及未反应的单体，因此必须考虑由此而引入有毒物质的问题。1 1 6 自组装法将带有可聚合功能基( 如碳碳双键) 的油脂分子分散在水中形成胶束，再加入引发剂引发其聚合，即可获得空心聚合物纳米球i l5 | 。两亲性共聚物具有较大的分子尺寸，因此可以形成比小分子油脂更为稳定的胶束【1 6 1 。7 1 ，在两亲性共聚物中引入可聚合功能基，将两亲性共聚物作为单体，然后引发聚合，可以获得共价键相对很稳定的空心聚合物纳米球。若将不带有聚合功能基的两亲分子，如表面活性剂直接分散在溶剂中制得双层微囊，然后引发溶于双层微囊中的疏水性单体聚合，最后抽提出表面活性剂，可制得疏水性聚合物微容器，其制备原理见图1 3 。6第一章绪论微囊。疏水单体聚合i聚合物纳米微容器图1 3 在双层微囊中形成聚合物微球示意图f i g 1 3s c h 锄a t i cd 硪w i n go f 吐坞m i c r o s h p e 陀sp r o d u c t i o ni nd o u b l ew a l l e di n i c r o c 印s u l 髂1 1 7 胶体模板法聚阳离子吸附一挚一( 2 )聚阴离子吸附图1 - 4 模板法制各聚合物微球示意图f i g 1 4s c h 黜t i cd 蹦v i n go ft h ep r 印r a t i o n go fp o b ，m e rm i c r o s p h e r e sb ym o u l d i n gm e t h o d经过表面处理带有一定电荷的胶体颗粒作为核，聚阴离子和聚阳离子分别通过静电作用力层层沉积在胶体颗粒上，形成核壳结构聚合物微球，再将7第一章绪论内部的核溶解掉，就可以获得聚合物微容器【1 钔，见图1 4 。其大小由胶体颗粒尺寸控制，壳层厚度及组成可以用静电吸附的层数来控制，以满足不同用途的要求。m o h w a l d 及其合作者以纳米聚苯乙烯乳胶粒【1 9 2 1 】、人血红细胞【2 2 】和荧光素【2 3 1 为核，成功制备了聚苯乙烯磺酸盐聚已二烯二甲基氯化铵纳米聚合物空心球。1 1 8 单乳法单乳法是制备生物降解性高分子、天然高分子微球常用的方法，而该类方法制备的微球在活性物质控制释放、生物分离等应用领域有着广泛的应用前景。采用单乳法制备微球主要包括4 个步骤【2 4 】：活性物质与基质材料的结合；液滴形成；溶剂脱除；微球的干燥与回收。单乳法已被广泛应用于包埋多种药物，尤其是疏水性药物。对于包埋酶、多肽或蛋白质等活性物质，可根据被包封活性物质和聚合物基材的亲、疏水性采用油水( o w ) ，油油( o o ) 方法。单乳法依据形成乳液的状态可分为o 侧法或o i 0 2 法。如p l a 或p l g a 溶于二氯甲烷易形成有机溶液，活性物质固体粉末分散或溶于上述高分子溶液中可形成活性物质悬浊液或溶液，将含有活性物质的该分散相倒入由乳化剂和水( w ) 或由矿物油( o ) 溶液构成的连续相内，通过超声或搅拌形成乳液( o w 或o i 0 2 ) 。分散相中的有机溶剂可通过溶剂蒸发或抽提去除。在溶剂蒸发过程中，分散相中的有机溶剂先扩散进入连续相，然后再蒸发进入大气环境中完成乳液的固化。图1 5 为w o 单乳法工艺流程图。有机溶剂蒸发去除的速度对最后微球产品特征的影响很大，它可以通过成球过程中体系温度、压强和聚合物在该溶剂中的溶度参数等来进行调节。过快的溶剂蒸发会导致油滴内部局部爆沸，在微球表面形成微孔结构。在溶剂减压抽提过程中，将乳液( o 脚或o i 0 2 ) 倒入大量水或其他媒介中，可以使油滴中的溶剂更快扩散出来。由于有机溶剂抽提的速度快于其自然挥发的速度，因而，在相似条件下，前者产生的微球往往比后者呈现多孔结构。应当指出，利用o 例单乳法制备微球时存在着一定的缺点，主要是它对水微溶或水溶性活性物质的包埋效率较低。在包埋过程中，会有部分活性物质从分散相( 油相) 扩散进入连续相( 水相) 中。而且亲水性活性物质的微晶常常在成球过程中沉积在微球表面，使得对活性物质的包埋率降低。由于微球表面富集有一定量的活性物质，使用时活性物质在溶出过程中具有较严第章绪论重的突释现象。图1 5 单乳法包埋活性物质制备微球的示意图f i g 1 - 5f l o wc h a r to f 也ew a t e r - i n o i ls i n g l ee 聊1 1 s i o n s 0 1 v e n te x 仃a c t i o nm e t h o df 0 rp r 印a r a t i o no fd m 哥1 0 a d e d 血c r o s p h e r e s1 1 9 多重乳液法多重乳液也称复乳液，是在单乳的基础上再乳化制成的一种非均相体系，依靠亲油、亲水两种不同性质乳化剂形成的一种乳液体系，在界面膜上存在两种不同性质的乳化剂分子( 如图1 6 所示) ，借助于液相界面膜，内相成分可以得到保护，并在外界条件变化时释放至目标区域。多重乳液最早于1 9 2 5 年由s e i 衔z 发现【2 5 1 ，由于其良好的分散、缓释性能，在食品、化妆等民用领域得到广泛应用【2 每2 引，其独特的性能在石油工程的缓释、缓蚀等特殊领域的潜在应用价值也在引起关注【29 1 。应用可生物降解聚合物材料作为活性物质如酶或多肽的载体是医药新剂型研究领域的热点课题之一。通过单乳法或多重乳液法，采用聚乳酸( p l a ) 、乳酸与羟基乙酸共聚物( p l g a ) 【3 0 3 4 1 、壳聚糖【3 5 】、聚酐【3 6 】、脂质第一章绪论【3 7 1 、硅树脂【3 8 1 和聚羟基丁酸酯( p h b ) 【3 9 】等为基材，可制得具有不同内腔结构、壳层透过性能和表面形貌的中空或类似蜂巢结构的微球，其中多重乳液法因可制得高稳定性核一壳结构聚合物微容器尤其受到重视。图1 6 多重乳液结构示意图f i g 1 6s c h 锄a t i co fs 仃u c n 鹏o fw i o 例2m u l t i p l e 锄u l s i o n传统的多重乳液法一般分为四步，即初乳化、二次乳化、固化及分离纯化。微球制备过程中各步骤的影响因素列于表1 一l 中。表1 1w l 刚v 2 多重乳液法制备微球过程中的主要变量t a b l e1 1m a i nv 赫a b l e si nw l 硒，w 2m u l t i p l ee m u l s i o np r o c e s sf o rp r o d h l c t i o no fm i c r o s p h e r e s操作步骤影响因素初乳化二次乳化固化聚合物组成及分子量、聚合物在有机相中的浓度、乳化剂种类及浓度、有机溶剂的种类及其体积、内水相活性物质的浓度及体积、内水相与油相的体积比、乳化方式、强度及时间、温度及压力。初乳液与外水相的体积比、稳定剂种类及浓度、初乳液倒入外水相的速度、乳化方式、强度及时间、温度及压力。外水相体积、稳定剂种类及浓度、盐的种类及浓度、搅拌速度及时间、温度及压力。洗涤、冻千离心速度及时间、洗涤溶液盐浓度、冻干保护剂的种类及浓度、冻干时间。尽管每一步操作都有许多变量，而且许多变量之间有交互作用，但其中只有少数变量是优化包埋过程的要素。这些关键变量需要通过评估所制备得1 0第一章绪论到的微球的各种性能来确定，这些特性主要包括被包埋活性物质的活性保持，包埋率( 被包埋活性物质的量与总投入量的比值，或微球的实际活性物质负载率与理论负载率的比值) ，活性物质突释效应大小及溶出速度。口日w 。园超声)目固化上( 蒸发或抽提法去除有机溶剂)分离纯化上( 离心或过滤洗涤、冻干)固态膜图1 7w i o ，w 2 多重乳液法包埋活性物质制备微球的示意图f 培1 7f l o wc h a no fm ew a t 小i 呐i lm u l t i p l ee m l l l s i o nm 曲o df o rp r 印a 谢o no fm e d i c i n e 一1 0 a d e dr n j c r o s p h e r e s图1 7 为w i o 侧2 多重乳液法制备过程，其作为传统的包埋水溶性活性物质的方法，尤其适合酶、多肽或蛋白质类【4 0 】活性物质的微包埋。在w i o w 2多重乳液法中，含活性物质的水溶液( w 1 ) 分散于溶有聚合物的有机溶液( o )中，高速搅拌或超声形成w i o 初乳液，然后将初乳液倒入含有稳定剂的外水相( w 2 ) 中二次乳化，形成w i 0 侧2 乳液。此时含活性物质的内水相完全被油溶液包覆与外水相隔离。通过蒸发或减压可抽提去除油相中的有机溶剂，随着有机溶剂的不断去除，溶于其中的聚合物发生凝聚，逐步固化成壳，并将含活性物质的内水相包裹成核，演变形成微球。最后，经过离心( 或过滤) 、洗涤将微球分离出来，一般将微球冻干进行保存。=胃o。黼oo o _ww相水口第一章绪论1 2 聚羟基丁酸酯聚羟基丁酸酯，是于1 9 2 6 年由l e m o i g n e 在巴黎巴斯德研究所首次分离并定性，他发现在革兰阳性菌巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i 岫) 的细胞质中存在非水溶性化学组分，经对氯仿提取物分析确定为p h b 。至2 0 世纪5 0年代末，许多研究表明这种生物高分子是作为细胞内碳源和能源的储存物而合成的，同时发现p h b 和其结构相似的储存聚酯几乎为所有原核生物所合成。6 0 年代末，美国的g r a c ew r 开始生产出少量的p h b 并用于商业评估，而此前p h b 一直仅仅被用于学术研究。1 2 1 合成1 2 1 1 微生物合成目前已知有不同的微生物种类可通过各种不同的细胞内途径稳定产生p h b l 4 ，其中主要包括野生型、突变型以及利用基因重组技术转入了必需基因的微生物【4 2 1 。在罗氏真养菌( r e u 仃o p h a ) 中，葡萄糖是最常用的生产p h b 的碳源【4 3 1 ，然而其他的底物，如甲醇、蔗糖、乙醇以及乙酸也可被微生物利用来生产p h b均聚物【4 4 1 。通过两步培养法罗氏真养菌可在非自养条件下有机培养基中达到指数级生长，在自养条件下聚集p h b ，通过这一过程可收获高浓度及高产率的p h b 【4 5 1 。罗氏真养菌在其指数生长期产生的p h b 仅仅具备羧基端，多聚物中次级羟基只有在聚合物积累阶段产生【4 6 1 ，因此发酵产生的p h b 通常包括过量的与次级羟基相关的羧基。p h b 的数均分子量( m n ) 可通过分析其末端羧基官能度得到，这一结果与通过凝胶渗透色谱测得的真实分子量一致，由于并非所有的主链都具有二级羟基末端，往往通过二级羟基计算得到的m n 偏高【4 7 】a罗氏真养茵中p h b 的生物合成途径见图1 8 ，催化过程需p 酮硫解酶( b k e t o t h i o l a s e ，p h b a ) 、乙酰乙酰辅酶a 还原酶( a c e t o a c e t y l c o ar e d u c t a s e ，缩写作p h b b ) 与p h b 合成酶( p h bs y n t h a s e ，p h b c ) 三种酶共同作用完成，分别由同一操纵子上的基因进行编码【48 1 。这条途径涉及两分子的乙酰辅酶a 经p h b a 催化形成乙酰乙酰辅酶a ，然后在p h b b 作用下形成d 3 羟基丁酰辅酶( 3 h b c o a ) ，最后由p h b c 催化单体3 羟基丁酸( 3 - h y d r o x y b u t y r a t e ) 聚合形成p h b ，在细菌细胞中p h b 聚集成不连续的、膜结合颗粒f 4 9 1 。通常情况下，细胞中p h b 含量较低，大约为1 第一章绪论3 0 。通过调控碳残留及限氮等发酵条件，可提高p h b 产量达到细胞干重的8 0 【5 0 - 5 2 1 。除罗氏真养菌外，大肠埃希菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 和食油假单胞菌( p s e u d o m o n a s0 1 e o v o r a n s ) 等也可进行p h b 的合成。9 0 s c “b 酮娥椭、l9 0 s - c o a品3& 顾器s 鱼肾升 h 2 燮扣：塑堂堕- 伶h 导寸占o 7 r 占卜。h 二、。= ik 8l凇砷p + 乜。l。jn磕z 黼蘩ad ( 描磁丁酰辆a珊图1 - 8 罗氏真养菌中产生p h b 的生物合成途径f i g 1 - 8b i o 咖e 矗cp r o c e s ss t 印so f p h bi nr e l l t r o p h a大肠埃希菌在正常情况下因缺乏p h b 合成基因不能用来产生p h b ，然而当转入载有来源于罗氏真养菌的合成酶基因时，它可以合成p h b ，其累积产量可达细胞干重的8 0 。利用大肠埃希菌合成p h b 的主要优点是，所有的适合于这个菌的遗传基因均可用于优化p h b 的生产。由于在大肠埃希菌中不存在p h b 降解酶，所以通过大肠埃希菌合成途径可得到高分子量的聚合物( 4 5 m d a ) 。同时，在产物的抽提和纯化上也具有潜在的优势，在已经得到的大肠埃希菌p h b 合成突变菌株中，p h b 经过温和的热处理，而非通过化学的抽提技术即可得到【5 引，通过4 2 低温诱导细胞裂解，该菌株可释放在其菌株内累积合成的p h b 。1 2 1 2 植物合成目前商业化p h b 的生产规模小、产量低、成本高，在经济上还无法与石化产业得到的常规高分子产品，如聚乙烯和聚丙烯等竞争。因此，科研人员设想通过利用转基因植物作为塑料合成工厂进行p h b 生产【5 4 】，理论上植物只需要二氧化碳、水和阳光，所以该途经在经济效益、环境保护等方面较传统的塑料合成工业更具有潜在的竞争力。与微生物发酵灵活地补充p h b 合成所需要的底物不同，目前在植物中产生并控制p h b 的生产是十分困难的。针对p h b 植物合成的研究工作表明，当p h b 生物合成酶表达于植物叶绿体时，植物合成p h b 途径是完全可行的 5 5 】。s o m e r v i l l e 及其同事的研究结果显示，将罗氏真养菌基因转入拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 树叶中，其产出的p h b 可达到植物干重的1 4 ，而且对植物的生长几乎没有产生第章绪论影响【5 6 】。在植物质体中生产p h b 与在微生物细胞质中生产p h b 的区别现在并不完全清楚，但是由于植物质体中可得到乙酰辅酶a ，植物合成p h b 的前景可能会非常好p “。利用植物作为p h b 生产系统需要解决的另一个技术障碍是如何从植物组织中回收p h b ，这也是影响利用植物生产p h b 总成本的主要因素。例如在油菜( b r a s s l c an a 口u s ) 种子中转入大肠埃希菌生产p h b ，则后处理过程要求从油脂、蛋白质和其他的细胞内含物中将其分离出来，才能得到p h b 产品。油菜籽质体中产生p h b 的电镜照片见图1 9 。图1 9 可生产p h b 的油菜籽质体的电镜照片f i gl 一9s c 8 毕m ge 】e c 廿o nm l c r o s c o p yp l c n u eo f p 岫p m d u c t l o n 址r a p e s e e dp l a s t l d聚合物p h b 的结晶性质和热性质，植物和组织类型( 叶子或种子) 等因素与从植物组织中分离回收p h b 的方法密切相关。用超 ”界流体萃取法、选择性非卤化溶剂抽提法以及利用p h b 与植物质体之间廿量度差别的途径从植物组织中提取p h b 均是可行的。但是，从经济和环保角度考虑，同一植物生产系统中除了高分子p h b 外，其他的副产品如植物油、蛋白质和糖类也能分别回收才是最理想的结果因此在分离、萃取过程中使用的各种类型的溶剂应是食品级溶剂，而当前实验室普遍使用氯仿作溶剂进行p h b 抽提显然是不好的选择。目前已有一些科研人员在从事该方面的研究工作，m o n 等对现成的商业机械压碎己烷萃取商业用油的抽提方法进行了改进，用来分离转基因油菜籽质体中的p h b ，分离后的残渣可作动物饲料”。研究过程中发现，经转基因第一章绪论的油菜种子较非转基因的油菜种子需要使用更强机械力来进行分离。此外，该研究小组还进行了从蛋白质粗粉中分离p h b 的研究工作”。一些相关专利也介绍了从不同植物原料中提取p h b 的通用方法，其中包括在分离过程中加入不良溶剂引起p h b 的选择性沉降【6 。该类不良溶剂一般包括线型和支化的醇和酯，在低于溶剂沸点温度下p h b 溶解度小于1 ，而在提高温度和压力的条件下p h b 的溶解度大大提高，搅拌下提取液冷却能沉降得到纯净的p h b 。类似的方法则是使用p h b 的良溶剂，溶解后通过溶剂蒸发可得到纯净的p h b 。1 22 性质l2 2 l 在细胞质中的存在形态p h b 在细胞质中以分离的球形小颗粒的形式存在，颗粒直径1 0 0 8 0 0 n m ，并且由一层大约2 4 n m 厚的单位膜包围川。细胞质体中p h b 球形颗粒的电镜照片见图1 1 0 。典型的p h b 球形颗粒约占9 8 ，其他组成主要是蛋白质和磷脂。对细胞质的c - n m r 研究结果表明，p h b 在球型颗粒中主要以流动状态( 非溶液状态) 存在【6 2 6 ”。图i 1 0 细胞质体中p h b 球形颗粒的电镜照片f 1 9l - 1 0s e mp l c m r eo f p h bo r b l c u l a rg f 柚u i e mc 副lp l 曲c 讯第一章绪论1 2 2 2 组成和分子结构p h b 分子结构与等规聚丙烯相似，具有与主链连接的单一构型侧链甲基，为全同立构【6 4 1 。p h b 分子是由紧缩的有2 次螺旋轴和0 5 9 5 皿重复单元的右手螺旋结构组成，由于羰基甲基相互作用而使其螺旋构象较稳定，成为自然界中所发现的少数几个不依赖氢键来维持其形成和稳定的螺旋结构之一。p h b 的分子结构示意见图1 1 1 【6 5 】。ro乇。一巳呻峨卜一心ihi 图1 1 1p h b ( p 皿v ) 的分子结构示意图f i g 1 一l1s c h e m a t i cd m w i n go f p 衄 h b v ) m o l e c u l 缸s 劬1 c t u r e天然p h b 颗粒是由1 0 0 1 5 0 埃伸展的聚合物构成纤维状链，平均每个颗粒有一万条这样的链分子，链分子平行排列然后压缩成球形颗粒。一般说来，由不同微生物发酵及采用不同的提取手段获得的p h b 分子量是不同的，p h b的m n 为0