（生物医学工程专业论文）中药材（石斛）鉴定特异性gDNA探针的筛选与应用研究.pdf

东南大学博士学位论文本论文所获得的主要研究成果如下：1 筛选g d n a 种特异性探针的“s s h a r r a y ”新技术该方法是将抑制性差减杂交与基于尼龙膜微阵列杂交相结合。首先足用抑制性差减杂交获得两个品种之间的g d n a 差异片段，然后用这些g d n a 差异片段与由所有研究晶种的g d n a 制各成的微阵列杂交筛选到某一个品种的种特异性g d n a 片段。这些种特异性g d n a片段可以作为种特异性探针进行物种鉴定。在该研究中，以迭鞘石斛( d a u r a n t i a c u mk e r r ) ，金钗石斛( d n 。6 el i n d ) ，铁皮右斛( n 研钯加口膪k i m u r ae tm i g o ) ，鼓槌石斛( d c h r y s o t o x u ml i n d l ) 流苏( d f i m b r i a t u mh o o k ) 为材料，对该方法的可行性进行了研究。结果显示：五种石斛的阳性克隆率最低7 8 1 ，晟高8 4 6 ，阳性克隆率平均达到8 2 3 ，元种石斛种质特异性探针的阳性探针筛选率最低7 9 ，最高1 4 6 ，平均达到1 2 1 ，初步获得了2 5 个种特异性探针。结果表明该方法能够有效地进行g d n a 种质特异性探针筛选。2 多重种质特异性操针o m i t i p i es p e c i e l ；一l ；p e c i f i c9 0 mp r o b e l ；。m s s p ) 的石斛鉴定用“s s h a r r a y ”方法从5 种石斛中筛选到的1 4 个种质特异性探针点样制备成微阵列，地高辛标记的不同的商品石斛样本和伪品的9 1 ) n a 与该微阵列杂交成功地对五种常见的石斛品种其中包括中国药典收录的三种石斛进行了鉴定。对这些特异性探针的序列结构、有效性及特征进行了研究。结果显示出多重种质特异性探针能够准确地鉴别不同的商品石斛样本、混合材料中的靶样本及伪品。3 研究遗传多态性的“d iv e r l ；i t ys s h - a r r a y ”新方法基因组d n a 的多态性在研究不同物种闯的生物多样性和遗传特征追踪等方面具有非常霞要的意义。“d i v e r s i t ys s h a r r a y ”技术首先通过抑制性差减杂交获得随机配对的两个品种之间的差减片段，差减片段进行克隆后，用这些差减克隆建立差减g d n a 文库。从差减g d n a 文库中随机挑选差减克隆制备多样性差减微阵列( d i v e r s i t ys s h - a r r a y ) 。d i v e r s 时s s h o a r r a y 与d i g 标记的待分析样本的g d n a 杂交获得d n a 多态性图谱。六个石斛品种作为该项研究的材料其中的四个品种作为t e s t e r 进行抑制性差减杂交，共获得6 1 7 个阳性差减克隆，平均阳性克隆率8 0 3 。四个品种两两比较的平均多态片段率高达4 2 4 ，依据六个品种的多态图谱建立了遗传亲源树状图。结果表明d i v e r s i t ys s h a r r a y 为研究不同样本g d n a 多态性及遗传距离提供了一个低成本、有效的分析技术甲台。4 石斛种特异性引将的筛选我们以“s s h a r r a y ”方法从5 种石斛中筛选到的1 0 个种质特异性探针序列为基础，设计了1 0 对引物。其中的两对引物能够从它们所代表的样本中扩增出单一条带而不能从其它四个品种样本和石仙桃中扩增出条带。一对为流苏石斛的种特异性引物，另一对为鼓槌石斛的种特异性引物。这两个引物能够分别从其它四个品种和石州 桃中鉴别出流苏白斛或鼓褪_ ii i摘要斛。结果显示该方法是方便可行的。关键词：石斛，中药鉴定，基因组d n a ，d n a 微阵列，筛选，种质特异性探针，多熏种质特异性探针，遗传多态性，亲缘树状图，种质特异性引物。i i i东南大学博士学位论文a b s t r a c tt i t l e ：s t u d i e sa n da p p l i c a t i o n so ns c r e e n i n gs p e c i e s - s p e c i f f i cg d n ap r o b e sf o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o no f c h i n e s eh e r b s ( d e n d r o b r i u m )c a n d i d a t ed o c t o r ：l it o n g - x i a n gs u p e r v i s o r ：p r o f l uz u h o n gn a m eo ft h eu n i v e r s i t y ：s o u t h e a s tu n i v e r s i t ys p e c i e si d e n t i f i c a t i o ni sag r o w i n gf i e l do fi n t e r e s tw i t h i nt h es t u d yo fp a t h o g e n i cp r o k a r y o t e s ，v i r u s e sa n de u k a r y o l e sd u et od i a g n o s t i c ，t a x o n o m i c ，e p i d e m i o l o g i c a l ，m e d i c a la n ds o c i - e c o n o m i ci m p o r t a n c e t h e r ea r ea b u n d a n tr e s o u r c e so f c h i n e s eh e r bi nc h i n a h o w e v e r , t h ec u r r e n tu s e dc h i n e s ed r u g si nm a r k e t sd e r i v ef r o md i f f e r e n tr e s o u r c e s o n es p e c i e so f t e ni su s e da st h eo t h e r , a n dt h ea d u l t e r a n t sa r eu s e da sc h i n e s eh e r b t h e s eb a d l yd e s t r o yt h es a f eu s a g e sa n dt h eq u a l i t yo fc h i n e s eh e r b e s i ti se m e r g e n tt of i n dar a p i da n da c c u r a t em e t h o df o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o no fc h i n e s ec r u d eh e r b h o w e v e r , t h et r a d i t i o n a la p p r o a c h e sf o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o n sa r eb a s e do nm o r p h o l o g i c a l ，a n a t o m i c a la n dc h e m i c a la n a l y s e s ，w h i c ha r eo f t e na f f e c t e db ye n v i r o n m e n t a la n dd e v e l o p m e n t a lf a c t o r sd u r i n gg r o w t h t oo v e r c o m et h e s el i m i t a t i o n s ，m a n ym o l e c u l a rt e c h n i q u e sw e r ed e v e l o p e df o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o nb yg e n o t y p i cp a t t e r n s ，i n c l u d i n gr i b o t y p i n g , r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) ，p c ra m p l i f i c a t i o no ft h ei n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r1 6 s 一2 3 s ( i t s1 6 - 2 3 sp c r ) ，i t s - p c r - r f l p ，p c r - s p e c i f i ci d e n t i f i c a t i o na n dm i pg e n es e q u e n c i n g t h o s em e t h o d sp r o v i d ep o s s i b l et o o l st oi d e n t i f ys p e c i e sd i r e c t l yb a s e do nt h e i rg e n o m i cs e q u e n c e s h o w e v e r ，n o n eo ft h e mh a sb e e na p p l i e da sar o u t i n ea n dr e l i a b l em e t h o df o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o np o s s i b l yd u et ot h e i ri n c o n v e n i e n td e t e c t i o np r o c e s s e so ri n c o n s i s t e n tr e s u l t s d n ac h i pt e c h n o l o g i e se x t e n s i v e l yh a v eb e e na p p l i e di nm a n yf i e l d si n c l u d i n gd n as e q u e n c i n g b yh y b r i d i z a t i o n , a n a l y s i so fs i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，g e n ee x p r e s s i o na n a l y s i s ，g e n ed i a g n o s i s ，d r u gs c r e e n i n ga n ds p e c i e si d e n t i f i c a t i o n h o w e v e r , w h e ni ti su s e dt oi d e n t i f ys p e c i e s ，t h el i m i t a t i o ni nt h en u m b e ro fs p e c i e s - s p e c i f i cp r o b e sh a sb e c o m et h eb o t t l e n e c ki ns p e c i e si d e n t i f i c a t i o nu s i n gp r o b e d e p e n d e n tt e c h n i q u e st h e r ea r et w op o s s i b l ea p p r o a c h e st oi m p r o v i n gs u c hm e t h o d s o n ei st of i n dn e ws p e c i e s - s p e c i f i cp r o b e st h a ta r ea b l et od i s t i n g u i s hb e t w e e nc l o s e l yr e l a t e ds p e c i e s ，a n da n o t h e ri st ou s em u l t i - s p e c i e s - s p e c i f i cp r o b e st oi d e n t i f yt h es p e c i e s t h e r e f o r e ，i ti sn e c e s s a t 3 t od e v e l o pn e wm e t h o d si nt h ed i s c o v e r yo f h i g h l ys p e c i e s s p e c i f i cg d n as e q u e n c e s ，e s p e c i a l l yi nt h ew h o l eg e n o m i cf i e l d u s e dd e n d r o b r i u ma se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s ，an o v e lt e c h n o l o g yc a l l e ds s h a r r a ya r ef i r s td e v e l o p e df o rs c r e e n i n gs p e c i e s - s p e c i f i cd n ap r o b e sf r o mt h eg e n o m i cd n a ( g d n a ) an u m b e ro fs p e c i e s - s p e c i f i cd n ap r o b e sa r es u c c e s s f u l l ys c r e e n e do u t s e c o n d ，am e t h o do f摘要m u l t i p l es p e c i e s s p e c i f i cp r o b e s ( m s s p ) f o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o ni se s t a b l i s h e ds o m ed e n d r o b r i u ms p e c i e sa r ei d e n t i f i e dc o r r e c t l y b a s e do nt h es s h a r r a yt e c h n o l o g y an e wa p p l i c a b l ep l a t f o r mc a l l e dd i v e r s i t ys s h - a r r a yf o rp r o f i l i n gg e n o m i cd n ap o l y m o r p h i s m s ，w h i c hi su s e de f f e c t i v e l yt oa n a l y z eg e n o m i ed n ap o l y m o r p h i s m so f6d e n d r o b r i u ms p e c i e sa n dp r o d u c ed e n d r o g r a m f u r t h e r m o r e ，b a s e do nt h es e q u e n c e so fs p e c i e s s p e c i f i cp r o b e st w od e s i g n e dp r i m e rp a i r sw e r ef o u n dt ob ec a p a b l eo fa su n i q u ep r i m e r s i tp r o v i d e san e ww a yf o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o nb yp c r t h en l a j o rc o n t r i b u t i o n sa r ed e s c r i b e da sf o l l o w s1 “s s h a r r a y ：an o v e lt e c h n o l o g yf o rs c r e e n i n gs p e c i e s - s p e c i f i cd n ap r o b e st h em e t h o dc o m b i n e st h es u p p r e s s i o ns u b t r a c t i o nh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) a n dd n aa r r a yt e c h n i q u et of i n ds p e c i e s s p e c i f i cd n ap r o b e sf r o mt h eg e n o m i cd n a ( g d n a ) f o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o n t h cm e t h o df i r s to b t a i n st h ed i f f e r e n t i a lg d n af r a g m e n t sb e t w e e nt w os p e c i e sb ys s h ，a n dt h e nh y b r i d i z e st h ed i f f e r e n t i a lg d n af r a g m e n t sw i t ht h ea r r a y sm a d eo fm u l t i p l ew h o l eg e n o m e sf r o ms e v e r a ls p e c i e st os o ! t e e nt h eu n i q u eg d n af r a g m e n t sf o ro n es p e c i e s t h es c r e e n e du n i q u eg d n af r a g m e n t sc a nb eu s e da ss p e c i e s s p e c i f i cp r o b e sf o ri d e n t i 6 ，i n gt h es p e c i e st h e yr e p r e s e n tf r o ma l lo t h e rs p e c i e s w eu s e df i v es p e c i e so f t h eg e n u sd e n d r o b r i u m ：d a u r a n t i a c u mk e r r , d o f f i c i n a l ek i m u r ae tm i g o , d n o b i l el i n d l ，d c h r y s o t o x u ml i n d l ，a n dd f i m b r i a t u mh o o k a se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l st os t u d yt h ef e a s i b i l i t yo f t h em e t h o d t h er a t i o so f p o s i t i v ec l o n e so f t h e5s u b t r a c t e ds p e c i e s v a r y f r o m7 8 1 u p t o8 6 4 t h ea v e r a g er a t i o o fp o s i t i v ec l o n e so f t h e5s u b t r a c t e ds p e c i e sr e a c h e s8 2 3 t h er a t i o so f s p e c i e s - 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d i g e s t e dd n a so f t e s t e ds a m p l e sw e r el a b e l e db yp c rr e a c t i o nw i t hd i g p r i m e r ，a n dt h e nh y b r i d i z e dw i t ht h ed n aa r r a y w es u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e df i v ec o m m o m l y u s e dd e n d r o b i u ms p e c i e si n c l u d i n gt h r e eo fh e r b ad e n d r o b i il i s t e di nt h ep r c p h a r m a c o p o e i ab yu s i n gm u l t i p l es p e c i e s s p e c i f i cg d n ap r o b e s ( m s s p ) t h ec o n s t r u c t i o n ，v a l i d a t i o na n dt h ev东南大学博士学位论文c h a r a c t e r i s t i c so ft h e s es p e c i f i cp r o b e sa r ed e s c r i b e d t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tm s s pc o u l de x a c t l yi d e n t i f yt h e s ec o m m e r c i a ls a m p l e s ( h e r b ad e n d r o b i i ) a n dc o u l dd e t e c tt h e i rt a r g e ts a m p l ef r o mac o m p l e xm a t e r i a la n da d u l t e r a n to fh e r b ad e n d r o b i ic o r r e c t l y 3 d i v e r s i t ys s h - a r r a y ：an o v e lm e t h o df o rp r o f i l i n gg e n o m i cd n ap o l y m o r p h i s m sa n dp r o d u c i n gd e n d r o g r a mg e n o m i cd n ap o l y m o r p h i s m sa r ev e r yu s e f u lf o rt r a c i n gg e n e t i ct r a i t sa n ds t a d y i n gb i o l o g i c a ld i v e r s i t ya m o n gs p e c i e s t h em e t h o df i r s to b t a i n st h es u b t r a c t e dg d n af r a g m e n t sb e t w e e na n yt w os p e c i e sb ys u p p r e s s i o ns u b t r a c t i o nh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) t oe s t a b l i s has u b t r a c t e dg d n al i b r a r yf r o mw h i c hd i v e r s i t ys s h a r r a ya r ef a b r i c a t e dw i t ht h es e l e c t e ds u b t r a c t e dc l o n e s t h ed i v e r s i t ys s h - a r r a yh y b r i d i z e sw i t ht h ed i g - l a b e l e dg e n o m i cd n ao ft h eo r g a n i s mt ob ea s s a y e dt op r o f i l eg e n o m i cd n ap o l y m o r p h i s m s s i xc l o s e l yr e l a t e dd e n d r o b i u ms p e c i e sw e r es t u d i e da sm o d e ls a m p l e s f o u rd e n d r o b i u ms p e c i e sa st e s t e rw e r eu s e dt op e r f o r ms s h at o t a lo f6 1 7s u b t r a c t e dp o s i t i v ec l o n e sw e r eo b t a i n e df r o mf o u rd e n d r o b i u ms p e c i e sa n dt h ea v e r a g er a t i oo f p o s i t i v ec l o n e si s8 0 3 w ed e m o n s t r a t e dt h a tt h ea v e r a g ep e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i cf r a g m e n t so fp a i r w i s ec o m p a r i s o n so ff o u rd e n d r o b i u ms p e c i e si su pt o4 2 4 ad e n d r o g r a mo f6d e n d r o b r i u ms p e c i e sr e l a t e d n e s sw a sp r o d u c e da c c o r d i n gt ot h e i rp o l y m o r p h i cp r o f i l e s t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h ed i v e r s i t ys s h - a r r a yi sah i g l l ye f f e c t i v ep l a t f o r mf o rp r o f i l i n gg e n o m i cd n ap o l y m o r p h i s m sa n dd e n d r o g r a m 4 am e t h o df o rs c r e e n i n gs p e c i e s - s p e c i f i cp r i m e r sb a s e do nt h es e q u e n c e so fs p e c i e s - s p e c i f i cp r o b e so f5d e n d r o b i u ms p e c i e ss c r e e n e db ys s h -a r r a yt e c h n o l o g y ，1 0p r i m e rp a i r sw e r ed e s i g n e d t w oo u to ft h ed e s i g n e dt e np r i m e rp a i r sw e r ef o u n dt ob ec a p a b l eo f a m p l i f y i n gau n i q u ef r a g m e n tf r o mt h e i rr e p r e s e n t a t i v es p e c i e sb u tn o tf r o mt h eo t h e r4s p e c i e sa n dp h o l i d o t ac a n t o n e n s 括o n ep a i ro fs p e c i e s - s p e c i f i cp r i m e r si sf o rd f i m b r i a t u mh o o k a n o t h e ri sf o rd c h r y s o t o x u ml i n d l t h e yc o u l db eu s e dt od i s t i n g u i s hd 乒m b r i a t u mh o o k a n dd c h r y s o t o x u ml i n d l f r o mt h eo t h e r4s p e c i e sa n da d u l t e r a n t ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h em e t h o dt of i n ds p e c i e s - s p e c i f i cp r i m e r si sf e a s i b l ea n dc o n v e n i e n t k e yw o r d s ：d e n d r o b r i u m , s p e c i e si d e n t i f i c a t i o no fc h i n e s eh e r b s ，g e n o m i cd n a d n am i c r o a r r a y , s c r e e n i n g , s p e c i e s - s p e c i f i cd n ap r o b e s ，m u l t i p l es p e c i e s - s p e c i f i cd n ap r o b e s ，g e n e t i cp o l y m o r p h i s m s ，d e n d r o g r a m ，s p e c i e s s p e c i f i cd n ap r i m e r 东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同t 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名日期东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南人学研究生院办理。研究生签名导师签名第一章绪论第一章绪论1 1 中药品种鉴定在中药质量控制中的地位与发展中药的质最控制涉及中药的品种、种植、采收加 _ 、炮制、制剂、有效成分含量、重金属、农药残留量检查以及药效学、安全性评价、临床验证等系列工作。中药包括植物约和动物药，品种繁多，其疗效与药材品质有着密不可分的关系。为了保证中药的安全性和有效性，数千年以来，中药一直处于不断标准化、规范化的进程中，在中药质量控制中，中药晶种的分类鉴定是其首要任务，也是中药质量控制的基础1 1 1 。1 1 中药品种的现状我国现有已知中药资源种类1 2 8 0 7 种，其中药用植物1 1 1 4 6 种( 占总资源种的8 7 ) ，药用动物1 5 8 1 种( 占总资源种的1 2 ) ，药用矿物8 0 种( 占总资源种的1 ) ；其中药用动、植物涉及生物分类的科、属分别为3 9 5 科与3 8 3 科，8 6 2 属与2 3 0 9 属。以被子植物为例，我国共有2 9 1 科，3 0 8 2 属和2 4 3 5 7 种，其中药用者就有2 3 1 科，1 9 5 属和1 0 0 2 7 种( 含1 0 6 3 个种以下等级) ，药用比例超过1 3 。真可谓品种众多，基源复杂。中药品种的多基源性由来已久，图经本草、证类本草中一药数图甚多。现代的中华人民共和国药典2 0 0 0 年版，收载的中药材共有5 3 4 中，据万德光等 1 统计其中有1 4 3 种中药为多基源( = 基源以上) ，占收载总数的2 7 ，其中二基源的有9 2 种，三基源的3 8 种，四基源的有8 种，五基源的有4 种，六基源的有1 种，网科不同属的有2 1 种，不同科者有4 种。从以上收载的中药基源背景中，已可窥视出中药品种的复杂性。实际上中药的品种要比中国药典所揭示的复杂得多。我国药材资源丰富，药用动植物约1 万余种。但目前使用的药材来源复杂，时有互混、互代、以假充真现象存在。为确保中药使用安全有效，对各种药材进行准确鉴定显得十分必要。这些情况都向我们提出了中药品种鉴定的重要性和艰巨性。1 1 2 中药品种鉴定是中药质量控耕的首要环节中药质量控制涉及许多环节，是一个多学科协作的复杂系统工程，而品种的确认鉴定应为质量控制系统的首要环节。谢宗万研究员在论述中药品种鉴定的重要性时曾精辟地指出：“品种一错，全盘皆否。”这就是说，中药质量控制涉及许多环节，是一个多学科协作的复杂系统一l 程，而品种的确认鉴定应为质量控制系统的首要环节。例如，曾经在中药大黄商品中出现过河套大黄r h e u m h o t a o e n e sc y c h e n g e tc t k a o ，后经卫生部药检所动物实验证明，该品泻下作用很差，而且根据临床报道，其有致腹痛的副作用，因而不能作为中国药典规定的中药大黄药用，给予了纠正。中药的品种鉴定是一项长期的任务。中药晶种的正确使用是中药质量控制不容忽视的首要环节。1 1 3 中药品种分类鉴定依据及方法的发展白林奈提出“自然系统”的思想以来，全世界的分类学家已给2 0 0 万种生物进行了命名这是我们今天利用生物资源分类的基础。传统上中药的物种分类鉴定和亲缘关系的确认，一东南人学博士学位论文直运片j 经典的形态分类学，这种分类方法是建立在个体性状描绘和宏观观测水平上的，易受环境影响，其总体可靠性也存在一些争议，但这种方法至今仍作为药用植物分类和中药品种鉴定的重要手段。传统生药鉴定主要包括：基源鉴定、性状鉴别、显微鉴定、理化鉴定、生物检定。传统的中药餐定手段有形态分类、解剖学特址以及理化鉴别等。但许多药材亲缘关系较近，外形类似，或经过加工后已不能辨别出原貌，此时传统的方法已不能满足需要。随着生物新技术的不断涌现和更新它们也不断地被应用到中药鉴定领域，推动着中药鉴定技术的不断进步和完善。特别是随着分子生物学技术的诞生和发展，以药材基因型特征为鉴定指标的d n a 分子遗传标记鉴别法以及其他一些分子生物学鉴别方法以其准确可靠的特点已在中药鉴定中得到了迅猛的发展，蛋白电泳法和核酸分析法作为新的分子生物学技术，正逐渐在中药鉴定。1 二作中得到广泛应用。蛋白电泳法在中草药品种鉴定中应用较早，但其应用有局限性，因草药中蛋白含量低，且药用时多为干品，常有蛋白变性现象。而核酸作为生命物质的遗传基础，用于品种鉴定更为直接、可靠。到目前为止，已有多种动、植物药材用此法进行了鉴定，如蛇类、贝类、西红花、溪黄草、郁金、莪术、人参、细辛、姜黄和葛根等，对中药鉴定学科产生了深远的影响。同时，随着该类技术在中药鉴定实践中的不断应用和日臻完善，将为革新法定的药品检验方法、提高名贵动植物药材捡验技术的准确性和先进性做好理论和物质上的准备。1 1 4 研究范围从物种问深入到物种内在以往的鉴定工作中，t 作重点主要放在对中药材进行物种鉴定和药材的种间鉴别。这些研究的目的一方面是要解决中药与其类似品、混淆品、伪品之间的差异，以保证临床用药的安全，比如：中药海藻及几种类同晶的性状和组织构造鉴别口】，4 6 批冤丝子检品中混伪品来源鉴定口】等，另一方面其研究目的是对中药的品质优劣进行评价，使临床用药疗效稳定可靠。如王岩、王婴等通过对不同药用部位和不同采收期藤荣中蛇葡萄素的含量比较”j ，探索出获得优质高产的藤茶适宜的采收期。然而，越来越多的研究表明：由t - 自然界生物的多样性，箨式各样的差异不仅存在于物种之间，而且还存在于种以f 分类等级。近年来，研究者们越来越多地关注此类科学问题。例如，乇寅等对崧蓝不同栽培居群进行等位酶分析研究，得出崧蓝不同栽培居群的等位谱有明显差别表明崧蓝种内存在遗传变异【，j 。不同栽培括群红花f 6 1 组织学特征和化学成分含量也存在着明显差异。中药材在生长过程中除了会发生遗传变异外，还有可能发生其他的变异( 7 1 ，如生境变异、栽培变异等：有人己发现这些变异使不同产地的广蕾香在株型、花叶等组织形态特征l 以及化学成分”等方面都有明显的不同。除此之外，还表现在药材的野生变家种如甘遂”“，因长期栽培引起的变异如牛膝、山参和圃参、丹参与栽培丹参、黄连等【“。人们关注不同产地药材的变异、野生变家种的变异以及长期栽培发生的种质变异等类问题是因为这些变异直接影响着中药的临床疗效。何冰等分别把高要产的广霍香和吴川产的广藿香进行研究，发现两种广霍香在总体效应方面对解赊胃肠道痉挛和促进消化有明显不同】；不同栽培居群红花的活血化瘀作用也有差异1 1 “。以上2第一章绪论研究的结果虽各不相同，但中药鉴定的研究对象由以往的种间若异深入到种f 分类单位的筹异，研究对象已经增加，研究视野已经拓宽12 3 。1 1 5 研究手段不断推陈出新近2 0 年来，随着科学技术蓬勃发展，涌现出许多新的学科，同时这些新的学科也1 ；断遣渗透到中药鉴定的研究中来，新的学科开辟了新的思路，不仅引进了许多新的技术手段，而且对中药鉴定j 二作的发展产生了深远的影响。目前，中药鉴定学已成为多学科参与、综合性科学技术应用的平台，已有许多中药鉴定中的技术和理论难题得到较好地解决“”。( 1 ) 在基原鉴定方面分子生物学技术的引进，逐步出现了利用中药所含的蛋白质、抗血清、同工酶、染色体等方法进行中药鉴定的研究，从而有效地解决了动、植物的基原鉴定中存在盼许多疑难问题。例如：丁培贤等利用虎、豹等骨骼中的特异抗原成分制备d h 一虎、豹骨检定试剂，采用免疫电泳法及琼脂免疫扩散法不仅可以准确检定虎、豹等多种动物的骨髓，还能将豹骨进一步检定为雪豹、云豹或金钱豹i l 。郭月秋等用抗梅花鹿血清进行免疫凝集试验以鉴别鹿心与其伪品牛心、羊心、猪心，结果表明抗梅花鹿血清与不同来源的鹿心组织均产生显著的凝集反应，而与伪品组织不发生凝集反应。这些方法的应用对于解决长期存在盼因动物类中药缺乏特异的次级代谢产物或专属性强的化学成分而无法准确鉴定的难题无疑有突破性进展。( 2 ) 在组织形态鉴别方面以往多是利用光学显微镜来观察中药的组织构造、细胞形态以及细胞内含物的特征，用以鉴定药材晶种的真伪和中药的品质评价。由于中药的组织结构和细胞形态缺乏种属特鼻性，所以在鉴别中存在局限性。随着现代电子仪器的广泛应用，使电子显微镜、扫描电子显微镜、放射自显影等技术的迅速发展，促进了显微鉴定的研究，目前，已从显微亚显微到分子水平，内质网、微管、微粒体等新细胞器不断发现，阐明了核酸与蛋白