（材料学专业论文）硅对羟基磷灰石（HA）生物陶瓷的作用.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第l i 页 b l u e 和a l p 的检测结果，进一步表明s i 0 2 的掺入增强了h a 的生物学性能。 在湿法合成含s i 磷灰石的体系中，研究结果表明，合成产物为含硅的磷狄 石，磷酸三钙混合物( s i h 刖t c p ) ，s i 的掺入降低了h a 的高温稳定性，并且在 s i 含量相同的条件下，这种方法合成的s i - h 圹r c p 的稳定性略低于s i 0 2 h a 体 系的稳定性。 关键词：羟基磷灰石，二氧化硅，热稳定性，生物活性 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 第1 章绪论 1 1 前言 二十世纪以来，现代科学技术和生产飞速发展，材料、能源与信息作为现 代技术的三大支柱，发展格外迅速，而在材料科学的发展中，生物材料科学是 发展最快、最受人关注的学科之一。其重要性在于它跨越了材料、医学、物理、 生物化学和现代高科技等诸多学科领域，并与人类自身发展息息相关。生物材 料走过了1 8 、1 9 世纪漫长的探索阶段，而在刚过去的2 0 世纪得到飞速的发展 并广泛应用于临床医学。随着材料科学与生命科学的发展，生物材料的研究已 从被动地适应生物环境发展到有目的地设计材料组分，以达到与生物组织的有 机连接。 生物材料一般是指生物医学材料，是一类人工或天然的材料，可以单独或 与药物一起制成部件、器件用于组织或器官的治疗、增强或替代，并在有效使 用期内不会对宿主引起急性或慢性危害“，2 1 。也有人认为1 3 4 】它是一种特殊的功 能材料，利用它可以对有机体进行修复、替代与再生。生物医学材料研究的最 终目的是用其能够代替或修复人体器官和组织，并实现其生理功能。但目前的 生物医学材料与人们的真正期望和要求相差甚远，长期以来，人们一直希望致 力于研究能够使损伤、病变组织或器官完美重现和再生的材料和装置。1 9 世纪 8 0 年代以来”l ，一类新的、具有激发、促进人体组织自身修复和再生作用的第 三代生物活性复合材料研究开始兴起，这类生物活性复合材料能够激发、主动 诱导人体组织的自身修复、再生能力，从而达到使病变组织、器官最终完全或 主要是由再生的自身天然健康组织或器官所取代，成为生物医学材料未来发展 最具有活力的方向之一。 人体骨组织的主要成分为无机相，而无机相中主要是羟基磷灰石。羟基磷 灰石 c a i o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 ，简称 n 与其它生物材料之间的显著差异是它具有与人 体骨组织相似的无机成分含有人体组织所必需的钙和磷元素，且不含其它有害 元素。羟基磷灰石是目前公认的具有良好生物相容性，能在其表面诱导生物化 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 学反应而与骨形成键性结合，是一类典型的生物活性的陶瓷材料。 由于实际人骨中的无机组分并不是纯的羟基磷灰石，它还含有碳酸根和纳、 镁、硅、银锌等离子【6 1 ，因此在羟基磷灰石应用中，为了满足临床应用的要 求，常需在其中添加一些元素来改善其临床性能。含硅羟基磷灰石就是其中的 一类改性材料。 1 2 舍硅羟基磷灰石的研究现状 硅在动物体中的主要存在形式为水溶性水合二氧化硅( 硅酸) 。它对于动物 体的作用通常表现为惰性无害。就人体而言，7 0 年代前硅曾被认为是人体的“无 害”或“非必需”元素。但近年来的研究工作表明，硅在人体的积极功能不容 忽视。故从7 0 年代中期起，硅与氟、镍、锡、硒及钒相继在5 年内被确定为人体 的“必需”元素。已经发现，硅与动物体内粘多糖的合成密切相关，硫酸软骨素 a ，b ，c 都含硅。动物实验表明：硅与骨骼的成长及结构有关，摄人不足，可使骨 骼含硅量减少：补硅后骨骼中的硅含量显著增加，骨生成旺盛的地方有硅渗入。 在骨化过程中，硅与钙的含量正相关。缺硅后可使骨骼异常、畸形、牙齿及釉 质发育不良。动物实验还表明：软骨正常生长需要硅，尤其是在胚胎时期特别明 显。c a r i s l e l 6 j 在体内和体外研究表明硅对骨骼的形成和矿化有重要的作用。电 子微探针表明硅置于活性生长区域，如年轻老鼠的骨样中，在这些区域中观察 到硅的质量分数高达o 5 。 h a 与生物玻璃和玻璃陶瓷之间的明显差异是后者的s i 0 2 含量高，s i 0 2 或s i 在这些生物活性玻璃的表面反应中起着重要的作用【吼，从而对其体内和体外的 生物活性起着关键的作用。这些玻璃中的s i 0 2 或s i 反应非常迅速，已有研究表 明反应在植入或接触到体液的几分钟内就发生了。含硅羟基磷灰石与羟基磷灰 石具有相同的晶 x 西南交通大学硕士研究生学位论文 第7 页 和骨分界面发现了组织胶原纤维，而纯的h a 需1 2 周。植入体内1 2 周后，在s i h a 周围生成的磷灰石远多干纯h a 。这些发现表明，将s i 0 4 4 掺人h a 中促进h a 骨 骼分界面的重塑过程，即s i h a 的成骨传导性更为优越。 1 2 4 生物相容性 生物材料的相容性是指材料与人体之间相互作用后产生的各种复杂的生 物、物理、化学等反应的一种概念。对于不降解的生物替代材料，植入体内后 作为异物一定会对生物体产生作用，同时生物体也会对植入物产生排斥反应， 这是机体的防御机制，这种反应从急性到慢性，由局部反应到全身。如果这些 植入物最终被生物体接受，就认为植入物与组织之间相容，被称为具有生物相 容性；反之称为生物不相容性【w 。植入人体内的生物医用材料及各种人工器官、 医用辅助装置等医疗器械，必须对人体无毒性、无致敏性、无刺激性、无遗传 毒性和无致癌性，对人体组织、血液、免疫等系统不产生不良反应。因此，生 物材料首先要解决的问题或者衡量其性能优劣的问题就是相容性。 植入物材料表面与组织、细胞、血液等短期或长期接触时，它们之间的相 互作用将产生各种不同的反应。长期以来，人们致力于这方面研究，一方面是 用各种方法来改善材料的相容性，另一方面研究了材料在于人体接触中的各种 生理、生化反应。生物相容性反应可分为血液反应、免疫反应、组织反应、生 物化学反应等。 生物医 x 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 于提高材料的血液相容性。 组织相容性要求医用材料植入体内后与组织、细胞接触无任何不良反应。 当医用材料与装置植入体内某一部位时，局部的组织对异物的反应属于一种机 体防御性对答反应，植入物体周围组织将出现自细胞、淋巴细胞和巨噬细胞聚 集，发生不同程度的急性炎症。当材料有毒性物质渗出时，材料被淋巴细胞、 成纤维细胞和胶原纤维包裹，形成纤维性包膜囊，使正常组织和材料隔开。如 果材料无任何毒性，性能比较稳定，组织相容性良好，则在半年、一年或更长 时间包膜囊变薄，囊壁中的淋巴细胞消失。 理想的种植材料应具有良好的生物相容性对细胞、组织等应无毒性无刺激 性、无致畸致突变性。而生物活性则指材料与骨组织之间形成骨性结合界而 具有骨引导或骨诱导作用。 k i m l 2 5 l 以及jl e e 等【2 6 】进行细胞增殖实验以评定s i h a 的生物相容性，并与 纯h a 进行比较，发现随着时间的增加，二者的细胞繁殖程度均增加，但2 4 天后 s i h a 样品细胞繁殖数目最多，因此表明，s i h a 具有良好的生物相容性。 b o t e l h o 等【2 7 】进行人成骨细胞( h o b ) 繁殖实验，结果发现在s i h a 上的细胞 数目显著大于h a 的，说明硅能够促进h o b 细胞的繁殖，至于在s i h a 上细胞有 广泛的粘附和散布这一现象，作者认为是可溶性硅刺激h o b 细胞产生胶原。因 为骨细胞能通过胶原键合而粘附于基底。实验过程中采用原子力显微镜观察了 s i h a 比h a 溶解得更快，且在溶解过程中硅酸根会优先释放，这就使得细胞培 养液中有可溶性硅存在。然而硅促进胶原的生成和促进细胞繁殖的机理还有待 进一步研究。 m s a y e r 等【2 8 】在破骨细胞和成骨细胞存在的条件下来评定材料的生物相容 性。研究发现，在破骨细胞存在条件下，材料表面出现吸收现象，可以检测到 多核巨细胞，并且随着s i 含量的增加，材料表面的吸收量不断增加，这说明含 硅的h a 能促进破骨细胞的吸收。在成骨细胞存在时，材料表面会沉积一层矿物 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 质。这说明材料具有细胞调制降解的性能。 1 3 纯h a 和含硅h a 的高温稳定性 h a 作为最重要的生物陶瓷、玻璃和涂层的起始原材料之一，合成粉末的 高温热稳定性是影响材料生物、力学及微观结构等特性的关键因素，而高温稳 定性与合成粉末的组成、粒度、形态及粉末团聚情况等密切相关。含硅的 i a 的热稳定性受多种因素制约，如硅的添加量，硅的引入方式以及烧结气氛等等。 1 3 1 磷灰石的高温稳定性 磷灰石的高温稳定性与许多因素有关，包括c a p 比，烧结过程中的气氛， 反应是否在平衡条件下进行等等，高温分解产物的不同可使材料性能有重大的 改变，因此研究磷灰石的高温稳定性就显得尤为必要。 1 3 1 1c a p 比 不同化学组成的磷灰石在烧结过程中其热稳定性不同【29 1 ，当1 c a p 比小于 1 6 7 ，热稳定性急剧下降，纯h a 可稳定存在于1 3 5 0 以下，当烧结温度高于 13 5 0 时，h a 脱掉羟基转交成氧磷灰石，温度超过1 4 5 0 ，转变成a t c p 和 磷酸氧四钙。在磷灰石烧结过程中的热分解和相转变使得材料的某些性能无法 预测，因此有必要研究下c a 、p 摩尔比对磷灰石陶瓷热稳定性和烧结行为的影 响。 研究表明，随c a p 摩尔比增加，合成h a 粉末的热稳定性依次提高【3 引。 当烧结温度为1 2 0 0 时，c a p 摩尔比为1 5 和1 5 5 的粉末已经转化为b t c p ， c a p 摩尔比大于1 5 5 而小于1 6 7 的粉末由h a 和d t c p 组成，h a 的热稳定性 较差，随着比值的减小，h a 的分解温度下降且很难获得致密烧结的细晶结构； c a p 摩尔比大于1 6 7 的粉末中除h a 外，还有少量c a o 。这是因为在合成c a p 摩尔比大于1 6 7 粉体时，由于调整了p h 值，生成部分无定形c o h ) 2 且包裹 在h a 颗粒表面，在烧成时，c a ( o h ) 2 分解生成c a 0 ，而c a 0 的生成可有效抑 制h a 向a t c p 和t t c p 转化，同时可以起到钉扎晶界的作用，抑制晶粒长大， 西南交通大学硕士研究生学位论文第l o 页 阻止致密化烧结。 1 3 1 2 烧结参数 大量实验表明，烧结的参数对h a 结构中羟基的分解有定的影响，如烧 结在真空和缺水情况下进行，则h a 脱羟基的温度会向低温方向移动，反之， 如在烧结过程中通入水蒸气则使羟基丢失的温度提高。采用热压烧结工艺，也 可使羟基分解的温度向高温方向移动。在冷金属基底上等离子喷射h a 涂层时， 由于h a 涂层由高温熔融态以10 8 s 速度冷却至低温态，所以会生成晶体、 非晶体和亚稳晶体，如o h a p ( c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 。o 。口。) ， n t c p ( c a 3 ( p 0 4 ) 2 ) ，t t c p ( c a 4 p 2 0 9 ) ，c a o 等口1 。3 3 1 。 x 射线结构分析表明，羟基的丢失并未使h a 的衍射图谱发生变化。这说 明羟基的部分丢失尚未破坏h a 的晶体结构，在远高于羟基丢失温度之上，h a 发生分解导致晶体结构才发生实质性的变化。 w a l l g 和c h a k i 【3 4 】报道了c a ，p 为1 6 9 的磷灰石在空气中烧结4 小时的稳定 性，1 1 0 0 时磷灰石即发生分解，结果表明，长期间的烧结可以降低磷灰石的 稳定性，加快磷灰石的分解。 1 ，3 1 3 理想配比的磷灰石的烧结性能 c h u n _ j e nl i a o 等【3 5 1 报道将纯h a 从室温至1 5 0 0 进行高温烧结，采用的大气 环境下的烧结条件，保持一定的升温速度，使实验在平衡条件下进行。在这种 情况下，1 0 0 0 - 1 3 6 0 h a 会逐渐失去羟基生成氧磷灰石( c a l o ( p 0 4 ) 6 0 ，o h a ) ， 当温度升至1 3 6 0 以上，具有点阵缺陷的0 h a 再分解生成q t c p 和t t c p ，在1 4 0 0 1 5 0 0 ，只有a - t c p 和t 1 p 两相存在。当温度从1 5 0 0 缓慢冷却至室温时，在 1 3 5 0 部分t t c p 和c l t c p 重新生成o a p ，且存在于1 3 5 0 1 3 0 0 。当温度下降 至1 2 9 0 时，部分t t c p 和伍t c p 再水合生成0 h a p ，1 1 0 0 t t c p 和小t c p 完全 重建为h a 。，而随着温度的降低，0 凡p 也逐渐再次水合直至完全生成h a 。 g m u r a l i t l l r a i l 等【3 6 】将h a 粉末在4 0 m p a 的条件下压成2 0 m m 厚的圆柱形，随后 置于橡胶袋中在2 0 0 m p a 下进行冷等静压，随后在1 0 0 0 1 4 5 0 进行烧结。结果 西南交通大学硕士研究生学位论文第l l 页 表明在1 3 5 0 下h a 稳定存在，当温度上升至1 4 0 0 时，h a 才开始发生分解， 生成a _ t c p ，温度继续升至1 4 5 0 时，h a 继续分解，产物为舡t c p 、t t c p 、b t c p 和c a o 。 1 3 2 含硅h a 的烧结性能 热稳定性对于评定硅的掺入对h a 体内和体外生物活性作用的研究是极为 重要的，因为如果在烧结时s i h a 发生了分解，那么由于次级相的存在，就难 以比较s i h a 和h a 的生物活性。6 i b s o n 【3 7 l 提出可以制备质量分数为o 1 一5 s i 姒，且质量分数以0 1 1 6 为宜，至于原因作者没有解释。k i m 提出当 硅质量分数超过2 时，在1 1 0 0 烧结后出现了磷酸三钙( t c p ) 和硅磷酸钙 ( c a 5 ( p 0 4 ) 2 ( s i 0 4 ) ) ，而当硅质量分数低于2 时，“o o 烧结后样品的x r d 图谱 中观察不到有次级相生成。c o s 等研究发现，当硅质量分数低于2 6 时，在 9 0 0 烧结6 小时后样品不会发生分解。因此掺入少量的硅不会影响到h a 的热稳 定性。 1 4 论文的主要内容和目的 1 4 1 论文的主要目的 有文献报道了s i - h a 植入体内后的生物学评价，表明含s i 的磷灰石材料有 更好的生物活性和生物相容性，在体外进行生物学评价，结果表明这种材料在 破骨细胞存在的环境下能被吸收，在成骨细胞环境下能促进骨矿物的沉积，可 以参与细胞的重建过程，具有细胞调制降解的性能。本研究的目的着重在于以 研究s i 0 2 对纯h a 热稳定性的影响以及混合产物在不同烧结温度下的生物学性 能的差异为基础，分析在二氧化硅没有进入h a 晶体结构的条件下，对h a 的 稳定性有何影响，对h a 的生物学性能又有何影响。同时，采用湿法合成的方 式合成含硅的磷灰石，比较在相同的硅含量下，纯s i 0 2 对h a 稳定性的影响和 t e o s 引入的硅对h a 热稳定性的影响j 分析不同方式对h a 结构的破坏程度。 通过以上研究明确s i 0 2 的作用，为制备含硅磷灰石提供科学依据。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 2 页 1 4 2 论文的主要内容 1 将二氧化硅( s i 0 2 ) 和羟基磷灰石( h a ) 进行机械混合压片，在不同高温 下进行烧结，采用x r d 、i r 、t g d s c 分析相成分、晶体结构和热失重，评价 不同烧结温度对材料的影响。 2 采用各种生物学检测手段对高温烧结后压片进行体外生物学评价，比较 材料生物学性能的差异。 3 在合成h a 的过程中加入t e o s ，利用t e o s 的水解和缩聚，使硅得以进 入磷灰石的晶体结构中，替代h a 结构中的p ，从而改变h a 的晶体结构和烧 结性能，使材料有更优异的生物活性。 西南交通大学硕士研究生学位论文 第1 3 页 第2 章 s i0 2 对h a 热稳定性的影响 高温烧结是陶瓷制作中不可避免的过程，材料的高温热稳定性就成为影响 其微观结构、力学和生物学等特性的关键因素【3 8 。由于硅在人体骨生长中的作 用以及生物玻璃中硅促进骨生长的效果等，含硅磷灰石的研究越来越受到重视， 但是硅与h a 晶格的相互作用的基本特性还研究较少。考察二氧化硅( s i 0 2 ) 对 结构完整的合成h a 热稳定性的影响，此体系叶1 的s i 未预先进入磷灰石晶格，其 热稳定性有别于s i h a 的热稳定性。s i 0 2 对h a 结构的稳定性的研究对s i h a 陶 瓷制各和性能控制等方面都具有重要的意义， 考察二氧化硅( s i 0 2 ) 对结构完整的合成h a 热稳定性的影响此体系中的 s i 末预先进入磷灰石晶格，其热稳定性有别于s i - h a 的热稳定性。s i 0 2 对l i a 结 构的稳定性的研究对s i h a 陶瓷制各和性能控制等方面都具有重要的意义。 2 1 实验部分 2 1 1 原料及主要仪器设备 原料型号 产地 二氧化硅( 石英砂) h a 微粉平均1 1 1 1 i i l 电予天平 a c c o l a b 磁力加热搅拌器7 8 1 型 f l i rn i c o i e t s x f y i r 【7 0 型 国x 1 p e r t p r 0 m p d 型 高温微量热分析仪p t c _ 1 0 a 型 高温微置热分析仪p t c 1 0 a 型 天津市科密欧化学试剂开发中心 四川大学生物材料工程研究中心 德国 江苏余城国胜仪器厂 p e r k i e l m e r 荷兰p h i l i p s 日本 日本 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 5 页 磷酸钙( 任- t c p ) 和磷酸四钙( t t c p ) ，且除此两相外无其他杂项如硅酸盐、氧化 钙存在，同时s i 0 2 ，h a 在烧结前后s i 0 2 的特征衍射峰无任何变化，这些结果表明 s i 0 2 没有与h a 或是h a 的分解产物发生任何化学反应，在h a 的高温分解中破坏 了h a 结构的稳定性，降低了姒的分解温度。那么，s i 0 2 引起h a 分解的最低温 度是多少昵7 2 - t h 女( d e 口) 图2 一ls i o 以姐在烧结和未烧结条件和纯h a 在烧结条件下的x r d 图谱 as i o 舢一1 2 0 0 ：bs i 0 2 h a 一常温；c 纯h a 一1 2 0 0 ( o = 旺t c p ：一= t t c p ：s i 0 2 ) 图2 2 给出s i 0 2 册a 混合物在不同温度下烧结后的x r d 图谱，图中a 为s i 0 2 h a 混合物未经烧结时各自的特征衍射峰。当温度升高到1 0 0 0 时，峰值没有发 生明显变化，表明h a 结构基本保持完整。当在1 1 0 0 烧结时，h a 晶体结构发生 了分解，分解部分生成旺一t c p 和t t c p ，s i 0 2 的晶体结构没有发生变化，也无任 何硅酸盐生成，表明s i 0 2 没有和h a 圾其分解产物发生化学反应。随着温度升至 1 2 0 0 ，h a 完全分解，图谱中已无h a 的特征衍射峰，此时产物为旺t c p 、t t c p ， s i 0 2 保持不变，除此之外无其它杂项生成。同时，也没有迹象表明h a 在分解前 s i 离子进入h a 晶格中。因此，我们可以判断s i 0 2 的存在促进了h a 的热分解， 一兽芦堙i!口一鲁n基lu 西南交通大学硕士研究生学位论文 第1 6 页 _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ - _ l _ _ 一 降低了h a 的热稳定性，使h a 在1 0 0 0 1 l o o 温度范围内发生分解，s i 0 2 并不与 h a 及其分解产物发生反应生成硅酸钙盐。 图2 2s i 0 2 ，h a 在不同烧结温度下的x r d 图谱 a 未烧结；b1 0 0 0 ：c1 1 0 0 ；d1 2 0 0 ( 0 2 a t c p ；一。t t c p ；2 s i 0 2 ) l i a o 等在研究理想化学配比的纯h a ( 德国m e r c k 公司出品) 在空气状态 下的高温分解时指出，h a 首先要经历高于1 3 5 0 及以上温度完全失去羟基生成 氧磷灰石( c a l o ( p 0 4 ) 6 0 ，o h a ) 的过程，随后具有点阵缺陷的o h a 再分解生成 t c p 和t t c p ，反应中的d t c p 只有通过骤冷的方式才能保持到室温；但当温 度缓慢降温到1 2 5 0 以下，高温分解产物旺一t c p 和t t c p 可逆地转化为h a 。可 将这一反应过程表述为： h 2 0 由此可见，h a 在1 1 0 0 时基本上未完成向o h a 的转变，这可以从下节的i r ， 分析结果中获得明确的证实，因此，可以推断s i 0 2 破坏h a 稳定性并不需要经过 失去大量羟基的0 h a 中间相，其催化h a 分解的反应方程式可写为： 雷善l_日直言5iu 西南交通大学硕士研究生学位论文 第1 7 页 c a i o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) r + c a 4 0 ( p 0 4 ) 2 + 2 c a 3 ( p 0 4 ) 2 + h 2 0 此外，本实验_ 中采用缓慢的降温过程，x r d 谱图中既未出现分解产物向h a 转化，也未见高温相小t c p 消失而出现低温相p t c p ，证明s i 0 2 的存在不仅使h a 的分解过程不可逆，而且具有稳定高温相a t c p 的作用。 m u r a l i t i l r 趴等州同样对德国m e r c k 公司的纯h a 的热稳定性进行了研究，实 验结果显示当温度达到1 4 5 0 时，纯h a 的高温分解产物中进一步出现c a 0 ，反 应方程如下所示： 2 c a i o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 _ c a 4 0 ( p 0 4 ) 2 + 5 c a 3 ( p 0 4 ) 2 + c a o + 2 h 2 0 以上两个研究小组针对同一公司同一品名产品出现的差异，被认为是由于 产品批次不同。l i a o 等认为，按照c a 0 p 2 0 5 h 2 0 的平衡相图分析，在热平衡 状态下h a 的高温分解产物不可能出现c a 2 p 2 0 7 或c a o 等相成分，只有非平衡 状态如等离子喷涂h a 在金属基体上制备其涂层时，才可能生成上述两种产物。 本实验结果也证实h a 的分解并没有c a 0 产生，同时也表明s i 在h a 分解前并 未进入其晶格中，s i 0 2 直接促进h a 的结构分解。 在含s i 的s i h a 体系中，其高温分解产物生成a t c p ，c a o 和 c a 5 ( p 0 4 ) 2 ( s i 0 4 ) ，与s i 0 2 璩混合体系的高温分解产物有所不同。前者是在合 成 i a 的过程中加入了t e o s 或醋酸硅口9 】，合成产物中硅进入了h a 晶格，取 代了p 。由于s i 和p 的原子半径有所不同，造成了s i h a 结构的缺陷和0 h 的缺失，这种结构的缺陷造成了结构的不稳定，分解温度降低且随着硅含量 的增多，稳定性更差。当s i 元素以s i 0 2 的形式与h a 进行机械共混时，在烧结 过程中s i 没有进入h a 晶格，没有生成c 8 5 ( p 0 4 ) 2 ( s i 0 4 ) 和硅酸盐。 n d 2 【4 0 】也可破坏h a 的高温稳定性，使h a 在低于1 2 5 0 下发生分解，与 t i 0 2 生成钛酸钙和磷酸钙，这说明n 0 2 对h a 结构的破坏是通过化学反应进行 的，与s i 0 2 破坏h a 结构有所不同，原因可能是由于t i 0 2 较s i 0 2 具有更高的 反应活性。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 8 页 2 2 2 红外光谱分析( f t i r ) 不同温度烧结后s i 0 2 m a 混合物的i r 图谱如图3 所示：1 6 3 6 c m 1 和3 4 0 0 一 3 5 0 0c m _ 1 为水的吸收峰，3 5 7 1 c m 1 和6 3 1 c m - 1 为羟基吸收峰，9 6 2 c m - 1 为p 0 4 3 一的 v 1 振动吸收峰，4 7 0 c m 1 为p 0 4 3 。的v 2 振动吸收峰，1 0 9 0 c m 。1 和1 0 2 1 c m 1 为p 0 4 孓的 v 3 振动吸收蜂，6 0 3 c m 1 和5 6 1 c m 1 为p 0 4 3 。的v 4 振动吸收峰。未烧结的样品具有 o h 1 和p 0 4 3 的特征峰，随着烧结温度的提高，羟基的吸收峰和水的吸收峰逐渐 减弱，表明h a 结构中羟基随着温度升高而丧失；当温度升至1 2 0 0 时，1 6 3 6 c m 1 和3 5 7 1 c m 。羟基吸收峰完全消失，同时磷酸根的吸收峰基本没有发生变化，而 且i r 图谱中没有出现8 7 0 c m 1 属于s i o 。4 。的特征振动吸收峰，说明h a 在此温度下 已完全分解，且s i 0 2 在高温烧结中没有与h a 及其分解产物发生化学反应，与 x r d 的数据保持一致。 mm z 1 u u uu w a v e n u m b e 巾m 1 】 图2 3s i 0 2 h a 在不同温度烧结后的i r 图谱 a 未烧结；b1 0 0 0 ；c 1 1 0 0 ；d1 2 0 0 2 2 3 热分析( t g d s c ) 图2 4 为纯h a 由室温升至1 2 0 0 并缓慢冷却至室温的t g - d s c 曲线。当温 度升至1 0 0 时，d s c 有一较宽的吸热峰，h a 有明显的失重现象，失重率约为 8c墨一ec罡丑 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 l 页 第3 章s i 0 ：h a 的生物学评价 材料的生物相容性是选择生物材料时首先必须考虑的问题，不论何种材料 植入机体后与机体环境必将发生作用。一方面是材料对机体的响应，另一方面 是机体对材料的响应。理想的种植材料应具有良好的生物相容性，对细胞、组 织等应无毒性无刺激性、无致畸致突变性。而生物活性则指材料与骨组织之间 形成骨性结合界而具有骨引导或骨诱导作用【4 ”。本试验采用体外细胞培养的 方法对三个不同温度下烧结的样品进行生物学评价，采用不同的检测手段来比 较不同样品的生物学性能，从而找出影响材料生物学性能的主要因素，评价硅 对羟基磷灰石生物学性能的影响。 3 1 原料及主要仪器设备 抗坏血酸( a s c o r b i ca c i d ) 0 一甘油酸钠( 8 一g l y c e r o p h o s p h a t e ) 地塞米松( d e xa 1 i l e t h a s o n ) 培养基a m e m 1 5 胎牛血清( f b s ) 超净台 离心机 c o 。培养箱 酶标仪 光学显微镜 高压灭菌设备 3 2 体外细胞培养 3 2 1 成骨细胞培养 取饲养6 0 天左右的s d 大鼠三只，体质量约1 2 0 9 ( 华西医院实验动物中心) ， 西南交通大学硕士研究生学位论文 第2 2 页 取乙醚麻醉后，颈椎脱臼致死：取医用剪刀将大鼠腿部皮肤及肌肉剪开，分离 出腓骨和股骨，浸泡于磷酸盐缓冲液( p b s ) 溶液中；在取骨过程中，注意应从关 节处剪开，避免将骨髓腔暴露于空气中，以降低产生细菌污染的可能性。 收集骨髓步骤在超净工作台上完成：使用0 2 2 u m 针头过滤器预先过滤n m e m 培养基( 成分为：n m e m 培养基；1 5 ( v v ) 胎牛血清：1 4 2 6 9 l 碳酸 氢钠) 5 0 m l ；使用预先高温灭菌的手术刀片及镊子，切除骨的两端骨骺，用注 射器针头吸取培养基后，冲洗骨髓腔，并收集所有冲洗液。冲洗过程中，不时 使用针头刮磨骨髓腔内壁，保证冲沈下尽量多的骨髓。待整根骨头显示白色， 表示大部分骨髓被收集，可以停止冲洗。将收集到的冲洗液转移至5 0 m 1 离心管 中，于1 0 0 0 r p m 离心速度离心3 分钟，离心结束后弃去上清液，加入伍m e m 培养基约1 0 m 1 ，并加入双倍浓度抗生素( 青霉素及链霉素各2 0 0 u m 1 ) ，抑止细 菌生长。 取2 5 m l 细胞培养瓶两个，将上述细胞收集液分装于两个培养瓶中，每个瓶 子加入细胞收集液5 m l 。将培养瓶置于c 0 2 培养箱内培养，培养条件为：3 7 0 c ； 5 c 0 2 - 9 5 湿度。培养三天后。取出于光镜下观察，并更换培养基，继续加 入青霉素及链霉素各2 0 0 u m l ，放回培养箱内继续培养；之后，隔天取出培养 瓶于光镜下观察细胞生长情况，更换培养基，一周以后停止在培养基内加入抗 生素。正常情况下，约两周以后可在镜下观察发现，健康成骨细胞铺满瓶底， 细胞浓度较大，细胞呈现三角形或四角形，可以进行冻存及传代培养。 3 2 2 成骨细胞传代培养及冻存操作 吸除瓶内旧的培养基，使用预先灭菌的p b s 冲洗细胞两次，每次约5 m 1 ： 使用0 5 胰岛素一乙二胺四乙酸( t r y p s i n e d t a ) 消化细胞：先用 5 m 1 0 5 t r y p s i n e d t a 冲洗细胞 然后加入1 m 1 0 5 t r y p s i n e d t a 消化细胞： 消化过程中，不断用手指敲打瓶底，加速细胞脱落，并不时置于镜下观察，待 大部分细胞悬浮至溶液中，加入约1 0 m l 培养基，将培养基转移至离心管中进行 离心，于1 0 0 0 r p m 离心速度离心5 分钟。弃去上清液，将剩余细胞振荡均匀后， 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 3 页 根据需要加入新培养基。 使用血球计数器对细胞进行计数：若为传代操作，则将得到细胞液稀释至 1 0 5 m l 后，在每个培养瓶内加入5 m l 该浓度细胞液后，置于培养箱内培养；若 为冻存细胞操作，则取2 m 】冻存小瓶，加入0 5 m l 冻存保护液，并加入细胞液 l m l ，在瓶壁上标明细胞名称，细胞代数，细胞浓度，操作人，操作时间。冻存 保护液成分为：f b s ：二甲基亚砜f d m s o ) = 2 ：l 。 3 2 3 细胞接种至材料表面 取不同温度烧结s i 0 2 肌陶瓷片5 组( 1 0 0 0 ，1 1 0 0 ，1 2 0 0 ) ，以及 不锈钢片及纯h a 陶瓷片各五组，直径1 3 m m ，厚度约1 m m ，标记后置于灭菌 箱内1 2 1 高温灭菌：灭菌结束后，将样品移至超净工作台上，取2 4 孔板一 块，每孔内加入样品一块，将所有样品分别浸泡于p b s 溶液中3 0 m n ，并使用 p b s 冲洗三遍。 取成熟成骨细胞一瓶，吸除旧培养基，用p b s 冲洗三遍；再用0 2 5 聊p s i n e d t a 冲洗一遍后，加入0 2 5 t r y p s i n e d l l a 约2 m i 消化细胞，加培养基， 离心，1 0 0 0 r p m ，5 m i n ，吸去上清液，通过振荡将细胞分散均匀，加入5 m l 成 骨细胞分化培养基，计数；将细胞浓度调整至1 1 0 5 m l ，每孔加入该浓度细胞 液1 m l ，置于培养箱内培养。 2 4 h 后，取出培养板，吸除旧培养基，取一块新培养板，将样品依次转移 至新板内，加入成骨细胞分化培养基每孔1 m l ，继续培养。 3 3 评价手段 3 3 1 乳酸脱氢酶( l d h ) 细胞毒性检测 l d h 作为一种细胞质酶存在于所有哺乳动物细胞中。细胞膜对于l d h 通常 为无通透性的，只有当细胞膜被破坏时，l d h 才可能被分泌到胞外液体中。因 此，在研究生物材料体外的生物相容性时l d h 可以作为细胞毒性一个敏感、准 确的指示剂。在免疫学中，已经将l d h 用于检测细胞内毒性。l d h 功能是催化 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 4 页 三羧酸循环过程中的脱氢步骤。l d h 不能够通过细胞分泌进入细胞外基质，因 此正常情况下，在胞外检测不到l d h 的存在，同时也证明细胞膜完整性良好， 没有遭到任何破坏。基于这个原理，研究者通过检测在细胞培养液( 胞外环境) 中的l d h 浓度，来评价细胞表面细胞膜受破坏的程度。在生物材料评价过程中， l d h 经常被应用于检测生物材料表面在接触细胞以后对该类细胞造成的膜破 坏程度【4 2 ，4 3 1 。 l d h 检测的具体原理为： l a c a t a t e + n a d = p y r u v a t e + n a d h + h + l d h 作为上述反应的酶催化剂，其在细胞内的含量与该反应的反应速度成 一定的比例关系，因此通常通过测定上述反应的反应速度来测定l d h 的浓度， 并进一步显示生物材料表面对细胞膜的损害程度。其具体测定机理为：在反应 过程中，n a d h 浓度随反应速度的变化而变化，其浓度变化的速度与l d h 的浓 度成正比，而根据比尔定律，n a d h 在3 4 0 n m 处具有最大吸光度，因此可选择在 3 4 0 n m 处测定n a d h 的浓度变化速度来测定l d h 浓度。 具体测定过程为： 1 配置无血清培养基适量，以每个样品1 0 0 m l 来计算具体用量； 2 在无血清培养基中，加入体积比为l ：l o 加入1 0 0 倍胰岛转化蛋白； 3 将材料灭菌后与细胞培养2 小时，同时取较高细胞浓度细胞液，梯度稀 释后，放入培养箱培养两个小时，作为标准曲线备用； 4 2 小时以后，从培养箱中取出样品及标准曲线，在标准曲线中加入2 0 u l 1 0 t r i t o n 一1 0 0 ，将细胞膜破坏后，从样品及标准曲线孔内各取5 0 u l 培 养基，转移至p c r 板中； 5 在9 6 孔板内加入每孔2 0 0 u l l d h 反应液，再加入步骤4 中所取培养基 1 4 u 1 ，一一加入各孔中； 6 将9 6 孔板迅速放入酶标仪中，以反应动力学模式测定l d h 浓度 西南交通大学硕士研究生学位论文 第2 6 页 磷酸酶，因此在大部分研究中，研究者将碱性磷酸酶作为成骨细胞分化的一种 标志物，其含量多少可在一定程度上表示成骨细胞矿化沉积过程的进行情况， 是一类在成骨细胞培养及检测中常用的重要参数，可以直接表征材料对于成骨 细胞的生物相容性【“】。 原理： r o p 0 3 2 + h 2 0 等r o h + p 0 4 3 。+ 矿 细胞内外均存在上述反应，该反应特异的催化酶为a l p 。因此，其反应速 度与a l p 浓度成正比。在a l p 检测中，研究中多采用4 - n i t r o p h e n l yp h o s p h a t e 作为反应底物r - o - p 0 3 各，检测其在反应过程中的减少速度作为反应速度，并换 算成相应的a l p 单位浓度，该方法简便，易操作，被广泛用于研究中。 具体操作规程为： 1 取a l p 标准品，浓度为2 5 u u l ，稀释至5 0 u m l ，不用时存于一2 0 。c 冰 箱内； 2 取a l p 标准品，进行梯度稀释，初始浓度为1 u m l ，稀释8 孔，其浓度 依次为：l ，o 5 ，0 1 2 5 ，o 1 2 5 ，0 0 6 4 ，0 0 3 2 ，o 0 1 6 ，o u m l ； 3 取待测样品，每孔样品取细胞上清液2 0 0 u l ，转移至9 6 孔p c r 板内备 用； 4 a l p 缓冲液； 5 配置a l p 试剂，以5 m i 体积为例：取5 倍a l p 缓冲液1 m l ，加4 m i 蒸馏水稀释，并在其中加入4 寸嘶打0 p h e n l yp h o s p h a t e l 8 5 5 m g ； 6 取9 6 孔板一块，按照样品及标准曲线数量，计算所需孔数，在每孔中 加入a l p 试剂2 0 0 u l ： 7 从步骤3 及2 所取样品及标准品中， a l p 试剂孔内； 检测； 8 设定酶标仪参数， 该步骤应快速完成 每孔吸取5 0 u l ，分别加入相应的 完成后立刻将孔板放入酶标仪中 采用反应动力学模式，选择检测波长为4 0 5 n m ，每 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 8 页 3 4 结果分析及讨论 3 4 1 l d h 细胞毒性检测 h a 嗣o h a l o s 1 0 2 - h a l l o o 髫o 冬h 1 瑚 s 图3 一ls i 0 雄n 在不同温度下的u ) h 检测 在细胞种植在材料表面4 5 h 后对材料进行l d h 检测。图3 1 是不同烧结 温度下s i 0 2 n 的l d h 检测情况，横坐标为不同烧结温度下的样品，纵坐标 为细胞膜的损坏程度。s i 0 2 ，h a 一1 1 0 0 对细胞膜的损坏程度最小，s i 0 2 h a l 0 0 0 和s i 0 2 ，h a l 2 0 0 对细胞膜的损坏程度次之，阴性和阳性对照对细胞膜的损坏程 度最大，对细胞膜的损坏最高约为4 5 ，最低约为2 。由于三种样品的l d h 都明显低于对照样，可以初步判断s i 0 2 的加入并没有使材料产生细胞毒性。 1 1 0 0 度烧结后的样品的l d h 要略低于另两个温度烧结下的样品，这点表明 s i 0 2 h a 一1 1 0 0 的细胞毒性最低，s i 0 2 h a l 0 0 0 和s i 0 2 h a l 2 0 0 的细胞毒性基本 相当。 3 4 2a l a m a rb i u e 细胞增值检测 图3 2 是细胞在不同烧结温度下s i 0 2 i a 试样上分别培养3 天和7 天后的增 值情况，阴性对照和阳性对照样分别为不锈钢和纯h a 片下干太岛裂篓；l j ：= ：缪毫巨例 割苷剥羹萋8 明薹委萋錾鬟甜踺培养三天后的结 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 9 页 细胞数目，但s i 0 2 h a l 2 0 0 上的细胞数目与纯h a 的细胞数目基本一致。但在培 养七天后，s i 0 2 珊a 1 2 0 0 上的细胞增殖很快，与纯h a 相比。细胞相对数目已经 明显增多。总体来说，s i 0 2 h a 混合物试样在不同温度烧结下，细胞数目在各 时期都明显多于其它试样，表明细胞更易于在s i 0 2 h a 表面生长，s i 0 2 增强了 h a 的生物相容性。s i 0 2 h a l 0 0 0 为h a 和s i 0 2 的混合相，s i o 棚a 1 1 0 0 为h a 、 s i 0 2 、a t c p 和t t c p 的混合相。二者在三天和七天的细胞培养后的细胞数目基 本一致，这表明a t c p 和t t c p 在这一阶段对细胞增值没有显著的影响，影响细 胞增值的主要相为h a 和s i 0 2 。进一步说明s i 0 2 的加入对材料的生物相容性有重 大的改善。对s i 0 2 ， i a l l o o 和s i 0 2 h a l 2 0 0 两组进行比较，后者为s i 0 2 、a t c p 和t t c p 的混合相，缺少了h a 相，试样所表现出来的细胞增值大大降低，在三 天和七天的a l a m a rb 1 u e 检测中，细胞相对数目都明显低于前两个温度烧结下的 试样，这一点说明h a 对细胞的增值起着重要的作用，同时由于培养七天后 s i 0 2 j 【a 1 2 0 0 的细胞相对数目要多于纯h a ，也从另一角度说明s i 0 2 能够提高试 样的生物相容性，有利于细胞的增值。 h s d 4 “1 0 咖 1 1 0 0s 1 0 2 j h 1 2 3 图3 2s i d 2 h a 在不同温度下的a l a m a rb l u e 检测 o 9 b 7 6 5 4 妻一目8重m 西南交通大学硕士研究生学位论文 第3 0 页 3 4 3a l p 细胞活性检测 姒s 1 0 2 肿a 1 0 s 1 0 2 蛆1 1 辚0 2 ，h a l 2 皓 图3 3 细胞在不同样品上培养产生的a l p 浓度 图3 3 给出细胞在不同试样上培养三天和七天后的a l p 浓度情况。细胞培 养3 天后，在各组试样上产生的a l p 没有显著性差异。因为试样均为无明显刺激 和毒性的材料，短期间内细胞的影响尚不足以表现出来。当细胞培养7 天后，在 s i 0 2 用a l o o o 和s i 0 2 用a 1 1 0 0 上的a l p 含量要明显高于其它3 组，说明在这两组 试样上细胞有更强的分化能力，同时，由于s i 0 2 h a l 0 0 0 和纯h a 相比只是多了 s i 0 2 这一单相，而细胞分化能力却有显著性差异，这一点表明s i 0 2 有利于细胞 分化。比较s i 0 2 h a l 0 0 0 、s i 0 2 h a “0 0 和s i 0 2 俄a 1 2 0 0 ，培养三天后a l p 数目 没有显著性差异，培养七天后前二者a l p 无显著差异，却明显高于1 2