（环境科学与工程专业论文）生物传感技术检测堆肥体系中木质纤维素功能编码基因的研究.pdf

硕士学位论文 a b s t r a c t c o m p o s t i n gt e c l l l l o l o g yi sa p p l i e dt od i s p o s a lo ft h em u n i c i p a ls o l i dw a s t e i n c r e a s i n g l y t h em e t a b 0 1 i cp r o c e s sd u r i n gm i c r o b i a ld e g r a d a t i o no fl i g g n o c e l l u l a s e i s c o m p l e t e dt o g e t h e rb yas e r i e so fe n z y m e si nt h ec o m p o s ts y s t e m ， i nw h i c h m a n g a n e s ep e r o x i d a s ea n dc e l l o b i o h y d r o l a s ei ip l a yt h ek e yr o l e i ti sb e t t e rt ok n o w t h es y n e r g yb e t w e e nt h et w oe n z y m e sb yu s i n gd n a b i o s e n s o r t h i ss t u d yw a st o p r e p a r ed n ap r o b e si m m o b i l i z e db i o s e n s o rf o rd e t e c t i n gm a n g a n e s ep e r o x i d a s ea n d c e l l o b i o h y d r o l a s ei i e n c o d i n gg e n e sf r o m尸办a 力p 厂d c 办口p f p c 办，) 岱d s p d 厂f “，” a n d 乃f c 向d d 台，m 口陀p j p f ， r e s p e c t i v e l y t h ef e a s i b i l i t yf o rd e t e c t i o no ft w og e n e sw 嬲 d i s c u s s e da i l dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r )a n a i y s i sw a su s e dt os t u d yt h e c o m p o s t i n gm i c r o b i a lc o m m u n i t yd i v e r s i t y f i r s t ， t h e d e t e c t i o no f m a n g a n e s ep e r o x i d a s e e n c o d i n gg e n e s f i r o m 尸厅口疗p ，d c 厅口p ，pc 五，：) 馏d 互p d ，f “，打w a s s t u d i e d m e r c a p t o m o d i f i e dp r o b es e l f - a s s e m b l e d o nt h eg o l de l e c t r o d es u r f a c ea n dt h ep r o c e s so fi n l m o b i l i z a t i o na n dh y b r i d i z a t i o no f s s d n aw e r ec h a r a c t e r i z e db yi m p e d a n c es p e c t r o s c o p ya n dc y c l i c v o l t a m m e t r y t h e l i n e a rr e l a t i o n s h i po fe l e c t r o c h e m i c a ls i g n a l sa n dc o n c e n t r a t i o no ft a r g e td n a w a s o b t a i n e db yc h r o n o a m p e r o m e t r ya n dt h er a n g eo f d e t e c t i o n ，s p e c i f j c i t y ， v a r i o u s f a c t o r sw e r ea l s os t u d i e d t h ea m p e r o m e t r i cc u r r e n tl i n e a r l yr e l a t e dt ot h ec o m m o n l o g a r i t h mo ft h et a r g e tn u c l e i ca c i dc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g ef r o ml l0 9t o1 1o 1 5 ma n dt h ed e t e c t i o nl i m i to fb i o s e n s o rw a s1 o 10 1 7m a m a g n e t i cs e p a r a t i o na n dd e t e c t i o nm e t h o df o rt a r g e t s e q u e n c eo fag e n e e n c o d i n gc e l l u l a s eu s i n gb i o c o m p a t i b l ec o r e - s h e l ln a n o p a r t i c l ep r o b e sw a sd e v e l o p e d t h i o l a t e dc a p t u r ep r o b ew a sc o n j u g a t e dw i t hb i o c o m p a t i b l ef e 3 0 4 s i 0 2 a uc o r e s h e u n a n o p a r t i c l e s t a r g e tp r o b ea n ds i g n a lp r o b ew e r eh y b r i d i z e dw i t hc a p t u r ep r o b eo n t h es u r f a c eo ft h ei n o r g a n i cd n a c a r r i e r ，w h i c hr e s u l t e di nc o r e s h e un a j l o p a n i c l e p r o b e s w i t ht h ee x i s t e n c eo fa ne x t e r n a im a g n e t i cf i e l d ，i ti sc o n v e n i e n ta n d t i m e 。s a v i n gt or e a l i z et h ed e t e c t i o no fc e l l u l a s eg e n ei n 丹f c 办d l 才p ，纷口，e s p f ( z ，p p s p f ) b y1 i q u i df e r m e n t a t i o na n dt h ef o l l o w i n gm a g n e t i cs e p a r a t i o n q u a n t i t a t i v ep c r ( q p c r ) w a sp e r f o r m e dt og i v ea b s o l u t eq u a n t i f i c a t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no ft a r g e t n u c l e i ca c i d ，r e s u l t so fq p c rw a sc o m p a r e dt ot h a to fe l e c t r o c h e m i c a jm e t h o d t h e o p t i m i z e de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw e r es t u d i e dt om a x i m i z et h eh v b r i d i z a t i o n e m c i e n c ya n dd e t e c t i o ns e n s i t i v i t y t h ea m p e r o m e t r i cc u r r e n tr e s p o n s ew a sl i n e a r l y i i i r e l a t e dt oc o m m o nl o g a r i t h mo ft h et a r g e tn u c l e i ca c i dc o n c e n t r a t i o n 1 nt h er a n g eo t 1 0 1 0 1 3 1 0 1 0 。9m ，w i t had e t e c t i o nl i m i to f 1 2x10 叫耳m f i n a j l y ，w er e p o i r t e d as t r a t e g yf o rf a b r i c a t i n gs o l u b l em u l t i 。w a l l e d c a r b o n n a n o t u b e s ( m w c n t s ) c o m b i n e dw i t hc a r b o x y lb yp h y s i c a la n dc h e m i c a l m e t h o d s a n e l e c t r o d e p o s i t i o nm e t h o dw a sp r o p o s e df b rt h ec o n v a l e n tb i n d i n go ft h ep o l y m e r s w i t hf r e ea m i n eo n t om w c n t s a n dt h e n ，w ed e c o r a t e dt h es u r f a c eo f m w c n t s g c e l e c t r o d ew i t hn a n o a ut h r o u g he l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d a sar e s u l t ，w eg o tt h eg e n e b i o s e n s o rd e c o r a t e db yn a n o a u m w c n t s d u et ot h el a 玛es p e c l 士i cs u r 士a c ea r e aa n d e x c e l l e n te l e c t r o c h e m i c a ip e r f o r m a n c e ， t h ee l e c t r o d ed e c o r a t e db yn a n o a ua n d m w c n t sc o u l db eb e t t e ri m p r o v e di nt h ea s p e c t so fs e n s i t i v i t ya n dd e t e c t i o nl i m i t a n dt h u st or e a l i z et h ef u n c t i o no ft e s t i n ga n di d e n t i f y i n gt h eg e n e se n c o d l n g1 1 9 n l n d e g r a d i n ge n z y m e s ，a n d a l s o p r o v i d e ab a s i sf i o rf u n h e rd i s c u s s i o no fe n z y m e b i o s e n s o ra p p l i e di nt h ed e t e c t i o no fm i c r o b i a lf u n c t i o n a lg e n e si nc o m p o s t w e i n v e s t i g a t e dt h ee l e c t r o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h eb i o s e n s o rw h i c hr e s p o n s e st o t h ed e t e c t e dg e n ea tt h es a m et i m e t h er e s p o n s ec u r r e n ta n dt h et a r g e t c h a l n c o n c e n t r a t i o nw i t h i nt h e1 i m i t so fl o w e s t1x10 。1 l t ot o p p e s tl 10 - ) mb e c a m eal i n e a r r e l a t i o n s h i p i tw a sas t r o n g e v i d e n c et h a tt h eb i o s e n s o ro w n sag o o db l o l 0 9 1 c a l c a t a l v t i ca c t i v i t y t h el i m i td e t e c t i o ni s l 5 1 0 。m k e y w o r d s ： b i o e n s o r ；l i g n o c e l l u l a s e c e l l o b i o h y d r o l a s ei i ；l a c c a s e d e g r a d a t i o n ；m a n g a n e s e p e r o x i d a s e ； 生物传感技术检测堆肥体系中木质纤维素功能编码基因的研究 插图索引 图1 1 木质素的三种基本结构2 图1 2 纤维素分子结构示意图3 图1 3 生物传感器的工作原理一7 图1 4 吸附固定法( 左) 和包埋固定法( 右) 示意图1 0 图1 5 构建生物传感器的步骤说明1 3 图1 6 纳米金识别单双链示意图【4 引1 6 图1 7 基于纳米金电化学放大的d n a 电化学传感器【4 引1 7 图2 1f e 3 0 4 纳米颗粒2 7 图2 2 粗提d n a 琼脂糖凝胶电泳图一2 8 图2 3p c r 反应后琼脂糖凝胶电泳图2 8 图2 4 磷酸盐缓冲液p h 值与响应电流的关系一2 9 图2 5 不同杂交温度对应的电流响应值。目标链浓度为l 1 0 1 0 m 2 9 图2 6 不同捕获探针固定时间对应的响应电流值3 0 图2 7 碳糊电极的循环伏安扫描图。3 1 图2 8 电流响应线性关系3 l 图3 1 粗提d n a 琼脂糖凝胶电泳图3 9 图3 2 荧光定量标准曲线。数据为三次平行实验的平均数。一4 0 图3 3 电极的在不同p h 的磷酸盐溶液中的循环伏安图( p h5 9 1 7 4 ) 4 l 图3 4h r p s a 的酶量对响应电流的影响；检测底液位磷酸盐缓冲液( p h6 9 8 ) 4 1 图3 5 杂交温度对响应电流的影响；检测底液位磷酸盐缓冲液( p h6 9 8 ) 4 2 图3 6 杂交时间对响应电流的影响4 2 图3 7 探针在磷酸盐缓冲液( p h6 9 8 ) 中的循环伏安图s ( a ) ，加入对苯二酚( 4m m ) 和h 2 0 2 ( 8 0m m ) 4 3 图3 8 目标链浓度为0 ，1 0 1 0 1 3m ，1 0 1 0 。1 1m ，1 0 10 。9m 的计时电流响应 捕获探针浓度为0 0 1n m ，对苯二酚浓度为4m m ，h 2 0 2 浓度为8 0m m ， 还原电位为0 0 6v 。4 4 图3 9 响应电流的线性关系。数据为三次平行实验的平均值。4 5 图4 1 电极制备示意图51 图4 2 基于纳米金碳纳米管修饰的碳糊电极在不同p h 的p b 溶液中的循环伏安 图51 图4 3 不同金沉积时间修饰下的电极对应的电流响应值5 2 v i i i 硕士学位论文 图4 4m c n t s g c 在不同扫描速率下的循环伏安图一5 2 图4 5 戊二醛温育时间优化图5 3 图4 6 在p b 缓冲溶液中加入对苯二酚溶液前后电极循环伏安图5 4 图4 7 裸电极，m c n t - c r ，纳米金的沉积循环伏安图5 5 图4 8 基于纳米金碳纳米管离子液体修饰的碳糊电极的i t 图一5 5 图4 9 电流响应线性关系5 6 生物传感技术检测堆肥体系中木质纤维素功能编码基因的研究 附表索引 表1 1 降解木质素微生物的种类3 表2 1m n p 编码基因探针及引物2 l 表2 2p c r 反应体系2 4 表2 3 不同磷酸盐的配比2 6 表2 4 紫外分光光度法与生物传感器法的比较3 2 表3 1 在本研究中用到的低聚核苷酸序列3 5 表3 2p c r 反应体系上下游引物3 5 表3 3p c r 反应体系上下游引物特性3 6 表3 4p c r 反应体系3 7 表3 5q p c r 与d n a 生物传感检测结果的比较一4 5 x 硕士学位论文 第1 章绪论 木质纤维素是地球上最丰富的天然高分子，是人类最宝贵的天然可再生资源， 是植物细胞壁的主要成分，约占植物秸秆干重2 5 5 0 ，也是自然界存在的分布 最广、含量最多的一种多糖f l 。3 】。它们与半纤维素一起构成了植物骨架，是自然界 中含量最丰富的可再生性有机资源之一。由于木质纤维素分子大，溶解性差，没 有任何规则的重复单元或易被水解的键，且其本身含有稳定的复杂键型，微生物 及其分解的胞外酶不易与之结合，故木质纤维素降解在碳素循环中占有重要地位。 电化学生物传感器是一种新型的生物传感器，它本身具有的高灵敏度和轻巧 便宜，耗能少的优点，使它可以与现代微电子技术联用，实现微型化等优点，因 而受到了研究者们的广泛关注。采用生物传感器对主要的木质素和纤维素降解酶 编码基因进行快速、准确的检测，不仅能了解这两种酶在木质素降解过程的协同 作用，而且有利于木质素降解微生物的筛选，更好地促进木质素的微生物降解。 纳米材料( c n t ) 是目前电化学领域一种新兴的传感材料。碳纳米管( c n t s ) 自1 9 9 1 年被s i i j i m a 【4 】发现以来，因其独特的结构以及电学、光学以及机械等性 能，在纳米电子器件、储氢材料、催化剂载体等诸多新领域取得了较大突破，已 引起物理、化学及材料等领域的极大关注。纳米技术与生物传感技术相结合是 d n a 传感器发展的一大趋势。纳米材料本身独特的物理和化学性质，如量子尺寸 效应、小尺寸效应、表面效应和量子隧道效应使得它在电化学传感领域有极大的 应用前景。功能纳米颗粒( 电子、光和磁) 可与生物分子连接，使生物分子传感信 号得以放大。纳米金颗粒由于制各过程简单，粒径可控，而且具有很好的生物相 容性，容易与生物分子，如d n a 、酶等结合，成为非常适合于在生物传感器中进 行生物标记的纳米粒子【5 j 。 近年来，分子生态学在以功能基因多样性为核心的方向上发展迅速，为从分 子生物学及功能基因角度了解堆肥体系中微生物群落，及木质纤维素功能降解菌 编码基因提供了新的视野【6 l 。在此基础上，以木质纤维素降解功能菌功能编码基 因作为研究切入点，对进一步深入研究堆肥体系中微生物发挥的功效及降解机理 具有十分重要的现实意义，与此同时，由于某些基因片段具备靶基因性能，因而 提供了以靶基因为新的研究入口实现对微生物群落多样性、微生物群落基因丰度 的的深层次了解途径【7 。9 】。目前已有大量研究集中于筛选、分离高效木质素降解菌， 微生物对木质纤维素的降解功能取决于其体内编码酶的相应功能基因已经为大家 所认识1 0 1 ，因此用生物传感器检测木质素降解酶编码基因在堆肥的过程控制以及 木质素降解条件的优化方面具有较为广阔的应用前景。 生物传感技术检测堆肥体系中木质纤维素功能编码基因的研究 1 1 木质纤维素降解微生物、酶系及其影响因素 1 1 1 木质素的概况 木质素是一类由醚键和碳碳键将苯丙烷单元连接形成的复杂无定型高聚物 【1 1 1 ，结构复杂，不溶于任何溶剂，它是木制腐殖质的产物，也是农田产物，如秸秆， 以及生活垃圾中的一种难降解的物质。在化学结构方面，木质素是由苯丙烷单元 通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子化合物。共有三种基本结构 ( 非缩合型结构) ，即愈创木基结构、紫丁香基结构和对羟苯基结构( 见图1 1 ) 。 c 二 愈创木基结构 紫丁香基结构 一一q 一。h 对羟苯基结构 图1 1 木质素的三种基本结构 1 1 2 堆肥体系中降解木质素的微生物群落 在自然界中，木质素的完全降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的 结果，其中真菌起着主导作用。根据木材腐朽类型，降解木质素的真菌木腐 菌( w o o d r o tf u n g i ) 可分为白腐菌、褐腐菌和软腐菌3 类1 1 2 j 。除此之外，还有一 些以放线菌为主的原核生物，也能产生木质素降解酶，但这些原核生物所分泌的 木质素降解酶都是胞内酶，这就决定了其在木质素降解菌的研究中处于一个相对 次要的地位。其中自腐菌降解能力最强。 目前，研究得最多的是黄孢原毛平革菌( 尸j l 口，l e ，- o c 矗口p 把c r d j p d ，f “m ) ，它 是目前最有效的木质素降解菌，已成为研究木质素降解的一种模式菌【l3 1 。黄孢原 毛平革菌是白腐真菌之一，具有很强的降解木质素的能力。目前报道，能被黄孢原 毛平革菌降解的有机污染物质多达数百种，尤其对人工合成的有机污染物有很强 的降解能力。它的木素降解酶系是由次级代谢阶段产生的过氧化物酶和乙二醛氧 化酶( g l y o x a lo x i d a s e ) 组成。黄孢原毛平革菌的木素降解系统是底物非特异性 的。而且在限氮、限碳培养基中都能合成木素过氧化物酶。并且，这种菌的特异 性在于它不仅对木质素，而且对许多种类的有机物尤其是人工合成的有机污染物 都有很强的降解能力，这种特殊的降解机制在环保方面展现了巨大的应用前景，引 2 硕士学位论文 起了学术界和工业界的极大兴趣1 4 。15 1 。其它木质素降解微生物种类见表1 1 表1 1 降解木质素微生物的种类 1 1 3 纤维素的概况 纤维素大多数由绿色植物合成【l6 1 ，是全球蕴藏量最大的天然高分子化合物。 纤维素分子是由d 吡喃式葡萄糖基通过l ，4 b 糖苷键连接而成的线性的植物纤维 素，各个纤维素链之间再通过氢键作用形成纤维素的结晶区。据估计，全球每年 木质纤维素的更新量约为4 o l0 1 0 吨【1 7 1 ，而纤维素、半纤维素占5 0 以上，然而 纤维素的利用率却很低。由于纤维素的直接利用率较低，所以需要寻找合适的利 用纤维素废物的方法，不仅会能够避免环境的污染，而且也能节省巨大的资源。 因而，探索纤维素类废弃物的处理措施，对其进行有效利用是2 1 世纪的重大课题。 图1 2 是纤维素的结构式。 o 公 图1 2 纤维素分子结构示意图 生物传感技术检测堆肥体系中木质纤维素功能编码基因的研究 1 1 4 堆肥体系中降解纤维素的微生物群落 堆肥体系中能够降解纤维素的微生物群落非常多。大多分解纤维素的细菌属 厌气型，生长速率缓慢，且降解纤维素分泌的纤维素酶多为胞内酶，难以提取、 利用。在常见的降解纤维素的细菌中，研究比较多的有纤维素粘菌属( c ) ，泖j i 口g 口) 、 生抱纤维粘菌属( 印d r d 钞矽 口g 口) 以及纤维杆菌属( c p 勉如m d 挖口j ) 。分解纤维素能力 较强的放线菌主要包括纤维放线菌口c p 胁，d s 鲫p ) 、黑红旋放线菌口c ，砌d ，砂c e s 研p ，口力d c ) ，c 沱s ) 、玫瑰色放线菌似，d j e “j ) 等等。 到目前为止，研究的比较深入的降解纤维素的微生物大多属于真菌，如木霉 属、漆酶属、曲霉属、毛霉属、青霉属、裂桐霉属、耙霉属、根霉属、葡萄状穗 霉属、抱霉属、阿氏菌属等。同时，以上微生物分解纤维素时的共同特点在于能 够合成胞外纤维素酶，虽然其中有少量的微生物合成纤维素酶簇降解结晶纤维素 【1 8 】。由于木霉产生纤维素酶活力最高，所以目前研究最多的纤维素降解菌是木霉 属( 乃f c d 比，肌口点即) ，如z 陀p s e f ， z 1 ，打f 如，z 勋刀f ，z g f f 和z p s p 甜咖勋竹f 馏f f 。我国 在纤维素酶生产上应用的菌种大多也属于木霉。 1 1 5 木质纤维素降解酶系 1 1 5 1 木质素降解酶系 根据木质素降解产物分析，目前普遍认为木质素降解分为以下几步：脱甲基 和羟基化以形成多酚结构；加氧裂解多酚环，产生链烃；水解使脂肪烃缩短。 目前常见的三类木质素降解酶为利用0 2 的多酚氧化酶系和利用h 2 0 2 的过氧 化物酶系。它们分别是：漆酶( l a c c a s e ) 、锰过氧化物酶( m n p ) 和木质素过氧 化物酶( l i p ) ，木质素的降解过程与这些酶的产生息息相关，木质素降解的主要 过程是在这些酶的催化作用下发生的氧化反应。在木质素研究中，l i p 、m n p 和 漆酶被认为是木质素降解中的主要降解酶，但是关于它们在体外彻底降解木质素 的报道却鲜有见到，因为这些酶本身具有的酚氧化活力，它们在体外通常是聚合 木质素类物质而不是解聚【1 9 】。据相关文献报导，能产生h 2 0 2 的酶有葡萄糖氧化 酶、乙二醛氧化酶、吡喃糖氧化酶、芳香醛氧化酶和甲醇氧化酶等【2 0 1 。目前，研 究者通过对白腐菌降解木质素过程的研究发现，木质素的降解包括多种胞内、胞 外酶的协同参与，最终使得木质素氧化成小分子有机物进而被彻底催化转化成 c 0 2 ，参与全球碳循环过程。 1 1 5 2 木质素降解作用机理 木质素是植物的结构成分，主要分布在细胞间和细胞壁之间，其含量大概占 细胞整体结构的1 5 3 0 。木质素通过与半纤维素共价键结合为纤维素提供了 天然屏障，使酶轻易不能接触到纤维素分子。同时，木质素的非水溶性，以及本 4 硕士学位论文 身化学结构的复杂性，使得木质素难以轻易被水解。所以，只有先解决木质素的 降解问题，才能实现纤维素的降解，从而实现木质纤维素的再利用。白腐菌对木 素的降解是一个胞外的、非专一的、非水解的次生代谢过程。它通过分泌胞外氧 化酶，使木材中的木质素发生降解且不产生色素，被认为是主要的木质素降解微 生物。一些研究表明白腐菌也产生胞外羟基活性体，可能在木质素的降解中起作 用。 ( 1 ) m n p 酶系 只要能降解木质素的白腐菌几乎都可以产生m n p ，黄孢原毛平革菌也不例 外。黄孢原毛平革菌可以产生l i p 和m n p 等木质素降解酶，对于m n p 来说，其 分子结构和l i p 相似，也是一种糖蛋白，由一个红血素基和一个m n 2 十构成它的活 性中心。m n 2 + 在催化氧化中作为必要的电子供给者产生m n ”。锰过氧化物酶以有 机酸作为底物，在h 2 0 2 和二羧酸螯合剂存在条件下，可以氧化m n 2 + 为m n 针，而 m n 3 + 可以螯合有机酸，催化氧化二级底物如酚化合物、木质素相关复合物及大分 子量氯代木质素、氯代酚和许多其它物质网。在许多真菌中，m i l p 是木素起始降 解的关键酶，因为m n 3 + 作为可扩散的氧化还原介质裂解木素聚合物中的芳环部 分，然后在其它酶的协同作用下，最终导致大分子的断裂1 2 1 2 3 j 。 ( 2 ) l i p 酶系 l i p 是从黄孢原毛平革菌中发现的第一种木质素降解酶，在木质素的降解过 程中起着关键作用。因为许多的能腐朽木材的白腐菌都可产生l i p 酶，所以l i p 酶在自然界中的分布比较广泛。l i p 是代表一系列含f e 3 + 、卟啉环和血红素附基 的同工酶。h 2 0 2 氧化l i p 成缺电子中间体，这种中间体催化底物发生失电子的氧 化反应后恢复为原状态。l i p 酶降解木质素时能氧化富含电子的酚型或非酚型芳 香化合物，在电子传递体攻击木质素时，首先从木质素的芳环上取得一个电子， 从而使木质素形成阳离子活性基团，继而以链式反应产生许多不同的自由基，导 致木质素分子发生一系列裂解反应【2 4 1 。l i p 能催化丙基侧链的c 伍一c d 链的断裂， 这种裂解反应被认为是白腐菌降解木质素时最为重要的一个环节【2 引。 ( 3 ) 漆酶( l a c c a s e ) 漆酶( l a c c a s e ) 是一种典型含c u 2 + 的糖蛋白，也是一种多酚氧化酶。漆酶在 木质素中有着多重作用，植物漆酶参与木质素的生物合成过程，而真菌漆酶有对 木质素起着生物降解的作用【2 5 1 。它主要对木质素中的苯酚结构起开环作用。在漆 酶作用下，苯酚因氧化产生自由活性基团而导致c 。氧化，c 。c 8 和烷基芳香基的 裂解。另一方面，漆酶同时具有催化解聚和聚合木质素的作用，而m n p 等其他 酶具有避免反应产物重新聚合作用，此时m n p 才能充分发挥其木质素降解效率 【28 1 。e g g e r t 等【2 6 】在白腐真菌毋c ，z d p d ，“sc 伽以动口，砌“s 的培养基中只检测到了漆 酶，而该菌能很好地降解木质素。孙芹英等人【2 7 】用灵芝属漆酶高产菌对农作物秸 生物传感技术检测堆肥体系中木质纤维素功能编码基因的研究 秆进行降解，发现漆酶对玉米秸秆的木质素降解率达到2 3 7 ，对油菜秸秆的降 解率达到1 6 2 。 1 1 5 3 纤维素降解酶系 第一次出现“纤维素酶”的概念是在1 9 1 2 年，而关于纤维酶相关系统的报道则 在1 9 5 0 年后才逐渐出现。依据根据纤维素酶的底物、作用位点和释放产物将其分 为三类2 7 】：内切葡萄糖苷酶( e n d o 1 ，4 p d g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 4 ，简称e g ) 。内 切葡萄糖苷酶主要作用在纤维素分子内部的非结晶区，将长链纤维素分子截短成 纤维素小分子，如纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖等等。外切切葡萄糖苷酶，或 称纤维二糖水解酶( e x o 1 ，4 一p d g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 9 1 ，c e l l o b i o h y d r o l a s e ，简称 c b h ) ，外切切葡萄糖苷酶作用于纤维素线状分子末端，通过水解切掉纤维二糖分 子实现对纤维素的降解。b 一葡萄糖苷酶( 8 g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 1 ，简称b g ) ， p 一葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子有胞内酶和胞外酶之分。 1 1 5 4 纤维素降解作用机理 纤维素的降解过程大致如下：内切酶首先发挥功效，它随机在纤维素链的各 个位点将底物水解成寡聚糖，之后外切酶从纤维素链的非还原端对寡聚糖进行进 一步水解，生成纤维二糖，最后在p 葡萄糖苷酶作用下，纤维二糖继续水解生成 葡萄糖【2 8 3 1 1 。 有研究者认为c t 酶首先活化纤维素，接着c x 酶在活化的部位与c l 酶协同 作用分解纤维素【3 2 1 。而p e t t e r s s o n 等人提出天然纤维素的水解始于c x 酶【3 3 1 ，他 们认为首先是c x 酶火花了纤维素，将特定位置上的分子链打开，为c l 酶进一步 深入打开氢键提供了便利，在二者的共同作用下，最终将纤维素水解为葡萄糖。 已有大量文献资料在介绍内切酶与外切酶之间的协同作用。二者之间的交叉 协同作用如今已经得到了大量资料的证实【3 4 1 。w b o d 等人认为在好氧真菌纤维二 糖水解酶与纤维素酶间同时存在着协同作用。与此同时，一些研究者已经在分子 水平上研究纤维素降解机制，他们认为负责催化的氨基酸通过底物异头碳原子位 构型的保留或转化完成催化反应【3 5 1 。但由于纤维素酶作用的底物具有高度复杂性 以及底物的多样性，纤维素水解过程的具体细节并没有完全研究清楚。因此，纤 维素酶系的降解机理还有待进一步研究和探讨。 1 2 生物传感器概述 1 2 1 生物传感器的基本结构 生物传感器是由固定化的细胞、酶或其它生物活性物质与换能器( 如电极、热 敏电阻、离子敏场效应管) 相配合组成的传感器。它是近年来生物医学和电子学、 6 硕士学位论文 工程学相互渗透而发展起来的一种新型信息技术，是多学科综合交叉的一门技术。 生物传感器在科学研究、工业生产乃至人们的生活中起着很重要的作用，同时在 医、药、农、牧等学科和食品、发酵、制药等工业部门以及环境监测等方面均有 广泛的应用价值，发展前景十分广阔【3 6 。4 3 】。 生物传感器主要由产生信号的敏感元件和处理信号的辅助仪器两部分组成， 其中敏感元件包括了敏感基元和换能器，它是传感器的核心。1 9 6 2 年c l a r k 【3 9 】在 纽约自然科学学会的论文集中首次提出了“在化学电极的敏感膜中加入酶以实现 对目标物进行选择性分析”的设想。这一设想经过u p d i k e 等人的发展后【40 。，于 1 9 6 9 年由g u i l b a u l t 和m o n t a l v o 变为了实验事实【44 。目前由于检测手段的不断 发展，新型的压电效应、光效应、热效应等换能技术已在进一步的完善之中【4 5 1 。 1 2 2 生物传感器的原理、特点和分类 生物传感器是利用生物的因子或生物学原理来检测或计量化合物的装置。其 传感原理如下图所示，待测物质通过生物识别物的特异性识别产生生物变化信息， 通过信号转换器将生物变化信息转换成可识别的信号，为进一步的研究和数据分 析工作提供便利【4 引。 生物传感器有以下主要特点：多样性。根据生物反应的特异性和多样性， 理论上可以制成所有生物物质的酶传感器。无试剂分析。除了缓冲溶液外，大 多数酶传感器不需要添加其他分析试剂。操作简便，快速、准确、易于联机。 可以重复使用，连续使用，也可以一次性使用。 信 分 信 号 子 母 号 母 放 识 转 大 别 换信 一 兀 器号 件 处 理 图1 3 生物传感器的工作原理 生物传感器的基本分类方法有以下两种：按生物敏感材料分类法和按能量分 类法。依据生物敏感材料分类，生物传感器包括酶传感器、免疫传感器、微生物 传感器、细胞传感器、光生物传感器、组织传感器等；按能量装换器件，分类如 下：电化学生物传感器、热生物传感器、光生物传感器、半导体生物传感器和声 生物传感器等，其中，电化学生物传感器是一类发展快速，得到研究者普遍青睐的 传感器类别【4 7 1 。同时，根据生物传感器中生物分子识别元件上敏感物质的不同，电 化学生物传感器可分为酶传感器、免疫传感器、电化学d n a 传感器等。 7 生物传感技术检测堆肥体系中木质纤维素功能编码基因的研究 1 2 3d n a 电化学传感器 d n a 电化学传感器通常由已知序列的单链d n a 分子和电极组成。该单链 d n a ( s s d n a ) 分子称为d n a 探针，一般为寡聚核苷酸。按照d n a 碱基配对原 理，单链d n a 与靶序列( t a r g e t sq u i n c e ) 是互补的，我们称之为d n a 探针。一 般而言，可以直接将s s d n a ( 探针分子) 修饰到电极表面构建d n a 修饰电极， 也可以利用s s d n a 的序列选择性，通过竞争式杂交法或者三链夹心式杂交法引入 其它设计链更好的来实现s s d n a 的固定，构建分子识别能力更强的d n a 修饰电 极。 1 2 4d n a 电化学传感器的原理和特点 d n a 的检测、d n a 序列测定和d n a 突变测定是如今应用d n a 在分子生物 学检测最常见的三种方式。这些测定对于临床诊断、反恐侦查、食品安全、检疫 有着重大的意义【4 8 4 9 1 。传统的d n a 检测方法主要包括分子杂交和电泳，然而这 些方法都存在时间消耗较长、操作繁琐复杂、效率偏低的劣势。近十年来，d n a 传感器和d n a 阵列的出现很好的弥补了这一缺陷。 d n a 电化学生物传感器的工作原理是：在适当的温度、p h 条件下，当检测 底液中存在可以识别单链d n a 和双链d n a 的杂交指示剂时，固定在电极表面的 单链d n a 一旦与其互补的单链特异性杂交，指示剂将会获得一个化学变化的信 号，即通常所说的电化学响应信号。研究者可以根据电化学响应信号的改变来判 断体系中是否存在目标d n a 链【5 引。一般情况下，在特定范围内，通过指示剂获 得的响应信号与待测d n a 的物质的量成线性关系，可根据此线性关系反过来定 量推算d n a 的含量。归纳而言，便是：由于单链d n a 与互补单链的杂交具有高 度的序列选择性，因此使得该类型电极的分子识别功增强能，一旦固定在电极表 面的d n a 探针分子与靶序列杂交，双链d n a 的形成将使得电极表面结构发生改 变，具有电活性的杂交指示剂可以识别而这一改变，最终达到了检测目标基因序 列的目的。 d n a 电化学传感器的特征如下：较高的特异性。这一特征源自d n a 分子 互补链之间具有较高的特异性识别能力。较强的稳定性。有报道称，d n a 传感 器的重现性较相同条件下制备的酶电极具有更高的重现性和稳定性。d n a 链的 简单易获取。由于分子生物学的发展，d n a 链的获得相比蛋白质等更为方便快捷， 不仅可以从生物体重提取获的，也可以用仪器批量合成。操作方法具有通用性 和扩展性，不仅容易实现标准化，也能够结合芯片技术，研制发展d n a 阵列， 从而获得高通量的测定办法。相较其他生物传感器具备更高的灵敏度【5 3 1 。 硕士学位论文 1 2 5 酶生物传感器的概述 目前的酶生物传感器的分类法主要有两类。一种是利用酶对底物的催化特性 来检测物质如本实验论文中利用漆酶对邻苯二酚的检测便是利用有毒有害物质的 对漆酶的抑制作用来定量分析有毒有害物质的量。此外，汤琳等人构建的基于c r 6 + 对葡萄糖酶的抑制作用来检测水体中的c r 浓度也属于此分类。第二种是利用酶与 底物的络合作用产生的电流变化对底物实现检测。 1 2 6 酶生物传感器中酶的固定方法 固定化酶技术目前己成为生物工程领域的重要分支【5 1 1 。固定化技术就是采用 物理或化学的方法将微生物固定于载体之上，使微生物细胞不溶于水并保持良好 的生物活性。固定化微生物技术存在着一系列优点：( 1 ) 固定化技术可以使得溶液 中长期维持比较高的微生物浓度，具有良好的吸附性能，因此处理效率高；( 2 ) 水力停留时间与固体停留时间的有效分离，有利于世代时间长的微生物存留；( 3 ) 由于载体的作用，生物分子的稳定性能大大提高，机械强度增强，微生物对不利 环境( 如低p h 、高温等) 的抵抗性增强，对污染物毒性的耐受能力也得到加强； ( 4 ) 固定化微生物技术适用范围广，技术日益成熟，相对传统处理方法，处理成本 有了很大的降低，从而具有竞争优势。 根据对各种方法的分析，一般可主要分为包埋法、吸附法、共价结合法、交 联法等，其中以包埋法的研究应用最为普遍。其中吸附法简单，但细胞膜易于脱 落；交联和共价结合法操作复杂，对细胞活性影响也较大；包埋法简单易行，对 生物分子活性影响较小，为很多研究者所采用。 1 2 6 1 包埋法 包埋法操作简单，对生物分子影响较小，是酶固定化最常用、研究最广泛的 方法之一。包埋法的基本原理是使酶分子包埋在半透明的聚合物或膜内，或使微 生物细胞扩散进入多孔性的载体内部，小分子底物及反应代谢产物可自由出入这 些多孔或凝胶膜，而酶却不能动。根据