苦蘵多糖的提取及体外抗氧化活性的研究.doc

苦蘵多糖的提取及体外抗氧化活性的研究【摘要】 目的研究苦蘵多糖的醇沉条件及其体外抗氧化活性。方法经超声提取，除脂，除蛋白等工艺得到苦蘵粗多糖，并考察了醇沉条件(醇沉比、温度、pH、时间、浓缩比)对多糖沉淀的影响。采用体外实验研究了苦蘵多糖对OH和DPPH的清除作用及对大鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用。结果在最佳的醇沉条件(浓缩比41,温度-20，醇沉时间16 h，醇沉比为14，pH为7)下，多糖提取率为3.15%。多糖对大鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制率可达80%,对OH和DPPH也都有很好的清除作用。结论苦蘵果实中多糖有良好的体外抗氧化活性。 【关键词】 苦蘵 多糖 抗氧化Abstract:ObjectiveTo study the antioxidant activities of polysaccharide extracted from Physalis pubescens L.MethodsPolysaccharide was extracted from Physalis pubescens L. fruit by ultrasonic method, the content was determined by spectrophotometry, the in vitro scavenging activities of polysaccharide on hydroxyl radical and DPPH,and its protective effects on lipid peroxidation of liver homogenate in rats were investigated in this study.ResultsPolysaccharide had strong scavenging effect on hydroxyl radical and DPPH,its effect on superoxide radical was week,and it showed significant protective effect on lipid peroxidation of liver homogenate in rats.ConclusionThese results suggest that the polysaccharide extracted from Physalis pubescens L. has good antioxidant activities in vitro.Key words:Physalis pubescens L.; Polysaccharide; Antioxidation property 苦蘵,别名：蘵、黄蒢(尔雅)，小苦耽(本草拾遗)，灯笼泡草(广东医学祖国医学版(2)：8.1966)，响铃草、响泡子(湖南药物志)，绿灯、野绿灯(上海常用中草药)。茄科酸浆属植物，拉丁名：Physalis pubescens L.以果、根或全草入药，性味苦、寒。功用主治：清热解毒，利尿消肿，消肿散结，凉血止血。现代研究报道，其化学成分为酸浆果红素，即玉蜀黍黄素二棕榈酸酯1 。但对其多糖的研究国内外未见报道，为深入开发这一丰富自然资源，本实验对其多糖进行了提取、纯化及抗氧化的研究，为苦蘵的中药现代化奠定了一定的理论基础。1 材料与方法1.1 试剂与仪器DPPH试剂 美国Sigma公司，2-硫代巴比妥酸 上海国药集团化学试剂有限公司，其他试剂均为国产分析纯；5810R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司，723型可见分光光度计 山东高密彩虹分析仪器有限公司，RE-52AA型旋转蒸发器 上海雅荣生化设备仪器有限公司，BP221S型电子天平 德国赛多利斯。1.2 多糖的提取及初步分离纯化称取苦蘵鲜果1 000 g烘干，加一定量的水60 W超声6 min，8 000 r/min离心7 min，上清液抽滤后浓缩，用醋酸乙酯加热回流1h进行除脂脱色2，再用Sevage法3去除蛋白得粗多糖。1.3 醇沉条件的研究1.3.1 浓缩比将粗多糖溶液浓缩后，分别加入4倍体积95%的乙醇，4下醇沉12 h。多糖用一定量的蒸馏水溶解后测定含量。1.3.2 温度取3份粗糖溶液分别加入4倍体积的95%乙醇，然后置于-20，4，室温（25）进行醇沉。溶解后分别测其多糖含量。1.3.3 醇沉比取5份粗糖液分别以11,12，13，14，15（糖液95%乙醇）比例加入乙醇。在4醇沉12 h。溶解后测多糖含量。1.3.4 醇沉时间4分别选择4，8，12，16，18，20，24 h进行多糖含量检测，其他条件均按摸索的最佳条件设置。1.3.5 pH分别选择pH为4，5，6，7，8，9,6个值进行多糖含量检测，其他条件均按摸索的最佳条件设置。1.4 体外抗氧化的研究1.4.1 对OH的抑制作用5采用亚铁离子催化过氧化氢产生OH（根据Fenton反应原理），由于OH可特异地使番红褪色，根据褪色程度用比色法来测量OH的含量。4 ml体系中包含150 mmol/L,pH=7.4的磷酸缓冲溶液1.5 ml，260 g/ml 番红花红0.2 ml，0.56 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠(Fe2+EDTA)0.7 ml,1% H2O2 0.8 ml，各浓度糖液0.8 ml。1.4.2 对肝脂质过氧化的抑制6过氧化脂质的二级分解产物丙二醛能与硫代巴比妥酸反应生成红色产物，在532 nm处有最大吸收。大鼠脱颈处死后迅速分离肝组织，用生理盐水洗净,冰浴下匀浆，制成0.5%的肝匀浆液。取匀浆液各1 ml，加入不同质量浓度的糖液1 ml和6 mmol/L,EDTA-Na-Fe（） 100 l,最后加60 mmol/L H2O2 100 l。以生理盐水代替糖液和H2O2为空白，以生理盐水代替糖液为对照，整个体系为2.2 ml。在37下水浴1 h后，加入1 ml15%TCA终止反应，再加入1 ml体积分数0.7%TBA,于沸水中显色15 min,冷却后离心，测532 nm处上清液的OD值。1.4.3 对有机自由基DPPH的清除作用7DPPH分光测定法的测定原理是依据DPPH在517 nm处有一强吸收峰,其乙醇溶液呈深紫色。当有自由基清除剂存在时,由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系,因而可用分光法进行定量分析。抗氧化活性以清除DPPH自由基能力大小表示。各取2 ml 0.2 mmol/L的DPPH溶液（以乙醇为溶剂），加入不同质量浓度的糖液。以50%乙醇代替DPPH为空白，以50%乙醇代替糖液为对照。摇匀后在室温下反应30 min,517 nm处测吸光度。2 结果2.1 醇沉条件对多糖提取率的影响醇沉法提取苦蘵多糖时浓缩比、温度、醇沉倍数、pH、时间对多糖提取率的影响。结果见表15。表1 浓缩比对多糖提取影响（略） 由表1可见，多糖浓度随浓缩比的增加而增加，当浓缩比达到41时，多糖浓度达到峰值，再增大浓缩比多糖浓度反而下降，说明41为最佳浓缩比。 由表2可见，多糖浓度随温度的降低而增加，但变化幅度并不明显，考虑到工业生产，因此选择在4进行醇沉。表2 醇沉温度对多糖提取的影响（略） 由表3可见，多糖浓度随醇沉倍数的增加而增加，当醇沉倍数为4时，多糖浓度达到峰值。表3 醇沉倍数对多糖提取的影响（略） 由表4可见，多糖浓度随时间的延长而增加，当醇沉时间达到16 h时，多糖浓度达到峰值。表4 醇沉时间对多糖提取的影响（略） 由表5可见，在酸性条件下，得到多糖浓度较低，当pH升高到7时达到峰值，在碱性条件下，得到的多糖浓度略有下降。综合上述试验结果，得出苦蘵果实中多糖提取的最佳条件为：浓缩比41,醇沉温度-20，醇沉倍数41,pH为7，醇沉时间为16 h。此条件下，1 000 g鲜果中提取多糖量为31.5 g。表5 醇沉pH对多糖提取的影响（略）2.2 体外生物活性实验2.2.1 对OH的抑制作用羟自由基(OH)被认为是毒性最强的活性氧自由基，可直接损伤各种生物膜，导致多种疾病发生，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成。本实验结果表明，苦蘵中多糖体外有显著的清除羟自由基的作用（见图1）。当多糖浓度超过0.39 mg/ml时，即有明显的清除羟自由基的作用，随着多糖浓度的升高，其清除作用也逐渐加强，呈现量-效关系。2.2.2 对大鼠肝质脂过氧化的抑制作用由Fe2+H2O2系统产生的OH-可诱导质脂过氧化反应，生成丙二醛。实验表明，苦蘵中多糖在体外能明显抑制OH-诱导大鼠肝脏质脂过氧化，氧化产物丙二醛的含量随加入多糖的浓度的上升而下降，呈量效关系。但当多糖浓度大于0.1 mg/ml，多糖对脂质过氧化的抑制率接近80%，不再继续升高。见图2。2.2.3 对有机自由基DPPH的清除作用如图3，实验证明，苦