（微生物学专业论文）地衣芽孢杆菌抑真菌作用及相关基因的研究.pdf

南开大学硕士研究生学位论文 摘要 摘要 本文介绍了利用m u 转座重组技术对本课题组分离的、能抑制病原真菌生长 的遗衣芽孢杆菌n k y m 3 菌株进行的掷真菌作用及祖关基因的研究，特另q 探讨了 m u 转座复合物电转化地衣芽孢杆菌的最佳条件，为地衣芽孢杆菌抑真菌物质相 关基因的组织结构、生物功能和基因调控的研究奠定基础。m u 转座复合物是由 人工m u 转座子( 携带一个卡那霉素抗性基因) ，在体外与四聚体m u a 转座酶形 成，然后，电转化地衣芽孢杆菌的受体细胞，引起插入位点基因的失活和相应表 型的改变，经重组抗性和表型筛选，可以进一步探索未知的地衣芽孢杆菌抑真菌 物质相关基因。 本研究建立了完整的地衣芽孢杆菌抑真菌的检测方法，确立了指示真菌，用 蛋白酶k 消化地衣芽孢杆菌上清液，证明了抑真菌物质中含有蛋白质。探讨了 培养基中添加甘氨酸浓度、细胞的生长状态、电击电压、，质粒的质量浓度对地 衣芽孢卡f 菌电转化效率的影响，优化了地衣芽孢杆菌的最适电转化条件：用含 o 3 4 甘氨酸的m 9 y e 液体培养基于3 7 ( 2 培养细胞至对数早期( o d 6 0 0 = 0 5 左 右) ，制备浓度为1 0 儿个细胞毫升的感受态细胞，电击电压为1 s k y ，涂布于含 0 2 5 m 蔗糖、5 0 峙i i l l 卡那霉素的固体m 9 y e 培养基上，得到6 , 8 x 1 0 5 c f u 0 9 d n a ( 带有卡那霉素抗性标记的p n l 5 0 1 质粒) 的高转化效率，并在国际上首次 成功的将m u 转座复合物电转化入地衣芽孢秆菌中，用1 弘1l ：8 稀释的转座复 合物与5 0 眦感受态细胞混匀，电击电压为1 s k y ，得到的转化效率为3 1 0 2 c f u o gd n a 。这为我们迸一步研究地衣芽孢杆菌的抑真菌物质相关基因奠定 了基础。 对抑真菌效果增强的m u 转座复合物转化子0 3 0 0 1 进行基因克隆和d n a 序 列分析，得到编码地衣芽孢杆菌n k y m 3 菌株核糖体蛋白l 3 3 的r p m g 基因，该 基因是地衣芽孢杆菌n k y m 3 菌株抑真菌物质分泌及芽孢形成的相关基因。这不 仅为我们进一步研究地衣芽孢杆菌的功能基因组奠定了基础，同时，也为其他革 兰氏阳性细菌的功能基因组研究开拓了新路。 关键词：地衣芽孢杆菌抑真菌m u 转座复合物电转化r p m g 基因 v 南开大学硕士研究生学位论文 摘要 a b s t r a c t t oe x p l o r eac l u s t e ro fg e n e sr e l a t e dt o a n t i - p a t h o g e n i cf u n g ii ng e n o m e so f b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sn k y m 3s t r a i n ，a l le f f i c i e n ti n s e r t i o n a lm u t a g e n s i ss t r a t e g yw i t h m ut r a n s p o s i t i o nc o m p l e x e sw a sa p p l i e d m ut r a n s p o s i t i o nc o m p l e x e sa r ea s s e m b l e d i nv i t r ou s i n ga l la r t i f i c i a lk a n - m ut r a n s p o s o na n df o b i m o l e c u l e so fm u a t r a n s p o s a s e s ，t h e ne l e c t r o p o r a t e di n t ob 1 i c h e n i f o r m i sn k y m 3s t r a i n si s o l a t e di n0 1 1 1 l a b t h et r a l l s f o r m a n t sw i t har e s i s t a n c et ok a n a m y c i na n dap h e n o t y p ea g a i n s t p a t h o g e n i cf u n g a ls t r a i n sw e r es c r e e n e dt of u r t h e rf u n c t i o n a lg e n o m i ca n a l y s i s t o d e t e c tt h ea n t i f u n g a ls u b s t a n c e ，t h em e t h o da n dt h et i p i c a lp a t h o g e n i cf u n g is t r a i nw a s d e t e r m i n e d ，a n dap r o t e i nw a sp r o v e di nt h ea n t i f u n g a ls u b s t a n c ew i t hp r o t e o l y t i c e n z y m e kt r e a t m e n t 。t oo p t i m i z et h ec o n d i t i o no fe l e e t r o p o r a t i o ns e r i a lp a r a m e t e r s i n c l u d i n gg l y c i n ec o n c e n t r a t i o ni nm 9 - y em e d i u m ，g r o w t hs t a t eo ft h es t r a i 1 e l e c t r o s h o c kv o l a g ea n dp l a s m i dc o n c e n t r a t i o nw e r es t u d i e d 。t h ec e l lc u l t u r eg r o w n i nm 9 一y em e d i u mc o n t a i n i n g0 3 4 g l y c i n ea t3 7 * ( 2w a sh a r v e s t e da to d e o = 0 5 w a s h e da n dc o n c e n t r a t e dt o1 0 1 1c e u s m l1u1o fd i l u t e d ( 1 ：8 ) w a n s p o s i t i o n c o m p l e x e sw a se l e c t r o p o m t e di n t o5 0u1o fc o m p e t e n tc e l l s 砒t h ev o l t a g eo f1 8 k v t h et r a n s f o r m e dc e l l sw e r es p r e a do n t om 9 - y e a g a rp l a t e sc o n t a i n i n g0 , 2 5 ms u c a o s e a n d5 0u g n do fk a n a m y c i nf o rs e l e c t i o n t h ef r e q u e n c yo ft r a n s f o r m a t i o nw i t ha p l a s m i dp n l 5 0 1i su pt o6 8 x1 0 5c f u u gd n a a n dw i t hm uu 盈n p o s i t i o nc o m p l e x e s i su pt o3 l 酽c f u u gd n a t h i si st h ef i r s tt i m et or e p o r tt h a tm u c o m p o s i t i o n c o m p l e x e sw e r es u c c e s s f u l l ye l e c t r o p o r a t e di n t ob 1 i c h e n 洳嗍 sa to p t i m i z e d c o n d i t i o n i ti sav e r ye f f i c i e n ts t r a t e g y f o r 吐u d y i n gt h es t r u c t u r e ，f u n c t i o na n d r e g u l a t i o no fr e l a t i v eg e n e so fa n t i - p a t h o g e n i cf u n g ii n 丑l i e h e n i f o r m i ss t r a i n s t h e a n t i f u n g ia n ds p o r u l a t i o nr e l a t i v eg e n tr p m gw h i c he n c o d e st h er i b o s o m a lp r o t e i n l 3 3w a sf o u n di nt h ec l o n e da n da n a l y s i s e dt h e0 3 0 0 1t r a n s f o m l a n to fm u t r a n s p o s i t i o nc o m p l e x e s i ti sav e r ye f f i c i e n ts t r a t e g y 岛rs t u d y i n gf u n c t i o n a l g e n o m i c so f b 1 i c h e n i f o 删捃s t m i d sa n dc a l lb ea l s ow i d e l yu s e dt oa n a l y z ef u n c t i o n a l g e n o m i c so f o t h e rg r a m - p o s i t i v eb a c t e r i a v i 南开大学硕士研究生学位论文摘要 k e yw o r d s ：b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ，a n t i f u n g a l ，m ut r a n s p o s i t i o nc o m p l e x e s e l e c t r o p o r a t i o n ，r p m gg e n e ， v 南开大学硕士研究生学位论文 一前言 真菌与人类及其生存环境密切相关。人类可以利用真菌进行生物防治、生物 除污，真菌可以与高等植物、其他微生物和动物结成特化的、密切的互惠关系， 还能产生多种类型有商业价值的代谢物f l 】，如：真菌疏水蛋白【2 】，但真菌也无时 不在地危害着人类的生存环境，它能造成生物腐烂、植物病掣引、动物和人类疾 病、甚至中毒死亡，如何攻克真菌、降低其危害性【4 1 ，长期以来，众多国家的科 研人员进行了大量的研究，并相继进行了抗真菌制剂和药物的研发，如：农作物 化学杀菌剂、两性霉素b 等药物，但多数为纯化学制剂，价格较高，且会产生 一定豹毒副作用。近些年来，抗真菌基因工程的研究在不断发展，面且一直是世 界的研究热点之一f 5 ，6 ，- 。 1 芽孢杆菌抑真菌作用的研究 微生物中存在抑真菌物质f 3 1 ，目前已有十余种来自微生物的抗真菌代谢物制 成的抑菌药物，其中以芽孢杆菌为代表，具有广泛的抑真菌作用。 芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，细胞壁不含内毒素，多营腐生生活，菌体 具内生芽孢，抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单，它作为一个属，于1 8 7 2 年被首次提出，至今已有一百多年。由于芽孢杆菌和革兰氏阴性菌细胞的结构有 所不同，合成的某些蛋白能跨膜分泌到胞外，所以是一些重要工业酶制剂的生产 菌种。 芽孢杆菌一些种类可分泌产生胞外杆菌肽、大环内酯、环肽、类噬菌体颗粒 等f 几种抗菌活性物质f 8 】，如：枯草芽孢杆菌分泌蛋白的抑菌作用【9 】、环状芽孢 南开大学硕士研究生学位论文 杆菌几丁质酶的抑病原真菌作用 10 1 、蜡样芽孢杆菌对致病菌的生物拈抗作用 】、海洋生境芽孢杆菌胞外抗菌蛋白的抗菌作用【1 2 】等等，抗菌谱广泛，对很多 病原真菌、细菌均有较强的抑制作用。一些芽孢杆菌还能产生多种酶类和多糖， 对其他生物具有促进生长和激发产生免疫病害的功能【12 1 。许多芽孢杆菌常被用 来进行动、植物真菌、细菌病害的生物防治【3 , 1 3 - 2 6 】。 目前，国际和国内关于芽孢杆菌抑真菌物质的研究报道大部分主要集中在芽 孢杆菌的抑真菌物质的抑菌作用鉴定、抑菌效果的分析比较、有效成分的性质分 析及分离纯化方面，以及抑菌物质产生条件和田闻试验结果等f 2 7 4 3 1 。关于芽孢 杆菌产生抑菌效果机理方面的研究报道并不多，且多数为抑菌物质对病原菌菌体 造成的伤害程度、伤害部位及如何限制病原菌的生长。而对芽孢杆菌自身抑菌物 质的产生机理及其分子基础的研究报道极少( 7 ，4 4 ，4 5 1 。这就为我们研究芽孢杆菌抑 真菌物质的产生初理留下了很大的空间。 2 地衣芽孢杆菌抑真菌作用的研究 世界上第一株地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 分离自健康妇女阴道。 是迄今为止发现的唯一司以从人体分离到的需氧芽孢杆谣，同时也兼性厌氧。地 衣芽孢杆菌具有能大量地分泌胞外蛋白的特性【4 6 】，能向胞外分泌碱性蛋白酶( 是 加酶洗涤剂的主要添加剂之一，在丝绸、制革工业中也有广泛用途【4 7 ，4 8 】) 、能降 解天然纤维素的纤维素酶【4 9 】、n 淀粉酶【5 0 j 以及应用在植物病虫害生物防治中的 几丁质酶f 5 1 】等等。 地衣芽孢杆菌是益生菌，它可以用作药物( 整肠生) 治疗抗生素相关性腹泻 【5 2 ，并可以与人体肠道内其他正常菌群一起维持人体肠道的生态平衡【5 3 1 ，还可 2 南开大学硕士研究生学位论文 以大量用作兽药或饲料添加剂【5 4 1 。 虽然在以往的报道中，地衣芽孢杆菌可向胞外分泌抑真菌肽【5 5 1 、几丁质酶， 并应用在植物病虫害的生物防治中【5 1 1 ，但筛选地衣芽孢杆菌的抑真菌物质基因 在国际和国内尚未见报道，目前尚无地衣芽孢杆菌抑真菌物质的产生机理及基因 定位、筛选并令其高效表达的报道。 因本课题组已分离到能抑制植物病原真菌生长的地衣芽孢杆菌n k y m 3 菌株， 所以，本文选择以地衣芽孢杆菌抑真菌物质为研究重点，旨在发现拥有自主知识 产权的新抑真菌物质的相关基因。 3 。地衣芽孢枵蓖基因及基因工程的研究现状 在目前已经完成的全基因组测序的2 0 多种微生物中，不包括地衣芽孢杆菌， g e n b a n k 中仅有地衣芽孢杆菌质粒p f l 5 ( 2 0 0 4 年1 月完成) 和p f l 7 ( 2 0 0 3 年 1 2 月完成) 核酸序列的最新记录。 目前，关于芽孢杆菌遗传和生物技术的国际会议每两年举行一次，可见国际 上这方面研究工作的规模。迄今为止，国内外学者对地衣芽孢杆菌基因及基因工 程的研究主要集中在三个方面：( 1 ) 对某些地衣芽孢杆菌中存在的有抗性标记的 质粒进行d n a 测序后，改造、构建成基因工程表达载体1 5 6 1 。( 2 ) 利用已经测序 的枯草芽孢杆菌全序列和曾经报道过的一些地衣芽孢杆菌菌株的某些功能基因 序列，运用成熟的p c r 技术、杂交技术等实验手段，对某些特定地衣芽孢杆菌 菌株的碱性蛋白酶基因、谷氨酸脱氢酶基因、纤维素酶基因、天门冬氨酸激酶基 因、n 一淀粉酶基因等娜“”进行克隆、d n a 序列同源性分析，并进一步在大肠杆 菌中实现表达，从而运用于生产实践。( 3 ) 因地衣芽孢杆菌具有能向胞外分泌蛋 南开大学硕士研究生学位论文 白的特点，不少学者将其作为基因工程的宿主表达系统，对编码a 蛋白、绿色荧 光蛋白( g f p ) 等的外源基因进行表达魄- 6 。 尽管自然界存在具有抑真菌功能的地衣芽孢杆菌菌株，但目前在国际和国内 尚未见有关地衣芽孢杆菌抑真菌物质基因的报道。 4 - u 转座重组技术的应用 m u 转座重组技术是近两年发展起来的，以m u 噬菌体为基础，人工组建的 转座重组系统【6 4 1 ，它已作为高效的体外插入突变系统和体外组装、体内插入重 组系统，广泛应用于d n a 序列分析，质粒d n a 和病毒基因组的功能分析，多 种细菌基因组和功能基因组分析【6 4 - 6 6 1 。 人工m u 转座予是由m u 两端的反向重复序列、中间携带一个抗性基因( 本 实验采用的m u 转座子为卡那霉素抗性基因，用于筛选重组子) 丽形成的，它在 体外与四聚体m u a 转座酶形成转座复合物，通过电转化将复合物导入受体细胞 中，在受体细胞内的镁离子的作用下，转座子d n a 随机地插入到受体菌基因组 中，引起插入位点基因的失活和相应表型的改变f 6 4 】。 与过去许多转座子工具不同的是，m u 转座子体外组装、体内重组系统中的 m u 转座予d n a 不编码转座酶，它是在体外与纯化的m u 转座酶形成复合物， 在通过电转化进入芽孢杆菌的感受态细胞，进而与受体菌d n a 发生重组。这样 在外源转座酶很快被降解而又无新的转座酶产生的情况下，就保证了转座子插入 的单一性以及避免了转座子在基因组上的迁移瞰】。 本研究首次应用m u 转座子体外组装、体内重组系统，以地衣芽孢杆菌的抑 真菌物质为研究重点，发掘地衣芽孢杆菌中抑真菌物质的产生机制。即；以抑真 4 南开大学硕士研究生学位论文 菌特性为功能选择标记，以m u 转座子上的抗性标记( 卡那霉素) 为筛选标记， 在体外，m u 转座子d n a 与四聚体m u a 转座酶形成转座复合物，然后通过电转 化将复合物导入产抑真菌物质的地衣芽孢杆菌受体细胞内，在受体细胞内的镁离 子的作用下，转座子d n a 随机地插入地衣芽孢杆菌基因组中。一次m u 转座复 合物的电转化，可产生一定数量的具有不同插入位点的克隆予。经过抗性标记和 抑真菌功能标记的双重筛选，含有m u 转座子插入的基因片段被克隆到质粒载体 p u c l 8 中，利用转座子两端人工合成的互补引物和p u c l 8 上的引物，进行p c r 定位和d n a 序列分析，找出未知的与抑真菌功能相关的基因群。我们用这种技 术可以进一步直接而有效地对地衣芽孢杆菌揶真菌物质相关基因的组织结构、生 物功能和基因调控进行深入的研究。 5 电转化方法的应用 电穿孔转化( e l c c t r o p o r a t i o n ) 简称电转化，是近年来快速发展起来的用于 d n a 转化动植物和微生物细胞的简便而有效的遗传学方法。1 9 8 8 年，d o w e r 等 人证明e c o l i 在电穿孔转化的条件下可以得到极高的转化率。利用质粒p u c l 8 和p b r 3 2 2 对k c o l i l e 3 9 2 和d h 5a 进行电穿孔转化，转化率高达 1 0 9 1 0 1 0 c f u i _ t g d n a , 他们第一次系统地总结了利用电穿孔对细菌进行转化的方 法，并对诸多的影响因素，如电场强度、脉冲时闻、电穿孔前后细胞的处理进行 t 分析 6 7 1 。近年来电转化技术已用于许多实验材料( 动物、植物、真菌、细菌 等) 的遗传转化研究，由于所需设备简单，研究比较方便、省时，现已被公认为 原核细胞中进行基因转移的最有效手段。 应用电转化技术首先要考虑宿主细胞感受态的形成能力，对于e c o l i 为宿 南开大学硕士研究生学位论文 主细胞，经过c a c h 处理以后可以使e c o l i 获得较好的感受态性能，而对于革兰 氏阳性菌如：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌要使其经过特殊处理得到较好的感受 态性能并非易事，目前有关机理还知道得很少【6 8 1 。有学者以枯草芽孢杆菌为宿 主制备成感受态细胞，并成功地进行了转化，但转化效率很低【6 9 ，7 0 1 。 目前，细菌感受态产生的机制有两种假说：一是局部原生质化假说，现象是 发芽的芽孢杆菌相对于营养体更加容易转化，二是酶受体假说，现象是枯草杆菌、 链球菌、肺炎双球菌中都分离到相对分子量为5 0 0 0 - 1 0 0 0 0 的感受态因子【7 1 1 。最 新对转化机制的研究认为，革兰氏阳性菌中首先产生感受态因子，双链d n a 吸 附于细胞壁后，单链d n a 进入细胞，细胞中特定的蛋白质包裹住外源d n a 防 止被降解，最居重组产生稳定的分子。而革兰氏阴性蔼来发现感受态因子，且外 源d n a 是以双链形式进入细胞的。 本研究以地衣芽孢杆菌的抑真菌特性为功能选择标记，利用m u 转座重组系 统的一次m u 转座复合物的屯转化，可产生一定数量具有不同插入位点的克隆子 的优点，可以直接有效地筛选出因基因插入突变而造成抑真菌功能丧失或增强的 所有重组子，经p c r 检测，对与抑真菌物质基因相关的基因片段进行克隆和序 列分析找到与抑真菌功能相关的基因群。此技术是以生物功能为选择标记，简 单而快速地研究与功能相关的基因。所以，电转化的应用及锝到m a 转座复合物 对地衣芽孢杆菌的高转化效率是本研究能否顺利进行的前提条件。 在细菌中能够形成感受态的细胞是很少的，一般认为0 1 - 1 而且细菌处 于感受态是短暂的，枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等是这类菌，一般认为感受态是在 细菌生长对数后期产生的。国内不少学者成功完成了质粒对地衣芽孢杆菌的电转 化，可是其转化效率都很难达到1 0 3 以上f 7 2 1 。有学者认为芽孢杆菌在营养缺乏 6 南开大学硕士研究生学位论文 的饥饿状态下。细胞易产生感受态因子，处生长芽孢时期的芽孢杆菌更容易产生 感受态【7 引，并根据上述原则进行探索，得到了比常规方法处理的地衣芽孢杆菌 的转化率提高了1 3 倍的新的最高转化效率【7 4 1 ，但该方法远远不能满足本研究所 需的电转化效率。因此，筛选、优化、提高地衣芽孢杆菌的电转化效率是本研究 前期工作的重中之重。 6 本研究的目的、内容和意义 本研究首次应用m u 转座子体外组装、体内重组系统，以地衣芽孢杆菌的抑 真菌物质为研究重点，发掘地衣芽孢杆菌中新的抑真菌物质基因，并通过基因克 隆、d n a 序列和功能基因组分析，揭示地衣芽孢杆菌中抑真菌物质的产生机制， 为今后对能应用于农业生产及临床治疗的抗真菌生物制剂和药物进行深入研发、 实现产业化，创造社会和经济效益提供良好的理论依据。 具体地讲：目前，本项目组己筛选出能抑制植物病原真菌的地衣芽孢杆菌 n k y m 3 菌株，应用m u 转座子体外组装、体内重组技术，通过电转化将复合物 导入该菌株的受体细胞中，一次m u 转座复合物的电转化，产生一定数量的具有 不同插入位点的克隆子，经过抑真菌特性的筛选和表型检测，p c r 进行基因定 位，相关基因克隆、d n a 序列分析和功能基因组分析，找出与抑真菌功能相关 的基因群，揭示芽孢杆菌抑真菌物质的产生机制。再通过相关基因的表达，得到 高效生产抑真菌物质的工程菌株，为进一步实现抑真菌物质的应用和产业化奠定 基础。 本研究首次对地衣芽孢杆菌进行抑真菌物质相关基因的克隆、表达和分析， 可能发现具有自主知识产权的新抑真菌物质基因。而且，m u 转座子体外组装、 7 南开大学硕士研究生学位论文 体内重组技术的应用也将在基因组分析和功能基因组分析方面带来新的技术革 命。 本文的研究内容和研究目标尚属首创，旨在发现并拥有具有自主知识产权的 地衣芽孢杆菌的新抑真菌物质基因。由于抑真菌基因工程的研究一直是世界上的 研究热点之一，若今后能在此研究成果的基础上继续研发出抑真菌的生物制剂和 药物，必将大大有益于农作物产量、质量的提高，有益于人类的健康，并产生极 火的经济和社会效益。 南，f 大学硕士研究生学位论文 材料与方法 = 材料与方法 1 材料： 1 1 菌种l ( 1 ) 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) n k y m 3 菌株为本项 目组杨文博老师分离所得： ( 2 ) 匍枝根霉( r h i z o p u ss t o l o n i f e r ) 、茄病镰刀病( f u s a r i u m s o l a n i ) 、灰葡萄孢霉( b o t r y t i sc i n e r e a ) 由天津市植保所王 勇老师惠赠。 ( 3 ) 尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u ms c h l e e h t ) 由天津市 黄瓜研究所李淑菊老师惠赠。 ( 4 ) 大肠杆菌d h i o b 为芬兰赫尔辛基大学s a r i l a h t i 博士惠赠。 1 2 质粒l ( 1 ) p n l 5 0 1 能在枯草芽孢杆菌中稳定遗传，具有卡那霉素抗性 标记。由南开大学生命科学学院陈启民教授惠赠。 ( 2 ) p u c l 8 为本实验室保存所有。 1 3m u 转座复合物l 为芬兰赫尔辛基大学s a r i l a h t i 博士惠赠。 1 4 试剂：卡那霉素标准品购自北京生物制品鉴定所，胰蛋白胨、酵母提 取物为英国o x o i d 公司产品，d n a 分子量标准 d n a h i n d i i i 、 限制性内切酶丹红、s a c i 、r n a 酶、溶菌酶购自华美公司，分 子量标准d l 2 0 0 0 、d n t p 、t a x i 酶、c l a p 为宝生物公司产品， 甘氨酸为华美公司产品，n a 2 h p 0 4 为国产优级纯，其他试剂均 为国产分析纯。 1 5 引物及序列： m u - k a m p l5 + 3 g c c g c t 9 8 t c a t c t a g a g a 南f 大学硕士研究生学位论文 材料与方法 m u k a m p 25 7 3 7 t c c c a c c a g c t t a t a t a c c t a m 4 2 p 15 7 3 g c a a c t g t c c a t a c t c t g a a m 4 2 p 25 一3 c g c t g g g t t t a t c g t c g a 均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1 6 溶液： 1 6 1 电转化所用溶液： e p 溶液：o 。6 2 5 m o l l 蔗糖 1m m o f lm g c h 1 0 x m 9 盐( 1 l ) ：n a 2 h p 0 46 0 克k i - 1 2 p 0 43 0 克 n a c l 5 克n h 4 c l1 0 克 2 0 葡萄糖母液 l m o f lm g s 0 4 母液 l m o f lc a c l 2 母液 1 0 甘氨酸母液 2 5 0m m o l lk c l 2 m o l l m 9 0 2 1 0 甘油 l m o f l 葡萄糖 1 ，6 2 质粒及总o n 提取所用溶液： l m o u lt r i s - c l ( p h 8 o ) 母液 0 5 m 0 1 le d t a ( o h 8 0 ) 母液 溶液1 ：5 0 m m o f l 葡萄糖2 5 m mt r i s c 11 0 m m o l f le d t a 高压灭菌1 5 分钟，贮存4 。c 冰箱中 溶液2 ：1 s d s 0 2 m o f ln a 0 h 临用再由浓贮液配成 溶液3 ：5 m o f l 乙酸钾6 0 m l 冰乙酸1 1 5 m l 水2 8 5 m l t a e ： 使用液浓贮液( 每升) l ：0 0 4 m o f lt r i s 一乙酸5 0 ：2 4 2 9 t r i s 碱 0 0 0 1 m o f le d t a 5 7 1 m l 冰乙酸 1 0 0 m l0 5 m o f le d t a ( p h 8 0 ) l o 南，f 大学硕士研究生学位论文材料与方法 5 m o 儿n a c l 母液 t e n5 0 0 r t a r 帕l l t r i s d ( p h 8 o ) 5 0 m m o l le d t a ( p u s o ) 5 0 n a n o l ln a c l s t e ：1 0 n u n o l l t r i s - c l ( p r i g o ) l l le d t a ( p h 8 0 1 0 1 n l m 0 1 ln a c l 2 s d s 3 m o f ln a a c 裂解缓冲液；2 0 m m o l lt r i s - c l ( p h 8 。0 ) 1 0 m m o l le d t a ( p u s 们 2 0 蔗糖 1 0 0 r a m o l ln a c l 溶菌酶5 0 m g m l 贮存温度2 0 屯 r n a 酶1 0m g r l l l 贮存温度2 0 。c 1 6 3 抑真菌实验所用溶液； 蛋白酶k2 0 m g m l 贮存温度- 2 0 蛋白酶k 缓冲液：0 0 1 m o l lt r i s ( p h 7 8 ) 0 0 0 5 m o 】le d t a 8 7 甘油 吐温6 0 缓冲液：1 0 0 m 水+ 数滴吐温6 0 5 n a c 母液 1 6 4 抗生素： 卡那霉素贮存液： 5 0 m g m l 氨苄青霉素贮存液：1 0 0 m g m l 1 6 5 芽孢染色所用溶液： 甫j f 大学硕士研究生学位论文 材料与方法 7 6 饱和孔雀绿液 0 5 蕃红染液 1 7 培养基； m 9 y e 液体培养基( 1 l ) ：酵母提取物3 克 酸水解干酪素1 0 克 1 0 x m 9 盐溶液 1 0 0 1 l 2 0 葡萄糖溶液 1 0 础 m g s 0 4 2n m l o l l c a c l 20 1n m m f l m 9 - y e 固体培养基：在m 9 y e 液体培养基中加0 2 5 m o l l 蔗糖和1 5 琼脂粉，在需要时加入5 0u g n 1 1 的卡那霉素。 l b 培养基( l ) ：胰化蛋白胨2 0 克 酵母提取物5 克 n a c l0 5 克 p h 值调至7 0 在液体培养基中加1 5 的琼脂粉即为固体培养基， 液体、固体培养基在需要时加入适量的卡那霉素。 s o b 培养基( l ) ：胰化蛋白胨2 0 克 酵母提取物5 克 n a c l0 5 克 溶解后加1 0 m l2 5 0m m o f lk c l ，p h 值调至7 0 ， 使用前加5 m l 灭菌的2m o v lm g c l 2 。 ( 固体培养基中加入2 0r r m a o f l 的m g s 0 4 _ 乖f l1 5 的琼脂粉) s o c 培养基( l ) ：s o b 培养基冷至6 04 c 或6 0 c 以下时，加2 0 m l 除菌 的l m o f l 葡萄糖溶液。 g y t 培养基：1 0 甘油 0 1 2 5 酵母提取物 1 2 南，f 大学硕士研究生学位论文材料与方法 0 2 5 胰化蛋白胨 0 2 2 u r n 滤器过滤除菌 土豆培养基：土豆汁2 0 蔗糖2 琼脂1 7 ( 固体培基) 1 8 仪器： m i c r op l u s e r 电转化仪为b i o - p a d 公司产品 高速冷冻离心机为日立公司产品 d x w l 电泳仪由北京生化仪器厂生产 7 5 2 分光光度计由上海分析仪器厂生产 p c r 仪由美国g e n e 公司生产 1 9 一般器材：离心管( 5 0 m l 、1 5 m l 、0 5 m 1 ) 、摇床、温箱、锥形瓶 ( 2 5 0 m l 、1 5 0 1 1 、1 0 0 m 1 ) 、接种针、水浴锅、移液器( 四种规格卜5 m l 、1 0 0 1 - 1 0 0 0 i il ，2 0 i l1 - 2 0 0 p1 ，2 0 “1 ) 、 试管( 1 5 m 1 ) 、平皿、涂菌棒、牛津杯、电转化杯、9 6 孔 酶标板。 2 实验方法： 2 1 有关抑真菌的实验方法： 2 1 1 抑真菌实验： ( 1 ) 试管中加入5 m l 液体土豆培养基接入病原真菌，3 0o c ，2 0 0 r p m 培养2 - 3 天。 ( 2 ) 向固体斜面试管中加入2 0 0 ul 菌液，并用接种针涂抹均匀，放入3 0 。c 温 箱培养至长出孢子。 ( 3 ) 用含t 5 甘油和0 5 n a c l 的吐温6 0 缓冲液冲洗孢子制成孢子悬液，分装 成小份于一2 0 。c 保存。 ( 4 ) a 土豆固体培基平板于3 0 。c 温箱倒置干燥过夜后，加入2 0 0ul 真菌孢子 悬液，用涂菌棒反复涂布均匀，将平板倒置于3 0 。c 温箱中培养孵化孢子3 5 小时后取出放40 | c 备用。 或b 将2 0 0i t1 真菌孢子悬液倒入冷却至5 0 。c 左右的2 0 m 土豆固体培养基 南，f 大学硕士研究生学位论文材料与方法 中，迅速混匀后，倒平板晗，凝固后将平板倒置于3 0 。c 温箱中培养孵化孢子 3 5 小时后取出，用打孔器在平板上打孔后“，放4 。c 备用。 ( 5 ) 用l b 液体培养基培养地衣芽孢杆菌单菌落，待菌o d 曲。值超过0 9 以后，直 接点样；或将培养液于r c 、1 0 0 0 0 r p $ 离心5 分钟，留上清液， 用o 2 2 u r n 滤器过滤除菌备用。 ( 6 ) 已灭菌的牛津杯，一端用火烧后放在长有真菌孢子的土豆固体培基平板上， 然后用移液器将已准备好的地衣芽孢杆菌菌液或无菌上清液3 0 0 u l 加入牛津 杯中。 ( 7 ) 将平板放入3 0 温箱中培养1 2 天后观察抑菌圈大小。 2 1 2 指示菌的筛选； 按照以上抑真菌的实验方法，随机选取以下四种植物致病真菌培养后，制 成孢子，并用地衣芽孢杆菌的无菌上清液分别进行抑真菌实验，根据实验结果 选择生长状态良好、生长速度较快、形成的抑菌圈较大、抑菌效果易于观察的 致病真菌作为本研究的指示菌( 见表1 ) 。 表1 用于本研究的4 种致病真菌 t a b l e1f o u rp a t h o g e n i cf u n g a ls t r a i n su s e di nt h e , e a r c h 植物致病真菌名称致植物病症 匍枝根霉( r h i z o p u s s t o l o n i f e r ) 草莓根霉软腐病( r h i z o p u s r o t ) 茄病镰刀病( f u s a r i u ms o l a n i )茄根腐病( e g g p l a m r o o tr o t ) 灰葡萄孢霉( b o t r y t i se i n e r e a )葡萄灰霉病( g r a p eg r e ym o l d ) 尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m黄瓜枯萎瘸( c u c u m b e r b l i g h t ) s e h l e e h t ) 2 1 3 抑真菌物质的初步鉴定方法： 为初步检测本研究所用地衣芽孢杆菌所分泌的抑真菌物质是否为含蛋白 质类的物质，平行做三组抑真菌实验，即分别用浓度为0 5 u g u l 、o 1 2 5 u g u l 、 0 0 3 3l j g u l 的蛋白酶k 于3 7 。c 、p h = 7 8 的t e 缓冲液中水解地衣芽孢杆菌无菌 南，f 大学硕士研究生学位论文材料与方法 上清液l 小时后，按照2 1 1 中所述的抑真菌实验方法点样，其他的对照点样 液分别为：地衣芽孢杆菌菌液，地衣芽孢杆菌无菌上清液( 以下简称上清液) ， t e 缓冲液( p h = 7 ，8 ，以下省略) ，上清+ t e 缓冲液，浓度分别为o 5 u 出01 2 5 u u l 、o 0 3 3 u g ，u l 的蛋白酶k 溶液，t e 缓冲液+ 浓度分别为o 5 u g u 1 、01 2 5 u g i j l 、o0 3 3 u g i j l 的蛋白酶k 溶液，上清+ 浓度分别为o 5 u i j l 、o 1 2 5 u g u l 、 0 0 3 3 u g t j l 的蛋白酶k 溶液。 2 2 有关地衣芽孢杆菌电转化的实验方法： 2 2 1 地衣芽孢杆菌部分生长曲线的测定： ( 1 ) 5 m l l b 液体培养基中接入地衣芽孢杆菌单菌落，3 0 。c2 0 0 r p m 过夜培养。 ( 2 ) 按1 ：1 0 0 稀释按入2 5 m lm 9 一y e 液体培基中，3 0 。c2 0 0 r p m 继续培养。 ( 3 ) 定时取样，监溪4 培养物的浓度，测菌液的o d l 6 0 0 值。 ( 4 ) 细胞将要进入对数生长期之后每隔1 5 分钟测一次菌液的值。 ( 5 ) 记录到细胞生长到平稳期后可停止记录，作图。 2 2 2 地衣芽孢杆菌m i c 的测定。 ( 1 ) 5 0 m g m l 的卡那霉素溶液和l b 液体培养基于1 5 m le p p e n d o r f 管中使卡 那霉素溶液终浓度为4 0 0 u g m l 。 ( 2 ) 卡那霉素溶液起始浓度为2 0 0 u g m 1 ，终浓度为0 3 9 u g m l ，用l b 液体 培基按对半稀释的方法对应加入无菌9 6 孔酶标板中( 1 一l o 孔) ，每孔1 0 0 u l ，同时加1 0 1 1 1 地衣芽孢杆菌菌液( 菌液制备：9 9 0 u l l b + 1 0 u l 过夜培 养菌液) 。1 l 孔为阳性对照( i o o u l l b + i o u i 地衣芽孢杆菌菌液) ，1 2 孔 为空白对照( 1 0 0 u i l b ) 。 ( 3 ) 将酶标板放入3 0 。c 温箱中孵育1 8 2 0 小时后，通过肉眼观察各孔内培养 基清亮程度来判断菌是否生长，无菌生长的最低浓度孔中的卡那霉素浓度 为卡那霉索对地衣芽孢杆菌的m i c ( u g m 1 ) 。 南，f 大学硕士研究生学位论文材料与方法 2 2 3 大量提取枯草芽孢杆菌p n l s 0 1 质粒的方法： o i ) 1 0 0 m 锥形瓶中加入2 5 m l 液体l b 培养基和1 0 9 l 卡那霉素( 5 0 m g m l ， 反应浓度2 0 9 9 m 1 ) ，接单菌落，3 0 。c 、2 0 0 r p m 培养过夜a ( 2 ) 菌液的o d 嘲。值长过1 0 后将菌液置于冰上。 ( 3 ) 将菌液转入5 0 m l 离心管，4 。c6 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清。 ( 4 ) 加入溶液i2 5 m l 和溶菌酶( 反应浓度l m g m 1 ) ，轻微混匀，3 7 0 c 水浴 1 5 3 0 m i n 。 ( 5 ) 加入溶液i i5 m l 轻轻混匀至透明，冰浴l o 分钟。 ( 6 ) 加入溶液i i i3 7 5 m 尉烈振荡后，冰浴3 0 分钟。 ( 7 ) 4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟，取上清，。 ( 8 ) 加入0 6 体积异丙醇，室温放嚣1 5 分钟。 ( 9 ) 4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清。 ( 1 0 ) 加入1 0 0 u i t e 溶解核酸。 ( 1 1 ) 加入r n a s e ( 反应浓度为1 0 0 i g m 1 ) ，3 7 6 c 水浴3 0 分钟。 ( 1 2 ) 等体积酚：氯仿( 1 ：1 ) ，抽提，振荡均匀，4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟，取上清。 ( 1 3 ) 加入2 倍体积的无水冷乙醇和1 1 0 体积的3 m n a a c ，一2 0o c 放置2 0 分 钟沉淀d n a 。 ( 1 4 ) 4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清液，干燥沉淀。 ( 1 5 ) 加入l m l7 0 的冷乙醇洗d n a 沉淀两次，空气中干燥。 ( 1 6 ) 加入5 0 扯lt e 溶解核酸。存一2 0 。c 。 2 2 4 小量提取质粒d n a 的方法； ( 1 ) 适量的抗生素和2 m l 液体l b 培养基加入试管中，最适温度、2 0 0 r p m 培养。 ( 2 ) 取l m l 菌液加入1 5 m 1e p p e n d o r f 管中，4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心l o 分钟，弃 上清液。 ( 3 ) 加入溶液i2 0 0 p ! 和溶菌酶( 反应浓度为l m g m 1 ) 轻轻混匀，3 7 。c 水 浴l o 分钟。 ( 4 ) 加入溶液i i4 0 0 1 ，混匀至透明。室温放置5 分钟。 1 6 南，f 大学硕士研究生学位论文 材料与方法 ( 5 ) 加入溶液i i i3 0 0 0 1 ，剧烈振荡，冰浴1 0 分钟。 ( 6 ) 4 c1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，取上清。 ( 7 ) 加入0 6 体积的异丙醇，混匀，室温放置1 5 分钟。 ( 8 ) 4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清液。 ( 9 ) 加入l m l7 0 的冷乙醇洗d n a 沉淀两次，空气中干燥 ( 1 0 ) 沉淀溶于2