（纺织化学与染整工程专业论文）微生物脱色及生物酶皂洗研究.pdf

摘要 从染料厂污泥中成功分离出具有高效脱色作用的细菌菌株a 3 ，并对a 3 菌株的 脱色条件进行了系统的研究。结果表明，该菌株适宜生长的p h 值范围较广在5 - 9 之间，最佳生长p n 值为8 0 ；温度在2 5 5 0 。c 细菌都能正常代谢，最适生长温度范 围为3 0 , - - - 4 5 ，超过5 5 ，细菌代谢缓慢，逐渐死亡。碳源对细菌脱色的影响不 大，几种常规碳源对细菌脱色的差别不大，而氮源对细菌脱色的影响较大，有机类 氮源要比无机类氮源脱色效果好的多，该菌株对多种常用活性染料脱色效果优异。 利用细胞破碎法，从细菌体内分离出了具有脱色作用的酶，并对该脱色酶的应 用条件做了相应研究。结果表明，该酶是一种胞内酶。 自制的生物酶最佳使用条件为：温度5 0 c ，p h = 7 5 。生物酶对活性染料脱色效 率较好，低染料浓度下，对大部分活性染料1 0 m i n 内的脱色率能达到8 0 以上，对 蓝色及红色染料脱色率1 0 m i n 能达到9 5 以上，对黄色脱色率稍低，1 0 r a i n 脱色率 在5 0 以上。该酶对活性染料脱色具有一定的广谱性。 将自制的生物酶脱色系统用于活性染料染色的后皂洗工艺，并对其应用效果做 了系统研究。结果表明酶皂洗能够取代一部分常规皂洗工艺，与常规皂洗相比，酶 洗后织物的色光基本没有变化，对一些活性染料酶洗能保持或提高干湿摩擦牢度0 5 级，皂洗牢度二者差别不大。生物酶皂洗节能、节水、节时，符合绿色环保工艺， 具有极大的发展前景。 关键词：微生物；脱色；生物酶；皂洗 a b s t r a c t ab a c t e r i a ls t r a i na 3c a p a b l eo fd e c o l o r i z i n gr e a c t i v ed y e si si s o l a t e df r o mt h es o i l c o l l e c t e df r o md y ei n d u s t r y t h er e s u l ts h o w st h a tt h i ss t r a i nh a sa b i l i t yt od e c o l o r i z e v a r i o u sr e a c t i v et e x t i l ed y e s t h ec o n d i t i o no fd e c o l o r i z i n gw a sr e s e a r c h e d t h er e s u l ts h o w st h a tt h ep hc o n d i t i o n i sr a n g ef r o m 5t o9 ，t h eo p t i m u mp r ii s8 t h eb a c t e r i ac a ng r o wn o r m a l l yu n d e rt h e t e m p e r a t u r eo f 2 0 5 0 。c ，a n dt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei s3 0 - - 4 5 c t h eb a c t e r i aw i l ld i e s l o w l yw h e nt h et e m p e r a t u r ei sb e y o n d5 5 。c c o m p a r e dt h ee f f e c to fn i t r o g e nr e s o u r c e s t h ee f f e c to fc a 】c b o nr e s o u r c e si sv e r ys m a l l t h eo r g a n i cn i t r o g e nr e s o u r c e sa r eb e t t e r t h a ni n o r g a n i cr e s o u r c e sf o rd e c o l o r i z i n g v a r i o u sr e a c t i v ed y e sc a nb ed e c o l o r i e db yt h i s l 【i n do f b a c t e r i a ls t r a i na 3 a r te n z y m ew a si s o l a t e df r o mt h ee e l lo fb a c t e r i a ；t h er e s u l ts h o w st h a ti th a st h e a b i l i t yt od e e o l o r i z ed y e s t h ec o n d i t i o no fd e c o l o r i z i n gw a sr e s e a r c h e d t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ef o rd e c o l o r i z a t i o ni s5 0 4 c ，a n dt h eo p t i m u mp hi s7 5 e n z y m ei sv e r y e f f i c i e n tf o rd y e sd e c o l o r i z a t i o n u n d e rl o ws t r e n g t h , i tc a nd e c o l o r i z em a n yk i n d so f r e a c t i v ed y e s8 0 u n d e r10 m i n , 9 5 f o rb l u eo rb l a c kd y e s ，5 0 f o ry e l l o wo n e s t h ep r o p e r t i e so ft h es o a p i n ge n z y m ea n di t su s ei nr e a c t i v ed y e ss o a p i n gp r o c e s s w e r es t u d i e d e n z y m es o a p i n gp r o c e s sc a nk e e po re n h a n c et h ef a s t n e s st ow e tc r o c k i n g o f r e a c t i v ed y e df a b r i cb y0 5 d e g r e ec o m p a r e d 、7 l ，i t l lt r a d i t i o n a ls o a p i n gp r o c e s sa n d i th a s n oa d v e r s ee f f e c to nc o l o rp r o p e r t i e s w h i l ee n z y m es o a p i n gp r o c e s si sa ne n v i r o n m e n t f r i e n d l yp r o c e s so f f e r i n gt h ea d v a n t a g e so fe n e r g y - s a v i n g , w a t e r - s a v i n ga n d t i m e - s a v i n g k e y w o r d s ：m i c r o o r g a n i s m ；d e c o l o r i z e ；e n z y m e ；s o a p i n g 2 学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。文中 依法引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果。 本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。 论文作者签名：欷砬 吼下缸日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。 学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校 后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为 青岛大学。 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密 ( 请在以上方框内打“妒) 论文作者签名：缘趁 啸w 年易肌日 5 3 第一章引言 第一章引言 一直以来，直接、活性、酸性等水溶性染料的湿摩擦牢度因常常不能满足客户 要求而一直被人们所关注。尤其是纤维素纤维焉活性染料染深色时( 7 0 。w 似上) ， 因为没有与纤维发生共价键结合而未固着的活性染料量很多，从而使湿摩擦牢度成 为老大难的闯题。棉孀皂洗剂是印染厂常爝的染色岳处理助剂，主要起着洗去未与 纤维结合而固着的活性染料的作用。传统的皂洗剂如丙烯酸盐型，主要是通过与水 解染料络合作用，清除织物表面的浮色，阻止洗液中的染料奔回洁到布面，提高织 物的水洗牢度，但对深色染色织物的湿摩擦牢度作用不明显。同时，染色后，使用 固色剂进行固色，通过形成色淀、交联与成膜，使摩擦牢度能够得到一定程度的改 善，但缝往是圃色效果好，澎摩擦牢度提升高，染色色光的改变也大嘲。新型生物 酶皂洗工艺的出现为皂洗剂的发展开辟了个新的领域。与传统的活性染料皂洗正 艺相比，生物酶皂洗工艺利用生物酶去除染液中未霉着的染料和东解染料，生物酶 皂洗后织物的各项牢度指标均优于传统皂洗工艺，且可缩短皂洗时间，降低耗水量 等能源消耗，减少污水排放量，同时使污水的色度明显下降，有助予环境保护和降 低污水处理成本【2 】。目前，酶已经广泛应用在织物及服装加工中，如前处理退浆、 精练，牛仔布的水洗等。应用适当的加工技术，可使酶在纺织晶上获得许多全新的， 令人振奋的特殊效果p 】。 董。l 生物酶的简介 1 1 1 生物酶的定义 生物酶是生物体中活细胞产生的一种爨有催化作用的物质，故酶也称必生物穰 化荆。酶的化学本质是蛋白质，所以酶的分子结构与蛋臼质一样，具有一级、二级、 三级和四极结构，也有少数酶具有催化活性但无豳极结构。 根据酶所催化的底物的类型，可把酶分为六大类： ( 1 ) 水解酶( 淀粉酶，纤维素酶，脂肪酶和蛋白酶) ，催化水解反应； ( 2 ) 氧化还原酶( 过氧化氢酶，漆酶和过氧化物酶) ，催化电子转移反应； ( 3 ) 裂解酶( 果胶裂解酶) ，催化一个化合物分子分解成两个或多个化合物 分子的反应，包括逆反应； ( 4 ) 转移酶，催化分子上基团的转移； ( 5 ) 异构酶，催化底物分子异构纯反应； 青岛大学硕士学位论文 ( 6 ) 合成酶( 连接酶) ，催化两个底物分子合成另一个产物分子的反应，反 应时蠢a t p ( 骤苷三磷酸 供给反应所需畿量。 至今，所有商品化的纺织用酶制剂都是催化降解反应，使聚合物大分子分解为 小分子状态阀。 1 1 2 生物酶的性质及作用机理 生物酶是一类天然商分子量蛋自质，可以催化化学反应的进程，被誉为“生物催 化剂”，作为一种特殊的催化剂，酶具有以下的特性： 专一性酶的专一性是指酶只熊催化一种或一类结构相似的底物，进行某种类 型反应的特性。酶的专一性是酶最重要的特性之一，是酶与其它菲酶催化剂的主要 的不同之处。酶的专一性对酶工程的发展具有重要意义。酶的专一性还有利于节约 成本，提篱产物生成的速度，必大工业生产带来便剩。 高效性酶对催化反应速率的提高很显著，某些酶可以将反应速率提高1 0 1 4 倍， 一般情况下，纯酶的催化反应速率比无机催化裁要高l 矿圭妒倍，工业用酶( 大多 含有杂质) 的催化反应速率也比无机催化剂要高1 0 5 1 0 7 倍。 温和性酶来自于生物体，催他反应条件都眈较温和，除个别酶外，均可在常 温常压条件下进行催化反应。因而采用酶进行的催化反应，可以节约能源，降低生 产成本，而且生产过程易于控制。另外，酶催化反应都是在弱酸、弱碱和中性条件 下进行的，因此对环境污染小，对设备的腐蚀轻，工业生产安全【5 】。 酶的作用机理1 8 9 4 年，e m i lf i s c h e r 的对一些催化碳水化合物代谢的酶进行了 经典的研究首先发现了酶对底物的专一性现象，提出了酶催化反应的“镄钥”模型， 使人们对酶催化反应的专一性有了非常直观的理解【6 】。这种模型认为底物类似于钥 匙，而酶类似予镁。按照这个模式，在酶蛋自的表面存在一个和底物结构互补的区 域，如果一个分子的结构中高分子的某段结构和这个区域充分的互补，那么它就能 和酶结合。而此时底物分子上的敏感部分会正确的走向酶的催化部分，底物就会变 成为产物。 1 1 3 影响酶催化反应的因素 影响酶催化反应的因素很多，主要因素有以下几个方面【7 - l o l ： ( 1 ) 底物浓度 酶催化反应阉样遵守化学反应动力学的一般规律一质量作用定律。当底物浓度 较低时，反应速度近似与底物浓度成正比。随着底物浓度的增加，反应速度趋近一 个极限值。 2 第一章引言 ( 2 ) 酶的浓度 酶是一种高效催化剂，反应前后本身性质和数量不会改变，但酶在催化反应时 先形成一种酶底物复合物，然后复合物分解再释放出酶和底物。所以在一瞬间， 酶分子要与底物分子碰撞和作用。很显然，在有足够底物的情况下，体系中酶分子 越多( 酶浓度越大) ，形成的复合物也越多，底物转化率也相应提高，即反应速度随 着酶浓度的增大而加快。 ( 3 ) p h 值对酶反应速度的影响 一般生物酶的活性受其p h 值的影响。在一定的p h 值条件下，酶反应具有最 大反应速度。高于或低于此值，反应速度下降，通常称此p h 值为酶反应的最适p h 值。用酶活对p h 值作图，往往可以得到钟罩型曲线。酶的p h 值目前只能用实验 方法测得，它可以随着底物的浓度、温度和其它条件的变化而变化。因此，酶的p h 值并不是一个常数，它只是在一定条件下才有意义。 ( 4 ) 温度对酶反应速度的影响 温度对酶反应的速度也有着重要影响。温度的影响通常包括两个方面：一方面， 与其它化学反应一样，当温度升高时反应速度加快；另一方面，随着温度的升高酶 蛋白逐步变性，反应速度也随之下降。因此，酶反应存在着一个最适反应温度。如 果以酶的活性对温度作图，所得的曲线为钟罩型，曲线的顶点即为最适温度，最适 温度是上述两各方面平衡的结果。最适温度不是酶的特征物理常数，它往往受到作 用时间、酶的浓度、底物、激活剂等因素的影响。因此，就一种酶而言，必须说明 是在什么条件下的最适温度。 ( 5 ) 酶抑制剂和激活剂对酶反应速度的影响 酶催化反应的速度有时可以被底物以外的其它化合物所改变。有的会降低酶的 活性，甚至使酶完全失去活性，这样的物质称为酶的抑制剂。相反，有些物质的存 在会增加酶的活性，这样的物质称之为酶的激活剂。 酶 ( a ) 钥匙一锁原理图 3 酶一底物复合物 青岛大学硕士学位论文 酶一底物复合物 ( b ) 酶失活示意图 中毒后的酶 图1 1 钥匙锬原理及酶失活示意图 f i 9 1 1f i g u r eo fl o c k - k e yt h e o r y 1 9 5 8 年，k o s h l a n d 提出了“诱导契合”理论，他保留了酶和底物形成立体络合物 的概念，而摒弃了酶的活性部分应是一个僵硬的、在结构上同底物互补的模式。根 据该理论，当底物靠近酶活性部分时，将引起活性部位的一些变化，使底物和酶之 间达到更密切的契合并使催化基团配置到更合适的位置。然而到目前为止，酶的具 体作用机理还有待于进一步的研究和探讨。 1 9 6 3 年，m o n d 等人提出了变构模型。认为某些酶除了活性部分外还有变构部位。 变构部位是独立于活性部位外的另一酶部位。活性部位的功能是结合底物并催化转 化底物，而变构部位虽然也是结合配体的一部位，但结合的不是底物，而是变构配 体。这种配体也叫做效应剂。变构部位的配体与活性部位结合的底物不同，配体本 身并不发生化学变化，只是间接的影响酶活力。增加酶活力的叫做正效应剂，反之 称为负效应剂。变构模型的提出，使人们了解到了生命体内活性调控的基础。酶催 化反应首先形成酶底物络合物，然后由络合物转化为产物并释放出酶【l 。 1 2 生物酶的发展 酶的生产和应用，在国内外已具有8 0 多年历史。早在上世纪3 0 年代就已应用于 洗涤剂中，酶可改进去污能力，并使织物平滑光洁。在纺织印染工业上，酶首先用于 织物的前处理退浆工序。8 0 年代后，酶制剂不断研究和开发，用于织物的生物打光， 代替石磨洗等，已取得了较大的进展。酶在纺织印染工业上不断取得成就，主要由于 生物工艺学的进展，使酶制剂品种不断扩大，酶的培养、生产和纯化技术不断改进和 提高。由于酶具有专一性和高效性，采用生物催化，用于纺织品湿加工具有独特优 点。在纺织品处理上，酶能显著改善织物的外观和手感，并能取代一部分酸、碱、氯、 4 第一章引言 磷化合物等化工原料，从而减少污染，不产生或少产生污水，有利于环保和生态。酶 处理已被公认为一种符合环保要求的印染加工方法，当今全球普遍重视生态环保， 纺织品酶处理已成为重点关注的技术，今后必将继续开发研究，不断扩大应用i l 引。 现在在纺织印染工业中主要用到的生物酶包括以下几种【1 3 】： ( 1 ) 淀粉酶对淀粉具有液化作用，用于织物退浆( 淀粉浆) ，国内应用较多。 ( 2 ) 纤维素酶能使纤维素起降解或水解作用，用于纤维素纤维减量、柔软、打 光和减少起毛起球等，国内已开始应用。 ( 3 ) 蛋白酶具有使蛋白质降解作用，选择专用蛋白酶用于丝绸精练，国内也有 应用。蛋白酶也可用于羊毛纺织品处理，可改善性能、提高质量、减少污染，国内已 开始研究应用。 ( 4 ) 果胶酶对分解果胶有催化作用，用于亚麻或苎麻脱胶以及纤维素纤维纺织 品处理。 ( 5 ) 过氧化氢酶可去除织物漂白后的过氧化氢。 1 3 生物酶在纺织印染中的应用 1 3 1 棉织物的前处理 棉织物退浆使用淀粉酶，通过淀粉酶的选择性反应使织物上淀粉大分子发生分 解，从而达到既完全破坏淀粉，又不损伤纤维素【1 4 】。应用于染整工业退浆的淀粉酶 主要有a 淀粉酶、p 淀粉酶等，一般使用温度为5 0 , 7 0 0 c ，p n 值6 7 。 棉织物的精练可采用碱性果胶酶，来取代传统的浓碱精炼。碱性果胶酶可分解 果胶质，并将附着的脂质及蛋白质等杂质去除，大大降低了污水排放，并提高了棉 织物的强力f 1 5 】。脂肪酶常用于辅助退浆，与果胶酶一起使用，可以将脂肪分解成甘 油和脂肪酸【1 6 】1 6 。过氧化氢酶可用来除去漂白后织物表面的过氧化氢【1 7 】。目前各厂采 用较多的退浆用酶制剂有诺维信公司的高温淀粉酶t e r m a m y l ( 8 5 - - , 1 1 5 。c ) 、苏宏宽 温酶s u g o n gd e s i z y m e2 0 0 0 l ( 2 0 , - - , 9 5 。c ) 、石家庄联邦科特化工公司开发的液体宽温 酶o f t 2 0 0 ( 4 0 1 i o c ) 。采用较多的煮练用酶制剂有诺维信公司开发的碱性果胶酶 b i o p r c p 及碱性果胶裂解酶s c o u r z y m e ，上海永光化工公司开发的s k d 系列煮练酶 ( 基因改性生物复合酶制剂) 、上海纺织科研院研发的生物酶制剂s c o l a s e l 0 0 t ( i 主l 生物 复合酶和螯合分散剂复配而成) ，江南大学研发的复合酶f w ，德国拜耳公司开发的 b a y l a s ee v o 碱性果胶酶等。关于漂白用酶制剂，目前尚处于开发阶段，研究最多的 有漆酶、过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶( g o d ) ，其中葡萄糖氧化酶和漆酶是目前被认为 最有可能开发成功的漂白用酶制剂。 5 青岛大学硕士学位论文 1 3 2 棉织物的生物酶整理 目前生物酶技术在染整工业中应用的另一领域是棉织物的生物酶整理加工。棉 织物经过纤维素整理后，手感和外观可以获得很大改善。因为织物表面的绒毛被去 除，处理后的织物更光洁，颜色更鲜艳，织物硬挺度和刚性降低，光滑度和悬垂性 提高，使织物获得了极好的手感。纤维素酶能够像烧毛一样使针织物的外观变得光 洁，而且加在洗衣粉中的纤维素酶通过正常的家用洗衣机洗涤也具有类似的效果。 人们还对纤维素纤维的酶催化水解机理进行了进一步的研究。他们认为酶处理过程 中的机械搅拌作用或者液体的流动速度对生物整理的效率和整理后的品质有重要影 响。因为纤维素水解产物会吸咐在酶与底物的复合物上形成无活性的酶一底物一产 物复合物或者酶与产物形成无活性的酶一产物复合物，从而抑制反应的进行。增加 机械搅拌会促使产物及时扩散到溶液中，产生新鲜表面，增加酶与底物的碰撞机会 【l 射。 1 3 3 酶在废水脱色中的应用 印染废水色度深的原因是废水中残留的染料造成的。印染废水脱色可采用活性 污泥法、生物膜法和臭氧法等，但是色度去除率不高。生物酶在印染废水脱色中的 应用也有研究，以氧化还原酶为主，其中又以漆酶研究最多。据报道，对有代表性 的3 0 0 多种染料，在溶解状态下用漆酶处理，确认约有5 6 染料基本可以脱色，或色 泽变得相当浅。如果将色泽变得稍浅的染料也计算在内，那么利用漆酶可使7 0 的染 料被分解。到目前为止，利用白色腐烂的真菌以及由这些真菌而产生的酶使污水中 的染料脱色还处在研究和试验阶段，随着生物工程技术和基因工程技术的发展，一 定会开发出使印染废液完全脱色的酶制剌1 9 1 。 1 4 具有脱色功能的酶的种类及作用机理 1 4 1 漆酶 漆酶是多铜氧化酶中的一种含铜的糖蛋白氧化酶，按照其来源大致可以分为植 物漆酶、微生物( 包括真菌和细菌) 漆酶和动物漆酣2 0 1 。 漆酶催化机制比较复杂，不同的反应有不同的机理，即漆酶催化苯酚类、芳香 胺和其他富含电子的底物单电子氧化，同时将氧分子还原成水，如下式所示： 6 第一章引言 1 4 - 2 木质素过氧化酶 o ，+ 4 e + 4 时_ 2 h 2 0 4 c 一+ 木质素过氧化物酶是一系列含有铁原仆琳r x ( 血红素) 辅基的同工酶，研究发现 酶的晶体结构是一个典型的含有血红素分子的衄红蛋白，该酶作用机理如图1 2 ： c o m p o u n di 图1 2 木质素过氧化物酶( l i p ) 作用机理推论 f i 9 1 2m e c h a n i s mo fi i g n i np e r o x i d a s er e a c t i o n l i p 在以h 2 0 2 为辅助底物时，可氧化酚型木质素模型化合物为苯氧自由基，氧 化非酚型木质素模型化合物为芳香正离子自由基，再经过一系列非酶催化的自由基 反应，使木质素侧链上的c 矿c b ，键断裂，产生c 旷q 断片和c 6 c 丫片段【2 1 1 。 1 4 3 锰过氧化酶 从p c h r y s o s p o r i u m 的胞外培养物中可以分离纯化得到m 【l p 。此酶由一系列糖基 化的同工酶组成，等电点范围p h 4 2 4 5 ，分子量范围在4 5 一4 7 k d 。每一分子酶蛋 白包含一个铁卟啉辅基和两个钙原子田】。 当h 2 0 2 和二羧酸螯合剂( 如丙二酸盐和草酸盐) 存在时，m n p 能氧化m n z + 成为 m n 3 + ，m n 3 + 进一步氧化各类酚型木素模型化合物，如2 ，6 一二甲氧基酚、香草丙酮、 a b t s ( 2 ，2 a z i n o b i s ) 和苯酚等。m n p 催化反应过程如图1 3 所示。 7 青岛大学硕士学位论文 过覆 h 2 0 2 h 2 0 复食物m f e l l ! 0 2 注： a h ：一个酚类或芳香胺底物；a ：单电子氧化产生的自由基 i p 1 ：卟啉扩阳离子自由基 图1 3m n p 的催化循环 f i 9 1 3c a t a l y s e m e n tc y c l eo fm n p p + 】 首先含三价铁的m n p 在f 1 2 0 2 作用下，经双电子氧化产生化合物i 。化合物i 在 m n 2 + 的作用下，经单电子还原产生化合物i i 。然后在底物m n 2 + 存在时，化合物i i 经单 电子转移被还原成含三价铁的m n p 。过剩的h 2 0 2 与自然状态的m n p 作用产生化合物 m 。多种酚或芳香胺都能把化合物i 还原为化合物i i ，但只有m n z + 能有效地把化合物 i i 还原) 爿茈m r i p 2 引，从而完成酶的整个催化循环。此外，某些经修饰变化的m n p 还能氧化 非酚型芳香族化合物如藜芦醇【2 4 】。 1 5 活性染料染色及皂洗 引起棉织物活性染料染色湿摩牢度差的主要原因是，染料本身和有色纤维粒子 的转移。活性染料的固色率不会是1 0 0 ，染色织物上存在通过范德华力结合、而未 与棉纤维反应的染料，它们跟直接染料类似。同时，纤维对染料的吸附也有一极限 值，即染色饱和值。在一般情况下，染料用量不能超过染色饱和值的1 0 。在染深 色时，如果染料用量过多，过量的染料非但不能上染和固着，反而会堆积在织物表 8 第一章引言 面。这些未固着的染料在受n 乡 i - 力作用，以及水的溶解作用下，会发生脱落和吸附， 从而沾附在衬布上，影响染色织物的湿摩擦牢度。活性染料与棉纤维发生共价结合 的同时，染料纤维键还会发生水解反应，水解的结果使活性染料与纤维素之间的共 价键断裂。由共价键断裂形成的染料也会以范德华力吸附在织物上，在受到水和机 械力作用时，发生再溶解，在浓度差的影响下，发生扩散和再吸附造成织物沾色 2 5 - 2 6 o 1 5 1 活性染料 活性染料的工业化生产已有四十多年的历史了，我国活性染料生产始于1 9 5 8 年，至今也己有四十年之久。活性染料是当今发展最快的一类染料，也是应用最重 要的染料。它的发展固然是由于它具有许多优点，但也和它的应用工艺，特别是染 色工艺不断完善和开发有关。目前活性染料不仅是纤维素纤维染色的最重要的染 料，也不断扩大应用于羊毛、蚕丝等纤维制品的染色和印花。 1 5 1 1 活性染料的结构 活性染料的化学结构包括染料母体和活性基团两个部分。它们的结构可用下面 的通式来表示： w 二d b r e 式中：d ：发色体或母体染料 b ：活性基与发色体的连接基 r e ：活性基 w ：水溶性基团 1 5 1 2 影响湿摩擦牢度的因素 虽然经过水洗、皂煮、固色等处理后其染色织物的牢度有了一定的提高，但是 湿摩擦牢度几乎没有什么改变，从染色过程和染色原理分析，影响湿摩擦牢度的主 要因素主要有以下几个方面 2 7 - 3 1 1 ： 首先是染料的性质，主要包括染料的提升性，染料的水溶性，染料的直接性， 染料的活性基等，选择合适的染料，染料提升性好，水溶性适中，直接性合适，以 及恰当的活性基可以显著提高染色织物的摩擦牢度。其次，染色织物的湿摩擦牢度 受染色深度的影响。染色布的耐湿摩擦牢度这一现象，反映的是染色布试样上的染 料分子通过界面接触向测试时使用的白布转移的程度。活性染料染色织物的颜色越 深，测试织物与被测试织物之间染料分子浓度梯度越大，染色布耐湿摩擦牢度就越 9 青岛大学硕士学位论文 差。再次，织物本身的组织结构及其表面光洁度也在很大程度上影响了织物的湿摩 擦牢度。这是因为织物的组织结构影响到织物表面的平滑程度，而平滑程度又决定 了摩擦时摩擦力的大小，造成摩擦牢度的好坏不同。最后染色织物上的浮色是影响 色牢度的主要因素，主要由已吸附在纤维上而未参与纤维共价反应的染料、部分水 解的染料等组成。以上三个原因共同做用的结果，使得活性染料染色后的牢度成了 老大难问题。 1 5 2 活性染料皂洗剂作用机理 传统染色后的皂洗工艺是使用肥皂或多种表面活性剂的复配物在一定的工艺下 对织物进行皂洗，皂洗过程中浮色染料从纤维上脱落下来进入洗液与皂洗液中的染 料重新吸附于纤维存在一个动态平衡。传统皂洗剂中大量使用的某些阴离子、非离 子表面活性剂虽然具有良好的浮色洗除效果，并在国内外皂洗剂产品中占据主导地 位，但是越来越不符合当前印染助剂向绿色环保方向的发展趋势。生物酶皂洗剂的 出现使得开发绿色环保的皂洗剂成为可能。 ， 活性染料的皂洗工序实际上是用皂洗剂去除纤维表面浮色染料的过程。在此过 程中，皂洗剂各组分、活性染料、纤维三者之间发生一系列复杂的物理化学作用， 如润湿、渗透、吸附、增溶、乳化、分散、解吸、起泡等，再借助机械力的作用， 将浮色从纤维表面分离，并能稳定的分散于皂洗液中，不能再回沾到纤维表面，该 过程可用下面关系式表示： 纤维浮色染料+ 皂洗剂- 纤维皂洗剂+ 浮色染料皂洗剂 这就要求皂洗剂具有良好的浮色洗除性能和防沾色性能。浮色的洗脱可以选用 洗涤能力较强的阴离子或非离子表面活性剂来实现，而防沾色性能则需要具有特殊 结构的高分子化合物来实现【3 2 。3 5 】。 与传统的活性染料皂洗工艺相比，生物酶皂洗工艺利用特殊的酵素去除染液中 未固着的染料和水解染料【3 6 】。 1 6 本课题研究的目的意义及主要内容 棉用皂洗剂是印染厂常用的染色后处理助剂，主要起着洗去未与纤维结合而固 着的活性染料。传统的如丙烯酸盐型皂洗剂，主要通过与水解染料络合作用，清除 织物表面的浮色，阻止洗液中的染料再回沾到布面，提高织物的水洗牢度，但对深 色染色织物的湿摩擦牢度作用不明显。同时，染色后使用固色剂进行固色，通过形 成色淀、交联与成膜，使摩擦牢度能够得到一定程度的改善，但往往是固色效果好， 湿摩擦牢度提升高，染色色光的改变也大。并且，对环境造成的污染也大。 1 0 第一章引言 本文的目的是利用具有脱色作用的微生物，从中提取出脱色酶来应用于皂洗过 程，从而取代常规的皂洗剂。 与传统的活性染料皂洗工艺相比，生物酶皂洗工艺利用特殊的酵素去除染液中 未固着的染料和水解染料，生物酶皂洗后织物的各项牢度指标均优于传统皂洗工艺， 且可缩短皂洗时间，降低耗水量等能源消耗，减少污水排放量，同时使污水的色度 明显下降，有助于环境保护和降低污水处理成本。新型生物酶皂洗工艺的出现为皂 洗剂的发展开辟了一个新的领域。 本课题的主要内容包括以下几个方面： ( 1 ) 从污泥中培养驯化并筛选出出对活性染料脱色的优势菌株，并对该菌株分 离纯化，扩大培养。 ( 2 ) 考查细菌对活性染料性能，主要是研究各种条件对细菌脱色效率的影响。 ( 3 ) 从细菌体内分离纯化出具有脱色作用的生物酶，并研究该酶的脱色效果 ( 4 ) 将脱色酶用于活性染料染色后的皂洗工序。 第二章脱色细菌培养、驯化及筛选 第二章脱色细菌的培养、驯化及筛选 染料工业属于精细化工行业，具有生产批量小，品种多，工艺流程长和总收率 低等特点，因而染料废水大多成分复杂、浓度高、色度高、难降解物质更多，含有 多种具有生物毒性或“三致”性能的有机物，尤其是废水中残存的染料组分，即使浓 度很低，排入水体也会造成水体透光率的降低，从而最终导致水体生态系统的破坏。 由于染料工业污染大，“三废”处理费用很高，因此自七十年代末以来，一些发达国 家的染料厂商纷纷减产、停产，转而向发展中国家投资建厂以降低成本和转移“三 废”。目前染料废水处理方法主要有物理法、化学法和生物法等，但是化学法和物理 法处理效率低，成本高，应用有限。而生物法由于其运行成本低，处理效率高，产 生污泥少等优点已成为当前处理染料废水的有效途径1 3 7 1 。 目前发现的具有脱色作用的微生物主要包括细菌、放线菌和真菌等1 3 8 删。这几 种菌类能够通过分泌漆酶、木质素过氧化酶等具有脱色作用的酶来对染料进行脱色。 本课题采用染料厂废水处理车间的污泥中的细菌进一步培养和筛选，来对活性 染料脱色，旨在筛选出一种能够对常用活性染料具有良好脱色作用的菌株。 2 1 实验 2 1 1 实验原料、药品及仪器 仪器和设备、药品、染料见表2 1 、2 2 、2 3 。 表2 1 仪器和设备 t a b l e 2 1e x p e r i m e n t a li n s t r u m e n t s 1 2 青岛大学硕士学位论文 表2 2 药品 t a b l e 2 2e x p e r i m e n t a lc h e m i c a l s 表2 3 染料 t a b l e 2 3d y e s 1 3 第二章脱色细菌培养、驯化及筛选 2 1 2 菌种及培养基 2 1 2 1 菌种来源 活性污泥取自青岛双桃染料厂废水处理车间的厌氧池。 2 1 2 2 培养基 ( 1 ) 培养基i ( g l ) ： k h 2 p 0 42 ，n a e h p 0 4 1 2 h 2 04 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 ，蛋白胨2 0 ， 牛肉膏3 0 ，葡萄糖5 0 ，染料0 0 2 ，p h7 0 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 ( 2 ) 培养基i i ： 牛肉膏3 9 ，蛋白胨l og ，n a c l5g ，琼脂1 5 2 0g ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 7 0 - 7 2 ， 1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 ( 3 ) 培养基： 牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0g ，n a c l5g ，0 0 2g 染料，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h7 o 7 2 ， 1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 ( 4 ) 固体培养基： 牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l5 9 ，0 0 2g 染料，琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ， p h7 0 7 2 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 2 2 实验方法 2 2 1 菌种的分离与纯化 ( 1 ) 平板稀释分离 将活性污泥接种至含有营养肉汤的锥形瓶中( 泥：水= 1 ：1 0 ) ，并加入5 0 m g l 的活性兰c i b a f n 3 7 。c 静置培养4 8 h 。取菌悬液l m l 于2 5 0 m l 锥形瓶中( 培养 基i1 0 0 m l ，兰f n r5 0 m g l ) 继续培养4 8 h 。反复培养3 次后，取l m l 菌悬液用无 菌水稀释后接种于固体培养基中( 兰f n r2 0 0 m g l ) ，涂布均匀培养纯化。 ( 2 ) 平板划线分离 将经过稀释液涂布的固体平板置于培养箱一定时间后取出，从上面挑取周围颜 色变浅的菌落，于染料固体培养基上进行多次划线分离，直至得到能使平板染料颜 色变浅且菌落特征一致的单菌株。将纯化菌株接种试管斜面培养后保存于冰箱。 ( 3 ) 菌种的复筛 1 4 青岛大学硕士学位论文 对于上述分离的分离过程，已经通过染料降解实验初筛出对染料有降解能力的 菌种。而后对各菌株进行了染料降解能力的测试，复筛出对染料有较高脱色能力的 菌株，制成斜面，保存在冰箱里备用。 2 2 2 脱色能力的测定 培养一定时间后，取上清液于4 0 0 0 r m i n 离，t 二, 2 0r a i n ，在染料的最大吸收波长处 测吸光度值，并以不加菌液的脱色培养液为对照，计算脱色率，脱色率按公式( 1 ) 计算： 脱色率= ( a b ) a x l 0 0 公式( 1 ) 式中，a 为不加菌液的吸光度值，b 为加菌液的吸光度值。 2 3 结果与讨论 2 3 1 菌种的分离与筛选 2 3 1 1 菌种筛选结果 将稀释后的菌悬液接种到含染料的固体培养基，培养4 8 h ，观察到染料固体培 养基上长出较多菌落。挑取周围颜色变浅的菌落，于染料固体培养基上多次划线分 离，根据菌落的形态及菌落的颜色初步筛选到5 株分别对三种活性染料有脱色能力 的菌株，分别编号为a 1 ，a 2 ，a 3 ，a 4 ，a 5 。 2 3 1 2 筛选出菌株的脱色性能 分别对这几种菌株扩大培养3 0 h ，移取l m l 菌悬液到分别含染料兰f n r 、红 f n 3 g 、黄f n 2 r 的液体培养基中培养2 4 h ，各菌株的脱色效果见图2 1 。 1 5 第二章脱色细菌培养、驯化及筛选 1 8 0 芝8 0 褥 如 婆柏 2 0 o a 2a 3a 4 菌株 图2 1 不同菌株对染料的脱色效果 f i g 2 1d e c o l o r a t i o nr a t eo fr e m a z o ld y e sb yi s o l a t e db a c t e r i a ls t r a m s 由图2 1 可以看出分离得到的五种菌株对三种染料的脱色能力差异较大，其中 a 1 脱色能力最差，a 2 ，a 3 ，a 4 效果较好，a 3 脱色率最高。 2 4 小结 筛选出了对染料兰f n r 、红f n 3 g 、黄f n 2 r 具有脱色作用的菌株a 3 。 1 6 第三章细菌对染料的脱色条件 第三章细菌对染料的脱色条件 染料废水普遍存在废水排放量大、色度高、毒性大、难以降解等特点 4 1 】。目前 能对染料废水脱色的细菌种类很多，主要分布在气单胞菌属、假单胞菌属、芽孢杆 菌属和克雷伯氏菌属中，这些细菌多为好氧生长，但在厌氧条件下也可以产生相关 的脱色酶，表现出脱色活性【4 2 1 。 细菌对染料的脱色机制主要包括吸附脱色和降解脱色。吸附脱色跟物理吸附类 似，降解脱色主要是通过细菌分泌的氧化还原酶对染料的共轭双键进行破坏，致使 染料的发色团遭到破坏。或者将染料进一步分裂成小分子【4 引。 本章主要研究细菌脱色的条件，考查了，温度、时间、p h 值等各种条件对细菌 脱色的影响。 3 1 实验 3 1 1 实验材料 3 1 1 1 菌种 经过分离纯化的a 3 菌株。 3 1 1 2 染料 德斯达雷马素系列，汽巴f n 系列。 3 1 1 3 培养基 培养基( l ) ：k h 2 p 0 4 2 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 04 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 1 ， 蛋白胨2 0 ，牛肉膏3 0 ，葡萄糖5 0 ，染料0 0 2 ，p h7 0 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 3 1 1 4 药品、仪器 k h 2 p 0 4 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，m g s 0 4 7 h 2 0 ，f e c l 3 6 h 2 0 ，蛋白胨，牛肉膏，葡萄 糖；汽巴系列染料，雷马素系列染料，安诺其系列染料皆为商品。 灭菌锅，恒温培养箱，冰箱，紫外分光光度计，离心机。 1 7 青岛大学硕士学位论文 3 2 实验方法 3 2 1 菌体生物量的测定 将菌液4 0 0 0 r m i n 离心3 0 分钟，收集菌体并用蒸馏水洗3 次，置于8 0 烘干 至恒重，用电子天平测菌体干重。 3 2 2 细菌对染料脱色实验 移取2 5 m l 对数期的菌液，按5 接种量加入到含有5 0 m l 培养基的1 0 0 m l 锥 形瓶中，于不同培养条件下脱色。 3 2 3 脱色能力的测定 培养一定时间后，取上清液于4 0 0 0r m i n 离心2 0m i n ，在染料的最大吸收波长处 测吸光度值，并以不加菌液的脱色培养液为对照，计算脱色率，脱色率按公式( 1 ) 计算： 脱色率= ( a b ) a x l 0 0 公式( 1 ) 式中，a 为不加菌液的吸光度值，b 为加菌液的吸光度值。 3 2 4 脱色条件的研究 研究细菌在不同p h 、温度、盐度、碳源、氮源、培养时间和染料质量浓度等条 件下对的脱色效果。 3 2 5 对其它染料的脱色 分别在培养基中加入活性红x - 3 b ，活性红f n 3 g ，c i b a c r o n 黑9 等活性染料，观察 a 3 菌株对不同染料的脱色效果。 3 3 结果与讨论 3 3 1 茵体生长曲线的测定 按5 接种量将纯化并进一步培养的菌株a 3 ，接种到培养基中，3 7 。c 静置培养， 并在不同时间内取样，测a 3 菌体干重，结果见图3 1 。 1 8 第三章细菌对染料的脱色条件 1 0 8 警6 恻 h - 爱4 最 2 0 051 01 52 02 53 0 时间h 图3 1 菌株a 3 生长曲线 f i g 3 1 g r o w t hc u r v eo fs t r a i na 3 由图3 1 可以看出在培养2 0 h 时，培养液中的生物量最大，此时属于对数期，适 宜接种。 3 3 2 脱色条件的研究 3 3 2 1p h 的影响 分别将培养液的p h 调至5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 ，9 0 ，接种量5 ，3 7 * ( 2 静置培养3 h ， 测定脱色效果，结果见图3 2 。 1 9 青岛大学硕士学位论文 1 0 0 8 0 永 瓣 如 婆6 0 468 1 0 p h 图3 2 初始p h 对脱色效果的影响 f i g 3 2e f f e c to fi n i t i a lp hv a l u eo nt h ed e c o l o r i z a t i o nr a t e 由图3 2 可以看出该菌株适用的p h 值范围较广，在p h 值5 - 9 范围内，3 h 内脱色率 能达到6 0 以上，最佳p h 值为8 0 。a 3 菌株在p h 7 8 范围内脱色效果最好，偏离这个 范围，随着酸碱性的增大，脱色能力下降。这是由于生物体内的生化反应是在酶的 参与下进行，而p h 值能使蛋白质、核酸等生物大分子发生变化，进而影响它的生物 活性；酸碱性的变化还能引起微生物表面膜电荷性质的改变，从而影响微生物细胞 对营养，物质的吸收能力；此外，酸碱性的变化也可能打破培养基中的离子键的化 学平衡，使化学平衡发生移动，进而改变环境中营养物质的性质及有害物质的性质， 对微生物的生命活动产生影响。 3 3 2 2 温度的影响 按5 接种量，将菌悬液接入脱色培养基中，分别于2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4