（茶学专业论文）普洱茶多酚提取分离研究.pdf

普洱茶多酚提取分离研究 摘要 普洱茶属于后发酵茶，是我国特有的一类茶，有很大的市场发展潜力。本实验 对普洱茶多酚进行提取分离，旨在确定最佳的普洱茶多酚提取分离方法和条件，为 普洱茶功能食品的开发提供科学依据。 1 普洱茶多酚浸提条件的优化 以普洱茶为原料，研究浸提温度、浸提时间、料液比、溶剂浓度对普洱茶多酚 提取率的影响。结果表明，浸提温度和乙醇浓度对浸提效果有显著影响。同时得到 茶多酚浸提的优化条件为：温度8 0 ，乙醇浓度3 0 ，料液比1 ：3 0 ，时间5 0 m i n 。 2 普洱茶多酚分离路线的优化 利用有机溶剂萃取法、离子沉淀法和超临界c 0 2 萃取法和吸附树脂法制备普洱 茶多酚，比较多酚的得率、纯度以及抗氧化活性。结果表明，普洱茶多酚的得率高 低依次为：有机溶剂法 离子沉淀法 超临界c 0 2 法 吸附树脂法，纯度大小依次 为吸附树脂法 离子沉淀法 有机溶剂法 超临界c 0 2 法。从儿茶素的分析结果可 知，不同分离方法对茶多酚样品中儿茶素含量有显著影响，儿茶素含量高低依次为 吸附树脂法 有机溶剂萃取法 离子沉淀法 超临界c 0 2 萃取法。各种方法制备的 茶多酚对超氧阴离子自由基都有显著的清除效果，以离子沉淀法为最高，有机溶剂 萃取法和吸附树脂法次之，超临界c 0 2 萃取法最差。综合比较不同分离方法所得多 酚的得率、纯度和抗氧化能力，认为有机溶剂法制备的普洱茶多酚不仅品质好，而 且操作简单，适宜于工业化生产。 进一步对有机溶剂萃取法的萃取时间、次数和静置时间进行分析。结果表明， 萃取时间和次数对萃取率的影响差异显著，而静置时间对萃取率的影响差异不显著。 利用有机溶剂法制备普洱茶多酚的萃取工艺为：用浸提液1 倍体积的乙酸乙酯萃取 2 次，萃取过程中，振荡1 0 m i n ，静置分层3 0 m i n 。 3 普洱茶多酚纯化工艺的优化 采用不同极性的大孔吸附树脂进行静态吸附实验，比较它们对茶多酚的静态吸 附率、解吸率以及解吸产物儿茶素含量。结果表明，所用树脂对多酚的吸附率和解 吸率有极显著影响，吸附率依次为强极性 中极性 弱极性，而解吸率呈相反的趋 势。通过h p l c 法分析解吸产物中儿茶素的含量，表明3 号树脂纯化的茶多酚中儿 茶素含量最高，是理想的纯化材料。 利用乙醇溶液作为洗脱剂，随浓度的增加洗脱能力增强，但当乙醇浓度大于8 0 后，洗脱能力反而降低。综合考虑洗脱能力、产品质量和操作的难易程度，树脂吸 4 普洱茶多酚提取分离研究 附法纯化茶多酚的条件为：茶多酚浓度为l o m g m l ，洗脱剂为8 0 的乙醇溶液，流 速以o 。8 m l m i n 为宣。 关键词：普洱茶；多酚；提取分离 5 普洱茶多酚提取分离研究 a b s t r a c t s p u e rt e ai sp o s tf e r m e n t e dt e a , as p e c i a lt e aw i t hm a n yb i o a c t i v i t i e sp r o c e s s e di n c h i n a t h em e t h o do fe x t r a c t i o na n di s o l a t i o no fp o l y p h e n o l sf r o mp u e l t e aw a ss t u d i e d i nm y p r o j e c ti no r d e rt of i n df e a s i b l ew a y t of u r t h e rd e v e l o pp u e rt e a 1 p a r a m e t e r sf o re x t r a c t i o no f p o l y p h e n o l sf r o mp u e rt e a t h ei n f l u e n c eo ft e m p e r a t u r e ，h e a t i n gt i m e ，r a t i oo ft e at os o l v e n t ，c o nc e n t r a t i o n a n dp hv a l u eo fs o l v e n to ne x t r a c t i o nr a t eo fp u e rt e ap o l y p h e n o l sw e r es t u d i e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a ta l lp a r a m e t e r se x c e p tp hv a l u ea f f e c t e dt h ee x t r a c t i o nr a t en o t i c e a b l y ， a n dt h eo p t i m i z e dp a r a m e t e r sw e r e ：u s i n g3 0 e t h a n o lw a t e rs o l u t i o na se x t r a c ts o l v e n t ， t h er a t i oo ft e at os o l v e n tw a s1 ：3 0 ，a n de x t r a c t i n ga t8 0 f o r5 0 m i n 2 t h em e t h o df o ri s o l a t i o no fp o l y p h e n o l sf r o mp u e rt e a f o u ri s o l a t i o nm e t h o d so f p o l y p h e n o l si n c l u d i n gp r e c i p i t a t i n gb ym e t a li o n , e x t r a c t i n gb yo r g a n i cs o l v e n t s ，e x t r a c t i n gb ys u p e r c r i t i c a lf l u i dc 0 2a n di s o l a t i n gb y m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nw e r ec o m p a r e da n dt h ey i e l d ，p u r i t ya n da n t i o x i d a n t a c t i v i t yo fp o l y p h e n o l sg e tf r o mt h ef o u rm e t h o d sw e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a t t h ey i e l dc h a n g et e n d e n c yo ff o u rm e t h o d sw a sd e c l i n e df r o mo r g a n i cs o l v e n t se x t r a c t i o n t oi o np r e c i p i t a t i o ne x t r a c t i o nt os u p e r c r i t i c a lf l u i dc 0 2e x t r a c t i o nt om a c r o p o r o u s a d s o r p t i o nr e s i ne x t r a c t i o n ；a n dt h ep u r i t yc h a n g et e n d e n c yw a si n c r e a s i n gf r o m s u p e r c r i t i c a lf l u i dc 0 2e x t r a c t i o nt oo r g a n i cs o l v e n t se x t r a c t i o nt oi o np r e c i p i t a t i o n e x t r a c t i o nt o m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i ne x t r a c t i o n ；t h ec o n t e n to fc a t e c h i n si n p o l y p h e n o l si s o l a t e db y f o u rm e t h o d s w e r eg r e a t l yd i f f e r e n t ，t h ec o n t e n tf r o m m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i ne x t r a c t i o nw a sl a r g e s t ，a n dt h ec o n t e n tf r o ms u p e r c r i t i c a l f l u i dc 0 2e x t r a c t i o nw a sl e a s t t h er e s u l t sa l s oi n d i c a t e dt h a tt h ep o l y p h e n o l si s o l a t e d f r o mp u e rt e ah a d g r e a ta b i l i t yt os c a v e n g es u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l a l lr e s u l t sl e a d e dt o t h ec o n c l u s i o nt h a tp u e rt e ap o l y p h e n o l se x t r a c t i n gb yo r g a n i cs o l v e n th a dg o o dq u a l i t y , a n dt h em e t h o dw a se a s yt oo p e r a t ea n df e a s i b l ef o ri n d u s t r y f u r t h e rs t u d yo nt h ec o n d i t i o n so fe x t r a c t i n gb ye t h a n o la c e t a t ei n d i c a t e dt h a tt h e y i e l do fp o l y p h e n o l sw a sg r e a t l ya f f e c t e db yt h et i m ea n dt i m e s t h eo p t i m i z ec o n d i t i o n w a se x t r a c t i n gf o r4 0 m i n ，2t i m e s 3 t h em e t h o do fp u r i f i c a t i o no fp u e rt e ap o l y p h e n o l s s e v e r a lk i n d so fr e s i n sw e r ec o m p a r e do nt h ec a p a b i l i t yo fs t a t i ca d s o r p t i o n ， 6 普洱茶多酚提取分离研究 d e s o r p t i o nt op u e rt e ap o l y p h e n o l sa n dt h ec o n t e n to fc a t e c h i n si nt h ep r o d u c t sd e s o r p t e d r e s u l t ss h o w e dt h a tn o 3w a sm o r es u i t a b l et h a no t h e r s 1 1 1 er e s i nc o l u m nw a se l u t e db ye t h a n o lw a t e rs o l u t i o n 1 1 1 ee l u t i n ga b i l i t yi n c r e a s e d 、砘t ht h ee t h a n o lc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n gb e l o w8 0 w h i l ed e c r e a s e dw i t hc o n c e n t r a t i o n i n c r e a s i n ga b o v e8 0 c o n s i d e r i n gt h ee l u t i n gc a p a b i l i t ya n dt h ep r o d u c tq u a l i t y , t h e c o n c e n t r a t i o no fc r u d ep o l y p h e n o lw a slo m g m l ，t h ee l u e n tw a s8 0 e t h a n o lw a t e r s o l u t i o na n dt h ef l o wr a t ew a s0 8 m l m i n k e y w o r d s ：p u e rt e a , p o l y p h e n o l s ，e x t r a c t i o n ，i s o l a t i o n 7 普洱茶多酚提取分离研究 英文缩写词语表 8 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 是如需保密，解密时间2 0 0 8 年0 6 月2 3 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：学、翘， 时问：2 0 0 6 年。6 月2 2 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定靠，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位敝储始 导师橼陬乙 签名日期：2 0 0 6 年0 6 月2 2 日签名日期：2 0 0 6 年0 6 月2 2 日 普洱茶多酚提取分离研究 第一章普洱茶及茶多酚提取分离研究进展 普洱茶原产于我国云南西双版纳地区，因早期集散地在云南普洱县而得名。历 史上所指的普洱茶，是以云南大叶种茶制成的晒青毛茶为原料，经加工整理而成的 各种云南茶叶的统称。现在仍沿用这种方式加工的茶叶称之传统普洱茶。现代普洱 茶则是将晒青毛茶经过后发酵处理加工而成的茶叶。普洱茶独具特色的内质风格和 文化内涵，引起了国内外专家、学者的广泛关注。 1 普洱茶资源的研究进展 1 1 普洱茶的品质特征及影响因素 普洱茶分为散茶和紧压茶两大类。普洱散茶外形条索肥硕壮实，色泽褐红( 俗称 “猪肝色 ) ，或带灰白色。压制的普洱茶是用晒青毛茶或普洱散茶经蒸压做形而成， 前者又称生普，后者称熟普。依形状不同，可分为碗形普洱茶，长方形的普洱砖茶 和圆形的七子饼茶等( 周红杰，1 9 9 7 ) 。 普洱茶的内质特色，汤色红浓，具独特陈香，滋味纯和回味甘，饮后令人心旷 神怡( 罗龙新，1 9 9 5 ) 。从普洱茶色、香、味、形品质特点来看，则以越陈品质 越佳著称。这是衡量品质优良普洱茶的重要指标，也是普洱茶与其它茶类的最大区 别之处。 普洱茶品质形成是加工工艺的特殊性决定的。传统普洱茶的关键工艺是在一定 温湿条件下的长时渥堆，由于温度、湿度、通气性的差异，使形成品质也不相同。 在渥堆过程中形成的霉菌和酵母菌以及生长繁殖最旺盛的黑曲霉是导致普洱茶品质 变化的主要霉菌。普洱茶加工中优势菌的产生是由于在堆积发酵过程中水分逐步蒸 发减少，酸度增加，营造了微生物活动良好的环境。其旺盛代谢活动所产生的热促 使堆温升高，进而又促进了微生物自身的繁殖生长( 邓时海，1 9 9 4 ) 。普洱茶加工过 程中温湿度的变化是影响微生物数量消长的主要因素。同时，与普洱茶醇、厚、甘、 甜、滑等品质特点的形成也密切相关。 普洱茶的品质还受鲜叶原料和加工环境影响。因为普洱茶加工过程中茶叶的老 嫩、气温、空气湿度、季节、发酵场地等不同，发酵茶叶水分不同品质形成是不同 的。且即使同种原料在不同地域加工品质也是不同的，这也是普洱茶之特殊性所在 ( 周红杰，2 0 0 3 ) 。 9 普洱茶多酚提取分离研究 1 2 普洱茶的生理功能 1 2 1 降血脂 普洱茶具有降血脂的功能，目前，研究工作者正在开展广泛、深入的生理、药 理功能的研究。法国的一家医院临床实验证明，饮用云南普洱茶对脂肪新陈代谢作 用明显，血脂的含量可下降1 3 ( 一个月中每日喝三碗) ，云南普洱沱茶还能加速降 低血液中酒精含量。法国国立健康和医学研究所、巴黎亨利伦多医院贝纳尔贾可托 教授、巴黎大学营养生理学实验室主任吕通教授等对云南普洱茶临床试验表明，普 洱茶可降血脂。王旭华等对云南沱茶降低血清血脂进行动物试验，沱茶煎剂( 4 0 ) 每鼠2 m l 灌胃，结果发现2 0 4 0 h 后血清血脂( 胆固醇、磷脂质和甘油三脂) 开始明显 降低。中国昆明医学院对云南普洱沱茶治疗高脂血病疗效作了5 5 例临床试验，并与 降脂较好的药物安妥明治疗的3 1 例作对比，普洱茶的疗效高于安妥明( 王树文， 1 9 9 0 ；梁铭志，1 9 9 6 ) 。何国藩、林月蝉等( 1 9 8 8 ) 研究了普洱茶对肠段的舒缩推进 运动和胃蛋白酶的影响，实验结果表明，普洱茶对离体肠段有减少收缩幅度和降低 收缩频率的作用。同时还证明普洱茶有显著降血脂效应可能与小肠减少甘油三脂和 糖的吸收密切相关，亦可能是普洱茶有减肥作用的原因。 1 2 2 抗癌 云南昆明天然药物研究所教授梁明达、胡美英用细胞培养及电子显微镜方法， 对普洱茶的抗癌作用进行了十多年的研究，提出了饮普洱茶能防癌的观点。他们发 现，普洱茶杀癌细胞的作用最为强烈，甚至常人喝茶百分之一的浓度就有明显的作 用。他们认为，普洱茶具有多种丰富的抗癌微量成分，如p 胡萝b 素，维生素b l 、 b 2 、c 、e 等( 苏芳华，2 0 0 2 ) 。 1 2 3 防龋抑菌 湖南医科大学口腔系茶与健康实验室主任曹进，通过对普洱健齿茶抑制变形球 菌附着能力进行体外实验观察研究，结果发现普洱健齿茶具有抗菌斑形成作用，其 有效浓度在0 1 2 5 1 之间，以1 浓度效果最佳；普洱健齿茶的抗菌斑形成作用， 主要表现在通过抑制葡萄糖基转移酶活性，抑制了胞外葡聚糖的产生( 黄桂枢， 1 9 9 4 ) 。赵燕等( 1 9 9 3 ) 通过对普洱茶抗龋齿作用的研究，结果显示，若每人每日用 4 9 普洱茶，冲泡浓度为o 5 ，5 0 1 4 4 0 m i n 内，摄入氟量都具防龋作用。 在云南民族饮茶习惯中，勐海县南糯山的哈尼族至今仍有将普洱茶加重煎服， 用于治疗细菌性痢疾的习惯。医药界研究和临床实验已证明，云南普洱茶有抑菌作 用，特别是浓的茶汁，日服4 次，可以治疗细菌性痢疾( 梁铭志，1 9 9 6 ) 。 1 0 普洱茶多酚提取分离研究 1 2 4 防治心血管疾病 西南农业大学研究认为，茶叶在渥堆过程中，黄酮类物质中以黄酮苷形式存在 最多。而黄酮苷具有跟维生素p 一样的作用，可防止人体血管的硬化。而对普洱茶 来说，“渥堆 正是形成其独特风味的一个重要工序，因此普洱茶对心血管硬化有很 好的治疗作用( 梁铭志，1 9 9 6 ) 。此外，何国藩，林月婵( 1 9 9 5 ) 在临床上观察了普 洱茶对脑血流图以及血压、心率的影响，结果表明，饮用普洱茶后能引起人体血管 舒张，血压暂时下降，心率减慢和脑部血流量减少等生理效应，提示普洱茶能够防 治心脑血管疾病。孙璐西等( 2 0 0 2 ) 的研究证实，普洱茶可以降低血浆总胆固醇、 三酸甘油酯及游离脂肪酸，亦可减轻胆固醇性脂肪肝现象及增加粪便中胆固醇的排 出。也可轻微地抑制肝中胆固醇的合成，增加动物禁食期间对胰岛素不敏感，显示 饮用普洱茶可能具有降脂、改善胰岛素抗拒及预防心血管疾病的效果。由离体实验 及动物实验的结果表明，普洱茶抽提物具有明显的抗氧化活性，清除自由基，降低 低密度白蛋白( l d l ) 不饱和脂肪酸的数量及增加l d l 生育酚的含量，以降低l d l 的氧化敏感度。推论饮用普洱茶可预防动脉粥状硬化及心血管疾病的发生。故饮用 普洱茶，对老年人和高血压与动脉硬化患者，均有良好作用。 1 3 普洱茶多酚的研究现状 目前，对普洱茶多酚的研究逐渐展开，主要是为了探明普洱茶多酚所起的生理 作用，进而从本质上揭示我国后发酵茶独特的保健作用机理。揭国良等( 2 0 0 5 ) 用 不同的有机溶剂，分步萃取普洱茶的水提物，得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、 正丁醇萃取物和萃取后剩余物。采用f e 2 + h 2 0 2 鲁米诺的化学发光法和有机自由基 二苯基苦基偕腙肼( d p p h ) 的分光光度法，比较各提取物的清除自由基的能力。结 果显示普洱茶水提物中的乙酸乙酯萃取层组分和正丁醇萃取层组分对d p p h 和羟自 由基均有较强的清除能力。说明普洱茶中主要抗氧化的成分是茶多酚和多酚氧化产 物。同时，有文献指出，普洱茶多糖的降血脂能力强于普洱茶多酚。吴文华( 2 0 0 5 ) 以普洱茶的原料一晒青毛茶为对照，以普洱茶的代表云南七子饼茶为材料，综合提 取其中的茶多酚和茶多糖，比较它们的降血脂能力。结果表明，晒青毛茶、普洱茶 均能有效地抑制高脂饮食小鼠血脂的升高，并能使血脂以上各项指标全面降至正常 水平，普洱茶的效果略优于晒青毛茶，二者对甘油三酯( t g ) 的作用强于血清总胆 固醇( t c ) ；普洱茶中茶多糖抑制高脂饮食小鼠血脂升高的作用远远强于茶多酚。 普洱茶因其独特的加工工艺，酚类物质的组成与其它茶类比较有很大区别。吕 海鹏( 2 0 0 5 ) 对普洱茶的化学成分进行分析，发现普洱茶中的茶多酚含量明显低于 绿茶和红茶，但普洱茶中的表儿茶素( e c ) 含量高于红茶和绿茶，而且普洱茶中的 儿茶素以非酯型儿茶素为主。实验中发现，乙酸乙酯萃取层中存在大量的没食子酸 普洱茶多酚提取分离研究 ( g a ) ，还从乙酸乙酯萃取层中分离出1 1 种单体化合物，包括没食子酸、表儿茶素、 儿茶素、没食子儿茶素、槲皮素、山奈酚、杨梅素、山奈酚一3 0 g l c 6 r h a 、槲皮素 3 一o d g l u 、2 ，5 - - 羟基苯甲酸和山奈酚3 o d g l u 。由此他推测普洱茶在加工过 程中，儿茶素类化合物发生了氧化聚合形成十分复杂的多聚体，或降解形成没食子 酸等简单酚类化合物。实验还利用d p p h 方法检测乙酸乙酯萃取层中所分离化合物的 抗氧化活性，发现没食子酸清除自由基的活性最强，因此认为没食子酸是普洱茶重 要的活性成分之一，能够有效的清除人体内的自由基，达到保护人体有机体免受有 害自由基进攻的危险。折改梅等( 2 0 0 5 ) 对普洱茶的化学研究结果也表明，没食子 酸是普洱茶的特征性酚类化合物。而没食子酸的形成与茶多酚没食子酰酯在微生物 参与的后发酵过程中的降解有关。他们在对渥堆工序的研究发现，与其原料相比较， 普洱茶的没食子酸含量显著增加，以第1 次翻堆时的增加最为显著，而后的加工过 程中增加幅度较小。最近报道，一些曲霉菌具有增加单宁酶的浓度，促进底物单宁 酸降解和没食子酸形成的作用( m u k h e d e 等，2 0 0 4 ；v a nd i e p e n i n g e n 等，2 0 0 4 ) 。 折改梅等从普洱茶发酵堆中分离到一系列的曲霉菌，其中，臭曲霉( a s p e r g i l l u s f o e t i d u st h o m & r a p e r ) 等均有降解没食子酸的能力( 待发表) 。显然，普洱茶的后发 酵过程中，没食子酸含量的增加与菌群的种类和发酵的条件有密切的关系。因此， 优选发酵菌群，控制后发酵过程，是生产优质普洱茶的关键技术环节。 也有研究工作者对普洱茶多酚生产工艺进行可行性分析。夏为龙等( 2 0 0 0 ) 提 出以低档普洱茶为原料，采用超临界流体萃取技术生产茶多酚产品的设想，并对 1 5 0 f f a 茶多酚生产装置进行了经济技术分析和环境影响评价，结果表明，超临界流 体萃取法工艺技术先进，成本低，原料来源有保障，市场f j 景好，经济效益高，企 业在市场经济中应变能力强。 2 茶多酚提取分离研究进展 茶多酚( t e ap o l y p h e n o l s ，简称t p ) 是一种从茶叶中提取的纯天然复合物，是茶 叶中具有保健功能的重要生物活性物质，在食品加工、医药、日用化工等领域有着 广泛的应用。茶多酚由约3 0 种以上的酚性物质组成，按其化学结构可分为儿茶素、 黄酮及类黄酮醇、花色素、酚酸及缩酚酸4 类，其中以黄烷醇类( 主要是儿茶素类化 合物) 最为重要，占茶多酚总量的6 0 8 0 ，其次是黄酮类，其他酚类物质含量比较 少。茶多酚为白色不定形粉末，易溶于水，可溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯， 不溶于氯仿。目前，国内外提取茶多酚的方法大体上有四种：有机溶剂萃取法、金 属离子沉淀法、柱层析法、超临界流体萃取法。 2 1 有机溶剂萃取法 有机溶剂萃取法是利用茶多酚在有机溶剂中的溶解度不同而分离茶多酚的一种 方法。 1 2 普洱茶多酚提取分离研究 中国农科院茶叶研究所于8 0 年代最早开始用水或乙醇等溶剂提取茶多酚，可得 到纯度为7 2 的粗品。l e e m i n - h s i u n g ( 1 9 9 1 ) 试验了甲醇、乙醚、乙酸乙酯和氯仿 对茶叶浸提后的提取物的抗氧化活性，结果表明只有乙醚和乙酸乙酯提取物具有极 好的抗氧化活性，他认为茶叶提取液中采用乙酸乙酯的制备工艺较好。姜绍通等 ( 1 9 9 7 ) 通过试验，研究了多级逆流萃取级数、相比和茶水比对茶多酚的提取率、 纯度以及茶多酚中儿茶素含量的影响，确定了茶多酚工业生产萃取操作的较佳参数。 采用溶剂法提取茶多酚具有有效成分含量少、提取率低、溶剂耗量大、提取周期长、 高温下易使茶多酚发生氧化等弊端。针对这些存在的问题，很多人对溶剂法提取茶 多酚进行了改进，并取得了一定的效果。 2 2 金属离子沉淀法 该法通常先用溶剂将茶多酚浸提出来，再利用茶多酚可与b a 2 + 、c a 2 十、m 矿+ 、 h 9 2 + 、z n 2 + 、a 1 3 + 等金属离子产生络合沉淀的原理，通过离心分离、酸转溶和溶剂萃 取等过程，得到纯度较高的茶多酚。沉淀法中的关键问题是金属元素的选择和沉淀 p h 值范围的确定。煤炭科学研究总院合肥研究所在这方面获得了国家专利。他们系 统研究了c a 2 + 、m 矿+ 、b a 2 + 、f d + 、z n 2 + 、a 1 3 + 等6 种可溶金属离子提取茶多酚的条件， 确定了优惠工艺与参数。研究表明：这些离子均可作为茶多酚的沉淀剂，其中以a 1 3 十 最好，z n 2 + 其次。葛宜掌等( 1 9 9 5 ) 采用三氯化铝，作为沉淀剂可使茶多酚含量达 到9 9 5 ，提取率达到1 0 5 。但徐徽等( 2 0 0 1 ) 的研究结果表t 凋z n 2 + l l a p + 的沉淀 效果好，而r a l 3 + 会引起老年痴呆。余兆祥等( 2 0 0 1 ) 采用z n 2 十、a 1 3 + 的复合沉淀剂， 分别与z n 2 + 、舢”单一沉淀剂进行比较，发现复合沉淀剂的提取率比单一沉淀剂高约 l 。邓泽元等( 2 0 0 1 ) 也采用z n 2 + 、触”作为复合沉淀剂，发现复合沉淀剂的提取率 比单一沉淀剂高大于1 2 ，而且产品中的咖啡碱含量低。p h 值的范围周志等( 2 0 0 2 ) 认为以5 3 5 7 为宜，余兆祥等( 2 0 0 1 ) 认为5 5 6 0 为好。 2 3 柱层析法 柱层析法是茶叶经水或有机溶剂浸提后，其浸提液采用柱分离法制备茶多酚。 此项技术的关键就是柱填充料和淋洗剂的选择，该法所制得的茶多酚纯度高。目前 已知有凝胶柱、离子交换柱和吸附柱三种层析柱。 吸附柱分离制备法是利用树脂对茶多酚的选择吸附特性而进行茶多酚分离纯化 的一种方法。国外利用树脂分离纯化茶多酚的研究不多，日本的阪中专二采用树脂 吸附柱结合膜技术制各不同纯度的茶多酚( 印寿根，1 9 9 8 ) 。良道文久( 1 9 8 9 ) 的 专利工艺则是将浸提液过填有苯乙烯二乙烯基苯共聚物或异丁烯酯的柱，再用 1 0 6 5 的甲醇、乙醇、二甲基酮水溶液或其混和液作淋洗剂分离提取茶叶中的儿茶 素。竹尾忠一等提出茶叶沸水浸提液过p h 2 m g 吸附柱，用7 0 的乙醇解吸后，直接 1 3 普洱茶多酚提取分离研究 真空浓缩干燥而得到纯度6 8 的儿茶素的专利工艺( 印寿根，1 9 9 8 ) 。而国内对此研 究较晚，用大孔吸附树脂分离纯化黄酮类化合物的研究始于7 0 年代中期。中国农科 院茶叶研究所徐向群等( 1 9 9 4 ) 进行了树脂筛选试验，结果表明9 2 2 ，9 2 3 两种吸 附树脂适于从茶叶中制取高纯度茶多酚制品的工艺要求，证实了吸附树脂层析法在 茶多酚制备上应用的可行性。陈海霞等( 2 0 0 0 ) 通过对1 5 种树脂的静态吸附和动态 吸附以及解吸性能的比较，得到了可从茶叶中连续提取茶多糖、茶多酚和咖啡碱3 种有效成分的新工艺，即将茶叶浸提液先后经过聚酰胺柱层析、吸附树脂2 号柱层析 和d 3 9 7 树脂柱层析，收集不同组分的解吸液，其茶多糖、茶多酚和咖啡碱的收率分 别为1 0 、4 9 和1 7 。汪小钢( 1 9 9 7 ) 对9 6 5 树脂进行了静态吸附和动态吸附试 验，结果表明温度和溶剂的量影响较为显著。吕远平等( 2 0 0 3 ) 比较了1 1 种不同树 脂对茶多酚的吸附特性，筛选出适合于茶多酚分离纯化的吸附树脂。结果显示，当 初始样品的茶多酚纯度为6 8 5 ，纯化后可达9 5 8 。 离子交换柱分离制备法和凝胶柱分离制备法在生产上一般和其他分离柱结合使 用。谷口繁以绿茶浸提液经聚酰胺吸附柱和离子交换柱x a d 2 制取茶多酚( 陶荣达， 1 9 9 7 ) 。h o v i t ah 在提出儿茶素制备工艺时，先对绿茶进行了多种溶剂的浸提试 验和吸附型树脂及亲脂凝胶过滤( t o y o p e a r lh w 一4 0 及s e p h a d e xl h 2 0 ) 对儿茶素净 化的方法对比试验。结果表明以t o y o p e a r lh w 4 0 对儿茶素纯化效果最好，其次为 s e p h a d e xl h 2 0 和x a d 8 ，并提出了采用t o y o p e a r lh w 4 0 柱的工艺( 陶荣达，1 9 9 7 ) 。 徐磊杰等( 2 0 0 4 ) 通过对有机溶剂萃取法、金属离子沉淀法和树脂吸附法比较 发现树脂吸附法符合化工“清洁生产”的发展趋势，但还需开发吸附容量大、选择性 高的树脂。董文宾等( 2 0 0 2 ) 也对三种方法进行研究，确定了最佳工艺参数，提取 率以金属离子沉淀法最高，其他人研究结果都是有机溶剂法最高，纯度以树脂法最 高。 2 4 超临界流体萃取法 超临界萃取法就是把作为溶剂的某一超临界流体( 如c 0 2 ，c 2 h 4 ，h 2 0 等) 和固体 ( 或液体) 混和物接触，利用它们“异常”的相平衡和传递特性，使原来的固体或液体) 混合物得以分离。 t 冯耀声，李军( 1 9 9 6 ) 曾利用该法制备茶多酚，研究了温度、压力、夹带剂等 对溶解度的影响。结果表明，高温高压有利于溶解度的提高，而用乙醇作夹带剂不 仅能提高茶多酚溶解度，还能提高茶多酚的萃取速率。而冯耀声，胡望明( 1 9 9 4 ) 从茶叶中萃取咖啡碱的研究表明，从茶叶中萃取出9 5 的咖啡因需要1 5 7 1 1 ，据此推 测茶多酚比咖啡因更难萃取，所以萃取时间需更长。王小梅等( 2 0 0 1 ) 的研究证明 超临界c 0 2 萃取茶叶中的茶多酚在工艺上是完全可行的，并参照如下工艺参数：萃 取压力为2 0 m p a ，萃取温度为5 0 ，分离压力为5 m p a ，分离温度为4 0 ，c 0 2 流量 1 4 普洱茶多酚提取分离研究 为2 5 l h ，萃取时间为5 h ，使茶多酚的萃取率达9 o 。 目前，超临界法中介质以c 0 2 为多，且c 0 2 是非极性物质，对极性的茶多酚溶解 度不高。为了提高提取率而加的夹带剂就增加了工艺步骤，操作不方便。 3 课题研究目的及意义 目前普洱茶在港、澳、台和东南亚，以及法国、日本等地，深受消费者欢迎。 普洱茶同其他茶类的主要区别在于它的后发酵工艺。在微生物参与的后发酵过程中， 茶叶中的化学物质特别是多酚类物质发生了一系列的显著变化，从而形成普洱茶特 有的品质风味和独特的保健功能。现经国内外有关专家的临床试验证明，普洱茶具 有降低血脂、减肥、抑茵、助消化、暖胃、醒酒、解毒等多种功效。然而，至今为 止，国内外对普洱茶中的化学物质的组成、结构和生物活性却知之甚少。研究报道 认为，普洱茶具有多种生理功能是由于含有丰富的茶多糖、茶色素和一定量的茶多 酚，但这些有效活性成分的作用机理并不清楚，特别是茶色素中的茶红素、茶褐素 的药理作用研究至今还尚未展开。 本论文以两年陈散普为材料，研究普洱茶多酚的提取分离工艺，探索其中起主 要作用的生理活性成分，旨在系统、全面地研究和科学地评价普洱茶，为普洱茶深 加工技术改进和产业化发展提供理论支持，为普洱茶功能食品的开发提供科学指导， 对消费者合理选择普洱茶进行保健提供参考依据，引导和扩大普洱茶的消费市场。 1 5 普洱茶多酚提取分离研究 第二章普洱茶多酚浸提工艺的优化 1 引言 茶叶深加工和综合利用的途径之一是将茶叶中的有效成分提取出来，应用于医 药、食品领域，浸提效果直接影响其经济效益和产品质量( 赖建辉，1 9 9 5 ) 。茶多酚 是茶叶中研究得最多的成分之一。有关茶多酚提取分离的研究结果显示，影响茶叶 浸提效果的因素很多，在正常情况下，主要有浸提温度、浸提时间、浸提溶剂浓度 和溶剂用量等方面。研究还表明，温度对茶叶浸提率的影响显著，且茶叶浸提率随 温度的升高而增大( 罗龙新，1 9 8 7 ) ，但是高温条件下，茶多酚尤其是儿茶素易于氧 化生成茶色素，并迸一步与体系中的咖啡碱、蛋白质生成茶乳酪。姚立虎等( 1 9 9 1 ) 的研究表明，茶叶浸提率与浸提时间呈正相关，延长时间，浸出物多。此外，溶剂 的选择也对茶叶浸提率有较大影响。以水为溶剂，儿茶素易于氧化，若用乙醇水溶 液浸提，由于醇的存在不利于咖啡碱的浸出，有利于茶多酚和儿茶素浸出，并抑制 它们的氧化( 罗晓明，2 0 0 2 ；范新年，2 0 0 5 ) 。国外有研究表明，用乙醇浸提的茶汤 比沸水浸提的茶汤有更强的生物学功能。为了进一步提高普洱茶多酚的得率和品质， 本课题先对原料各化学成分进行检测分析，然后再分析浸提温度、浸提时间、溶剂 浓度、溶剂用量和溶剂p h 值等因素对普洱茶多酚浸出率的影响，为进一步优化新工 艺提供理论依据。 2 材料与方法 2 1 试剂与仪器设备 2 1 1 主要试剂 茚三酮 葸酮 浓硫酸 磷酸二氢钾 磷酸氢二钠 盐酸 酒石酸钾钠 硫酸亚铁 乙醇 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a r 北京益利精细化学品有限公司 工业级华中农业大学设备科 1 6 普洱茶多酚提取分离研究 2 1 2 主要设备与仪器 巨轮牌植物粉碎机f z l 0 2 型河北省黄骅市齐家务科学仪器厂 恒温水浴锅h h 系列江苏金坛中大仪器厂 紫外可见分光光度计 s p e c t r u m5 3 型上海棱光技术有限公司 循环水式真空泵 s h z - d ( i i i ) 型河南省巩义市英峪予华仪器厂 电热恒温鼓风干燥箱 s k f g 0 1 型湖北黄石医疗设备厂 电子分析天平a w 2 2 0津岛 2 2 样品制备 试验材料为云南两年陈普洱散茶，经粉碎机适当粉碎后，过4 0 目筛，收集筛下 物于4 。c 冰箱避光保存备用。 2 3 方法 2 3 1 普洱茶主要化学成分测定方法 2 。3 。1 。1 水分含量 1 2 0 。c ，l h 法( 湖南农学院主编，1 9 9 2 ) 。称取3 o g 样品( 2 2 ) 置于预先干燥 的称量器内，干燥箱预热至1 3 0 1 3 5 。c ，称量器置于干燥箱的上层架上，自烘温调至 1 2 0 。c 时算起，加热6 0 m i n 。加盖取出，于干燥器内冷却，称量。 2 3 1 2 氨基酸含量 采用茚三酮比色法( 钟萝，1 9 8 9 ) 。称取样品( 2 2 ) 1 o g 于三角瓶中，加沸水 8 0 m l ，于沸水浴中浸提3 0 m i n ，趁热抽滤，定容至1 0 0 m l ，摇匀。取提取液2 m l 于 2 5 m l 的容量瓶中，加p h 8 0 缓冲液o 5 m l 和2 茚三酮0 5 m l ，于沸水浴中加热1 5 m i n ， 冷却后用蒸馏水定容，放置5 m i n ，于波长5 7 0 n m 处比色。 2 3 1 3 茶多酚含量 采用酒石酸亚铁比色法( 钟萝，1 9 8 9 ) 。浸提处理同氨基酸。测定时，准确吸取 茶汤l m l ，注入2 5 m l 容量瓶中，加4 m l 蒸馏水，酒石酸铁溶液5 m l ，用缓冲溶液定 容至刻度，混匀。用1 0 m l 比色皿，以试剂空白做参比，于波长5 4 0 n m 处测吸光度。 2 3 1 4 可溶性糖含量 采用葸酮比色法( 钟萝，1 9 8 9 ) 。浸提处理同氨基酸。提取液稀释5 倍。加葸 酮试剂8 m l 于2 5 m l 刻度试管中，将稀释后的茶汤取l m l 缓慢加入刻度试管中，置 于沸水浴中加热显色7 m i n ，取出置于冰浴中冷却，恢复至室温后在波长6 2 0 n m 处比 任。 1 7 普洱茶多酚提取分离研究 2 3 。1 5 茶黄素、茶红素、茶褐素含量 茶黄素、茶红素和茶褐素含量采用系统分析法测定( 钟萝，1 9 8 9 ) 。 2 3 1 5 1 试液制备 准确称取茶样3 0 9 ，置于2 5 0 m l 锥形瓶中，加沸水1 2 5 m l ，于沸水浴中提取1 0 m i n ， 提取过程中，摇瓶1 2 次，立即用脱脂棉过滤，迅速冷却。 2 3 1 5 2 分离 取3 0 m l 试液，注入6 0 m l 筒形分液漏斗中，加入乙酸乙酯3 0 m l ，振荡5 m i n ， 静置分层，分别放出水层和倒出乙酸乙酯层。 吸取乙酸乙酯层2 m l ，加9 5 乙醇定容至2 5 m l ，摇匀( 溶液a ) 。 吸取水层2 m l ，加饱和革酸溶液2 m l 和水6 m l ，再加9 5 乙醇定容至2 5 m l ，摇 匀( 溶液d ) 。 吸取乙酸乙酯层1 5 m l ，置于3 0 m l 筒形分液漏斗中，加2 5 碳酸氢钠1 5 m l ，振 荡3 0 s 后，静置分层。弃去碳酸氢钠层，吸取乙酸乙酯层4 m l ，加9 5 乙醇定容至 2 5 m l ，混匀( 溶液c ) 。 取水层1 5 m l ，置于3 0 m l 筒形分液漏斗中，加正丁醇1 5 m l ，振摇3 m i n ，静置分 层。吸取正丁醇层2 m l ，加饱和草酸溶液2 m l 和水6 m l ，再加9 5 乙醇定容至2 5 m l ， 混匀( 溶液b ) 。 2 3 1 5 3 比色 将溶液a b c d 分别用1 0 m m 比色皿，以9 5 乙醇作参比，于3 8 0 n m 处测光密 度e a 、e b 、e c 、e o 。 2 3 1 5 4 结果计算 茶黄素( ) = 茶红素( ) = 茶褐素( ) = e c x 2 2 5 试样量( g ) 试样干物率( ) 7 0 6 ( 2 e a + 2 e d e c 一2 e a ) 试样量( g ) 试样干物率( ) 2 e bx 7 0 6 试样量( g ) 试样干物率( 脚 1 8 1 0 0 1 0 0 1 0 0 普洱茶多酚提取分离研究 2 3 2 单因素试验 2 3 2 _ 1 溶剂的选择 称取茶样1 o g ，在7 0 。c ，料液比1 ：8 0 ，用浓度分别为o ，1 0 ，3 0 ，5 0 ， 7 0 ，9 0 的乙醇溶液浸提4 0 m i n ，过滤后滤液定容至l o o m l 。采用酒石酸亚铁比色 法测定其中的茶多酚含量。 2 3 2 2 料液比的选择 称取茶样1 o g ，在7 0 ( 2 ，5 0 的乙醇溶液，分别以1 ：1 0 ， 1 ：2 0 ，1 ：3 0 ，1 ： 4 0 ，1 ：5 0 ，1 ：6 0 料液比浸提4 0 m i n ，过滤后滤液定容至l o o m l 。采用酒石酸亚铁 比色法测定其中的茶多酚含量。 2 3 2 3 浸提时间的选择 称取茶样1 0 9 ，在7 0 * ( 2 ，5 0 的乙醇溶液，料液比1 - 5 0 的条件下，浸提2 0 m i n ， 3 0m i n ，