（材料物理与化学专业论文）天然色素的提取及其在树脂中的应用.pdf

a b s t r a c t p h y c o b i l i p r o t e i n si sa l li m p o r t a n ts u b s t a n c ee x t r a c t e df r o ma l g a ea n dh a v eb i o l o g i c a l a c t i v i t y a sp e o p l eg r a d u a l l yd e e p e n i n gt h eu n d e r s t a n d i n go fp h y c o b i l i p r o t e i n s ，i t sv a l u e i sg r a d u a l l yb e i n gr e a l i z e d ，l a r g e - s c a l ee x p l o i t a t i o no fp h y c o b i l i p r o t e i n sh a sb e c o m eah o t r e s e a r c h p h y c o b i l i s o m ep r o t e i nn o to n l yh a si m p o r t a n tr e s e a r c hv a l u ei nt h ei n i t i a lt h e o r y o fp h o t o s y n t h e s i s ，b u ta l s ob eu s e f u li naw i d er a n g e i tc a nb eu s e da san a t u r a lp i g m e n t i nf o o d ，c o s m e t i c s ，f u e li n d u s t r y ；i ti sa ni m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a la c t i v i t ym a t e r i a lw h i c h c a nm a k eu pf o o do rm e d i c i n ef o rm e d i c a lc a r e ，i ta l s om a d eu pf l u o r e s c e n tr e a g e n t sf o r c l i n i c a l d i a g n o s i s ，i m m u n e c h e m i c a la n d b i o l o g i c a le n g i n e e r i n g r e s e a r c h a s p h y c o b i l i p r o t e i n sh a v ew i d ea p p l i c a t i o n ，p h y c o b i l i p r o t e i n sh a sg e tm u c ha t t e n t i o na n db e c o m et h eh o t s p o to fr e s e a r c h i nt h i st h e s i s ，p h y c o b i l i nw a se x t r a c t e df r o ms p i r u l i n ap l a t e n s i s a f t e rb r e a k i n gc e l l b yr e p e a t e df r e e z e - t h a w ，s a l t e do u tb y ( n h 4 ) 2 5 0 4s o l u t i o no f2 5 a n d5 0 s a t u r a t i o n ， w eg o tr o u g hp h y c o e r y t h r i n ，a tl a s t ，p h y c o c y a n i nw a se x t r a c t e db yh ac h r o m a t o g r a p h y t h e nt r e a t e dt h ep h y c o c y a n i nb yh y d r o c h l o r i ca c i do fl o m o l lf o r3 0 m i nt os e p a r a t et h e d i s s o c i a t i v ec h r o m o p h o r e p h y c o b i l i nf r o mp r o t e i n ，f i n a l l yp h y c o a n i nw a sb l e n d e dw i t h a c r y l i cr e s i np m m a t og e tp h y c o b i l i n p m m af i l m b ya n a l y z i n gt h ea b s o r p t i o ns p e c t r u ma n df l u o r e s c e n c es p e c t r u mo fp r o d u c t s ，w e r e a l i z e di t so p t i c a lc h a r a c t e r ，t h ee m i s s i o nf l u o r e s c e n c ep e a ko fp h y c o b i l i ni sa t6 6 0 n m ， a n dt h ep h y c o b i l i n p m m af i l mh a v ef l u o r e s c e n c ea t6 7 2 n m ，t h e nw et e s t e dt h ef l o w c h a r a c t e ro ft h ec o m p s i t e s a tl a s tw em a d es u r ep h y c o b i l i ni su s e f u li ni m p r o v i n go p t i c a l c h a r a c t e r so fr e s i n p h y c o b i l i nw em a d ef r o mt h i se x p e r i m e n th a v es o m ec h a r a c t e r s i t sf l u o r e s c e n c ei s b e t w e e n5 5 0 n m 一7 0 0 n m ，i nw h i c ht h e r eh a v ef e wb a c kf l u o r e s c e n c e ；t h es t o c k s d i s p l a c e m e n to fp h y c o c y a n i ni sa b o v e2 0 0 h mw h e nt h es t o c k sd i s p l a c e m e n to fc o m m o n f l u o r e s c e n c ee l e m e n ti sb e l o w3 0 n m ；p h y c o b i l i ni sn o tr e l i a n tt ot h et e m p e r a t u r e ，i ti s s t e a d ya f t e rh e a t e da t8 0 。cw h e np h y c o c y a n i ni sd e n a t u r a l i z a t i o na t4 0 。c ；p h y c o b i l i ni s h y d r o p h i l i c ，i t c a nb em i x e dw i t ho r g a n i cm a c r o m o l e c u l e ，i sag o o da d d i t i v eo f m a c r o m o l e c u l em a t e r i a l sw h i c hc a l li m p r o v et h eo p t i c a lc h a r a c t e r so fm a t e r i a l s k e yw o r d s ：n a t u r a lp i g m e n t ；e x t r a c t i o n ；f l u o r e s c e n c e ；a c r y l i cr e s i n 目录 1 1 1 11 1 11 1 1 1 i ii i lli ii il y 17 3 3 8 2 0 弓i 言”1 第一章综述2 1 1 藻胆蛋白的结构及光学特性”2 1 1 1 藻胆蛋白的结构2 1 1 2 藻胆蛋白的氨基酸组成及其等电点4 1 1 3 藻胆蛋白的光学特性5 1 2 藻胆蛋白的提取和纯化技术”7 1 2 1 细胞破碎方法一7 1 2 2 分离提取方法8 1 2 3 纯化方法1 0 1 3 藻胆蛋白的稳定性1 2 1 4 藻胆蛋白的功能1 3 1 5 藻胆蛋白的应用1 4 1 5 1 天然色素和功能食品1 4 1 5 2 光敏剂1 5 1 5 3 荧光探针1 5 1 6 藻胆蛋白的研究现状1 6 1 7 本论文研究的目的及意义1 7 参考文献1 9 第二章藻蓝蛋白的提取和纯化2 5 2 1 原料与仪器”2 6 2 2 实验过程2 8 2 2 1 藻蓝蛋白的粗提。2 8 2 2 2 藻蓝蛋白的纯化2 8 2 3 表：征2 9 2 4 实验结果3 0 2 4 1 藻蓝蛋白提取纯化实验条件的确定3 0 2 4 2 藻蓝蛋白的性质分析”3 1 2 5 本章小结”3 7 参考文献- 3 8 第三章藻红蛋白的提取与纯化3 9 3 1 原料与仪器4 0 3 2 实验过程4 1 3 2 1 藻红蛋白粗提物的制备4 1 3 2 2 苯基琼脂糖柱层析分离藻红蛋白4 1 3 2 3 羟基磷灰石柱层析分离藻红蛋白4 1 3 3 表征4 2 3 4 实验结果4 3 3 4 1 藻红蛋白提取纯化实验条件的确定4 3 3 4 2 藻红蛋白的光谱分析”4 4 3 5 本章小结5 0 参考文献5 1 第四章藻蓝素及藻蓝素p m m a 复合材料的制备”5 2 4 1 原料与仪器5 2 4 2 实验过程5 2 4 2 1 藻蓝素与载体蛋白的分离5 2 4 2 2 藻蓝素p m m a 复合材料制备5 2 4 3 表征5 3 4 4 藻蓝素及藻蓝素p m m a 复合材料的光学性质”5 3 4 4 1 藻蓝素的光学性质5 3 4 4 2 藻蓝素p m m a 复合材料的光学性质5 5 4 5 本章小结5 7 参考文献5 8 结论5 9 攻读硕士学位期间的研究成果6 0 致谢6 1 学位论文独创性声明6 2 学位论文知识产权权属声明6 2 引言 己l 吉 丁l口 藻胆蛋白是海藻中的一种重要生理活性物质，具有广泛的用途。藻胆蛋白的大 规模开发利用已成为当前研究的热点，但昂贵的价格成为制约其开发利用的瓶颈， 因而如何在分离纯化技术上取得突破，低成本高效益地获得高纯度的藻胆蛋白已显 得极为迫切。我国海域宽广，藻类资源丰富，产量大，但是开发深度和力度不够， 大部分仅限于简单的食用，因此把研究和生产结合起来，充分开发利用海藻藻胆蛋 白，对提高海藻的经济和社会效益将具有革命性的意义。 本论文旨在研究从螺旋藻中提取得到高纯度的藻蓝蛋白，以螺旋藻粉为原料， 采用反复冻融法将细胞破碎，然后分别用不同饱和度的硫酸铵溶液盐析得到粗提的 藻蓝蛋白，通过羟基磷灰石柱等进一步的纯化方法方法制得纯化的藻蓝蛋白；从紫 菜中提取得到高纯度的藻红蛋白，采用反复冻融法将细胞破碎，然后分别用不同饱 和度的硫酸铵溶液盐析得到粗提的藻红蛋白，通过苯基琼脂糖和羟基磷灰石柱层析 等方法得到纯化的藻红蛋白。用浓盐酸在处理破坏蛋白质与发色团之间的硫醚键， 得到游离的发色团藻蓝素：在一定条件下将藻蓝素与丙烯酸树脂p m m a 共混 制得藻蓝素p m m a 膜。通过分析产物的紫外可见吸收光谱和荧光光谱了解产物的 光学性质，测得所制得p m m a 复合材料在6 7 2 n m 处有荧光，制得了具有一定荧光 性质的树脂。 青岛大学硕士学位论文 第一章综述 藻胆蛋白是蓝藻、红藻和隐藻等藻类特有的捕光色素蛋白，已知的藻胆蛋白主 要可以分为藻红蛋白( p e ) 、藻蓝蛋白( p c ) 、别藻蓝蛋白( a p c ) 和藻红蓝蛋白 ( p e c ) u ，2 1 。在不同藻类中，藻胆蛋白的种类、数量不同，所有蓝藻和红藻中都存在 藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，红藻和部分蓝藻中含有藻红蛋白。在某些缺乏p e 而有异 形胞的蓝藻中存在充当p e “天线”功能的藻红蓝蛋i 刍( p e c ) 。隐藻中只有p e 和p c 两类，但隐藻中很少同时并存p e 和p c 。甲藻藻胆蛋白的报道较少，仅在蓝藻甲藻 中有两种p c 的存在【j j 。 藻胆蛋白不仅在光合作用的初始理论方面具有重要的研究价值，而且用途十分 广泛，可作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、燃料等工业，还是一种重要的生 理活性物质，可制成食品和药品用于医疗保健上，又可制成荧光试剂，用于临床医 学诊断和免疫化学及生物工程等研究领域中。此外，藻胆蛋白还是一种最具开发潜 力的光敏剂。目前对藻胆蛋白的基础研究取得了一些重要成果，同时发现藻胆蛋白 具有广泛的应用前景，藻胆蛋白现已成为各学科的研究热点，备受人们的关注。 1 1 藻胆蛋白的结构及光学特性 1 1 1 藻胆蛋白的结构 藻胆蛋白由载体蛋白和发色团线性开链延展的四吡咯化合物组成，载体蛋 白和发色团之间通过硫醚键连接，到现在为止已发现的连接方式有六种，氨基酸序 列分析结果表明发色团均通过硫醚键连接在载体蛋白的半胱氨酸残基上【4 ，5 1 。载体蛋 白和发色团之间的连接方式见图1 1 。 2 第一章综述 c y i - p u b c y s p b d i c y s p u b d i c y s - p f b c 弘r 8 图1 1 藻胆蛋白的结构( p c b 藻蓝胆素，p e b 藻红胆素，p u b 藻尿胆素，p x b 藻黄胆素) f i g u r e l 1t h es t r u c t u r eo fp h y c o b i l i p r o t e i n s ( p c b - p h y e o c y a n o b i l i n ，p e b - p h y c o e r y t h r o b i l i n ，p u b - p h c o u r o b i l i n ，p x b - p h y e o b i l i v i o l i n ) 藻胆蛋白每分子含两条多肽链，a 亚基和b 亚基，a 亚基的大小约为1 3 0 0 0 - - 2 0 0 0 0 ， b 亚基的大小约为1 4 0 0 0 2 4 0 0 0 1 6 , r l ，其中每条链包含一个或多个共价连结的发色团。 藻胆蛋白一般以六聚体或三聚体状态存在。聚集态越高，其捕获和传递光能的能力 越划圳。某些藻胆蛋白还含有( a 1 3 ) 6 7 ，其中y 亚基分子量为3 0 0 0 0 。藻胆蛋8 - - 聚体呈 圆盘状，直径为1 2 0 a ，厚度为3 0 a 1 9 l 。藻胆蛋白的a 和b 亚基通过分子间的各种相互 作用力( 疏水键、氢键、和离子键等) 先形成单体( a b ) ，单体之问再聚合成三聚体( a b ) 3 ( 这时还需要有连接多肽的作用) 。藻胆蛋白的六聚体( a 1 3 ) 6 由两个( a b ) 3 组成【1 0 】。每个 三聚体圆盘的外径约为1 1 0 a ，盘厚大约为3 0 a ，中央空洞的直径大概是3 5 a 。虽然a 亚基和b 亚基含有不同数量的氨基酸残基，并且一级结构不同，但它们的二、三级结 构却十分相似，均是含有九个a 螺旋，每两个a 螺旋之间由不规则的转角相连，形成 与球蛋白十分相似的三级结构。 藻蓝蛋白分子含有三个色基，分别在连接在a 8 4 、b 8 4 和b 1 5 5 位上【1 1 , 1 2 l ；别藻 3 青岛大学硕十学位论文 蓝蛋白含发色团的数目较少，分别连接在a 8 4 和b 8 4 上；藻红蛋白有五个发色团， 分别连接在a 8 4 、a 1 4 3 、b 8 4 、b 1 5 5 和b 5 0 、b 6 1 位上，其中b 5 0 、b 6 1 这两个连 接点可能是由于氨基酸取代生成的【1 3 】。 l e m b e r g 在1 9 2 8 年首次证明了藻胆蛋白是由脱辅基蛋白和开链线性延展的四吡 咯色基所组成1 1 4 】。o h e o c h a1 9 5 8 年用1 2 m o l l 的盐酸酸解藻胆蛋白得到了游离的色 基，1 9 6 6 年他又用甲醇回流的办法分离到了色基，1 9 6 4 年，有人发现在r 藻红蛋白 中除含有藻红胆素外，还有另外一种藻胆素，它的吸收峰位于4 9 5 n m 处，在室温下 用浓盐酸处理很难将其从脱辅基蛋白中除去，这种色基以后被命名为“藻尿胆素”。 1 9 7 1 年，s c h r a m 和k m g s 用溴化氢处理藻胆蛋白也得到了游离的色基。他们称之为“藻 胆素”，并且发现c 藻蓝蛋白中仅含有一种色基，即藻蓝胆素。以上所述色基的结构 相继被确定，1 9 7 6 年，b r y a n t 等在藻红蓝蛋( a a 亚基中发现了第四种色基 “p h y e o b i l i v i o l i n ”，1 9 8 7 年它的结构i ：i ：t b i s h o p 等人确定。至此，在藻胆蛋白中总共发 现了四种色基，它们分别是藻红胆素( p e b ) 、藻蓝胆素( p c b ) 、藻尿胆素( p u b ) 和 ( p x b ) ，这四种藻胆素是同分异构体，它们的差异只表现在双键位置的不同。 藻胆蛋白分子可以结合不同种类的色基，而且一个分子可以共价结合很多个色 基，例如r 藻红蛋白共价结合2 5 个藻红胆素，9 个藻尿胆素；三聚体的藻红蓝蛋白可 以共价结合三个藻红胆素和六个藻蓝胆烈1 5 j 。 1 1 2 藻胆蛋白的氨基酸组成及其等电点 汤朝晖等测定了钝顶螺旋藻藻胆蛋白的氨基酸含量，8 种必需氨基酸含量丰富， 约占氨基酸总量的5 5 5 6 。殷钢等测定了钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的氨基酸组成，除半 胱氨酸及色氨酸未测定外，其他五种必需氨基酸( 亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨 酸、苯丙氨酸等) 含量都很丰富。研究表明螺旋藻藻胆蛋白中含有丰富的人体必需氨 基酸，而且藻蓝蛋白中的碱性氨基酸少于别藻蓝蛋白，酸性氨基酸多于别藻蓝蛋白， 因此藻蓝蛋白等电点低于别藻蓝蛋白；别藻蓝蛋白等电点在4 3 - - - 4 9 之间【1 6 】，藻蓝 蛋白等电点在4 2 - - 4 8 之间，沈蓓英等测定了极大螺旋藻中别藻蓝蛋白和藻蓝蛋白 的氨基酸组成并测定了其等电点，别藻蓝蛋白等电点为4 5 ，藻蓝蛋白等电点为4 2 。 藻胆蛋白在溶液中的状态与藻胆蛋白的浓度、种类、离子强度和溶液的p h 值等 因素有关。如c 藻蓝蛋白在p h = 6 8 时，以三聚体( a b ) 3 为主，在接近其等电点( p h = 5 0 5 5 ) 时，六聚体( a b ) 6 为其主要的存在形式，而在蛋白质浓度为0 6 m g m l 、离子强度为 o 2 、p h = 5 4 时，存在六聚体与单体间的平衡( a b ) 6 - - 釜- 6 ( a b ) ：在p h = 6 8 ，蛋白浓度较 低时，则存在着三聚体与单体间平衡( a 1 3 ) 3 3 ( a b ) ；而当蛋白质浓度很高时，即使 4 第一章综述 p h = 6 8 ，仍然以六聚体与单体间的平衡为主。而对于b - 藻红蛋白和r 藻红藻白来说， 在一个很宽的p h 范围内都是以很稳定的六聚体( a b ) 6 t 形式存在。其原因可能是丫亚基 将两个三聚体“盘 铆在一起。一般来说，大部分时候异藻蓝蛋白是以三聚体的形 式存在【1 7 1 。 1 1 3 藻胆蛋白的光学特性 光谱特性是藻胆蛋白的主要特性，光谱法是研究藻胆体、藻胆蛋白结构和功能 的重要方法。藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白呈蓝色，藻红蛋白呈红色，都溶于乙醇、水等 极性溶剂，其中在高浓度乙醇中，藻胆蛋白将发生凝聚；藻胆蛋白不溶于乙醚、氯 仿等非极性溶剂。 有文献将各藻胆蛋白的光学性质归纳如下【1 8 】： 表1 1 藻胆蛋白的性质 t a b l e l 1p r o p e r t i e so fp h y c o b i l i p r o t e i n s 1 v a l u e si np a r e n t h e s e si n d i c a t es e c o n d a r ya b s o r b a n c em a x i m a 2 p h y c o b i l i p r o t e i n sa r ea g g r e g a t e so fs u b u n i t s ，a n dv a r i o u sa g g r e g a t e sm a yo c c u ri na q u e o u s s o l u t i o n v a l u e sg i v e na r ef o rm o s tc o m m o nr e p o r t e da g g r e g a t e s ；a g g r e g a t e so fb o t hl a r g e ra n d s m a l l e rs i z em a yo c c u r 3 j ma p p r o x i m a t er e l a t i v ei n d i c a t o ro ft h eq u a n t u me f f i c i e n c yo ft h ep i g m e n t ( m e a s u r e da t a b s o r b a n c ea n de m i s s i o nm a x i m a ) 5 青岛大学硕士学位论文 藻胆蛋白的颜色不是单纯的由发色团决定的，如藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白均带有 藻蓝素基团，但藻蓝蛋白最大吸收峰在6 2 0 n m 处，而别藻蓝蛋白最大吸收峰在6 5 0 n m 处。在藻胆蛋白中，每个发色团的光谱学特性受构象和环境影响很大。在一级结构 中，发色团残基的位置是固定的，而不同的藻胆蛋白的发色团因其位点不同其化学 性质也不同，这一现象在所有的藻胆蛋白中都存在【1 9 】。此外，a b 单体之间的相互作 用也很重要。例如，单聚体a l $ 雯j t j 藻蓝蛋白的最大吸收值在6 1 5 n m 处，而三聚体( a b ) 3 别藻蓝蛋白最大吸收值在6 5 0 n m 处【2 0 1 。 c 藻蓝蛋白包含了一个蛋白和一个发色团，当藻胆蛋白从机体中分离纯化出来 后，由于已经没有邻近的受体来转化收集过来的能量，这种水溶性的亮颜色的胆蛋 白就变得高度的荧光性。藻胆蛋白的光谱学和结构特性使得它具有独特的特征，藻 胆蛋白发射的荧光强度比常见的荧光素强3 0 倍，并且在较宽光谱范围内有较高吸收 系数；藻胆蛋白荧光受干扰小，不因其它生物分子的存在而消失，在较宽的p h 范围 内有较高的荧光产率，液体或固体状态存在时都较为稳定，能保存较长时间，有很 好的水溶性【2 0 , 2 1j 。 对于螺旋藻，经提纯的螺旋藻p c 和a p c 的可见吸收峰分别在6 2 0 n m 和6 5 0 n m 处， 室温荧光发射峰分别在6 4 6 n m 和6 5 7 n m , 左右【引。实质上，藻胆蛋白的光谱特性主要应 归因于发色团( 藻胆素) ，但也离不开脱辅基蛋白和连接多肽的作用。另外，离体和 活体状态下的藻胆体、藻胆蛋白和藻胆素的光谱特性( 光谱曲线和强度) 是不相同 的。变性的藻胆蛋白的可见吸收峰值显著降低，荧光变弱甚至完全消失。因此，一 切导致藻胆蛋白变性的因素( o n 离子强度、p h 、光照、温度等) 都能影响其光谱特性。 离体条件下的藻胆蛋白较活体状况下更易变性。 藻红蛋白的可见光光谱1 2 2 l 在5 6 5 n m 和4 9 8 n m 处存在2 个完全吸收峰，5 4 5 n m 有吸 收肩峰，5 6 5 n m 为最大吸收峰，对r p e 进行2 0 0 5 0 0 n m 荧光激发情况进行研究的结 果表明r p e 在此范围内存在4 5 8 n m 、3 7 6 n m 和3 1 0 n m3 个荧光激发峰。分别用三种不 同波长对r p e 的荧光发射情况进行研究，在三个不同波长激发下，r p e 的发射峰位 置基本一致，位于5 8 4 n m 左右，其中4 5 8 n m 的荧光激发强度最大。因此，选用4 5 8 和 5 8 4 n m 作为其最适荧光激发和发射波长l 矧。b 藻红蛋白在5 4 5 和5 6 0 n m 处存在两个吸 收峰，在4 9 8 n m 处还有一个吸收肩峰。对紫球藻藻红蛋白荧光激发状况进行分析的 结果表明，紫球藻藻红蛋白存在4 4 0 n m 、4 7 0 n m 和4 9 0 n m 三个荧光激发峰；荧光发 射峰位于5 7 8 n m 处【2 4 1 。 6 第一章综述 1 2 藻胆蛋白的提取和纯化技术 藻胆蛋白的提取一般用红藻或蓝藻【2 5 1 ，藻种不同所含藻胆蛋白的种类和含量也 不同。藻蓝蛋白一般从钝顶螺旋藻、极大螺旋藻、层理鞭枝藻、多管藻、条斑紫菜、 坛紫菜和红毛菜中分离纯化得到；别藻蓝蛋白可从钝顶螺旋藻中分离纯化得到；藻 红蛋白则可从龙须菜、红毛菜、红毛藻、紫球藻、江篱、多斑紫菜和多管藻中分离 纯化得到。如林红卫、彭卫民等从钝顶螺旋藻中提取藻蓝蛋白等藻胆蛋白，王广策、 张建平等从多管藻中提取藻红蛋白和藻蓝蛋白。此外，坛紫菜、条斑紫菜、红毛藻 也是经常用的提取原料。螺旋藻是我国目前大规模养殖的微藻物种，藻蓝是螺旋藻 特有的光合色素，因此，螺旋藻是生产藻蓝蛋白经济而有效的首选原料【2 6 。 对于不同生长期的藻类，其藻胆蛋白含量也有差异，一般生长初期藻胆蛋白的 含量较少，成熟前达最高值，其后藻胆蛋白的含量逐渐减少，而且新鲜海藻中藻胆 蛋白的含量比晒干或加工后的蒯2 7 j 。 藻胆蛋白的提取和纯化一般包括两个阶段，一个阶段是粗提，第二个阶段是纯 化精制阶段。目前，常用的细胞破碎方法和提取纯化方法有很多，下面就主要的方 法做简单的介绍和比较。 1 2 1 细胞破碎方法 藻胆蛋白是水溶性的蛋白，提取比较方便，但对于细胞内蛋白，必须要破碎细 胞壁和细胞膜，使蛋白以溶解状态释放出来，并保持其活性【2 8 1 。许多方法和试验条 件都被用于处理大量的细胞和提取藻胆蛋白，例如反复冻融法、球磨法、机械破碎 法等，都是通过压力或者剪切力来达到目的的。常用的细胞破碎法主要有以下几种： 1 2 1 1 反复冻融法 反复冻融法的原理是利用细胞内冰粒的形成和盐浓度增高引起溶胀，使细胞破 碎。将收集的藻体或藻粉用蒸馏水浸泡，在零下2 0 以下冰冻，再在5 融解，反复 几次，细胞即可破碎。据彭为民【2 9 j 等用反复冻融的方法来破碎螺旋藻细胞壁，效果 很好。经过三次反复冻融以后，用显微镜观察，发现藻丝己完全断裂，藻细胞已经 解体，藻胆蛋白从细胞内释出，光下肉眼即可见所发出的强烈荧光。离心后可以获 得螺旋藻藻蓝蛋白的粗提液。由于粗提液的浓度较大，因而荧光极其强烈，外观呈 暗红色，而藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白本身的蓝色被遮盖住了。李绍利圳、余丽君【3 l l 等 也用该方法破碎螺旋藻细胞提取藻胆蛋白。此操作方法简单方便，比较适合实验室 少量样品的处理。 7 青岛大学硕士学位论文 1 2 1 2 溶胀法 用蒸馏水或低盐溶液浸泡藻体细胞，可以使细胞溶胀、破裂，释放出藻胆蛋白。 韦涮3 2 】等研究了极大螺旋藻藻蓝蛋白的提取，认为用1 0 m m o l i c a c l 2 或1 5 9 l n a n 0 3 的浸泡效果很好；程凌江【3 3 1 等直接用水浸泡条斑紫菜得到了藻红蛋白的粗提液；于 九九【矧等认为采用低浓度c a c l 2 溶液或蒸馏水在4 0 条件下浸泡螺旋藻的提取方法 效果好。溶胀法提取周期较长，用低盐溶液浸泡要3 4 天，用蒸馏水浸泡要1 0 天。 1 2 1 3 化学试剂处理法 用十二烷基磺酸钠等化学试剂处理藻体细胞，可以破坏其细胞膜提取藻胆蛋白。 林卫红等用此法破坏钝顶螺旋藻的细胞膜提取藻蓝蛋白，藻蓝蛋白的提取率高达 9 8 ，结果明显优于冻融法提取【3 5 1 。还有人用n a n 0 3 【3 6 l 或者k c i l 3 7 1 和溶菌酶联合作 用提取藻胆蛋白。化学法适用于大量样品的制备，但因为在提取过程中加入了化学 试剂，后期的纯化难度增加，而且操作不好容易引起蛋白质的变性。 1 2 1 4 超声波破碎法 超声波破碎法常作为辅助方法，破碎细胞壁使藻胆蛋白溶出，须与其它方法合 用以最大限度破碎细胞，一般采用先冻融后超声波破碎的方法【3 8 1 。超声波破碎细胞 产生的热量大，多用在实验室的小量操作。杨立红【3 9 】等用超声波细胞粉碎仪破碎鱼 腥藻细胞，其最佳处理条件为超声波仪的功率为6 0 0 w ，破壁容量为2 0 r a l ，固液比为 1 ：8 ，超声时间为9 m i n 。余九九等也研究了运用超声波从螺旋藻中提取藻胆蛋白，但 效果并不理想。 1 2 1 5 组织捣碎法 组织捣碎法是将材料配成糊状液，用高速组织捣碎机来破碎藻体细胞的方法。 汤朝晖等【删曾先用冻融法，再用该法来破碎钝顶螺旋藻细胞以提取藻胆蛋白。 在实际生产中，上述几种方法经常混合使用，以最大限度地破坏藻体细胞，使 藻胆蛋白溶出。把反复冻融法和超声波破碎法结合使用来破碎细胞，对设备要较高， 要注意散热，以免温度过高使蛋白变性，破坏产品成分。也有使用化学试剂处理的， 但此法增加了后期操作难度。细胞破碎的方法除了上述介绍的几种法外，还有搅切 法、液氮研磨法、渗透压破碎法、高压匀浆法等【4 1 , 4 2 j 。 1 2 2 分离提取方法 细胞破碎以后通过离心可以使藻胆蛋白与藻体碎片分离，得到藻胆蛋白的粗提 8 第一章综述 液。进一步通过一定的方法可以将藻胆蛋白与主要的杂质分离开来，主要有盐析法、 等电点沉淀法等。 1 2 2 1 盐析法 盐析法是通过加入盐溶液使蛋白沉淀析出的方法，当盐浓度升高时，蛋白质按 照溶解度不同先后析出，这种现象称为盐析。大量盐加到蛋白质溶液后，高浓度的 盐离子由于具( 如硫酸铵的s 0 4 2 ) 有很强的水化力，可以夺取蛋白质分子的水化层， 使其“失水 ，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时溶液p h 若在蛋白质等电点 附近则效果更好。由于各种蛋白质分子的颗粒大小、亲水程度不同，盐析所需的盐 浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中中性盐的浓度可使各种蛋白质分段沉淀 出来1 4 3 1 。 在藻胆蛋白粗提中常用的盐为硫酸铵。用2 5 ( w v ) 饱和度硫酸铵可将藻红蛋白 沉淀出，用3 0 ( w v ) 饱和度硫酸铵可将藻蓝蛋白沉淀出，再用5 0 ( w n ) 饱和度硫 酸铵可将别藻蓝蛋白沉淀出【矧。大多数提取藻蓝蛋白粗体液的方法都要用到硫酸铵。 盐析法也比较适合实验室少量试样的处理。 1 2 2 2 等电点沉淀法 在溶液的p h 值在等电点附近时，溶质的溶解度下降从而析出。调节溶液的p h 至 藻胆蛋白的等电点，可以使藻胆蛋白沉淀析出。但是在操作过程中要注意藻胆蛋白 对p h 很敏感，要避免p h 引起的藻胆蛋白变性。 1 2 2 3 结晶法 不同藻胆蛋白在低浓度硫酸铵中可产生不同晶体，利用这一特点，用结晶方法 可以提取藻胆蛋白。条斑紫菜先用硫酸铵盐析，将沉淀在4 0 下放置2 0 天以上，再 用1 5 低饱和度的硫酸铵沉淀，可得到藻红蛋白的沉淀，并且纯度很高可达4 0 ，这 种方法效果很好但周期较长。 1 2 2 4 超滤法 李娟等曾报道了用该法从螺旋藻中提取藻蓝蛋白【4 5 】。用超滤膜过滤藻胆蛋白的 粗提液，可以得到藻胆蛋白粗制品。国外有人用硝酸钠高渗一超滤法分离提纯藻胆 蛋白，用聚砜膜超滤，在超滤过程中，小分子蛋白质包括小分子的藻毒素和无机盐， 透过滤膜而去掉，这种方法适用于易产生水华的微囊藻脱毒，可以提高产品的安全 性。用此法提取的藻胆蛋白是安全无毒的，易于纯化，而且超滤的产品脱水方便， 易于产品的干燥。硝酸钠高渗超滤法是提取藻胆蛋白简单易行的方法之一。 9 青岛大学硕士学位论文 1 2 3 纯化方法 简单的细胞破碎之后，藻胆蛋白粗提液中杂蛋白含量仍然很高，需要进一步的 纯化。其纯度高低可以采用最大可见吸收峰波长处的吸光值与2 8 0 n m 处的吸光值之 比【4 钏n 砌垴o ) 来表示。纯藻胆蛋白的纯度一般要求a 2 8 0 4 。 1 2 3 1 羟基磷石灰( h 舢柱层析法 羟基磷灰石( h a ) 是一种吸附剂，有天然的和合成的，具有好的生物相容性 4 6 1 。 它的表面带有c a 2 + ，r f i p 0 4 3 。两种带电基团，碱性蛋白质可以与e 0 4 3 - 结合，酸性和中性 蛋白质可与c a 2 十结合，用不同离子强度的缓冲液可以将结合的蛋白质洗脱下来。羟 基磷灰石柱层析分离蛋白质简单易行，而且有很好的分离效果，同时羟基磷灰石制 备经济，所以国内现已广泛用于藻红蛋白和其他藻胆蛋白的分离，当其他分离技术 无效时，使用该技术往往能呈现良好的分离性能。而且它价格低廉，用它作为色谱 填充料，可作为制备色谱易于放大【4 7 1 。此法为常见方法，所用沈脱液是梯度浓度的 磷酸盐缓冲液，过柱后收集不同浓度的洗脱液，浓缩，再进行一次h a 柱层析，往往 需要经过多次羟基磷灰石柱层析，再经其它柱层析，才能得到单一的蛋白溶液。用 该法提纯效果较好，得到的蛋白纯度可以达4 5 - - 6 。 1 2 3 2 葡萄糖凝胶柱层析法 先用羟基磷石灰( h a ) 柱层析，再过s e p h a d e x g 1 5 0 的葡萄糖凝胶柱层析，得到较 纯的藻蓝蛋白( 纯度大于4 ) ；用结晶法先对条斑紫菜进行粗提，再用葡萄糖凝胶柱 b i o g e l p 3 0 0 层析可得到高纯度的r 藻红蛋白( 纯度为8 1 ) 4 8 】；实际应用中几种方法 混合使用能取得较好的纯化效果。 1 2 3 3d e a e 纤维素阴离子交换 d e a e 纤维素离子交换是一种弱阴离子交换【4 9 】。单独使用d e a e 纤维素离子交 换柱分离效果并不理想，需要和其它方法配合使用。先用硅藻土5 4 5 柱层析，用梯度 浓度的p h = 7 0 的硫酸铵溶液分级洗脱，分部收集，再分别用d e a e 5 2 纤维素柱、葡 萄糖凝胶柱b i o g e l p 3 0 0 层析，用磷酸盐缓冲液( p h = 6 0 ) 洗脱。洗脱液经盐析、沉淀、 渗析、离心，得到的上清液即为纯化的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，产品纯度能达到4 0 以上【5 0 l 。c a r m e n ss 等川采用q s e p h a r o s ef a s tf l o w 填充的阴离子交换色谱( 1 5 c m l o e m ) ，经一步纯化，使粗提液的中藻蓝蛋白的纯化因子达到2 2 ，纯度达到9 3 。可 见阴离子交换色谱是规模化纯化螺旋藻蛋白的有效的手段之一。 1 2 3 4 膨胀床吸附色谱 1 0 一 llllllllll【llllllllllllllllll。lllllll。lilllllillllllllllllllllllllllllllllllllllllllilllllllllllllllllllllllllllllliill卜 第一章综述 膨胀床吸附色谱技术是近十年发展起来的介于流化床和固定床吸附之间的一种 新型的吸附色谱技术。它是集料液澄清，目标产物浓缩和分离纯化于一体的规模化 生物集成分离技术。n i u jf 等【5 2 】采用膨胀床吸附技术提取分离螺旋藻藻胆蛋白，效 果较好。将通过硫酸铵沉淀后的藻蛋白粗提液通过装有5 0 m lp h e n y l s e p h a r o s e i 吸附剂 的膨胀床，用大体积上样，体积为2 9 8 - - 一3 4 0 m l 的藻蛋白粗提液，采用0 5 m o l l 硫酸 铵进行脱附，收集流出液。通过一步膨胀床吸附，藻蓝蛋白的纯化因子从o 6 9 提高 到3 0 左右，且分别得到t 2 9 9 - - - 5 1 0 9 的藻蓝蛋白。结果表明，膨胀床吸附色谱可以 作为实现藻蓝蛋白规模化分离纯化的较好选择。 近年来，不仅产生了一步层析法，简化了层析步骤，还出现了双水相萃取法等 新的分离纯化技术。 1 2 3 5 双水相萃取法 双水相萃取法操作步骤少，时问短，回收率高，同时能使藻胆蛋白在一相浓缩 【5 3 1 。g a n a p a t h ip a t i l 等【5 4 l 对藻胆蛋白进行分离时采用1 1 6 3 磷酸钾缓冲液和1 2 2 8 聚乙二醇形成的双水相体系，研究发现，p h = 7 2 时，一次萃取藻蓝蛋a ，纯度可以 从3 9 6 提高到5 2 2 ，经双水相萃取的藻蓝蛋a 再经d e a e s e p h a d e x 离子交换柱层析， 纯度可以达到6 6 9 。双水相提取所得的藻蓝蛋白纯度为5 2 2 ，回收率为6 6 ，证明该 方法具有现实的可行性。p a t i l 等同时指出了双水相萃取法萃取藻蓝蛋白的最佳条件： 聚乙二醇4 0 0 0 磷酸钾体系，两者的体积比为4 ：5 ，体系o h = 6 0 时为最优组合，通过超 滤可以去掉聚乙二醇4 0 0 0 。 国内外对藻胆蛋白的提取纯化工艺较复杂，制得的产品纯度有限，且安全性不 高，国外在工业规模生产上，目前采用的膜分离方法，技术上还不够成熟，色谱纯 化步骤多会大大降低产品收率。导致藻胆蛋白制剂价格昂贵，成为制约其丌发利用 的瓶颈，因此研究如何在分离纯化技术上取得突破、低成本高效益地获得高纯度的 藻胆蛋白意义重大。 胡一兵1 5 5 j 等采用羟基磷灰石柱层析和s e p h a d e x g 1 0 0 凝胶层析得到纯度比大于 5 0 的藻蓝蛋白。殷钢【5 6 j 等采用s e p h a c r ) r l s 2 0 0 凝胶层析和羟基磷灰石柱层析对人工 养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行分离纯化，得到藻蓝蛋白纯品。韦萍等将藻蓝蛋 白的粗提液分别通过d e a e s e p h a d e x a 2 5 和羟基磷灰石( h a ) 柱层析，并将藻