（特种经济动物饲养专业论文）四种紫菜自由丝状体遗传多样性的同工酶和issr研究.pdf

川种紫菜自由丝状体的州t 酶和i s s r 分析中t 摘赏 中文摘要 利用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳法对坛紫菜、半叶紫菜、少精紫菜、h 个条斑 紫菜栽培品系共8 个样品的自由丝状体进行m d h 、m e 、l d h 、g d h 、i d h 、g 6 p d h 共6 种同工酶的比较研究。结果表明：8 个样品的6 种同工酶谱共显现出5 8 个酶带， 4 种紫菜平均多态性位点比例为0 6 5 5 ，条斑紫菜血个品系f n j 多态性位点比例为o 5 8 6 ： 每一种酶系统对无论是不同种间还是种内的各个品系都能够进行区分。经p h i l i p 软 件计算遗传相似性系数：条斑紫菜5 个样品平均相似性系数为0 7 5 2 8 ，条斑紫菜与6 号半叶紫菜、7 号少精紫菜、8 号坛紫菜的平均相似性系数分为0 7 1 9 9 、0 7 6 8 1 和 0 7 5 9 8 。依据遗传距离进行聚类分析，可把供试的8 个样品分为两大类，条斑紫菜5 个品系中4 个和半叶紫菜聚在一起；少精紫菜与条斑紫菜y - 9 3 0 8 ，坛紫菜归为一组。 用c t a b 法提取紫菜自由丝状体基因组d n a ，经琼脂糖电泳检测大小约为2 3 k b ， 且重复性好，从每克丝状体中平均可获2 0 u g 左右的基因组d n a 。d n a 带型完整， 没有降解，可成功应用于i s s r p c r 扩增。i s s r p c r 反应体系为：2 5 “lp c r 缓冲 液，2 5 m m o l l m g c l 21 5 “l ，d n t p ( 2 5 r e t o o l l ) 2 u l ，0 2 p m o l l i s s r i 物，2 0 n g 模板d n a ，1 5 u d n a 聚合酶。优化反应程序为：9 4 预变性5 m i n ，然后进入p c r 循环，即9 4 。c 变性4 5 s ，5 2 。c 退火4 5 s ，7 2 。c 延伸9 0 s ，共进行4 5 个循环。最后7 2 延伸1 0 m i n 。 从1 0 0 个i s s r 引物中筛选2 3 个引物扩增2 1 7 个d n a 片段，其中2 0 1 个片段呈 现多态性，占总扩增片段的9 2 6 。每个引物可扩增的d n a 带平均为9 3 4 条，扩增 的条带的大小在1 5 0 b p 2 5 0 0 b p 之间。依据扩增结果进行遗传相似性和遗传距离分析， 构建分子树状图，结果与同工酶分析基本相符。条斑紫菜5 品系中，采自南通海区的 2 个品系首先聚在一起，其遗传距离为o 3 8 9 7 ；接着依次和来自青岛的2 个野生品系 聚类，那两个野生品系问的距离为o 4 2 9 9 ；原种来自r 本的样品与其他4 个样品桐距 最远，平均遗传距离为o 4 4 6 9 。同时，8 个紫菜样品的i s s r 分析中产生了一些特有 的指纹图谱，可进一步应用于种质分析的研究。 关键词：紫菜同工酶 i s s r 遗传多样性种质鉴定 作者袁昭岚 指导教师黄鹤忠 、h l d 、ni h e c n “kd i v e r s i t yo lt h u rs p c c i c tf i - c c h v i n g c o n c h o c c l i so lp o r p h y r aw i t hi s a z y m ea n di s s r p c r a b s l r a c t s t u d yo nt h eg e n e t i cd i v e r s i t yo ff o u rs p e c i e sf r e e l i v i n g c o n c h o c e l i so fp o r p h y r aw i t hi s o z y m ea n di s s r - p c r a b s t r a c t po l i g o s p e r m a t a n g i aa n d5c u l t i v a r so fp y e z o e n s i sf r e e l i v i n gc o n c h o c e l i sw e r ed o n e b yv e r t i c a lf l a te l e c t r o p h o r e s i so fp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s i xi s o z y m e p a t t e m sw e r eo b t a i n e d 。n a m e l ym d h 、m e 、l d h 、g d h 、i d h 、g 一6 一p d h t h es i x i s o z y m e sp a t t e r n ss h o w e dt h en u m b e ro fi s o z y m eb a n d sw a s 5 8 t h ea v e r a g ep o r t i o n p o l y m o r p h i cl o c io f t h e s ef o u rs p e c i e s p o r p h y r aw a s 0 6 5 5 ，a n dw h i c ho f t h e5c u l t i v 0 3 so f py e z o e n s i sw a so 5 8 6 ；e v e r yi s o z y m ep a t t e r nc a l ld i c r i m i n a t et h ee i g h es a m p l e s c o m p a r a b i l i t y c o e f f i c i e n tw a sc a l c u l a t e db yp h i l i ps o f e w a r e ：t h ec o m p a r a b i l i t y t o e f f i c i e n to f5c u l t i v a r so fpy e z o e n s i sw a so 7 5 2 8 a n dw h i c hb e t w e e npy e z o e n s i sa n d 户 k a t a d a im i u r av a t ：h e m i p h y l l a 、po l i g o s p e r m a t a n g i a 、尸h a i t a n e n s i sw a so 7 1 9 9 、o 7 6 8 1 a n do 7 5 9 8 c l u s t e ra n a l y s i sb a s e do nt h ei s o z y m er e s u l t sw a sp e r f o r m e d ，d i v i d e dt h ee i g h t s i m p l e si n t ot w og r o u p f o u rs a m p l e so f5c u l t i v a r so fpy e z o e n s i sa n dp k a t a d a im i u r a m rh e m i p h y t l aw e r et o g e t h e r , y - 9 3 0 8a n dpo l i g o s p e r m a t a n g i a 、ph a # a n e n s i sw e r ei no r l e g r o u p t h ee x p e r i m e n to ni s o z y m e so f ph a i t a n e n s i s ，pk a t a d a im i u r ay a eh e m i p h y l l a ， t h ed n ao ft h ef r e e l i v i n gc o n c h o c e l i so fp o r p h y r aw a se x t r a c t e dw i t hc t a b ( c e t y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ) ，w h i c hw a su s e dt o i s s r - p c rr e s e a r c h t h ey i e l d d n ai sa p p r o x i m a t e l y2 0ugd n a f r e e l i v i n gc o n c h o c e l i sw e i g h t g 一，a n dt h ea v e r a g e s i z eo fg e n o m i cd n aw a sa b o u t2 3 k be s t i m a t e db ya g r o s eg e le l e e t r o p h o r e s i s t h e o p t i m i z e dr e a c t i o n sw a sc o m p o s e do f 2 5p1p c r b u f f e r ，2 5m m o l lm g c l 215 “1 ，d n f p f 2 5 m m o l l ) 2ul ，0 2um o l li s s rp r i m e r ，2 0 n gt e m p l a t ed n a ，1 5 ut a qd n a p o l y m e r a s e t h eo p t i m i z e dp r o g r a m sw e r ep r e d e n a t u r a t i o na t 9 4 cf o r5m i n ；t h e n4 5 c y c l e sc o n t a i n i n gd e n a t u r a t i o n4 5 s a t9 4 ，a n n e a l i n g4 5 sa t5 2 ，a n de n l o n g a t i o n2r a i n s t u d yo r i h e g e n e t i cd i v e r s i t yo f f o u rs p e c i e s f r e e - l i v i n g c o n c h o c e l i so f p o r p l w * a w i t h i s o z y m ea n d i s s r p 【r m 1 s t t a c a t7 2 。c ；a n da tl a s th o l d i n g1 0m i na t7 2 。c o n eh u n d r e d1 s s rp r i m e r sw e r es c r e e n e d ，o fw h i c h2 3p o l y m o r p h i ca n di n f o r m a t i v e p r i m e r sw e r e s e l e c t e dt o t a l217d n ab a n d sw e r ea m p l i f i e d ，2 010 1 1w h i c hw e r e p o l y m o r p h i c ( 9 2 6 ) t h em e a no fe a c hp r i m e ra m p l i f i e dw a s9 3 4b a n d s t h ea m p l i f i e d b a n d ss i z ew e r em o s t l yb e t w e e n15 0 b p 一2 5 0 0 b p c l u s t e ra n a l y s i sb a s e do nt h ei s s rr e s u l t s w a sp e r f o r m e d ，w h i c h o r d i n a r i l ya c c o r dw i t ht h ea n a l y s i sb yi s o z y m e a m o n gt h e 5 c u l t i v a r so fpy e z o e n s i st h eg e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e ny - 9 9 6 5a n dy - 9 5 0 5w a so 3 8 9 7 ；a n d t h ed i s t a n c eb e t w e e nt h et w os a m p l e sf r o mq i n g d a o ( y - 9 3 0 8 ，y - 2 0 3 5 ) w a s0 4 2 9 9 ；f u r t h e r m o r e ，t h ec u l t i v a rc o m ef r o mj a p a n ( y - 0 0 0 8 ) h a dt h ea v e r a g eg e n e t i cd i s t a n c e0 4 4 6 9 c o m p a r e dw i t i lo t h e rf o u rs a m p l e s a tt h es a m et i m e d n ap r o f i l e sb a s e do nt h e1 s s r m a r k e r sh a dr e v e a l e dp o t e n t i a lf i n g e r p r i n t sf o rv a r i o u si n d i v i d u a lc u l t i v a r s k e yw o r d s ：p o r p 7 砂r 日i s o z y m e i s s r g e n e t i cd i v e r s i t yg e r mp t a s mi d e n t i f y w r i t t e nb y ：y h a nz h a o l a n s u p e r v i s e db y ：h u a n gh e z h o n g 四种紫菜自由丝状体遗传多样性的同上= 酶和i s s r 研究 引占 引言 1 紫菜的生物学特性和养殖概况 紫菜在分类上属红藻门( r h o d o p h y t a ) 、原红藻纲( p r o t o f l o r i d e o p h y c e a e ) 、 红 毛菜目( b a n g i a l e s ) ，红毛菜科( b a n g i a c e a e ) 、紫菜属( p o r p h y r ac a g ) 。紫菜属 的种类大多数发现于北半球，近年来南半球的研究也逐渐增多。现在紫菜种类在世界 约有1 3 4 种之多，我国也已记载了2 2 个物种或变种，其中主要栽培种类是北方的条 斑紫菜( 尸y e z o e n s i su e d a ) 和南方的坛紫菜( ph a i t a n e n s i sc h a n g e tz h e n g ) 。 紫菜的生活史具有大型的叶状体( 配子体) 世代和微型的丝状体( 孢子体) 世代。 叶状体是由一层或二层细胞组成的膜状体，也就是在海边采集到的紫菜，可分为叶片、 柄、固着器三部分。依照紫菜叶状体营养细胞一层或两层，营养细胞中星状色素体一 个或两个，紫菜属又分为真紫菜亚属( e u p o r p h y r a ) 、双皮层紫菜亚属( d i p l o d e r m a ) 和 双色素体紫菜亚属( d i p l a s t i d i a ) 三个亚属。其中真紫菜亚属藻体为一层细胞组成，具 单一色素体，我国的紫菜都属于该亚属。藻类学家曾呈奎和张德瑞又根据藻体的边缘 细胞有无刺状突起，把紫菜亚属分为三组，即全缘紫菜组( s e c t i o ne d e n t a t a ) 、刺缘紫 菜组( s e c t i o nd e n t a t a ) 和边缘紫菜组( s e c t i o nm a r g i n a t a ) 。丝状体是丝状藻丝，呈树枝状， 在不同世代具有不同的形态构造特性【1 1 。紫菜的果孢子在春末、夏初从成熟的叶片上 陆续大量地放散出来。遇到具有石灰质的基质如贝壳等就附着萌发，钻进贝壳内部蔓 延生长，形成丝状体。在人工培养时，附生在玻璃容器等人工基质的表面萌发，生长 为游离丝状体( 即自由丝状体) 。丝状体有果孢子萌发、丝状藻丝、壳孢予囊枝、壳 孢子形成和放散等五个阶段。 紫菜是一种营养丰富、味道鲜美的食用海藻，作为一种佐餐食品，在我国和东亚 诸国具有悠久的历史。紫菜所含蛋白质、脂肪、糖、无机盐、维生素等，都是人类所 需的营养成分。其中条斑紫菜不仅有大量的蛋白质、氨基酸，而且脂肪酸组成中，大 部分为不饱和的脂肪酸，如e p a ( 2 0 ：5 m 3 ) 占5 0 1 ；无机元素也异常丰富，游离氨 基酸总量可达4 2 8 7 2 3 m g k g ，同时还富含维生素，因而在大型栽培海藻中，就其营 养价值而言位居首位f 2 】o 紫菜还具有一定的药用价值，我国古代的食疗本草、本 草纲目中记载：紫菜味甘、寒、清热、补胃、利水肿，主治甲状腺肿大、水肿、慢 l 四种紫菜自由丝状体遗传多样性的同j 。酶和i s s r 研究引寿 性气管炎、渝性脚气、喉炎、麻疹等症。此外紫菜富含多糖及琼脂，a ，作为工业原料 加以利用，因此具有重要的经济价值。 中国地处亚热带、温带、北半球中高纬度，海洋国土面积约为3 0 0 万平方公罩， 海水养殖生产总量一直位居世界首位。紫菜是世界上经济产值最高的栽培海藻，仅 日、韩、中三国紫菜一次加工品产值就超过2 0 亿美元。中国作为海藻栽培第一大国， 2 0 0 3 年度我国的紫菜产量按国际标准计算约达1 8 2 亿张( 每张约3 9 ) ，其中条斑紫 菜为2 2 亿张，坛紫菜约折合4 。8 x1 0 4 t ( 于重) ，产量屡世界首位吼 早在千多年前的隋唐时期，我国就有了关于食用紫菜的记载。我国人民利用 和养殖紫菜已经有相当长的历史。积累了丰富的经验。最原始的是采用简单工具清 除或火把烧除的方法，清除岩礁上的杂藻、野贝来增殖紫菜。到了2 0 0 多年前，在 福建的平潭发展为用石灰水处理岩礁的杂藻，创造了“菜坛式养殖法”，并传到福建 莆田、东山等地和浙江省，取得了良好的增产效果。解放后，我国的紫菜栽培取得 了显著的进步，产量迅速提高，成为紫菜出口国。8 0 年代中期，张佑基等曾用选择 育种发培育出长叶品种，在生产上发挥了重要作用。 近十几年来，我国紫菜养殖产业得至h 蓬勃发展。特别在江苏沿海一带，紫菜养殖 规模不断扩大，紫菜二次加工产业趋于成熟，各种紫菜产品的出口带来了巨额利润， 使得沿海紫菜养殖户收入得到大幅提高。随着紫菜人工养殖生产规模的扩大，紫菜的 种质问题日益受到人们关注，养殖户希望能获得高产、优质、抗逆的良种。但是，由 于水产种质管理技术的相对滞后，异地种质无序引入形成的品种混乱现象日益严重， 而且盲目的引种破坏了本地种群的遗传平衡，使得某些遗传基因信息无意识丢失。从 紫菜种质的遗传特性方面来看，其独特的生殖方式，近交程度极高( 条斑紫菜自交水 平为5 0 ) ，同质化进程很快，种质性状十分容易退化。自九十年代以来，紫菜已有三 个年度发生与种质质量密切相关的大面积病害减产。另外，现代化的生活及作业方式 造成了天然水体和生态环境的日益恶化，加之某些人为因索，野生种群资源量逐渐枯 竭。所有这些情况都需要我们能够随时对紫菜种质进行监测、鉴定。 2 生物技术在紫菜遗传多样性和种质研究中的应用与进展 要改变这种现状，应该从两个方面入手。首先，必须开拓寻找新的选育途径，发 2 四种紫菜白由丝状体遗传多样性的阃i ：酶和i s s r 研究 引言 展紫菜的遗传标记辅助育种技术。可以在加强紫菜生物遗传方面研究的同时，借鉴陆 地高等植物遗传育种技术特别是分子生物技术和基因工程方面的经验，培育优质、高 产、抗逆的紫菜新品种，促使传统的紫菜养殖业向高新技术产业转变，这对于实现海 洋养殖业的绿色革命的宏伟目标，具有切实深远的意义。而所有这些的研究都必须建 立在对紫菜遗传多样性研究的基础上。 其次，可以通过建立紫菜种质库，对濒予灭绝的、优良的野生或养殖品系进行选 择、分离、纯化、保存和扩增，未来生物方面的竞争可能更多的是资源方面的较量。 同时，种质库可以把优良的紫菜品种以自由丝状体的形式提供给紫菜栽培者，在一定 程度上实现人工控制条件下的纯系栽培。这样，既可以满足生产上对良种的需求，又 可以保存备种野生种群资源，以备将来所需。 位于江苏省海洋水产研究所的国家级紫菜种质库，针对紫菜所具有的独特的繁殖 与生长特性遗传学与育种学特点，经过多年研究观察，确定紫菜丝状体( 无性系) 最适 宜作为种质保存，并确定出紫菜种质生产的主要技术路线与工艺。对于种质资源的选 择，种质库从紫菜自然产地采集具备栽培特征的野生藻株，分别制作保持系和纯系， 作为自然种群和栽培种质资源保护与保存；从各产地的主要栽培群体中选取种藻，由 果孢子和成熟组织制备保持系，并选取具有质量与生长优胜的个体藻株，按保持系和 纯系操作制备保存种质；还从经诱变获取的实验育种材料中选取具有特殊栽培性状的 个体藻株，分别制作保持系和纯系；另外他们还保存国外赠与、交换的紫菜品种，试 验观察其栽培与适用性状，评估其使用的可行性或应用范围。 保存保护紫菜种质资源是种质库的最根本的任务之一。种质库北自山东青岛，南 至福建南日岛广泛收集到具有栽培性状的自然种群种质和现有栽培群体种质，按照 操作规程，分别制备成纯系或保持系种质保存，同时系统地开展了紫菜遗传学与育种 学研究，通过细胞技术育种研究，人工诱变等育种方法获得并保存了国内实验室中种 类最多的色素突变体材料及一些自然界难以寻觅的新品种，培育保存了各种紫菜种质 和育种材料3 4 4 株。在此基础上，又不断新增制备了1 5 3 0 份种质株( 系) ，进入保存 系统3 0 0 多份，目前种质库保存各类种质材料达到6 7 8 株( 系) 。 种质库通过市场机制合理配置资源，推动建立良种供应推广体系。在近年紫菜栽 培生产发展较快的海安县建成1 0 0 0 m 2 的良种生产专用育苗室，通过经营示范推广良种 培育、栽培技术，连年来获得较好的经济效益，迅速带动海安产区全面实行了良种化 3 四种紫菜自由丝状体遗传多样性的周工酶和1 s s r 研究 引言 生产，从而也在如东、启东及连云港产区产生很大的反响。近年来按照紫菜种质库的 技术规范相继建成海安兰波、如东海达、启东富源以及赣榆富安等骨干育苗室2 i 丁多 m 2 ，与紫菜种质库合作专门从事良种种苗生产。同时分布在各产区约近2 ) j m 2 的其他 育苗生产单位也与紫菜种质库签定技术合作协定，接受技术培训，改育苗生产方式为 良种种苗培育。2 0 0 0 年一2 0 0 4 年种质库提供的良种应用接种面积1 3 2 1 5 0 m 2 ( 包括2 0 0 4 年面积) ，良种栽培面积1 2 9 1 4 0 亩。通过提供良种和建立专门技术推广网络，紫菜良 种种苗己覆盖主产区种苗生产的i 3 以上，江苏省紫菜使用良种生产的面积逐年稳定 增加，推动条斑紫菜栽培业步入全面良种化生产的阶段 对于种质库中保存的丝状体，除颜色上的细微差别外，仅依赖传统的形态性状检 测存在一定的困难。而且单纯的形态学和细胞学研究手段对于揭示具有同样染色体数 目的同个种或同一个种内不同品系在遗传上的多样性往往显得无能为力。因此有必 要建立一种新型、有效、简单的标记用于种内品系区分、种闯或种内的亲源关系和遗 传变异水平的检验、优良品系的鉴定等，也可为今后的遗传标记育种做好准备。 遗传标记( g e n e t i cm a r k e r s ) 是基因型的特殊的易于识别的表现形式。理想的遗传 标记应当具有对基因组取样无偏离、共显性，对变异的检测分辨率高及不受环境条件 直接影响等特点1 3 】。此外，任何基于居群理论的研究对实验材料都有一定数量的样本 要求，故标记体系的实验稳定性和易用性也是评价其优劣的重要标准【4 1 。当前遗传 标记主要分四大类：即形态标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) 、细胞标记( c y t o l o g i c a l m a r k e r s ) 、生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) 和分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r s ) 。 2 1 同工酶标记 对于传统方法而言，生物个体之间的遗传以及亲缘关系鉴定是综合其形态学特征 检测来确定的。生物多样性无论是从种上还是种下来说，归根到底都是遗传上的多样 性。在2 0 世纪初期，由于显微镜的发明，促进了染色体的研究和细胞遗传学的发展， 使得生物多样性的研究从种的多样性深入到了种下和种内细胞水平。染色体资料对遗 传多样性的了解是非常重要的，但它作为众多基因的“大包装”，我们看不到在它内 部的每个基因的变化细节，对染色体数目一样和形态相似的种，或同一居群 ( p o p u l a t i o n ) 内的不同个体来说，单纯用形态学和细胞学手段研究遗传多样性就失 4 四种紫菜自由丝状体遗传多样性的同i + 鹤和i s s r 研究引言 去了分辨能力。上世纪5 0 年代以来，分子生物学的手段( 特别是蛋白质和d n a 分析 技术) 的提高，则使我们看到这种变化成为可能，生物多样性的研究从而深入到了居 群内个体间的分子水平。其中，等位酶资料作为基因变异的标记首先作出了贡献。 酶电泳技术始于上世纪3 0 年代，s m i t h1 9 5 5 年开始用淀粉凝胶来电泳蛋白质， h u n t e r 和m a r k e r t1 9 5 7 年采用组织化学的染色方法使得特定酶( e n z y m e ) 的位置在 胶上能够被看见，从而发现了在同一个体内各种酶的多种分子形式。1 9 5 9 年m a r k e r t 和m o i l e r 报道了乳酸脱氢酶在不同组织、不同个体以及不同种里的不同形式的存在， 导致了同工酶( i s o z y m e ) 概念的产生 饥”。同工酶可以狭义的定义为不同基因位点所 编码的、催化反应相同丽结构及理化性质不同的一组酶，是生物体内基因转录和翻译 的直接产物，它反映了编码酶蛋白的d n a 序列信息l s l 。在此基础上，p r a k a s he ta 1 9 1 又提出了等位酶( a l l o z y m e ) 的概念。他提出把同一基因位点的不同等位基因所编码 的一种酶的不同形式叫做等位酶。从此，对表型酶谱的遗传学分析有了更深的意义。 酶谱作为基因编码的产物，由于模板作用，酶蛋白质中多肽链上的氨基酸顺序( 通过 r a n ) 直接反应了d n a 链上碱基对的顺序，其变化能很好地代表d n a 分予的变化，表 明等位基因和位点变化的存在。由于同工酶谱带与基因位点直接相关，而且几乎2 5 的位点具有多态性，所以这种技术已经成为一种十分有效的遗传标记方法1 1 0 】。因此 同工酶分析方法也被正式列入分子系统学的方法，它可以帮助回答居群遗传学结构分 析、系统学研究或标本鉴定等工作中的许多问题，它在遗传学和其他有关生物学各分 支学科中都迅速的发展起来【1 1 】。同工酶作为一种生化指标，己广泛应用于物种及杂种 鉴定、物种倍性鉴定、物种间亲缘关系比较、种群遗传结构分析及系统分类、基因连 锁分析及基因作图、胚胎发育过程中的基因表达与调控、进化理论、环境生理、等理 论研究和实际应用领域1 2 。”。同工酶的电泳分离技术己发展成为生化遗传学的主要研 究手段之一。 h a r r i s 于1 9 6 6 年首次把同工酶分析用于人类，h a r r i s 和h o p k i n s o n 在人类遗传 学酶电泳手册一书中对酶催化反应的化学基础作了详细的总览，使同工酶电泳分析 的染色原理、方法和技术更趋于实用和系统化，为在其他生物类群中的使用奠定了基 础f l “。紧接蓑在动物研究中被广泛使用，随着资料的积累和方法上的需要，r i c h a r d s o n 等出版了等位酶电泳一动物系统学和居群研究手册 1 7 1 在植物研究中同工酶使用 较晚，g o t t l i e b l l 8 , 1 9 1 首次用于种子植物，s o l t i s 等【2 0 1 开始用于蕨类植物，c u m m i n s 和 s p q 神紫菜臼由丝状体遗传多样性的黼j 一酶和i s s r 研究引言 w y a t t i 2 l 】在苔藓植物的遗传多样性、系统学和进化研究中也使用了同工酶分析方法。 随着动物和植物等各领域使用的电泳方法的不断改进，近几十年中，同工酶分析 资料得到爆炸式的积累。在藻类研究方面，b l a i r 等【2 2 1 对c h a e t o m o r p h a4 种物种进行 了系统分类学研究；n e f u s 等1 2 3 1 对海带及其他大型褐藻进行了群体遗传学研究， m a r s d e n 等1 2 4 , 2 5 1 以及r i c e 和c r o w d e n t 2 q 则利用同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) 对大型红藻和褐藻进行了分类学研究。国内，王莹f 2 7 】也用这种方法研究了海带丝状体 和海带丝状体与其他丝状体的生化遗传结构图谱。 关于紫菜同工酶方面的研究，国外开展较早。1 9 7 8 年，m i u r a 等障8 1 对条斑紫菜、 甘紫菜等4 种紫菜的8 种同工酶进行分析，研究它们之闻的遗传差异；1 9 8 7 年，f u i o 1 5 用水平淀粉凝胶电泳技术( h s g e ) 研究了t o m a r i h a m a 地方的条斑紫菜叶片的同工 酶，通过十一个位点的等值基因分析，得到这个品种的平均杂合度为o 1 9 7 ，遗传分 化系数( f s t ) 为o 1 2 5 ，平均多态位点比例为o 5 8 3 ，种种数据表明该研究的几个群 体具有向种内亚种分化的趋势。加拿大的s a n d r a f 2 9 1 在1 9 9 3 年对不同种间和种内的紫 菜叶状体进行遗传差异的比较分析，发现多态性位点比例不是很高，仅有 0 0 6 3 0 3 7 5 之间。 然而，同工酶分析也存在一定的局限性。首先，有限种类的酶分析会带来一定的 偏差，即便一个个体的全部酶也只是该个体的很少一部分结构基因的反映。目前所有 已鉴定出的酶有3 0 0 0 种以上，可染色观察到的酶只是其中很少的部分，约有1 0 0 种，常用的酶又只是其中2 0 一3 0 种可溶性酶。同工酶分析在一定程度上会因所选酶 的多少和种类的不同而受到影响，使结果数据发生偏差 s o l 。其次，由于翻译后的修饰、 酶和酶谱的特异性及相对较低的多态性等，研究所选酶的所有基因未必都能表达在酶 谱上，酶电泳分析可能会低估遗传变异的量。电泳条件( 凝胶孔径、p h 值等) 的差异 都可能产生额外的酶谱差异，因此同工酶分析在指纹图谱中的应用受到一定限制f 3 ”。 另外，由于同工酶是基因表达的产物，受到生物在发育过程中基因表达的时序控制， 所以同一生物的不同发育期会表现出不同的同工酶酶谱，这给物种阅关系的研究造成 了定的干扰【3 2 33 1 。 2 2d n a 标记技术 6 四种紫菜自由丝状体遗传多样性的同工酶和i s s r 研究引言 进入2 0 世纪8 0 年代以后，分子生物学的迅猛发展以及实验技术的不断突破，使 人们可以在基因组水平上对生物进行指纹分析。d n a 由于具有进化速度快和易于分析 操作等特点，已经成为研究近缘种间和种内群体问遗传分化关系的有力工具，更多的 学者开始采用分子标记技术直接从d n a 水平上研究物种遗传的多样性。利用分子标记 技术直接从d n a 水平上对不同基因型材料进行区分与鉴定，具有快速、准确的优点， 即使是亲缘关系比较接近的品种克隆也能找到合适的分子标记加以有效的区别。 首先，随着限制性核酸内切酶的成功分离和提纯，基于d n a 杂交的限制性片段 长度多态性( r f l p ) 技术受到密切关注，并被广泛用于遗传作图、基因标记、系统进 化等研究领域。9 0 年代以来，随着p c r 技术的发明，基于p c r 技术的分子标记，如 随机扩增多态性d n a ( r a i d ) 、小卫星d n a ( i l l i n i s a t e l l i t ed n a ) 、微卫星( m i c r o s a t e l l i t e d n a ) 、简单重复序列区间( i s s r ) 、扩增片段长度多态性( a f l p ) 等受到广泛重视 和应用【3 ”。与同工酶和其他标记相比，分子标记具有以下的优越性：直接以d n a 的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可以检测到，不受季节、材料、环 境条件限制，不存在表达与否的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高， 自然存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；表现为“中性”，即不 影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；有许多分子标记表现为共显性 ( c o d o m i n a n c e ) ，能够鉴别出纯合基因型与杂合型基因型，提供完整的遗传信息【3 ”。 2 2 1r f l p 分子标记技术 r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 是发展较早的一种分子标记技 术，它是指应用特定的核酸限制性内切酶切割有关的d n a 分子所产生出来的d n a 片段 在长度上的变化。原理是由于d n a 分子中由于限制性内切酶酶切位点的插入，重排或 缺失，点突变导致酶切位点的增减所引起的基因型间限制性片段的差异，利用标记过 的探针与经限制性酶内切酶消化过的总基因组d n a 杂交，通过显示限制性酶切物的 片段的大小来检测不同遗传位点变异的一种分子标记技术3 6 1 。优点：r f l p 标记呈共 显性遗传，可区分纯合子与杂合子，从而提供较完全的遗传信息口7 1 。缺点：d n a 需 求量较大，需要的设备仪器多，技术繁琐复杂并涉及到同位素操作【3 8 1 。 2 2 2r a p d 分子标记技术 r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i e d n a ) ；1 妻1 9 9 0 年由w i l l a m s | 3 9 1 提出的以p c r 7 四种紫菜自由丝状体遗传多样性的同l ：酶和i s s r 研究 引青 为基础的一种分子标记技术。其原理是以一个随机的寡核苷酸单链作为引物去扩增基 因组d n a ，若基因组中的某区域恰好是与此引物互补配对，经过扩增，则会产9 ： 不连续的扩增片段，从而表现出多态性。优点是：对d n a 需求量少，d n a 的制备的 质量要求也不高，引物不需要专门设计，仪器简单，操作比较简单迅速无放射性。 缺点是：扩增产物的稳定性差，多数位点的标记表现为显性不能提供完整的遗传信息， 难以区分纯台与杂合基因型，必须经过后代分析才能区分纯合予与杂台子，并且实验 的可重复性较差【4 04 1 1 。 2 2 3a f l p 技术 a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 是d n a 指纹技术的重大突破。 它是1 9 9 2 年由荷兰k e y g e n e 公司科学家z a b e a um a r e 和v o sp i e t e r 发明并发展起来 的一种选择性扩增限制性酶切片段的方法4 羽。它拥有了r f l p 稳定性和p c r 技术高 效性的特点，可以分析基因组较大的作物，多态性很强，远远超过r f l p 、r a p d 等 技术，适合绘制品种的指纹图谱及进行分类研究。但该技术需要同位素检测，同时成 本也较高，另外，a f l p 已经申请了专利，生产及商业上的应用受到了限制。 2 2 4s s r 技术 s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t e s ) 微卫星是指以少数几个核苷酸( 一般为卜6 个b p ) 为一个单位，呈多次串联重复状广泛分布在真核基因组中的d n a 序列，又称为简单 序列重复或短序串联重复3 6 】。其多态性高，重复性与稳定性好，可用p c r 扩增等优点， 但由于该技术必须针对每个染色体上的微卫星，测序得知其两端的单拷贝序列然后才 能设计引物，没有足够的投资、人力和时间是不可能实现的。 2 2 5i s s r 分子标记 i s s r ( i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 是一种新型的分子标记，是z i e t k i e w i c z 于1 9 9 4 年建立起来的一种分子生物学技术。其原理是在真核生物的基因组中广泛存 在着的以1 6 个碱基为一个单位呈串联状重复排列的序列，即s s r 序列。i s s r 分子 标记技术就是利用简单重复的s s r 序列设计引物，即引物主要由1 4 个碱基组成的 重复序列，通常在引物的3 端或5 端加几个非重复的锚定碱基以保证引物与基因 8 四种紫菜白由丝状体遗传多样性的同 i 酶和i s s r 研究引言 组d n a 中的s s r 的3 或5 端结合，通过p c r 反应扩增位于反向排列的s s r 之 间的d n aj 段。由于s s r 在真核生物中广泛分布，进化变异速度快，所以通过与锚 定引物的p c r 扩增后可以检测到基因组位点的差异。i s s r 引物具有通用性和适应性， 无种属界限，故无需预先知道实验对象的基因组d n a ，且具有d n a 用量少、检测方 便等优点4 4 , 4 5 1 ，所以i s s r 标记不仅具有s s r 标记的优点如多态性高、重复性和稳定 性好等优点，而且无需测序。i s s r 通常为显性标记，呈m e n d e l 式遗传，是非常理想 的分子标记，以被广泛的应用与遗传多样性分析、绘制d n a 指纹图谱、种质鉴定 4 6 - 6 3 】。 以d n a 分析为基础的分子生物学方法在海洋藻类研究方面已经有了广泛的应 用。例如，利用d n a d n a 杂交 6 4 1 、限制性内切酶分析【6 5 删以及序列分析6 7 8 1 技术 确定了海带、江蓠等海藻的亲缘关系和地理种群分布，解决了许多用传统手段难以定 论的问题。与此同时，限制性片段长度多态性分析( r f l p ) 6 9 , 7 0 、随机扩增片段长 度多态性分析( r a p d ) 7 1 - 7 3 、d n a 指纹】、扩增片段长度多态性分析( a f l p ) m 7 6 瞎鉴定技术已经在藻类线粒体d n a 和核基因组d n a 的研究方面得到了广泛应用， 并取得了一定的进展。 在紫菜研究方面，s t i l l e r ( 1 9 9 6 ) 7 7 1 利用r f l p 研究分析确定了太平洋地区某种 紫菜的起源，郭宝太( 1 9 9 9 ) 【7 8 1 发现r f l p 分析的谱带表现种的特异性。还有，杨品 官7 9 i 通过对条斑紫菜丝状孢子体e s t 序列分析得到6 条抗病相关基因序列，这些序 列可用于研制抗病单核苷酸多态性标记，辅助紫菜抗性遗传改良。另外，杨锐【8 0 1 等研 究利用a f l p 技术对浙江和福建两省的野生坛紫菜以及栽培坛紫菜进行初步分析，得 到可靠的a f l p 指纹图谱，通过比较栽培类型与野生型之间的遗传差异，以期找到特 异性标记，为缩短育茁周期、提高选育准确性积累资料，也为坛紫菜品系培育、性状 改良和分子标记辅助育种提供参考数据。m i z u k a m i t a l l ( 1 9 9 6 ) 对p y e z o e n s i s 和pt e n e l a 进行了r a p d 分析，9 1 个随机引物的扩增产物中1 8 个出现多态性，该结果与f u j i o l l 副 ( 1 9 8 7 ) 同工酶数据相吻合。梅俊学【8 刁( 2 0 0 0 ) 通过对条斑紫菜不同栽培品系的r a p d 研究，获得了可用于品系鉴定的特异性条带。徐涤等m 1 ( 2 0 0 1 ) 应用r a p d 技术对2 种紫菜的5 个品系进行遗传多样性分析，结果表明条斑紫菜或坛紫菜的养殖品系首先 聚类在一起。柳波、马家海等【州( 2 0 0 3 ) 应用r a p d 技术对2 7 个紫菜自由丝状体材 料进行遗传多态性分析，获得了7 个紫菜材料的特异标记，并对其进行回收、克隆、 测序，最终合成了5 对s c a r - p c r 引物。可直接用于丝状体材料的种质鉴定。 9 四种紫菜自由丝状体遗传多样性的同工酶和i s s r 研究 f 寿 在众多的d n a 分子标记中，新近发展起来的i s s r 以其多态性高、快速、无需 活体材料、能实现全集因组无偏取样、无组织器官特异性等优点，在较短的时闸内已 经在许多生物研究领域中取得了成功。用1 s s r 标记绘制遗传图谱和进行綦凼定位， 目前已用于桃、大麦、欧洲和日本落叶松、欧洲革莓、柑橘等的遗传作图 s 5 - 8 9 】。i s s r 遗传图还可以与同工酶、r f l p 、r a p d 遗传图相互参照、相互补充：a m m i r a j u i g o l ( 2 0 0 1 ) 等通过i s s r 技术与小麦籽粒q t l 连锁的分子标记，找到并定位了与抗枯萎病基因连 锁的i s s r 标记。物种遗传多样性研究，i s s r 分子标记技术适用于任何在基因组中 分布有足够数量s s r 单元的物种，对目前尚不清楚基因组序列的物种尤为有用 9 1 -