（发酵工程专业论文）原生质体电融合法构建酒精高产菌株.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 为得到能直接利用早籼米进行发酵产酒精的融合子，对k 氏酵母与黑曲霉分 别进行物理诱变，从而筛选得到酒精高产菌株与糖化酶高产菌株。并对两高产菌 株分别进行原生质体制备实验，将在优化条件下制备所得原生质体进行电融合， 最终选出一株性能稳定、高产酒精的融合子，且摸索出融合子产酒精发酵工艺优 化实验条件。主要实验结果见下： 1 k 氏酵母对数生长期为4 h l o h ，酒精耐受性为1 7 ( v v ) 。k 氏酵母经剂 量为0 4 k g y 的钴源照射后得到酒精高产菌株k c 一4 酵母，其酒精产量为8 6 ( v v ) ，该产量比原始出发菌株于同等发酵条件下提高4 1 。黑曲霉在剂量为 0 6 k g y 的钴源照射后得到产糖化酶高产菌株a c 一6 曲霉，其产糖化酶活力为 1 0 2 6 u g ，该糖化酶活力比原始出发菌株于同等发酵条件下所产糖化酶活力提高 1 6 9 。 2 k c 一4 最佳产孢培养基为1 号产孢培养基，且在该培养基上培养的k c - 4 酵母产 孢率为7 8 3 4 。菌龄为8 h ，不经b 一巯基乙醇预处理及以0 8 m o l l 甘露醇为稳 定剂时有利于k c 一4 原生质体形成与再生。k c 一4 原生质体形成与再生的优化条件为： 蜗牛酶浓度2 、酶解温度3 0 、酶解时间1 5 h ，在该条件下k c - 4 原生质体形成 率与再生率分别为7 2 4 、2 6 7 。a c 一6 原生质体再生的最佳菌龄为1 2 h 。其原 生质体再生优化实验条件为：1 o 纤维素酶+ 0 5 蜗牛酶+ 0 5 溶菌酶，3 0 ， 酶解3 h 时，a c 一6 原生质体再生率达3 9 2 。 3 k c 一4 与a c _ 6 两者原生质体电融合条件为：交变电场频率为1 m h z ，交变电场 强度7 0 0 v c m ，脉冲电场强度l o k v c m ，脉冲宽度5 0 肛s ，脉冲个数为5 个，在该 条件下融合率为1 6 1 0 一，a c - 6 原生质体经紫外线单亲灭活后，在该融合条件下 筛选出一株性能稳定，且酒精高产的融合子a i ( 一2 。其中该融合子最适生长温度为 3 0 、最适生长p h 为5 0 、对数生长期为1 2 h 2 4 h 及其酒精耐受度为1 6 ( v v ) 。 4 融合子a k 一2 生料发酵产酒精工艺条件：早籼米最佳粉碎度为6 0 目数，最适 接种量为1 0 ，料液比为1 ：3 0 ，发酵温度3 2 、发酵时间3 5 d 、p h 4 0 ，且在 该优化条件下融合子利用生料发酵产酒精量为7 4 ( v v ) 。 所得融合子性能稳定，能直接利用生料发酵产酒精，省去传统酒精生产工艺 中蒸煮过程，起到节约能耗的优点，具有较强的经济实用价值。 关键词：原生质体，电融合法，融合子，生料发酵，酒精 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t n e s a c c h a r o m y o e sc e r e v 妇i a sk a n da n i g e rw e r ei n d u e e db yp h y s i c a lm u t a t i o nt o g e tf u s a n t st h a tc a nf e r m e n tu n c o o k e dr i c et op r o d u c ea l c o h 0 1 a n dt w os t r a i n sw e r e s e l e c t e dw h i c hw e r ea l c o h o lh i g h - y i e l ds t r a i na n dg l u c o a m y l a s eh i g h - y i e l ds t r a i n r a s p e c t i v e l y t h eo p t i m a lc o n d i t i o l i sf o rf o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o no ft h et w os t r a i n s w e r eo b t a i n e d af o s a n tw h i c hw a ss t e a d ya n dc a np r o d u c em o r ea l c o h o lt h a no t h e r f i l s a n t sb yf e r m e m i n gu n c o o k e dr i c ew a ss e l e c t e db ye l e e t r o f u s i o nw h i c ht h et w o s t r a i n s p r o t o p l a s t sw e a ef o r m e do nt h eo p t i m a lc o n d i t i o n st e s p e c t i v e l y a n dt h eo p t i m a l f e r m e n t a t i o np r o c e s sc o n d i t i o n so ft h ef u s a n tw e r eo b t a i n e db yo r t h o g o n a lt e s t 1 1 ” r e s u l t s ： 1 n el o g a r i t h m sp h r a s eo f s a c c h a r o m y o e sc e r e v 捃i a skw a s4 h l o h a n dt h ea l c o h o l d u r a t i o no f s a c c h a r o m y o e sc e r e v i s i a skw a s1 7 ( v v ) t h es a c c h a r o m y o e sc e r e v i s i a sk w a si n d u c e da tt h ed o s eo f0 4 k g y ”c ow h i c has t r a i nn a m e dk c - 4w a ss e l e c t e d t h e a l c o h o ly i e l do fk c - 4w a s8 6 ( v v ) b yf e r m e n t i n gu n c o o k e dr i c ea n dt h ey i e l dw a s h i 曲e rt h a no t h e rs t r a i n sa n dw a si m p r o v e d4 l t h a na l c o h o ly i e l do fs a c c h a r o m y o e s c e r e v 妇i a ska tt h es a m ec o n d i t i o n s t h ea 力垃w a si n d u c e da tt h ed o s eo f 0 6 k g y ”c o w h i c has t r a i nn a m e da c 6w a ss e l e c t e d t h ea c t i v i t yo fg l u c o a m y l a s ep r o d u c e db y a c 6w a s1 0 2 6 u ga n dt h eg l u c o a m y l a s ea c t i v i t yw a sh i g h e rt h a nw h i c hp r o d u c e db y t 1 1 eo t h e rs t r a i n s a n dt h eg l u c o a m y l a s ea c t i v i t yw a si m p r o v e d1 6 9 t h a nw h i c h p r o d u c e db y a n i g e ra tt h es a m ec o n d i t i o n s 2 t h eo p t i m a ls p o r u l a d o nc u l t u r em e d i u mo fk c - 4w a st h e1 s te u l t u r em e d i u m 1 1 1 e s p o r u l a t i o nr a t eo f k c - 4w a s7 8 3 4 w h e ni tw a sc u l t u r e do nt h ei s tc u l t u r cm e d i u m i t w a sp r o p i t i o u st ok c - 4p r o t o p l a s t st of o r i l la n dr e g e n e r a t ew h e ni t ss e e da g ew a s8 ha n d i tw a sn o tp r e t r e a t m e n t e db y 3 - m e r c a p t o e t h a n o la n do nt h ec o n d i t i o no f0 8 m o b r l m a n n i t 0 1 o nt h eo p c l m a lc o n d i t i o i l s ( o 8 m 0 1 lm a n n i t o l ，2 s n a i l a s e ，e t i z y m o l y s i s t e m p e r a t u r e3 0 e n z y m o l y s i st i m e l 5 h ) t h ef o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o nr a t eo fk c - 4 p r o t o p l a s t sw a s7 9 6 a n d2 7 1 r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a ls e e da g eo fa c - 6 s p r o t o p l a s t s r e g e n e r a t i o nw a s1 2 h o nt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ( 1 0 f i b i r ne n z y m e + o 5 s n a i l a s e + 0 5 l y s o z y m e ，e n z y m o l y s i st e m p e r a t u r e 3 0 。c ，e n z y m o l y s i s t i m e 3 h ) , t h e r e g e n e r a t i o nr a t eo f a c - 6p r o t o p l a s t sw a s3 9 2 3 t h ep r o t o p l a s t sf r o ma c 一6w e t ei n a c t i v a t e db yu v t h e nt h e yw e r ee l e c t r o f u s e dw i t h p r o t o p l a s t sf r o mk c - 4w i t haf r e q u e n c yo f1 m h za n da 矗e l ds t r e n g t ho f7 0 0 v c r n f u s i o n sw e r ei r r i a t e db yv o l t a g ep u l e s ( 1 0 k v c m ，5 0 9 sd u r a t i o n , 5p u l e s ) a p p l i e da t a ni n t e r v a lo f 5s e n c o n d s a n dt h ef u s i o nr a t ew a s1 6 l o o n ei n h e r i ts t a b i l i z e df u s a n t w a sa c q u i r e dn a l n e da k - 2 t h ea k 2c a nc u l t u r ew e l lw h e nt h et e m p e r a t u ew a s 3 0 ，p hw a s5 0 t h ea l c o h o ld u r a t i o no f a k 2w a s1 6 ( v v ) a n dl o g a r i t h m sp h r a s eo f a k 一2w a s1 2 h 2 4 h 4 i tw a sp r o p i t i o u st oa k 一2t 0f e r m e n tw h e nt h ec r u s h i n gd e g r e eo fr i c ew a s6 0m e s h a n dt h ei n o c u l a t i o nv o l u m ew a s1 0 b yo r t h o g o n a lt e s t ，t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o n 湖北工业大学硕士学位论文 p r o c e s sc o n d i t i o n so fa k - 2w e r eo b t a i n e d t h ea l c o h 0 1y i e l do fa k 2w a s7 4 ( v v ) w i t hs t a t i cf e r m e n t a t i o n ( m a t e r i a l ：w a t e r1 ：3 0 , t e m p e r a t u r e3 2 , t i m e s 3 5 d ，p h 4 o ) t h ei n h e r i to fa k - 2w a ss t a b i l i z e dw h i c hc a l lf e r m e n tu n c o o k e dr i c et op r o d u c e a l c o h o lw i t h o u tc o o k i n gm a t e r i a l s ，e l i m i n a t i n gt h ep u l p i n gp r o c e s so f t r a d i t i o n a la l c o h o l p r o d u c t i o np r o c e s st h a tc a n s a v ee u e r g y i th a ds t r o n ge c o n o m i ca n d p r a c t i c a lv a l u e k e y w o r d s ：p r o t o p l a s t ，e l c c t r o f u s i o n ，f u s a n t ，f e r m e n t a t i o no f r a ws t a r c h ，a l c o h o l i n 佩 l 主工案火淫 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：名而芳日期：川年月矿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名：考五芳 日期：翻年月妒日 指导教师签名： 日期：勿7 年 湖北工业大学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 酒精生产方法及其国内外发展状况 1 1 1 酒精生产方法 目前酒精生产的方法主要有微生物发酵法和化学合成法。微生物发酵法主要 是利用酿酒酵母发酵一些农副产品如玉米、薯类等发酵生产酒精。化学合成法是 利用炼焦炭、裂解石油的废气等为原料，经化学合成反应生成酒精。但是利用微 生物发酵法产酒精方法较简便且节约能量，我国有着丰富的农副产品资源，且微 生物发酵法已沿用了几千年，因此我国主要用微生物发酵法来产酒精。 微生物发酵法生产酒精的机理为“1 ：在密闭条件下酵母因细胞内酒化酶的作 用，可利用可发酵性的糖生成酒精与c 瓯然后通过细胞膜将酒精与c 0 2 排出体外。 整个发酵过程主要经历以下几阶段： 第一阶段：葡萄糖磷酸化，生成活泼的1 ，6 一二磷酸果糖。 葡萄糖在己糖激酶的催化下，由a t p 供给磷酸基，转化成6 一磷酸葡萄糖； 6 一磷酸葡萄糖在磷酸己糖异构酶的催化下，转变为6 一磷酸果糖； 6 - - 磷酸果糖在磷酸果糖激酶催化下，由a t p 供给磷酸基及能量，进一步磷 酸化，生成活泼的1 ，6 一二磷酸果糖； 第二阶段：1 ，6 一二磷酸果糖分裂为二分子磷酸丙糖。 1 ，6 一二磷酸果糖在醛缩酶催化下，分裂为磷酸二羟丙酮和3 一磷酸甘油醛； 磷酸二羟丙酮在磷酸丙糖异构酶催化下转换成3 - - 磷酸甘油醛； 第三阶段：3 一磷酸甘油醛经氧化( 脱氢) ，并磷酸化，生成1 ，3 一二磷酸甘 油，然后将高能磷酸键转移给a d p ，以生产a t p ，再经磷酸基变位和分子内重 排，又给出一个高能磷酸键，然后变成丙酮酸。 总反应式为：c 羽1 2 吼+ 2 n a d + 2 h 3 p 仉+ 2 a d p 一2 c h 3 c o c o o h + 2 n a d h z + 2 a t p 第四阶段：酒精生成，酵母菌在无氧条件下，将丙酮酸继续降解，产生乙醇。 在脱羧酶催化下，丙酮酸脱羧生成乙醛； 乙醛在乙醇脱氢酶及其辅酶( n a d h 。) 的催化下还原成乙醇； 因此由葡萄糖发酵生成乙醇的总反应式为：c 棚。o 。+ 2 a d p + 2 h s p 0 4 2 c h 3 c h ：o h + 2 c 0 2 + 2 a t p 湖北工业大学硕士学位论文 1 1 2 酒精工业国内外发展状况 将酒精混入汽油作汽车燃料始于第一次世界大战，1 9 2 1 年德国混用酒精已达 2 1 0 0 0 吨，在抗日战争和解放战争时期我国也曾将酒精作为燃料嘲。在二次世界大 战前，由于石油价格上涨，出现能源危机，酒精被作为汽油扩增剂进入燃料工业 引起了世界许多国家的普遍注意，特别是巴西和美国率先在机动车辆采用酒精和 汽油体积比为1 ：9 的混合燃料啪。 被用作燃料的酒精有两种：一种称变性燃料乙醇，将无水酒精按照一定的比 例加入汽油和柴油中，可提高汽油的辛烷值，使其燃烧更充分，提高城市空气的 质量，减少汽车废气中排放的二氧化碳、重金属、氮的氧化物等污染环境的物质伽。 因而，酒精作添加剂可起到增氧和抗爆的作用，替代有致癌作用的甲基叔丁基醚 ( 岍b e ) “。另一种是含水酒精，不需掺入到石油中，而直接用作于车用燃料。由于 乙醇无毒性，因而没有被利用完的乙醇可进行生物降解，明显降低了汽车废气的 排放，因而燃料酒精有绿色燃料之称嗍，可节省大量的石油，减轻对原油的依赖。 巴西是世界上第一个推出国家酒精计划的国家，也是目前世界上年产燃料酒 精最多的国家。巴西主要以甘蔗及糖蜜为原料制取燃料酒精，年产量达1 1 0 0 万吨。 1 9 7 5 年，巴西开发的燃料酒精获得成功：1 9 7 9 年，首辆以含水酒精为燃料的酒精 汽车问世；1 9 9 9 年，巴西新一代酒精汽车诞生。 1 9 世纪初期，利用玉米原料产酒精的技术被传入美国，1 9 世纪末与2 0 世纪初 交替期，在当时福特公司的支持下酒精被用作燃料，而直到2 0 世纪3 0 年代酒精作 为燃料才被好好的利用。1 。目前，美国是世界第二大酒精生产国，其中8 0 为燃料 酒精。美国先前主要以玉米，马铃薯淀粉植物资源为原料生产燃料酒精，现在逐 步利用了木材废料、禾草甚至城市的固体废物来生产燃料酒精，这样有利于充分 利用资源变废为宝。1 9 7 9 年，全美燃料酒精生产产量约3 万吨；8 0 年代由于生产技 术的发展提高使燃料酒精年产量达蛰 2 6 5 万吨；9 0 年代美国政府加大对乙醇作为燃 料酒精的补贴政策，使燃料酒精生产企业及规模不断增加塑j 5 4 0 万吨，2 0 0 3 年达到 1 0 6 0 万吨。而且，如美国全面禁用m t b e ，至r j 2 0 1 0 年有望达n 1 2 5 0 万吨。一。 9 0 年代后，燃料酒精的生产和应用在加拿大及部分欧洲、亚洲国家得到一定 发展。日本于1 9 8 3 年开始实施燃料酒精开发计划，目前日本是世界上最大汽油消 费国之一，为减少石油的消耗，日本每年从国外进口1 4 万吨1 7 万吨的酒精。印 度也是原油进口大国，因此印度政府也在努力部署开发燃料酒精，主要是以粉碎 和发酵甘蔗废料生产酒精，生产能力约为2 0 0 万吨。法国年产酒精6 0 万吨，是欧盟 国家中产酒精最多的国家，其主要是以甜菜为原料生产酒精。加拿大每年产酒精 2 湖北工业大学硕士学位论文 4 5 9 i 吨，3 0 用于燃料，其它主要用于香水、化妆品和外用药等。澳大利对燃料 酒精工业发展的计划是至u 2 0 1 0 年，年产酒精3 5 万吨”。 1 9 9 8 年n k s r e e 等采用固体底物发酵法从不同的淀粉质原料中发酵得到了高 产量酒精，该法对于热带缺水地区来说是一种产酒精的好方法o 。同年印度学者 b gp a t i l 等在传统发酵蔗糖蜜产酒精的工艺中加入了罗望子，试验结果表明该物 质有提高了酒精产量n 1 3 。2 0 0 0 年，j i nf u j i t a 等人研究发现在酵母发酵产酒精加 入曲霉，其所产的植酸酶( p h yi ，p h y i i ) 有利于酵母对无机磷酸盐的吸收，从而 提高酒精的产量，并且当p h yi 与p h y 的量为1 ：3 更有利于代谢产物的提高“。 c a r v a l h o 和c a r o l i n em a k i 等人分别报道了利用重组的e s c h e r i c h i ac o l ik 0 1 1 来 发酵甘蔗渣及玉米质原料产酒精，均取得了较为理想的结果“”1 。d pb a y r o c k 等研 究了超高浓度连续发酵法产酒精，实验结果表明该法有利于提高酒精的浓度，并 且减少由微生物带来的污染，使酒精生产成本降低m 1 。k s u r e s h 等以墨c e r e v i s i a e 为出发菌株利用淀粉含量为2 5 的小麦进行生料发酵，在3 5 下，p h 为5 8 条件下 发酵4 天酒精产量为5 6 ( v v ) “”。 我国的酒精工业始于1 9 0 0 年黑龙江哈尔滨市，但发展较缓慢，到1 9 4 9 年全国 酒精总产量不n 1 万吨，但自从新中国成立后，酒精产量得到了飞速的发展，原始 发酵酒精年产量为4 5 0 万吨5 0 0 万吨“。2 0 0 0 年我国政府实施了燃料酒精的规划： 从2 0 0 2 年起，在黑龙江、吉林、河南、安徽部分地区开展“汽油醇”试点。于2 0 0 3 年组建了4 个大型燃料酒精生产厂：年产量3 0 万吨的吉林燃料乙醇有限责任公司， 年产量3 0 万吨的河南天冠集团，年产量3 2 万吨的安徽丰原生物化学股份有限公司 和年产量1 0 万吨的黑龙江华润酒精有限公司。我国8 0 左右的酒精生产是以玉米， 小麦，高梁薯类等为原料。经过试点实验，我国汽油醇计划已经取得初步成功， 现全国有8 个省开始使用燃料酒精，燃料酒精替代石油已成趋势。 * 1 2 原生质体技术概况 原生质体研究始于1 9 世纪末，n 2 0 世纪五、六十年代酶制剂才开始被利用来 制备原生质体。w e i b u l l 等于1 9 5 3 年首次利用溶菌酶处理巨大芽苞杆菌得到了原生 质体，并首次提出原生质体的概念。2 0 世纪7 0 年代，原生质体较成熟的被应用于 工业微生物育种技术“”。 原生质体是指一般用酶学方法使细胞壁溶解后释放出来的只有半透性细胞质 膜包裹着的原生质部分，其形状随不同的菌种而异，有的呈球状有的呈类似球状， 它们虽然没有了细胞壁，但仍然具有和完整细胞基本相同的生理、生化和遗传特 湖北工业大学硕士学位论文 性，并在合适的条件下能再生细胞壁，回复成为一个完整的细胞“”。由于去壁的 原生质体与正常细胞相比，对外界环境的影响更加敏感，对诱变剂的诱变效应也 更强烈，因此，原生质体常被应用于再生育种，原生质体诱变育种，原生质体转 化育种，原生质体融合育种等。 1 3 细胞融合技术概况 细胞融合技术起源于2 0 世纪5 0 年代末，先应用于高等动植物，后被引进微生 物中，并在随后的几十年中得以迅速的发展“到。原生质体融合技术打破了物种 间细胞不能互相融合的障碍，原生质体进行融合时，两亲本整套基因组将接触， 随机发生各种染色体交换，产生各种基因组合的融合细胞，从而产生了各种基因 组合的重组体o “”。“嘲。原生质体融合分生物学方法，化学法和物理法。1 9 5 8 年o k a d a 发现并证明了紫外灭活仙台病毒( h v j ) 具有促融细胞的作用，随着生 物技术的不断发展，随后一些化学试剂被发现有促进原生质体融合的作用。1 9 7 4 年k a o 等，首次报道了聚乙二酵( p e g ) 能提高植物细胞原生质体融合率”1 。f e r e n e z y 首先证明p e g 对真菌细胞的促融作用嘲。主要被用着的化学融合剂有盐类物质、 p e g 、二甲亚砜脂质、c a “配合物等。而p e g 普遍被利用作融合剂，其融合机理是： p e g 具有脱水的作用，在原生质体融合过程中，它以分子桥形式在相邻原生质体膜 间起中介作用，导致质膜的流动性发生了改变，使原生质体膜表面势能降低，从 而使膜中的相嵌蛋白质颗粒凝聚，形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷酯双分 子层区，而c a ”的存在，使细胞膜表面的电子分布改变，从而使接触处的质膜形成 局部融合，出现凹陷，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两原生 质体全部融合叫，。 1 9 7 8 年，第三届工业微生物遗传学讨论会上，把原生质体融合作为一种新的 基因重组手段提出来，引起了全世界的关注。随后b a l t z ( 1 9 7 8 年) ；c o e t z e e ( 1 9 7 9 年) ：y a m a c h i t a ( 1 9 8 3 年) 等相继分别开展了其他多种微生物的种内、种间、属内 和属间原生质体融合的研究，使工业微生物原生质体融合技术逐渐形成了一个新 的实验体系啪o “捌。 物理融合法有电融合法，激光融合法等，而电融合法经过2 0 世纪7 0 年代的奠 定阶段和8 0 年代的初创之后，从1 9 8 4 年开始初步的被推广利用1 。其中细胞电融 合技术( e l e c t r o f u s i o nt e c h n i q u e ) 由s e n d a 等1 9 7 9 年首次报道胁1 ，并于2 0 世纪 8 0 年代中期发展起来的一种高效率融合技术。其发展主要经历了两个阶段：电细 胞融合仪的发明和细胞电融合的应用汹1 。1 9 8 2 年，z i m m e r m a n n 等研制出首台电细胞 4 湖北工业大学硕士学位论文 融合仪”1 。1 9 8 4 年起细胞电融合技术己步入广泛实用化阶段”“，二十世纪8 0 年代 中期以后，b a t e s ，t e m p e l a a r 等通过植物原生质体对z i m m e r m a n n 等研制的电细胞融 合仪进行了研究，得出诱导细胞融合的适宜电场参数，使原生质体的异种间融合 条件得到更加精确的控制。”。进a 9 0 年代后，一些学者在细胞电融合应用领域进 行了研究如有：1 9 9 1 年t s o n g 细胞电融合进行了研究；1 9 9 8 年，n a o t ou r a n o 等 对酵母原生质体电融合进行了研究嘲；2 0 0 2 年，c o r i n n er a m o s 等利用生物过滤的 方法对细胞电融合杂交技术进行了研究州。 化学融合中的融合剂对原生质体也具有一定的毒性，融合率较低，且不易控 制。而电融合技术的应用使细胞的融合率大大提高，电融合技术融合率高，残余 毒性小，可控性强，一次可处理大量原生质体，且操作简便、速度快、重复性好 等优点溉“】。 1 4 酿酒酵母细胞融合育种及其它育种研究状况 1 9 7 6 年，s i p i c z k i 和f e r e n z y 等首次成功的对酵母菌的原生质体融合进行了融 合”。随后t a m a k i 对酵母融合过程中未成活细胞的基因特性进行了研究；1 9 8 6 年， l e g n m n n 将蜂蜜酵母与酿酒酵母进行原生质体融合，所获得融合子在葡萄糖培养基 中产乙醇的速度分别是亲株的3 倍和7 倍。在我国，张博润等1 9 8 8 年对酵母菌进 行属问原生质体融合获得了能发酵乳糖生产酒精的融合体m 1 ；1 9 9 5 年，李桃生等通 过原生质体融合技术将二倍体酿酒酵母与单倍体糖化酵母构建成遗传上稳定的种 问三倍体融合杂种“”；同年，何秀良等利用原生质体融合技术构建出了高产酒精 酵母株，产酒精量为9 1 1 ( v v ) 嘲；1 9 9 5 年，王建玲等利用糖化酵母与耐 高温酒精酵母所构建融合子在加入4 0 糖化酶条件下发酵玉米淀粉产酒精率达 i i 3 ( v v ) h 刀。1 9 9 7 年，黎碧莲等对酿酒酵母和扣囊拟内孢霉属问原生质体融 合进行了研究，所得融合子能直接利用木薯粉液化物发酵，乙醇含量分别由亲本 的4 5 ( v v ) 和5 6 ( v v ) 提高到6 9 ( v v ) 和7 7 ( v v ) 嘲。2 0 0 0 年 庞小燕等以酒精酵母和热带假丝酵母为亲本，通过单亲灭活原生质体融合技术， 获得了既具有糖化酶活性又能高产酒精的稳定的酵母融合株，在加入微量糖化酶 的条件下其融合子直接发酵淀粉产酒精量达8 8 ( v v ) ，1 1 5 ( v v ) 。2 0 0 2 年孙君社得到了能在4 5 高温下发酵产乙醇量为7 2 8 ( v v ) 酵母融合子嘲。同 年，王婿进行酿酒酵母原生质体融合研究，所得融合子以葡萄糖为基质乙醇量达 7 9 ( v v ) 比亲本提高4 9 7 “。2 0 0 5 年，汪江波等进行了早籼稻谷生料发酵 生产酒精的工艺研究，在最佳条件下发酵酒分达n 9 3 ( v v ) m 1 。 湖北工业大学硕士学位论文 1 5 研究目的、意义 我国盛产的第一大粮食作物是水稻，其产量为1 8 亿吨2 0 亿吨，折合成大 米为1 2 8 亿吨1 4 亿吨，而全国年粮食食用消耗量约为1 3 5 亿吨。由于早籼米直 链淀粉含量较高，含硫化物低，糯性香气和精加工性能较差。外观和食用品质也 较差从而造成大量积压。因此利用早籼稻作为生产酒精的原料，是解决国内陈化 水稻库存积压严重的重要途径旧剐。 而随着我国产油能力下降，石油价格不断上涨，目前国内市场对石油的需求 量猛增，使得我国汽油供应将面临非常严峻的局面，因而，燃料酒精作为国家战 略部署的新型能源之一，在我国具有广阔的市场前景。因此，“石油危机”一旦 发生，燃料酒精将会是其很好的替代品。 酿酒酵母不含有淀粉酶基因，不能直接利用生淀粉生产酒精。因此可以利用 基因重组的方法，把糖化酶的基因引入酿酒酵母构建能直接利用生淀粉的酵母工 程菌，消除传统酒精生产工艺中的液化和糖化过程，从而可以简化工艺，降低能 量的消耗从而节约成本，对酒精发酵工艺用着十分重要的经济意义。由于融合子 含有两亲本的遗传特性，因此原生质体融合作为基因重组方法中的一种，具有高 频重组性，受到国内外生物界学者的极大重视o “删。要取得融合的成功，首先要 形成大量的原生质体，才能使原生质高频率地再生。然而原生质体融合技术关 键是要获得再生活性较高的原生质体，因此制备高活性原生质体成了该研究的核 心。酵母菌育种在原生质体融合技术中，其优良性能的整合方面的优越性得到了 显示嘲。 1 6 研究内容及方法 利用酒精生产常用菌k 氏酵母( 妇c 幽酃阳酗c e r e v i s i a sd 及常用的产 糖化酶菌黑曲霉a s 3 4 3 0 9 ( 彳n i g e r ) 先分别经紫外及气。一y 射线诱变筛选出高 产菌株，且摸索出酒精高产菌株及糖化酶高产菌株原生质体形成与再生的优化条 件。将在优化条件下制备得到地的两亲株原生质体利用电融合法进行融合，并摸 索出电融合法的优化条件，检出融合子带有两亲株特性既能直接利用生淀粉 且高产酒精的融合子，且该融合子遗传性能稳定。并对其进行特性及其生料发酵产 酒精工艺条件实验，摸索出融合予的生料发酵优化工艺条件。 6 湖北工业大学硕士学位论文 2 1 前言 第2 章菌种筛选 从自然界中得到的工业微生物菌种，由于其目的代谢产物产量较低而很少直 接被用于工业生产。因此，从自然界筛选出来的菌种一般都需经过人工诱变，从 而来提高其代谢物的产量。诱变育种是在人工诱变基因突变为基础，通过诱变可 以得到高产菌株常用的诱变方法。 诱变育种培育出的优良新品种直接应用生产上，同时通过诱变可创造出具有 特点的新突变体，扩大亲本的遗传基础，而间接应用于培育新品种。人工诱变 育种的方式法主要有：物理诱变、化学诱变和生物诱变。其中物理诱变因其简单 实用、效果明显而得到了广泛的应用咖，化学诱变和生物诱变对人体存在较大的 危害，而紫外诱变实验条件易得、简单方便，因而本试验在具备实验条件的基础 上，分别利用紫外诱线和”c o y 源作为诱变剂，而分别摸索出紫外线照射与弋。 一y 辐射技术诱变出发菌株可能会取得理想的结果。物理诱变其主要是由高能辐 射导致生物系统损伤，从而引发生物体基因突变和染色体畸变导致微生物发生诱 变4 “。 2 2 实验材料 2 2 1 菌种 k 氏酵母( s a c c h a r o m y o e sc e r e v i s i a s 肋，来源于湖北工业大学微生物菌种 保藏室。 黑曲霉a s 3 4 3 0 9 ( 爿n i g e r ) ，来源于中国科学院微生物研究所。 2 2 2 主要仪器 单面双入无菌操作台 光学显微镜 恒温摇床 电热恒温水浴锅 台式离心机 s w c j i f x s 一2 1 2 2 0 2 h q 4 5 b g s y l l t c l 一1 6 c 7 苏州净化有限公司 南京江南光电集团股份有限公司 中国科学院武汉科技仪器厂 北京医疗设备厂 a n k e ( 上海安亭科学仪器制造厂) 湖北工业大学硕士学位论文 玻璃仪器气流烘干器c 型郑州成城工贸有限公司 手提式压力灭菌锅y x q s g 4 1 2 8 0上海华代医用核子仪器有限公司 光照培养箱2 0 0 2 一1 1国华企业 电子天平 电子天平 可见分光光度计 微量移液器 2 2 3 主要药品 药品名称 c a c l 2 琼脂粉 葡萄糖 可溶性淀粉 ( 4 ) ：s 瓯 m 9 2 s o , 7 h 2 0 k h 2 p o 。 n a c l h c i 乙醇 酒石酸钾钠 冰乙酸 乙酸钠 次甲基蓝 亚铁氰化钾 硫酸铜 酵母浸膏 2 2 4 主要溶液 b l 一2 2 0 h a r d 一1 l o 7 2 2 s 型 s h i m a d 2 yc o r p 0 兄a t l 0 n o h a u sc o r p p i n e 上海精密科学仪器有限公司 上海市求精生化试剂仪器有限公司 生产单位 天津市福晨化学试剂厂 广东环凯生物科技公司 广东光华化学有限公司 天津市福诚化学试剂厂 天津市福诚化学试剂厂 成都化学试剂厂 上海试一化学试剂有限公司 上海试剂一厂 上海试一化学试剂有限公司 上海振兴化工一厂 天津市博迪化工有限公司 天津市博迪化工有限公司 天津市科密欧化学试剂开发中心 上海三爱思试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海科昌精细化学品公司 北京双旋微生物培养基制药厂 ( 1 ) 费林试剂： a 液：称取1 5 o g c u s o , 5 h 。0 ，0 0 5 9 次甲基蓝，溶于水，稀释至1 l 。 b 液：称取5 0 o g 酒石酸钾钠，4 o g 亚铁氰化钾，溶于水，稀释至l l 。 ( 2 ) 0 1 标准葡萄糖液： 湖北工业大学硕士学位论文 准确称取预先在l o o 1 0 5 烘干的无水葡萄糖1 0 0 0 9 ( 精确到0 0 0 0 1 9 ) 溶解 于水，加5 m l 浓盐酸，定容至l l 。 ( 3 ) 2 m 乙酸溶液：量取1 1 8 m l 冰乙酸，加水稀释至l o o m l 。 ( 4 ) 2 m 乙酸钠溶液：称取2 7 2 9 乙酸钠( c 1 3 c o o n a 3 h 2 0 ) 用水溶解并稀释 至1 0 0 m l 。 “ ( 5 ) 0 1 n n a o h 溶液：称取0 4 9 n a o h 用水溶解并稀释至1 0 0 m 。 ( 6 ) 2 可溶性淀粉溶液配制 准确称取5 9 可溶性淀粉( 预先置干燥箱中于1 0 0 1 0 5 烘干) ，加少量水调匀， 倾入1 0 0 m 沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至2 5 0 m l 。 ( 7 ) 3 ，5 一二硝基水杨酸溶液 称取6 5 9 3 ，5 一二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1 0 0 0 m l 容量瓶中，加入 2 m o l 1 氢氧化钠溶液3 2 5 m l ，再加入4 5 9 丙三醇，摇匀，冷却后定容到1 0 0 0 m l 。 ( 8 ) 碘液配制m 习：碘片1 9 ，碘化钾2 9 ，蒸馏水3 0 0 r a l 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全部溶解后， 将余下的蒸馏水全加入。 2 2 5 培养基 ( 1 ) 马铃薯培养基( p d a ) ：马铃薯( 市售) 2 0 0 9 ，水1 0 0 0 m l ，葡萄糖2 0 9 ， 琼脂1 5 9 2 0 9 ，p h 自然。 马铃薯去皮，切成小块煮沸3 0 m i n ，然后用六层纱布过滤，滤液中加葡萄糖与 琼脂，溶化后补足水至1 0 0 0 m 1 ( 2 ) 液体完全培养基y e p d ：蛋白胨1 ，酵母粉1 ，葡萄糖2 ，p h 自然。 ( 3 ) 固体完全培养基：y e p d + 2 琼脂。 ( 4 ) 淀粉选择培养基：可溶性淀粉3 0 ，酵母膏1 ，( n 也) ：s o , 0 2 ，k h ：p o , 0 0 5 ，琼脂2 ，其中可溶性淀粉在紫外灯下照射过夜，其它的成分在1 2 l 灭 菌2 0 分钟。 ( 5 ) 种子培养基：葡萄糖2 ；酵母膏l ；( n 吼) 2 s 仉0 1 3 ；m g s 仉7 h 2 0 0 0 1 ；c a c l j0 0 0 6 ；用h c l 调p h 到4 5 5 0 。 ( 6 ) t t c 下层培养基：葡萄糖l ，蛋白胨2 ，酵母浸膏1 5 ，酸性磷 酸钾1 o ，硫酸镁o 4 ，柠檬酸0 2 7 ，琼脂2 0 。 t t c 上层培养基：t t c0 0 5 ，葡萄糖0 5 ，琼脂1 5 。 ( 7 ) 黑曲霉发酵培养基：l o g 麸皮和l o m l 水。 ( 8 ) 酵母发酵培养基：早籼米经粉碎过4 0 目筛子，取3 0 9 ，2 1 9 0 m l 水，用酸 9 湖北工业大学硕士学位论文 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 曼暑! ! ! ! i i = = ：i ! 鼍! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 调p h 为4 0 。 以上培养基除淀粉选择性培养基及酵母发酵培养基外，其它培养基均在11 5 灭菌3 0 分钟。 2 。3 实验方法 2 3 1k 氏酵母生长曲线制备 将于4 斜面保藏的k 氏酵母转接于y e p d 液体培养基中，并予2 8 ，1 5 0 r m i n 条 件下振荡培养活化。 将配置好的y e p d 液体培养基，分装于1 0 只1 0 0 l i l l 三角瓶进行灭菌操作，用记号 笔分别标记培养时间，f l p o h 、2 h 、4 h 、6 h 、8 h 、l o h 、1 2 h 、1 4 h 、1 6 和1 8 h 。将上 述已活化k 氏酵母转入己灭菌并标记的l o 只1 0 0 m 1 三角瓶中。 将上述已经接种的三角瓶置于摇床上2 8 c 、1 5 0 r m i n 条件下振荡培养，分别 培养o h 、2 h 、4 h 、6 h 、8 h 、l o h 、1 2 h 、1 4 h 、1 6 h 和1 8 h ，在相应的时间取出标有对 应时间的三角瓶并利用吸管吸出菌悬液，按照十倍稀释法用生理盐水稀释两个梯 度，将稀释液于紫外分光光度计在6 6 0 n m 条件下( 比色皿的厚度为l c m ) 测定o d 值，其中以y e p d 液体培养基稀释相应的梯度作为空白对照，以o d 值为纵坐标、 培养时间为横坐标绘制k 氏酵母生长曲线。 2 3 2k 氏酵母酒精耐受性实验 将k 氏酵母接种于液体y e p d 培养基中活化，取l m l 接种子含有不同酒精量的 液体y e p d 养基的三角瓶中，2 8 c 培养1 天，稀释到适当的梯度，并取0 1 m l 菌悬 液涂y e p d 平板上，2 8 培养2 天，观察菌落生长情况。 2 3