（基础兽医学专业论文）H5和H9亚型禽流感病毒诊断芯片的初步研究.pdf

摘要摘要禽流感是由正黏病毒科流感病毒属a 型流感病毒所引起的禽类的感染和倒艺疾病综合征，其中高致病性禽流感被国际兽疫局( o 回定为a 类传染病。a i v 基因组含有8 个单股负链r n a病毒节段，目前分为1 6 个血凝素a 汗口9 个神经氨酸酶0 蛆) 亚型，其亚型鉴定主要依靠血凝抑带怖验和神经氨酸酶抑制试验，这是世界卫生组织m ，h o ) 进行全球流感监测所普遍采用的试验7 弓怯。基因芯片技术是种快速、并行、高通量的基因水平的诊断技术，可以应用于并行的检测数百个疾病相关分子，它的出现为禽流感病毒的快速检测和分型提供了可能。本实验利用基因芯片技术在禽流感病毒亚型鉴定上做了初步的研究，希望构建_ 种在基因水平提供一次样品就可以鉴别流感病毒亚型平台。研究的内容主要包括：1 探针的制备：禽流感病毒的h i h i s ( 无h 1 2 ) 、- e 型h a 基因、n 1 - n 9 亚型的n a 基因、n p 基因各分成三段，m 基因和n s 基因：新城疫、法氏囊和传染性支气管炎病毒的保守基因片段；阳性对照g a p d h 基因共8 5 个基因片段用各自特异的引物进行p c r 扩增，获得的产物经乙醇沉淀、浓缩、纯化后，将潍渡均调整到l 嵋似l 左右做为探针。2 芯片的制备和反应条件的优化：用点样仪将以匕制备的探针、空白对照和p u c - 1 8阴性对照按照设计好的阵列点制到已经包被好的载玻片上制成芯片。通过对点样条件和杂交条件的优化最终确定：探钳农度3 0 0 - , 1 0 0 0 岭似、点样缓冲液为3 s s c + i 5 m o l 甜菜碱、点样湿度在6 0 r h 、杂交温度在4 2 、杂交时间在弘1 2h 时，杂交信号e 魄鹕副碌。3 样品不同标记捌去的b 匕较：通过在反跨哥挠程中用c y 3 - u n i t l 2 标记和在r t - p c r 扩增过程中掺加c y 3 - d u t p 标记两种不同的方法的比较，成功的建立了通用引物r t - p c r 方法在基因芯片上的运用，提高了c y 3 的掺加效率，降低了成本。4 芯片的应用：实验主要应用e 述方法制备的芯片检测了h s n l 和h 9 n 2 两种不同亚型的禽流感病毒。结果显示，扫描后获得的芯片图谱与预期亚型相符，达到了利用基因芯片技术鉴定禽流感病毒部分亚型的目的。通过对芯片的灵敏度、特异性、重复断口稳定| 生的检测，证明本研究制备的芯片可以用于i 缶床。结果表明本实验所建立的基因芯片诊断方法是可行的，为下步高密度芯片的制备奠定了基础。关键词禽流感；基因芯片：亚型鉴定；优化va b s t r a c tp r e l i m i n a r ys t u d yo fh 5a n dh 9s u b t y p ea v i a ni n f l u e n z av i r u sm i c o a r r a yt e c h n i q u ea b s t r a c ta v i a n 砌1 煳嗄a di sai n f e c t i o na n d o rd i s e a s es y l g j r o m ei nb o t hw i l db i r da n dp o u l 仃y , w h i c hc a u s e db ya v i a ni n f l u e n z av i r u st y p eao ft h eo r t h o m y x o v i r i d a ef a m i l y h i 曲p a t h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z ao - m a di sc l a s s i f i e dt o l i s ta d i s e a s eb yt h eo f f i c ei n t e r n a t i o n a ld e se p i z o o t i e s ( o i e ) a wg e n o m ec o n t a i n se i g h ti l 删v 岛s i n g l es 昀n dr n av i n 峨w h i c hi sd i v i d e di n t os i x 咄mh e m a g g l u a n i n o 认) a n dn i n en e u m m i n i d a s e ( n a ) s u t , t 艄i d e n t i f i c a t i o no f a i vs u b t y p e si sm a i n l yb a s e do nh ai n h i b i t i o nt e s ta n dn ai n h i b i t i o nt e s ta d o p t e db yw h o m i c o a r r a yi sak i n do f t i m es a v i n g , h i g hp a r a n e la n dt h r o u g h p u tn e wt e c h n o l o g y , w h i c hc a nb e印曲e dt ot h ed e t e c t i o no f h u n d r e d so f d i s e a s em a r k g r ss i n l u l t a n e o u s l y t h i ss t u d yw a sap r e l i m i n a r ye x p l o r a t i o no fa p p l y i n gm i c o a r r a yt e c h n i q u et oi d e n t i f i c a t i o no fa i vs u b t y p e s t h i ss t u d yw a n t sd e t e c tt h es u b t y p e so f a i vf l ：1 l o u g ham a n i p u l a t i o no nt h em i c o a r r a yp l a t f o r m t h ep r o c e s s e si n c l u d e ：1 t h e 删o no f t h ep r o b e sh ag e n eo fh 1 - h 1 5 ( w i t h o u th 1 2 ) s u b t y p e sa n dn ag e n eo fn 1 - n 9s u b t y p e s ，n pg e n e( s e g m e n t e di n t ot h r e es e p a r a t e l y ) , ma n dn s ；n d v , i b d v , i b vg e n e sa n dg a p d hg e n e ( p o s i t i v ec o n u - 0 1 ) w e 陀a m p l i f i e db yp c r t h ee i g h t y - f i v ep c rp r o d u c t sw e r ep r e c i p i t a t e db ye t h a n o l ，0 0 】瞰i a l s e dt 0f i n a lc o n c e n l r a f i o na b o v e1g g i - t 1 2 p 1 1 e i 均枷n g 锄do p t i m i z a t i n go f t h em i c o a r r a ya l lt h ep r o b e s n 曜霉i v ea n db l a n kc o n l r o l sw e r es p o t t e do n t os l i d e sc o a t e db yc h i p w r i t e r t h e删o nc o n d i t i o n sw 骶0 1 ) t i m 切e df i o md o t t i n ga n dh y b r i d i n gc o n d i t i o n s 。t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h es i g n a lw a sm 0 陀i d e a l i s t i cw h e nt h ed o t t i n gc o n c e n t r a t i o nw a s3 0 0 - - 1 0 0 0 枞t h ep r i n t i n gb u f f e rw a s3 x s s c + i 5 mb 砸n e ，t h eh u m i d i t yw a s6 0 r h , t h eh y b r i d i z i n gt e m p e r a t u r ew a s4 2 ，a n d 恤h y b r i d i z i n gt i m ew a s 弘1 2i l3 c o m p a r a t i o no f d i f f e r e n ts a m p l ef l u o r e s c e n c e - l a b e l e dt h em e t h o dw a st h a tt h es a m p l ew a sl a b e l l e db yc y 3 - u n i t l 2d u r i n gr e v g r 赞t r a n s c r i p t i o no rl a b e l l e db yc y a - d u r vd u r i n g0 1 1 es t e pm e t h o dm u l t i p l er t - p c rt e c h n i q u e t h i ss t u d ye s t a b l i s h e dau n i v e r s a lp r i m e rr t - p c rm e t h o di nt h ea p p l i c a t i o no f m i c r i a n a y , i m p r o v e dt h em i x i n ge f f i c i e n c yo fc y 3a n dr e d u c e dc o s t s 4 a p p l i c a t i o no f t h ec h i pi nt h es t u d y , h 5 n 1a n dh 9 n 2s t l b t y p e sa i vw e r ee x a m i n e db yt h ep r e p a r a t e dm i c o a r m y t h er e s u l t sw e r ea c c o r d a n c ew i t h , w h i c hp r o v e dt h a tt h em i c o a r r a yc o u l di d e n t i f yt h es u b t y p e so fa w v i i东北农业大学农学硕士学位论文t h r o u g ht h es e m i l i v i t y , s p e c i f i c i t y , r e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t yt e s t i n g , t h i ss t u d yp r o v e dt h a tt h em i c o a r r a yc a nb eu s e di nc l i n i c a ld e t e c t i o n ，n l er e s u l t ss h o w e dl h a tf i l ed i a g n o s t i cm i c r o a r r a yc a l lt e s tt h e s es u b w r 憋o fa i v , w h i c ha p p r o v e dt h a to u re s t a b l i s h e dm e t h o d sw e r ep r a c t i c a l 1 1 1 ep r o g r e s so ft h i sr e s e a r c hl a i ds o l i df o u n d a t i o nf o rl t a es e t u po f h i g h e rd e n s i t ym i c r o a r m y k e y w o r d s ：a v i a ni n f l u e n z av i r u s ；m i c o a r r a y ；d e t e c t ；o p t i m i z a t i o nc a n d i d a t e ：面a nl i n as p e c i a l i t y ：b a s i cv e t e r i n a r ys c i e r r es u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o r w a n gx i u r o n gv i i i研究生学位论文独创性声明和使用授权书独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及所取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得( 洼i 如遗直墓丝霞噩挂星4 直明的! 奎拦窒2 或其它教育初构的学位或证书而是用过的材料。与我一起工作过的同志对本研究所作的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：田而渤即日期：力口矽年月，孑e l学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：回加蝠p时间：汐毋年石月，吕日导师签名：豆叠粜帆力班占月日引言1 引言禽流感0 州锄i n f l u c m a , a t ) 是由正黏病毒科、流感病毒属、a 型流感病毒所引起的禽类的感染和倒涝召芮综合征( 殷震，1 9 9 7 ) 。本病1 8 7 8 年首次发生于意大利，现已几乎遍布世界各地。根据毒力强弱将禽流感病毒划分为高致病性a i v ( h i g hp a t h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z a v w t l s h p a i v ) 、非致病性a i v ( n o np a l h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z av u u s , n p a w ) 和低致病性a i v ( l o wp a t h o g e n i c a v i a ni n f l u e n z a v n u s , l p a i v ) 。但是习惯上还是将后两者统称为低致病性a i v ( m lp e r d u e , 2 0 0 0 ) 。高致病性禽流感病毒仅包括h 5 和h 7 亚型中的部分毒株，由于其传染性极强，可引起家禽全身性感染，造成多个组织器官严重病理损伤，致死率达7 5 以上，因此被国际兽疫局( o d 列为a m 染病。a i v 可以感染家禽、笼养鸟等禽类，其中在家禽中火鸡最易感，其次是鸡。疾病的严重程度取决于病毒的毒力及被感染禽的禽种、日龄、性别、并发症等因素。综合征可表现为从亚临床到轻度的呼吸系统疣扁，从产蛋下降到急隆弱怫甥摘等多种形式。禽流感已l ! 维泄界养禽业造成了巨大的经济损失，如1 9 8 3 年在宾西法尼亚、弗吉尼亚、新泽西等州发生h 5 n 2高致病力禽流感毒株感染，死亡率为5 0 0 旷8 9 ，直接经济损失达6 千万美元。1 9 9 6 至1 9 9 8年在美国宾西法尼亚低致病力h 7 n 2 禽流感流行中，造成了当地共计1 8 个商品鸡群、2 个商品雏鸡群和1 个商品火鸡群感染，经济损失总计达3 5 0 万美元( 于康震，2 0 0 0 ) ，2 0 0 4 年亚洲h s n l 亚型禽流感的两次式曝发，共捕杀了尽1 亿7 千万只家禽，a i v 对养禽业危害严重。9 r 7 年之前，尽管人和其他灵长类动物可人工感染禽流感病毒i lm u r p h y , 1 9 8 2 ；a s b e a r e , 1 9 9 1 ) ，但在这些宿主体内禽流感病毒的复制受到很大限制，使人们直认为禽流感病毒在自然界不能跨越种间屏障直接感染 类，然而9 7 年香港爆发的h s n l 亚型禽流感导致6人死亡事件，使人们清楚的认识到禽流感不仅可直接由禽感染人，而且还能致人死亡饵j c l a a s , 1 9 9 8 ；k s u b b a r a o , 1 9 9 8 ) ；2 0 0 3 年荷兰h 7 n 7 亚型禽流感感染8 9 人，导致1 死亡假a f o u c h i e r , 2 0 0 4 ) ；2 0 0 4 年亚洲h 5 n 1 亚型禽流感的大爆发，已导致3 2 人死于禽流感，其中泰国1 2 人死亡，越南2 0 人死亡。这些事件的发生使人们更加肯定禽流感是唯一能够在沉寂一段时间后可以突然在世界范围内发生大暴发并导致高发病率和高死亡率的传染病，正在不断的获得感染人的能力，禽流感的防制工作已经提升到前所未有的公共卫生学高度。它的危害已不仅是对养禽业的破坏，更重要的是它对 、类健康也构成了极大威胁，高致病性禽流感的防制工作成为全世界相关研究人员面临的重大难题。尘i ! 至：! 垩兰竺兰篓尘三11 禽流感病毒( a i v ) 的研究进展111 禽流感病毒( a i r ) 形态结构禽流黼毒睫于在电镜下逝似籼，酷或艮丝状，其直往为8 0 1 2 0 a m 左右姒l a m b ,1 9 9 6 ) ，湔掮毒具有囊摸病毒表面有两种突起h a 和n a ，m 2 蛋白镶暾在来源于宿主细胞膜的脂质t 层巾n p 蛋白和二种聚合酶蛋 h ( p b l 、p b 2 和c a ) 与八段v r n a 起构成核糖桩蛋白体q m 砷，m 1 蛋白将病毒壅噗与r n p 连接起来，而n s 2 蛋白通过与m l 蛋白相互作用间接地与r n p 发生聪系，n s l 蛋白是a i v 仅有的种非结构蛋白质n h o r i m e n 2 0 0 1 ) 。a i 病毒粒子存在于感聋细胞的目浆，表面和闻腺，土要以胞嚏上出芽的方式磁熟租种墩，也可以从胞浆中的空泡膜r 出芽成熟。病毒 构见图l - i ，圈1 - 1 流感病毒结构不赢削f i 9 1 - 1s k e t c h m a p0 f 慨i n f l u e a z a v i r e sv i r i o n2 禽流感分子的生物学特性21 禽流盛病毒基园组的结构及其编码蛋白的功能a 属正站商毒科流感庸蟊届a 型流盛病毒( i ( 1 1 b 0 呦e ，1 9 8 7 ) 为8 个节段的负链r n a病毒由太到小依次为p b 2 、p b l 、p a ，h a 、n p 、n a 、m 、n s ，共编码1 0 个病毒蛋白其中8 个是病毒的 r 戚成分o _ i a 、n a 、n p 、m i 、m 2 、p b i 、p b 2 和p a ) ，锻最小的n s基因编码两个非结构蛋白n s l 和n s 2 。龅酌自毒基田咀片段的共附点高嚏保守的5 和引言3 末端。每个r n a 片段的5 。末端均由1 3 个高度保守的核苷酸组成，即3 - g g a a c a a a g a u g a p p p - 5 ，3 味端由1 2 个核苷酸组成，即3 - u c g u u u u c g u c c - 5 。在这些共有序列中，可部分互补，形成锅柄环状结构，该结构是病毒r n a 聚合酶结合所必需的核苷酸识别位点( e f o d o r , 1 9 9 1 ；ef o d o r , 2 0 0 2 ) 。研究表明，流感病毒的致病性取决于宿主和病毒之间的关系，病毒的不同基因节段编码的不同产物，在病毒的生命周期中起的作用也是：不同i 拘( a l e x a n d e r , 2 0 0 6 ) 。a i v 基因组在转录和复制过程中易于发生基因重排。宿主细胞没有a w 复制所必需的依赖r n a 的r n a 复制酶和依赖r n a 的r n a 转录酶，因此这两种酶都是由自身基因编码的。这两种酶在复制和转录过程中的忠实性不及d n a 聚合酶和转录酶，这决定了病毒在复制和转录过程中有较高变异性。事实上也是如此，a i v 最显著的生物学特性就是变异频繁，血清亚型众多。a i v 在两个方面进行变异抗原漂移( a r n j g e n i ed r i 哟和抗原转变( 圳鲫i c鲥国( q ww o o d e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。抗原漂移是基因组的点突变，特别是h a 和n a 的点突变造成h a 和n a 较小范围的抗原性改变。抗原转变则是由于基因组的大片段缺失和插入，造成抗原性较大的改变，以至于出现新亚型毒侏和毒株毒力的变异( 郭元吉，1 9 9 r 7 ) 。流感病毒的聚合酶是由3 个最大的v r n a 片段( 1 3 ) 编码的三种蛋白质，分别为p b 2 ，p b l 和p a 。其中p b 2 和p b l 是碱性蛋白，p a 是酸| 生蛋白。三种蛋白结合在起起着病毒基因复制酶的作用，进行子代病毒的复制和m r n a 的产生，是启动病毒复制的必须酶系统( s t r i d h e ta 1 ，1 9 8 1 ) 。它们具有类似的结构和功能，其氨基酸序列有个共同的特点，都有一特定的亲核序列区，可使i 塞门种蛋白质在胞浆中合成后能顺利进入细胞核，所以在感染细胞的细胞核内都可发现这3 种蛋白。目前3 个聚合酶和核以及核糖核酸的复合物的三维结构( mh a t t ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 以及在r n a 中的定位基本清楚，对于进步研究提供了良好的信息c a 嗽e ta l ，2 0 0 4 ) a已有研究表明p b 2 与病毒对不同宿主致病l 生湘关，p b 2 的第6 2 7 位氨基酸的变化对于病毒感染哺乳动物的能力有着极大的影响力( s 1 1 i n y a , e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。p a 对于病毒的复制和转录调控以及病毒宿主的特异性也有着重要作用( b r o w n , e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。h a 是由v r n a 片段4 编码的表面糖蛋白，为7 5 k d 的典型l 型糖蛋白，即羧基端在囊膜内，氨基端在囊彬h 。流感病毒h a 蛋白与流感疾病的发生和流行最为密切，多年的研究证明h a 蛋白是流感病毒的主要保护性抗原，同时也是流感病毒抗原亚型分类的个重要标记抗原。h a 分子j 豳常有的1 0 个糖基化位点，4 个结构域：信号肽、胞浆域、跨膜域、胞外域，h a 的三维结构是由三个h a 聚合在起形成的三聚体，呈头茎结构。h a 是禽流感病毒所有蛋白中最重要的个，具有凝集多种动物红细胞的性质。作为宿主免疫系统主要的靶抗3东北农业大学农学硕士学位论文原，h a 可以诱导产生中和抗体，进而起到础建保护作用，抵抗感染和疾病。h a 的主要功能是结合宿主唾液酸之类的细胞受体，使病毒附着于细胞上，帮助病毒穿透宿主的细胞膜并改变抗原性，以逃脱宿主免疫系统的监视( s t e i n h a 蛾, e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。h a 在翻译后的加工处理主要有3 个过程：裂解酶的裂解、糖基化和脂肪酸的乙酰化。h a 的裂解活燃毒感染和在宿主体内的扩散是非常关键的。低致病性和中等致病性毒株的h a 只能在有限的细胞中裂解，所以感染也只局限在呼吸道和消化道，而高致病性毒株的h a 可在各种细胞中裂解，因此可引起全身性致死i 生感染。h a 的切割活l 生是由两种结构决定的，即裂解位点的氢基酸序列和裂解位点附近是否有糖基化位点。低韵南性毒株在裂解位点匕游仅有个喊性氨基酸r ，而高致病性毒株在裂解位点匕游有多个嘁| 生氨基酸。即使裂解位点处有多个碱陛氨基酸，如果在该位点晰尉趔砉化位点上的寡糖链将裂解位点遮掩起来，那么该毒株仍然表现为低致病性，但这种毒株在复制过程中糖基化位点如发生缺失，则非常容易转变为高致病性毒株。迄今为止，已经发现1 6 个h a 亚型的流感瞒毒，虽然它们在血清学匕存在着明显的差异，然而序列比饺表明，其半胱氨酸残基在所有亚型的序列中都很保守，表明它们来自个共同的祖先，并且具有相似的结构。氨基酸序列比较发现，相同亚型的不同毒株之间h a 序列同源性在9 0 0 4 以上，不同亚型毒株问同源陛在2 5 8 0 之间，其中h i 和h 3 亚型的差异最大，仅有2 5 的同源性，h 2 和i - 1 5 亚型间同源性较高为8 0 。对于h a 整体而言，除h a l上的r b s 高度保守外，h a 具有很高的变异率。尽管a i v 的毒力是由多个基因决定的，然而h a 是最具决定性作用的( s t e i n h a u e r , 1 9 9 9 ) 。h a 介导病毒结合到细胞受体上，并且促进病毒核糖核蛋白复合体( r n p ) 通过膜融合释放出来，从而激发病毒的感染。h a 的裂觯l 生是流碴螨毒组织嗜l 生的主要决定因素之一，蛋白酶在组织中的不同分布和h a 对这些酶的敏感性决定了流感病毒的感染。h a 的两个结构特征裂解位点处的氨基酸序歹蚜附近氨基酸的糖基化决定其裂解性。b o s c h 等( 1 9 8 1 ) 比较了l p a i v 和h p a i v 的h a 氨基酸i 芋歹u ，发现二者在h a 裂解位点处的氨基酸序列不同，通常，l p a i v 的h a 裂解位点处只有单个的碱性氨基酸，只能在呼吸道、消化道等少数细胞中裂解，因此只能感染呼吸道和消化道，造成温和感染或不表现临床症状；而一般来讲，h p a w 的h a 裂解位点处有多个连续的碱陛继酸插入，可以在无类胰蛋白酶的情况下发生裂解，因此可以在很多不同的宿主细胞中裂解为h a l 和h a 2 ，造成感染禽全身系统衰竭，导致死亡。在体外组织培养中，h p a i v 可在没有外源蛋白酶存在的睛况下繁殖，l p a i v 却不能( b o s c h , e t a l ，1 9 7 9 ) ，进步证明，h a 的裂解l 生是a i v 感染的决定因素之一。n p 是由片段5 编码的结构蛋白，分子质量为6 0 k d ，是种单体的磷酸化多肽，是构成病毒核衣壳的主要蛋白成分。在流感病毒的各个基因中，h i p 基因最为保守，n p 与v r n a 和r n a 依赖的p b 2 ，p bi 和p a 瑚成r n p 。n p 具有型特异性，根据其抗原性的不同，可将流感病毒分为a 、b 、c 三个型。n p 是种多功能蛋白质，除了形成病毒的核衣壳外，还4引言可通过r n p 米稳定v r n a ，使之免受r n a 酶作用，另外n p 还在病毒的表达和复制过程中及确定病毒的宿主特异性方面起一定作用。n p 有两种形式，种是可以移入核内的磷酸化形式刚p 5 吼另种是留在细胞质内的非磷酸化( n p - 5 3 ) 的形式。虽然n p 是宿主的细胞毒t细胞免疫应答的主要靶标，但是抗n p 的抗体不能给宿主提供免疫保护( 殷震等，19 9 7 ；b w卡尔尼克等，1 9 9 9 ) 。n a 是由v r n a 片段6 编码的表面糖蛋白，分子质量为2 0 0 k d ，是型糖蛋白，即氨基端在囊膜内，而羧基端在囊膜外，是病毒粒子表面的另种重要的抗原。n a 是种唾液酸酶，可以在病毒感染靶细胞时，识别细胞表面流感病毒受体末端的唾液酸残基，使病毒能够进入细胞( h a ，2 0 0 3 ) 。n a 的另个功能是为要出芽的病毒粒子清理通道，有利于病毒粒子的成熟和释嫩c o t m a , , e ta 1 ，1 9 8 7 ) 。n a 的活眭可被抗体和特异抑制物阻断，从而限制病毒的复制，主要表现为n a 没有吸附、融合、复制、装配和出芽功能。n a 在病毒粒子表面并不是随机分布，而是呈不连续的斑片状。n a 基因在翻译后不需要切割，不需除去信号肽，起始密码子翻译的m e t 一直存在，羧基端也不经过加工。n a 的级结构包括4 个区：氨基端胞浆尾、非极 生跨膜区、茎部、头部。其中，n a 的氨基端胞浆尾包括6 个氨基酸残基，非常保守，在所有的a 型流感病毒中都相同、j 阶j q k ，能将糖蛋白固定在脂质双层匕。n a的三级结构已经明确，成熟的n a 分子是个四聚体，呈蘑菇型，其头部有四个酶活性位点。n a 基因在翻译后不需要切割，不需除去信号肽，起始密码子翻译的m e t 一直存在，羧基端也不经过加工。当前，已经知道存在9 个亚型的n a ，它们在血清学t 不存在交叉反应。m 由v r n a 片段7 编码的非糖基化蛋白，是病毒粒子中含量最大的蛋白，占病毒粒子总量的3 0 - 4 0 。m 基因有两个阅读框架，可转录出两个m r n a 分子，分别翻译出两种基质蛋白一一m l 、m 2 。m 1 由2 5 2 个氨基酸组成，分子质量为2 5 k d ，是病毒的主要结构蛋白，是核衣壳的主要成分，具有型特异性，其抗原性的差异是流蔗墉毒的分型依据之一。研究发现m 1 的氨基端含懿水区，羧基端与病毒的跨撤间存在相互作用，推测它能够调节病毒转录酶的活性，从而在病毒感染的早期调节其生长蜘s y a s u d ae ta 1 ，1 9 9 3 ) 。另外m 1 在病毒粒子的装配中起重要作用。m 2 由9 r 7 个氨基酸组成，分子贡量为15 k d 。m 2是种跨膜离子通道蛋白，是非塘基化的四聚体，在感染细胞中大量生产，z e b e d e e - 敏1 9 8 9 )发现，在个感染了流感病毒的哺乳动物细胞表面上大约累积有1 0 6 1 0 7 的m 2 分子，但只有很少被混合于病毒粒子中，这是由于能够起离子通道作用的m 2 的数量受p h 的制约皿h -p i n t o , 1 9 9 2 ) 。p i n t o 钦1 9 9 2 ) 还发现，当m 2 蛋白的跨膜区域发生突变时，病毒对药物的抗性也随之发生改变。5东北农业火学农学硕十学位论文6 非结构蛋白洲s n l i 曲喵lp r o t e 讥n s )n s l 和n s 2 是禽流感病毒的两种非结构蛋白，由片段8 编码，序列分析发现，n s i 和n s 2 有7 0 个氨基酸的重叠，并且在氨基端有9 个氨基酸是相同的。n s l 在感染的早期大量合成，由2 3 0 个氨基酸组成，分子质量为2 5 k d ，主要参与到感染的细胞核中；n s 2 由1 2 1个氨基酸组成，分子质量为1 2 k d ，在感染的后期合成生产，在不同的毒株中高度保守。n s l聚集在核中，负责磷酸化的世代交替，可能参与病毒m r n a 的合成和拼接。n s 2 的发现较晚，直到1 9 9 1 年r i c h a r d s o n 和a k k i n a 才证实在纯化的病毒中有n s 2 蛋白的存在，并且在感染细胞中的n s 2 蛋白是磷酸化的。已有研究表明，在个病毒颗粒中大约有1 3 0 - 2 0 0 个n s 2分子，在n s 2 和m 1 之间存在直接的蛋白蛋白相互作用，病毒核衣壳刚溶解时，n s 2 与r n p结合在起，然后与m 1 解离，直接参与子代病毒r n p 从感染病毒的细胞中释放出来的过程，n s 2 羧基端的7 0 个氨基酸是m 1 的结合区( y a s u d a ，e ta 1 ，1 9 9 3 ；w a r d , e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。1 1 3 病毒的复制和遗传变异1 1 3 1 病毒的复制病毒的r b s 与细胞膜匕糖蛋白或糖8 骼渊的唾液酸结合后，通过受体介导的吞噬作用进入细胞浆，与酸性沼确僻融合，导致病毒周围的p h 降至5 0 ，使r n p 释放到细胞质中，在此酸隆环境下，h a 发生改变，导致病毒核衣壳和核糖体膜之间发生膜融合，使病毒核衣壳释放到胞浆内，然后，在核糖体内部m 2 离子通道暴露了病毒杨b 的低p h ，促使m 1 从r n p 上解离出来，进而使r n p 由核定位信号系统转运到核中。病毒r n a 转录机制是独特的。核酸内切酶将细胞m r n a5 端的帽子结构切下，作为病毒转录的引物。病毒的8 个r n a 片段中的h a 、n a 、n p 、p b 2 、p b l 、p a 基因都只有个o r f ，转录后只翻译成相应的单蛋白，而n s 、m 基因却有两个o r f ，翻译成两个不同的蛋白，n s l 、n s 2 和m 1 、m 2 。研究证明，游离n p 浓度的上升可激发v r n a 的合成，新合成的v r n a 与n p 组合在起，其功能是作为第二次病毒m r n a 转录的模板。在感染后期，重要的翻译产物是m 1 、h a 和n a 。h a 和n a 在粗面内质网上进行糖基化，然后运送到高尔基体e ，再运送到细胞表面，在此由细胞膜包被，完成病毒的组装。m 1 、n s 2 蛋白的核定位功能对r n p 转移出细胞核和在细胞质中进行子代病毒的装配起重要作用。1 1 3 2 病毒的遗传变异流感病毒具有很强的变异能力，也正是由于其抗原性的频繁变异，a i v 有众多的血清亚型是，使我们无法通过单纯疫苗的免疫米控诲惭c 2 丞的流行。沈酌卤毒的抗原性改变是由点突变( 抗原漂移) 的积累或基因重组( 抗原转霉d 突发引起的。6弓l 言_ ：ii i i i i ii i 黑篡! ! 皇! ! 苎皇篁黑糕曼! ! ! ! ! 曼曼黑嬲雹曼! 竺! ! 曼皇黑懋鼍! 詈量皇! ! 曼寰攀苎曼! 曼抗原漂移是由基因组的点突变等引起小幅度的变界，导致氨基酸的积累到达一定的程度或突变氨基黢正好改变了抗原决定簇，从而弓i 起抗原性的改变这类变异般仅限于人流感病毒，丽在禽类中发生的凡率要小些。抗原转变是由较大幅度的改变( 如重组等) 导致新的毒株或皿型的形成。鉴于a i v 的基因缝由8 个基因冀段缝成，这就摄容易导致通过基因重越箩蠢形成新的变异株。实验证明，不嗣亚型病毒同时感染个细胞时，病毒基因组可发生节段的交换噼qw e b s t e r , e ta 1 ，1 9 8 1 ；gw e b s l e r , e ta 1 ，1 9 8 2 ) 。仅仅就a i v 的鼹释袤露塘蚤自h a 帮n a 来谶弱蘸存在1 6 个h a 、9 个n a 蓝型，在抗原转变作为挤原性变化补充l 生的机席邮t 仪在a 型流感病毒中发规。由于在不可了蜀 i 贝4 的间隔期内，现行的流感病毒亚型不见了，又出现了对人来说_ 或薅个表嚣糖蛋白已替换的新亚型的病毒，针对先前流行株的抗体与新的毒株没有交叉反应，起不到抗病作用了，那么，又一次流感大暴发就有可能发生。1 2 禽流感诊断方法研究现状禽流感的诊断可以根据i 瞄；| ；毒赫状、剖检变化等作出初步诊断，实验室确诊需要依靠病原分离和鉴定、盘清学方法秘分予学方法进 亍诊龄，下越对对这些技术分别进行叙述。1 。2 。1l 晦床诊断由a 型a i v 引起的禽流感，因感染禽的种类、年龄、性别、并发感染愤况及所感染毒株的毒力及箕它环境因素等不两丽表现出的症状很不致。典型m 主要表现为体温升高，呼吸困难，精神萎靡，食欲不振或废绝，肿头，眼分泌物增多，冠和肉髯边缘有紫黑色坏死斑点，跖部鳞片下有紫黑色窭盘，有的鸡出现神经摩获葶翼下痢，母鸿产蛋量急捌下降毒典型m 则仅见轻微的呼吸道症状及母禽产蛋量迅速下降；隐性感染则无任何症状。1 2 1 1 发病率和死亡率因毒橡的致病力不同，发病率由亚临诊感染型l ，死亡率从0 - 1 0 0 ；同时，不同种类禽的易感性也不同，如h 5 n 8 戏型对火鸡致病，对鸭则不致病。野生鸟类的流感病毒感染，珊有明显症状，但燕区鸟感染a t e r n s o u t h a f r i c a 1 6 1 ( i - 1 5 n 3 ) 栅31 起大茧妻死亡。高致病性禽流感暴发，大批急髅死亡，发瘸率程雅率可达餮1 0 0 ：低致病性禽流感无症状，呈隐性感染，死亡率5 15 ，产蛋率下降5 - - - 5 0 。7东北农业大学农学硕士学位论文1 2 1 2 病理变化禽流感的病理变化因病毒毒力强弱、病程长短和禽种的不同而有所差异。最常见的大体病变是全身皮下尤其是头部皮下出现胶冻样浸润；气管、支气管充血、出血：腹腔内有多量干酪样渗出物；卵巢退化、出血、卵泡畸形和卵子破裂，内脏尿酸盐沉积( 内脏型痛风) ，肾肿胀，肺充血和水肿，气管炎、肠炎、气囊炎、输卵管炎，纤维素性或蛋性腹膜炎、肾小管坏死、肝坏死：泄殖腔黏膜充血、出血。病理组织学变化为水肿、充血、出血和血管套形成，主要表现在心肌、肺、肝、脾等。此外还有严重的坏死j l 生胰腺炎和心肌炎。如果感染高致病性毒株，因死亡很快，可能见不到明显的病理变化。低毒力毒株可引起蛋鸡产蛋率、受精率、孵化率下降，呼吸道及生殖道黏膜出现轻微的炎症，可见轻度充血、出血：隐性感染病例则无可视病理变化。1 2 2 实验室诊断禽流感病毒的确切诊断依赖于病毒的分离和鉴定，检测病毒的抗体也是非常有效的间接诊断方法。因为临诊症状变化很大，除了疾病呈流行性外，临诊诊断常难以定性。因此，禽流感主要依靠实验室方法进行确切诊断，诊断方法主要包括病原学、血清学和分子诊断三部分( z a m b o n , 2 0 0 1 ；宋晓晖等，2 0 0 3 ) 。1 2 2 1 病原学诊断病毒诊断很大程度匕依赖于样品的质量、样品在进行实验室处理前的储存和运输隋况。用于细胞培养、鸡舾强管胂、直接检测病毒抗原或核酸的呼吸道病毒的样品，应在流感症状出现的开始3 天进行采集。哺乳类动物包括人、猪、马的流感基本上是呼吸道感染，而禽流感可能是呼吸道和大部分消化道感染。因此，哺乳动物及禽类匕呼吸道采集的样品适合用于流感病毒的鉴定和诊断。上呼吸道拭子分为三种：鼻雠拭子、喉侮好和气管棉拭子。己屠宰或已死亡的哺乳动物应在下呼吸道采集样品，样品分为气管棉拭子、支气管棉拭子、肺组织等三种。禽类样品采集的部位应集中在呼吸道和大部分的消化道，采集的病毒样品种类包括泄殖腔棉拭子和粪便，其中泄殖腔棉拭子可从活体鸡或剖杀的鸡群中采集，从鸡舍或环境中采集粪便样品是常用的采样方法，但其具有不能确定样品的准确来源的缺点，如果防鸡琵死禽体内含有高致病力的禽移苋感病毒，还应采集有代表性的内脏器官如脑、脾、心、肺、胰腺、肝和肾以及呼吸道、消化道等部位的标本。从动物体内采集的病料样品是病毒监测的重要数据来源。对于呼吸道病毒特别是扫龟感病毒的监测，只有分离到病毒后才能确定流感病毒的型和亚型，进而对病毒的特性做进步研究，所以病毒分离是至关重要的。由于流f 嫠螨毒能嗡殖鸡胚中良好牛长，病毒可以在鸡胚中：达到较高的滴度，并具有裂解得h a 。所以般用9 1 1 日龄的鸡胚通过羊膜腔或尿囊腔接种而分离病毒，接种后2 4h - - 9 6h 收集鸡胚尿囊液，2 4h 内死亡的鸡胚弃掉。用鸡的红细胞检测8引言尿囊液或细胞培养液的血凝活性来证实病毒的增殖和存在。_ 般而言，如初次分离不到病毒，可盲传2 代再进行检测。般地，如果病料中有病毒存在，那么初次传代后就具有红细胞凝集作用，若未检测到血凝活性，可将收获的鸡胚尿囊液盲传三代，若仍不出现血凝性，则可判定为阴性。出现血凝活性的病毒首先要排除n d ，可采用两种方法：种方法是血凝( i 认) 试验，a i v 可凝集马、骡、驴、绵羊、山羊红细胞，而n d v 不能；另方法是用血凝抑制( i 皿) 试验，用n d和e d s - 7 6 标准阳性血清来抑制分离病毒的血凝性，若分离病毒的血凝性不能被n d 和e d s - 7 6 的抗体所抑制而能被a j 的抗体抑制，则分离病毒可能为流感病毒，可作进步的鉴定( 朱果，1 9 9 9 ) 。尽管病毒快速分离方法不断涌现，病毒分离技术仍然是流感病毒分离的黄金标准，新方法的建立均需要用该方法验词e ( m a 嘲n 钯，e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。1 2 2 2 血清学诊断血清学方法，如琼脂扩散( a g p ) 、血凝( h a ) 和血凝抑制试验呷) 、神经氨酸酶试验州a ) 、病毒中和试验、免疫荧光试验( m ) 、酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 等已广泛应用于流行病学调查和免疫学研究以及疫苗免疫原性的评价等领域。1 琼脂旷散( a a 响验a g p 实验是建立在抗原抗体在琼脂糖介质中同步相对迁移基础上的。介质中含有较高浓度的盐，通过谳原抗体复合物免受杂质下沉的影响。因为所有a 型流感病毒核蛋白和基质都具有相似的抗原性，所以a g p 可用来检测这两类抗原的抗体。在此实验中，浓缩的备用病毒中应含有匕述种或两种抗原，所有的a 亚型都具有a i v 型特异性共同抗原( 即a 的核心抗原，主要是核蛋白n p 或基质蛋白m p ) , n - i 用种a i v 的抗原或抗血清对所有a 型禽流感病毒的抗体或抗原进行鉴定。此法虽然简单易行，但是敏感性低，易出现假阳性。a g p 最常用的是免疫双扩散，陈海燕等开展了禽流感病毒撇型双扩散法的研究，不仅提高了其敏感度，且快速省时，在此方蛐出匕建立的a g p 诊断技术及其诊断试剂盒。但由于方法自身在时效性，灵敏隆) 弓面的局限，本方法已j 黼敲取代阵坚等，2 0 0 4 ) 。2 酶联免疫吸附皿璐涨酶联免疫吸附试验正l i s a ) 以免疫过氧化物酶技术为基础，是目前应用最广泛的病毒抗原及抗体的检测技术，已经建立了多种方法，如间接法、双抗体夹心法、捕获法、生物素亲和素法等。e l i s a 早在1 9 7 4 年就用于流感病毒的睑测。研究者对e l i s a 、a g p 及m 检测流感抗体进行了匕懒究，结果a g p 和e l i s a 样能俭i 贝! l 型特异性抗原或抗体，但其敏感性远远低于e l i s a，m 试验用于亚型的检测时其敏感性也不如e l i s a ( y o o n e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。9东北农业大学农学硕上学位论文李海燕等( 1 9 9 9 ) 以混合纤维素酯微孔滤膜为固相载体，用自制的禽流蝴毒抗原和酶标抗体，建立了禽流感抗体斑点- e l i s a 检测法，该方法对s p f 鸡血清及新城疫、传染性法氏囊