（环境工程专业论文）高效石油烃降解菌的分离、鉴定及降解能力研究.pdf

北京化工大学硕士学位论文 了一定的降解作用( 2 6 2 ) ，其对石油烃的的抗性高于玉米。水稻、高效 石油烃降解菌以及水稻一高效石油烃降解菌复合体系对土壤中的石油烃降 解率有显著差异，其中水稻一微生物联合体系的降解效率最高( 5 3 3 ) 。 关键词：石油烃，高效石油烃降解菌，温度，p h ，营养，氮磷比 i l 摘要 i s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n dd e g r a d a t i o nch a r a c t e r i s t i c so f p e t r o l e u m - d e g r a d i n gb a c t e r i a a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm o d e mpe t r o l e u mi n d u s t r 弘i tb r i n g sg r e a t e c o n o m i cb e n e f i t s ，a tt h es 锄et i m ei tp o s e ss 耐o u st h i e a tt ot h ee n v i r o n i i l e n t d u r i n gt h ep r o c e s so fr e c o i l i l a i s s a n c e ，e x p l o i t a t i o n ，仃a n s p o n a t i o na n dd 印o s i t ， al a 唱ea r e aa r o u n dt h eo i lf i e l ds u 缅珧d 舶ms e r i i o u sp o l l u t i o n t h ep r e s e n t d i s p o s a lw a y so fo i lp o l l u t i o ni n c l u d e sp h y s i c a l t e c l u l i q u e ，c h e m i c a lt e c 王u l i q u e a n db i o l o g i c a lr e s t o r a t i o n ，锄o n gw h i c h ，b i o l o g i c a lr e s t o r a t i o nh a sd i s t i n c t a d v a n t a g e sb e c a u s et h em i c r o b i o l g i c a lt e c h i q u ea t t r a c t sp e o p l e s a t t e n t i o n d u et oi t se c o n o i n yh i g he 伍c i e n c ya n dn os e c o n dc o n t a m i n a t i o n l a b o r a t o 拶s c a l eb a t c hs t l l d i e sw e r ep e r f o n n e dt ot e s tt h ep e 打o l e u m h y d r o c a r b o nb i o d e g r a d a t i o na b i l i t yo ft 、) l ，o 体绷如m d ，z 船s 舰i n sbla n db 2 i s o l a t e df b mt p h ( t b t a lp e t r o l e u m h y d r o c a r b o nc o i n p o s e do fa l k a n e ， a r o m a t i c s ，n i t r o g e n 一，s u l m r ， a n d o x y g e n - c o n t a i n i n gc o n l p o u n d ， a n d a s p h a l t e n ef h c t i o no fc m d eo i l ) c o n t 锄i n a t e ds o i li nt h ev i c i n i t yo fa nc o 妯n g p l a n ti nt i a n j i n s t r a i n sb 1a n db 2c o u l du t i l i z et p ha st h es o l es o u r c eo f c a r b o na n de n e 玛y t h ew h o l e 就o r e m e d i a t i o np r o c e s s e sa r e s i g n i f i c a n t l y i l i 北京化工大学硕士学位论文 a 虢c t e db yt h ei i l h e r e n tc a p a b i l i t i e so ft h e 血c r o b e ，t h e i ra b i l i t yt oo v e r c o m e t h eb i o a v a i l a b i l i 哆l i m i t a t i o n si ne n v i r o m n e n t ，a l l de n v i r o 眦e n t a lf a c t o r ss u c h a s o x y g e nc o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a _ t u r e ，p h ，s a l i n i 坝 e x t e n to fp e t r 0 1 e u m d i s p e r s i o n ，n u t r i e n t sa n de l e c t r o na c c 印t o ra v a i l a b i l i 哆i no u rr e s e a r c h ，t h e m a x i i n u md e 罂a d a t i o nn e a n y8 0 w a ss h o w e da tt e m p e 胁r eo f3 5 0 c ，p ho f 7 o ，n ：pr a t i oo f5 ：la n di n i t i a lt p hc o n t e n to f2 0 0 0 m 蚝r e s p e c t i v e l y o n t h eb a s i so ft e s ta n da n a l y s i st h ep o t t e dp l a me x p 嘶m e n to fm a i z ea n dr i c e ， a n da d di nt h ep e t r o l e u mh y d r o c 打b o n d e g r a l d i n gb a c t e r i a lw ei s o l a t e df 两m t h ep e t r o l e u mh y d r o c a 而o n c o n t a m i n a t e ds o i l ，w es t u d i e dm eg r o w t ho ft h e p l a mr o o ti n n u e n c e db yt h ep e t r o l e u mh y d r o c a r b o na i l dt l l o s ec o n t a m i n a t i o n s d e g r a d e db yt h ep l a n t - m i c r o b es y s t e m t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，t h eg r o w t ho f t h er o o tw a sa c c e l e r a t e dw h e nt h ep e t r 0 1 e u mh y d r o c a r b o nc o n t e n tw a sl o w e r t h a n1o o o m g 瓜g 黜c ec a l ld e 伊a d em ep e t r o l e u mh y d r o c a r b o nt o o ( 2 6 2 i n t h r e ew e e k s ) a n di t sr e s i s t a n c et ot h ep e t r o l e u mh y d m c a r b o nw a ss 缸o n g e rt h a n m a i z e t h ed e g r a d a t i o no ft h ep 咖l e u mh ”i r o c a r b o nb yr i c e ，m i c r o b ea n d r i c e m i c r o b es y s t e mw a so b v i o u s l yd i f f i e r e n ta n dm er i c e - m i c r o b es y s t e mw a s t h eb e s t ( 5 3 3 ) k e y w o r d s ：p e t r o l e u mh y d r o c a r b o n ，p e 们1 e u mh y d r o c a r b o nd e g r a d i n g b a c t e r i a l ，t e m p e r a t u r e ，p h ，n u t r i t i o n ，n ：pr a t i o i v 北京化工大学硕士论文 前言 石油是重要的工业原料，同时又是不可或缺的燃料与能源，是国民经济建设的重要 支柱，也是经济快速发展的必要保障。随着社会的发展，人类对石油的需求不断扩大， 各国都加快了对石油资源的开发利用，目前世界石油总产量每年约2 2 亿吨。石油在 开采、加工和利用的过程中，由于意外事故或管理不当，造成石油及其残渣进入生态 环境而引起环境的污染和破坏，当今石油污染已成为世界性公害之一。 石油污染的治理主要有物理法、化学法和生物法三种。由于物理、化学法在处 理石油烃污染时效果不够理想且容易引起二次污染，所以2 0 世纪8 0 年代以来，石油烃 污染的生物修复技术逐渐引起人们的关注。石油烃污染的生物修复技术，主要是指利 用特定的生物( 植物、微生物或原生动物) 吸收、转化、清除或降解石油烃污染，实现 环境净化。生物修复技术具有费用低、处理效果好、对环境影响小、无二次污染、不 破坏植物生长所需要的土壤环境等优点。常用的石油烃污染修复技术主要有微生物修 复技术和植物修复技术两种，而其中微生物修复技术是当今世界研究的热点。 本论文研究的主要内容是从被污染土壤中分离出能够降解石油烃的微生物，通 过驯化，优化其降解条件之后对土壤中石油烃进行修复。与前人的研究相比，本实验 利用气相色谱进行定量研究，误差小，实验重现性好，筛选所的菌种降解效率也比较 高，修复效果好。而且本论文对微生物一植物联合修复的盆栽实验也做了一定的研究， 可以为大规模微生物一植物联合修复提供一定的参考和帮助。 由于利用生物修复石油烃污染具有无可比拟的优越性，而高效降解菌的选育是 实验微生物修复的重要前提步骤，能为石油污染的治理提供微生物基础，为大规模工 业化处理提供菌种。因此，本课题具有重要的经济和社会效益。 v i l l 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 作者签名：刍迂垂日期：2 翌曼垒：丝 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大 学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在土年解密后适用本授 权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：刍重塾 导师签名：2 堑丝! 日期：丝垦苎二罗兰 第一章文献综述 第一章文献综述弟一早义陬琢尬 石油是目前环境中广泛存在的污染物之一，包括汽油、煤油、柴油、润滑油、石 蜡和沥青等，是多种烃类( 正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳烃) 和少量其他有机物( 硫化 物、氮化物、环烷酸类等) 的混合物。随着经济的发展，人类对能源的需求不断扩大， 石油已成为人类最主要的能源之一，各国都加快了对石油资源的开发利用，目前世界 石油总产量每年约2 2 亿吨u 1 。石油在开采、加工和利用的过程中，可能会进入生态环 境而引起环境的污染和破坏，当今石油污染已成为世界性公害之一。利用微生物对石 油烃特别是土壤中的石油烃污染进行生物治理和修复是目前环境科学研究的重点和 热点。本文就土壤中总石油烃( t p h ) 污染的修复重点是微生物修复进行了综述，以 期反映此领域的研究进展、存在的问题及将来的发展方向。 1 1t p h 污染的危害 进入土壤的t p h 可以在很多方面影响土壤环境，对土壤和植物生态系统造成影 响：1 ) 土壤中t p h 积累堵塞土壤孔隙，改变土壤有机质的组成和结构，引起土壤有机 质的碳氮比( c n ) 和碳磷比( c p ) 的变化；2 ) t p h 阻碍植物根系的呼吸与吸收，引起根 系腐烂，影响农作物的根系生长，导致农作物减产嘲；3 ) 通过吸收作用进入并积累在 植物体内的t p h 具有致癌、致变、致畸作用，由食物链传递进入动物体内，最终引起 人类的健康风险嗍；4 ) 没有被土壤吸附的t p h 渗入地下并污染地下水，增加污染范围， 从而对人类生存环境的多个层面产生广泛影响h 1 。 t p h 经常以非水相液体( n a p l ) 的形式污染土壤、含水层和地下水。在重力作 用下，若未被土壤吸附的n a p l 的密度比水大，t p h 将穿过地表的土壤层，在含水层 的底部扩散；而密度比水小的则沿地下水面横向扩展。其可溶性成分逐渐溶解到水中 形成持久性污染嗡1 。 1 2t p h 污染的修复 土壤和水体对t p h 具有一定的自净能力，能通过自身的一些物理、化学和生物学 变化来消除t p h 污染的不利影响。当进入环境的t p h 超过环境的承受能力时，这种自 净作用就远远不能满足要求了。经过人们的不断研究，逐步出现了包括物理法、化学 北京化工大学硕士学位论文 法和生物处理( 生物修复) 法等一系列人工修复t p h 污染的方法。 1 2 1 物理修复法 物理法是目前处理t p h 污染最常用的方法之一，主要包括热处理法( 焚烧法) 、 隔离法、换土法等。但这些方法都存在一定的局限性：热处理法在净化土壤中大部分 t p h 同时会破坏土壤结构和组分，并且焚烧过程中会产生有毒物质从而对环境造成二 次污染；隔离法没有破坏t p h ，只是阻止了它在土壤中的迁移，不能作为永久性的处 理方法；换土法人工费用较高，适用于小面积严重污染的土壤治理，尤其是事故后的 简单处理最近a y o t a m u n o 和k o 曲a r a 等人晦3 研究了利用活性炭来吸附水体中的石 油污染物，取得了令人满意的结果。 1 2 2 化学修复法 化学处理法也是目前t p h 污染环境修复过程中经常采用的方法，主要包括： ( 1 ) 萃取法：根据相似相溶原理，利用有机溶剂对污染土壤中的t p h 进行萃取、分离、回 收，并实现废物的资源化，比较适合用于油浓度较高的土壤。( 2 ) 土壤洗涤法：将 污染土壤破碎，混入足够的水和洗涤剂，得到土壤、水和洗涤剂相互作用的浆液，过 滤洗去t p h 后将土壤重新归入环境。有人曾利用6 种表面活性剂对有机污染土壤进行淋 洗实验，结果土壤中残余的有机物大大减少口1 。( 3 ) 化学氧化法：向被t p h 污染的土 壤中喷撒或注入化学氧化剂，使其与污染物质发生化学反应来实现净化的目的，适合 土壤和地下水同时被t p h 污染的治理。这些化学处理方法虽然除油效果比较好，但是 操作非常复杂，而且所加入的化学试剂很容易会引起二次污染的问题，因此实际应用 受到了很大的限制。 由于物理、化学法在处理t p h 污染时效果不够理想且容易引起二次污染，所以 2 0 世纪8 0 年代以来，t p h 污染的生物修复技术逐渐引起人们的关注。t p h 污染的生物 修复技术，主要是指利用特定的生物( 植物、微生物或原生动物) 吸收、转化、清除或 降解t p h 污染，实现环境净化。生物修复技术具有费用低、处理效果好、对环境影响 小、无二次污染、不破坏植物生长所需要的土壤环境等优点。常用的t p h 污染修复技 术主要有微生物修复技术和植物修复技术两种，而其中微生物修复技术是当今世界研 究的热点。 1 2 3 生物修复法 2 第一章文献综述 微生物修复主要利用土壤中的土著微生物或向污染环境补充经驯化的高效微生 物，在优化的环境条件下，加速分解污染物，修复被污染的土壤隅】，具体可以分为原 位生物修复和异位生物修复两部分m 。 原位生物修复是将受t p h 的污染土壤在原地处理，包括投菌法、生物培养法、生物 通气法等n 们。投菌法是直接向遭受t p h 污染的土壤接入外源的污染降解菌，同时提供 这些微生物生长所需要的营养物质，包括常量营养元素和微量营养元素。s a l l j e e t m i s s h 随，j e c v 趾j y o t 等1 通过采用存在于载体上的细菌联合体和营养物质对4 0 0 0 m 2 的 t p h 污染土地进行处理，结果证明是可行的。生物培养法是定期向t p h 污染的土壤中 加入营养元素和氧或h 2 0 2 作为微生物氧化的电子受体，以满足污染土壤中已经存在的 降解菌的需要，提高土著微生物的代谢活性，将t p h 彻底地矿化为c 0 2 和h 2 。生物通 气法是一种强迫氧化的生物降解方法，在t p h 污染的土壤上打至少2 口井，安装鼓风机 和抽空机，将空气强排入土壤中，然后抽出，土壤中的挥发性有机毒物也随之去除。 在通入空气时，可以加入一定量的氧气和营养液( n 、p 等) ，为土壤中降解菌提供营养， 促进其降解活性提高n 2 培1 。 异位生物修复是将t p h 污染土壤挖出，运送至专门场地进行处理的方法。主要方 法有：堆肥处理法、预制床法、生物反应器法等。堆肥处理法是将受t p h 污染的土壤 从污染地区挖掘起来，运输到一个经过处理的地点( 布置防止渗漏底，通风管道等) 堆 放，形成上升的斜坡，并进行生物处理。a 1 d a l l e rr 等n 钔在科威特b u r g a i l 油田采用长 条行堆肥法处理原油污染土壤，在连续运转l o 个月后，土壤中的t p h 污染物基本被降 解完全。预制床法是在不泄露的平台上铺上沙子和石予，将污染的土壤以1 5 3 0 c i i l 厚 度平铺其上，加入营养液和水，必要时加入表面活性剂，定期翻动充氧，以满足土壤 微生物的需要，处理过程中流出的渗滤液，即时回灌于土层，以彻底清除t p h 污染。 生物反应器法是将t p h 污染土壤置于专门的反应器中进行处理。生物反应器一般建在 现场或特定的处理区，通常为卧鼓形和升降机形，有间隙式和连续式两种。因为反应 器可使土壤与微生物及其他添加物如营养盐、表面活性剂等彻底混合，能很好地控制 降解条件，因而处理速度快，效果好。原始的序批式生物反应器降解t p h 污染一般需 要l 3 个月，o w e l lw a r d 等u 司通过改进碳氢化合物接近降解菌的方式，进而发明了一 种缩短降解时间的方法，可以使降解时间缩短为1 叽1 2 天。 1 3t p h 降解菌的种类和相关基因 在细菌、真菌、藻类和酵母中均发现了能以石油烃为唯一碳源和能源的微生物， 约有3 0 属1 0 0 多种，主要包括a p 砒，l o 刀鲫、彳如加m d 施c 幽盯，彳，珐厂d 施c 胞，、施c 阳c c 淞、 o c 口，访以、 m 6 ，f d 、么c f 玎e 幻6 n c f e ，、b 愆v f 6 a c 纶一“m 、c 6 秒n e 6 a 纶，f “m 、，肠v d 6 口c 把一“m 、 3 北京化工大学硕士学位论文 c a 蒯z 妇、鼬d 如幻朋肠，跏，d 6 d 如删等。 t p h 降解基因是近年来研究的重点，随着研究手段的增加和技术的不断进步，关 于这方面的研究成果也非常显著。1 9 9 9 年，c 1 l r i s t i 锄h 锄a l l n 等人n 刚对2 0 种芳烃类化合 物降解菌的降解酶基因进行编码，并运用d n a 的杂交实验和p c r 方法确定了降解基 因。s 锄j e e tm i s h r a 等人n 刀从原油污染的土壤中提取了么c 切口幻6 口c 幽盯施加协口万一f fs 3 0 菌 种，将编码荧光酶的锻基因质粒导入菌种基因，考察了该基因重组菌的原油降解能 力、存活能力及稳定性，都得到了较理想的效果。r u b e 哟l u c 弱等n 阳考察了极端条件 下石油烃降解菌的降解情况，研究了南极洲土壤中碳氢化合物的非生物流失、菌群的 生物降解活性以及n 、p 的生物聚集，利用p c r 技术对降解菌的1 6 sr r n a 进行克隆放大 后测序，得到了以1 6 sr r n a 序列为基础的系统发育树。 近年来，1 p h 中芳烃类化合物的降解基因研究也取得了重大突破，确定了许多能 降解芳烃类化合物的基因。炳锄e y 盯和h e i d e r 从一株反硝化菌中分离得到了乙苯 脱氢酶。1 w a b u c l l i 和h a r a y 锄a 从菲降解菌中纯化得到了2 羟基苯醛脱氢酶。 c o s 幽g a n 0 和y o 眦g 首次在一株反硝化菌中发现了与芳香烃类厌氧降解的调节基因 胁坍和砌嘲。 基因工程的出现使改变细胞内关键酶和酶系统，构建高效t p h 降解菌成为可能。 利用不同底物具有t p h 降解活性的酶，组合构建新的复合代谢途径已经用于卤代芳 烃、烷基苯乙酸等的降解。通过引入编码新酶活性基因，对现有的基因物质进行改造、 重组，构建的新微生物可用于氯代芳烃的降解。 1 4 微生物降解t p h 的机理 t p h 的微生物降解过程主要分3 步来进行：第l 步是t p h 在水中的溶解及在微 生物表面的吸附；第2 步是t p h 在微生物细胞膜的运输；第3 步是t p h 在微生物细 胞内的降解。 1 4 1t p h 在水中的溶解及在微生物表面的吸附 由于t p h 在水中的溶解度非常小，且部分t p h 还可以强烈地吸附在土壤颗粒上， 很难直接被微生物利用，从而限制了微生物对t p h 的降解乜。鉴于表面活性剂对石 油烃具有一定的增溶和分散作用，有人提出了利用表面活性剂来增加t p h 的溶解度。 南照东等口羽研究了非离子表面活性剂t w e e n 8 0 的相图、相转换温度和表面活性剂的 亲水亲油平衡值对相态的影响，结果表明t w e e n 8 0 对多环芳烃具有很好的增溶作用， 可以增强微生物对有机污染物的降解。j o n a t h a i ld 等啪1 研究了发现非离子表面活性剂 4 第一章文献综述 t g 印a lc o - 6 3 0 ( n o n y l p h e n 0 1e t h o x y l a t e ) 能增强菌株内p 砌聊d 嬲妒j a 5 b 4 5 和 r d 如c d c c 淞印f 9 一d 7 对t p h 的降解。 有研究表明表面活性剂对微生物也存在一定的毒害作用。张丽芳等乜町研究了表 面活性剂对从辽河油田分离出的4 株高效降解石油菌除油率的影响，发现表面活性剂 浓度过高时对菌株的生长和除油率均存在明显的抑制作用，其可能的原因是：1 ) 表 面活性剂与细胞膜的脂质物质相互作用，而破坏了细胞膜；2 ) 表面活性剂会与酶或 其他影响细胞基本功能的蛋白质发生反应。此外表面活性剂作为碳源可能被微生物优 先利用，从降低微生物降解效率。 微生物还通过自身的适应性机制来提高对t p h 的利用率。对此目前存在两种解 释，一种是特异性附着机制：微生物通过菌毛或细胞膜的脂类和蛋白使细胞形成疏水 表面而附着于水中的油滴上；另外一种是烃类乳化机制：微生物通过释放出乳化剂将 油滴乳化成小颗粒，增大油滴的表面积，有利于微生物的直接接触和利用n 射。如 白，l 历妇彳疗幼虎口菌自身能够产生生物表面活性剂，使得它对烷烃的降解能力大大增 加。z h a l l gy m i l l e rr 等瞄1 研究发现a 绷如聊d ，l 甜菌对污染物的降解能力还与它们产 生的表面活性物质的疏水性有关，疏水性越强，降解污染物的速度越快。 1 4 2t p h 在微生物细胞膜的运输 t p h 在微生物细胞膜的运输是t p h 微生物降解的重要环节之一，但关于t p h 如 何通过细胞膜目前还不很清楚。现在的跨膜运输理论主要存在被动运输和主动运输两 种。b a t e i i l 觚jn 和s p e c rb 等哺1 认为萘是通过被动运输的方式进入微生物体内的，不 存在转运蛋白。而w h i t i t l a i lbe 和h 垤l k o n gdr 发现风鲥如朋d ，l 船口g 似曲z d 船菌和 n p “如m 伽础肛d 陀，淞菌在吸收萘的过程中存在主动运输1 。也有研究表明，微生 物自身产生的生物表面活性剂也能使微生物细胞膜结构发生改变，从而引起污染物通 过细胞膜的机会大大增加。c a r r i l oc 与t e n l r lja 等发现有些表面活性剂能够集合排 列在微生物细胞膜的表面，有的甚至还可以镶嵌在细胞膜中，从而在细胞膜表面形成 类似通道的孔状结构，使t p h 更容易通过细胞膜进入细胞体内瞄】。 1 4 3t p h 在微生物细胞内的降解 t p h 在细胞内的降解主要是由于t p h 与细胞内的降解酶结合发生了酶促反应。 t p h 的微生物降解机理是由美国微生物学家z o b e l l 首先提出的，通过大量研究，最终 形成了烷烃和芳香烃两套不同的机理啪1 。 ( 1 ) 烷烃的降解机理： 主要有烃类的末端氧化模式，包括： 5 北京化工大学硕士学位论文 单末端氧化 r c h 2 c h 3 r c h2 c h o h r c h 2 c h o r c h 2 c o o h 双末端氧化 c h 3 c h 2 r c h 2 c h 3 - c h 2 0 h c h 2 r c h 2 c h 2 0 h 亚末端氧化 r c h 2 c h 3 r c h o h c h 3 r c h o c h 3 卜r c o o h c h 3 在不同的反应体系中，这3 种氧化模式各自起着不同的作用。比如，以烷烃为 唯一碳源和能源的细菌，末端氧化可能较为重要，而在那些主要起辅助氧化烷烃作用 的细菌中，亚末端氧化作用可能是主要的啪1 。 除了上述3 种机理外，烷烃还有可能存在的降解途径有： r c h 2 c h 3 r c h 2 c o o h c h 3 r c h 2 c h 2 0 h 。r c h 2 c o o h r c h 2 c h 3 r c ( o o h ) h c h 3 r c h o h c 单r c o c h ， ( 2 ) 芳香烃的降解机理： 相对于烷烃来讲，芳烃稍难于降解。它的微生物降解机理，目前认为，首先生成 中间体顺式结构的二氢二醇，然后在过氧化物酶的催化下转化为邻苯二酚，邻苯二酚 再通过苯环的邻间位部分裂解，然后再进一步氧化。 o 一一联挈一q 二 一妖一e 黜一。裟： 越来越多的研究表明，微生物除了在好氧条件下能够降解t p h 外，在厌氧条件 下同样能对其进行降解，只不过降解的速度和能被降解的烃的种类都有所降低。例如， w i d d e l 等报道，在石油上生长的两种兼性厌氧菌能够在厌氧条件下，用硫酸盐或者硝 酸盐作为电子受体来降解烷基苯，并且微生物群落的数量和代谢活性与好氧条件相 比，可以在更宽的氧化还原电势范围内稳定存在b 。 6 第一章文献综述 1 5 降解条件对t p h 微生物降解的影响 微生物对1 p h 的降解作用受很多因素的影响，主要有：营养物质的供给、电子 受体及氧化还原电位、p h 值、温度、微生物的种类和活性、微生物的数量等。 1 5 1 营养物质的供给 微生物的生长繁殖需要碳、氢、氧、磷和其他各种矿物质元素。t p h 污染物主要 提供的是碳和氢，因此外界条件中的氮和磷最有可能成为微生物降解t p h 的限制性 因素。研究表明氮、磷营养物质的缺乏或过量均限制石油烃的降解。氮、磷最好的比 例与细胞成分中的比例相近，质量比为5 6 7 ：1 。就降解效果而言，无机氮比有机氮 效果要好，硝酸氮比铵态氮要好口2 瑚1 。o t i l 】叮k d r 和s l l l l i ak n e z e v i c 等发现在开放 式的环境中，铵和硝酸盐由于具有高水溶性，浓度会被不断稀释，从而降低了氮源的 可利用率，因此他们建议用非水溶性的尿酸来代替水溶性的硫酸铵等作为微生物降解 石油的氮源。 1 5 2 电子受体及氧化还原电位 土壤中污染物氧化分解的最终电子受体的种类与浓度也极大地影响着生物修复 的速度和程度。微生物氧化还原反应一般以氧为电子受体，但在厌氧条件下，也可以 用硫酸根离子和硝酸根离子做为电子受体。厌氧条件下t p h 的降解率要比好氧条件下 低，这可能与氧化还原电位有关。g o r d o na 和h 锄b r i c k 等啪1 考察了氧化还原电位对微 生物降解石油烃的影响，发现在相同p h 下，t p h 的矿化与氧化还原电位成正比。 p h 值能对氧化还原电位产生影响从而影响t p h 的降解率。p h 值对t p h 降解率的 影响非常复杂，在不同的p h 值条件下，微生物对营养物质的利用、微生物的吸附作用、 胞外酶的产生和分泌等均不相同，同时不同微生物生长的适宜p h 范围也不一样，这也 导致了在不同p h 范围内微生物在数量上存在差异，如真菌适合生长的p h 值比细菌低， 因此在大多数p h 5 的酸性土壤中，真菌数量就比细菌的数量大。 1 5 3 温度 能降解石油的微生物有嗜冷菌、嗜热菌和嗜中温菌，因此在温度低于o 和在7 0 左右的环境中均有能降解石油的微生物。但是温度对t p h 的降解速率具有显著影 响，在2 5 左右，t p h 的降解速率比5 下高出1 个数量级。m a r g e s i nr 和s c h i 仰e r f 矧 研究了和3 0 内柴油在无机培养基和土壤中的嗜冷菌渺办加z 唧j l l 纪生物降解情况，发 7 北京化工大学硕士学位论文 现最高的微生物降解率出现在1 5 ，而且在1 0 的降解率比2 0 明显要高。 温度对微生物降解的影响主要存在两种机理：1 ) 温度的增加在一定程度上可以 增加解吸常数和分配系数，从而提高底物的生物有效 性；2 ) 在给定的范围内，提高温度可以微生物的繁殖能力和活性，从而提高生 物降解率。 l ，u i sg t 0 玎c s 等人啪3 考察了温度、表面活性剂呻瑚1 的h l b 和剂量对t p h 的微生物 降解的影响，发现影响最大的是温度，其次是表面活性剂的h l b 值，最后是表面活性 剂的剂量，最后得到了温度与t p h 降解率模型： t p h d i e s e l 去除率= 1 9 7 7 1 6 5 8 ( h l b 值) 0 0 5 4 3 ( 剂量) 1 8 1 8 ( 温度) c f u = 6 2 7 + o 1 2 4 ( h l b ) o 0 0 4 6 ( 剂量) 0 1 1 6 ( 温度) 1 5 4 不同菌种的协作关系 降解t p h 的微生物很少以纯种的方式存在，而是与其他微生物共同混杂生活在 某一生态系统中。在同一个系统中，不同的t p h 降解菌扮演着不同的角色。j o n a 吐l 趾 d 发现j 确d 而c d c c 姗菌株f 9 d 7 9 只存在于油水界面并产生一种微酸胶团1 ，使原油一 水体系形成短暂的乳化现象，约维2 4 4 8 小时；假单胞菌j a 5 一b 4 5 只存在于水相，与 原油的乳化无关却能降解原油。在混合培养的过程中j a 5 一b 4 5 能产生一种与f 9 - d 7 9 分泌的相似的胶团，从而原油水体系形成稳定的乳化，使原油的降解率提高。 在t p h 污染土壤中，不同菌种间的数量关系对t p h 降解也有很大的影响。谢丹 平、尹华等人“0 1 曾从含油污水中分离得到了四株高效石油降解菌，分别为黄单胞菌属 ( 物以砌d m d 刀傩印) 、动胶菌属( z 0 傩r f d 阳印) 、芽孢杆菌属( 砌d 跏印) 和邻单胞 菌属( p f e s 如，l 伽础印) ，对四株菌进行了复配实验确定了各株菌属混合后的石油降解 效果，并用正交实验法分析了达到最佳石油降解效果时各菌株的投加量。 即使是同一菌种在降解相同1 1 p h 污染土壤中时，在不同时间段其作用也是不同 的。m a r c n 嬲等人1 对杂芬油污染的土壤中的微生物多样性和t p h 、p a h 的生物降 解过程进行了研究，他们发现在微生物降解t p h 的早期阶段，无论是加营养物质还 是不加营养物质口p l ，d 纪d 施c 纪，妇菌种都处于主要地位，但降解后期，在不加营养物 质时y p m c e o b n c t e n 口菌困、q p r o t e o b q c t e n o 菌阻邦c y t o p h 口g a f l e x i b 口c t e r - b t e m i d e s 菌种处于主要地位；在加营养物质时，口巾加纪d 6 口c 幼记菌团和p 巾加纪d 施c 纪，缸菌团 处于主要地位。因此的出结论，在t p h 的不同降解阶段对应了不同的降解菌种。 8 第一章文献综述 1 6 微生物修复土壤石油烃污染的发展前景 t p h 的微生物降解是一个极其复杂的过程，它的效率和质量不仅仅取决于微生物的 群落和组成，还与t h p 存在的数量和状态、周围的环境条件等众多因素相关。环境中 的共存物质( 如重金属) 对微生物降解的抑制效应及外源物质( 如表面活性剂) 对微 生物的促进效应应当成为环境因素的重要研究方面。高分子有机污染物降解过程中的 共代谢机理至尽仍有不足之处，需要进一步的深入研究。随着科技的不断发展，由基 因工程构建的高效t p h 降解菌将成为t p h 降解的主流菌种，这项研究正在逐渐被提上日 程。微生物修复技术的环境风险评价技术也急待进一步被完善。这些都是当前t p h 的 微生物修复应主要研究对象。 总之，在t p h 污染土壤的治理过程中，我们要加强基因改造、克隆、基因转移等高 新技术的实际运用，不断开发新的高效t p h 降解菌，进一步完善生物修复技术，使其 成熟化、系统化。同时结合传统方法的优点、与微生物修复方法结合使其成为一个有 机整体，不断开发无污染、高效率、低成本的土壤t p h 污染微生物修复技术。 9 北京化工大学硕士学位论文 第二章菌种的分离、驯化和鉴定 2 1 主要实验仪器和药品 2 1 1 实验仪器 l o 第二章菌种的分离、驯化和鉴定 2 1 3 石油烃来源： 石油烃为汽油和柴油的混合物，9 3 撑汽油和5 撑柴油购买于中国石化某加油站，以 汽油：柴油= l ：l ( v ，v ) 来模拟石油烃 2 1 4 培养基： ( 1 ) 选择性培养基： n h 4 n 0 3 o 3 k h 2 p 0 4 o 0 5 k 2 h p 0 4 o 0 5 m g s 0 4 o 0 2 微量元素液l i i d p h7 m 7 2 ( 2 ) 微量元素液： m g s o4 o 4 c u s 0 4 o 1 m n s 0 4 o 1 f e s 0 4 7 h2 0 o 1 c a c lo 1 ( 3 ) 选择性固体培养基：选择性液体培养基中加入1 8 2 0 的琼脂粉 ( 4 ) 富集培养基： 葡萄糖0 3 1 1 北京化工大学硕士学位论文 n h 4 n 0 30 3 k h 2 p 0 40 0 5 k 2 h p 0 4o 0 5 微量元素液 l l n l p h7 0 - 7 2 ( 5 ) 牛肉膏蛋白胨培养基： 牛肉膏 0 3 蛋白胨1 n a c l0 5 琼脂粉 1 8 - 2 0 p h7 4 7 6 2 2 实验方法 2 2 1 菌种的培养 在2 5 0 i i l l 广口三角瓶中加入1 0 0 m l 选择性培养基，1 2 1 灭菌2 0 m i n ，移至超净 台冷却后，取2 - 3 9 焦化厂附近取得的污染土样加入其中，以塑料封口膜封口，3 0 、 1 5 0 r m i l l 恒温水浴培养5 天。 培养结束后，取2 1 1 1 l 的菌液移至1 0 0 l i d 富集培养基中，以塑料封口膜封口，仍 然在3 0 、1 5 m i n 条件下恒温水浴培养5 天。 2 2 2 菌种的筛选 将熔化好的并冷却至4 5 5 0 的选择性固体培养基注入灭菌的培养皿中( 直径为 9 0 i 姗，培养皿注入量为1 8 2 0 m 1 ) ，待培养基冷却凝固后，取1 0 0 0 0 0 m g l 【g 的石油烃 二氯甲烷溶液3 0 0 山，均匀涂布其上，待二氯甲烷挥发后倒置培养皿，并除去培养皿 表面的凝结水( 防止菌落扩散，以便得到单菌落) 。平板放于培养箱内2 4 h 后，经检 查确定无细菌污染方可使用。该平板内的即为一石油烃为唯一碳源的选择性固体培养 基。取1 m l 培养后的茵液以生理盐水稀释1 0 5 、1 0 6 、1 0 7 倍后，吸取o 5 m l 均匀涂布于 以石油烃为唯一选择性固体培养基分离平板上，每个浓度重复5 次，将平板置于3 5 的恒温培养箱内培养3 5 天，生长出来的菌就是能降解石油烃的菌种。 1 2 第二章菌种的分离、驯化和鉴定 2 2 3 菌种的驯化 由于筛选得到的菌种对石油烃的降解效率不高，因此我们对其进行了驯化。具体 做法是：在选择性培养基中加入3 0 0 m g k g 的石油烃，考虑到石油烃的水溶性较低， 我们采用二氯甲烷做增溶剂，配置了石油烃含量为1 0 的二氯甲烷溶液，将该溶液加 入到l0 0 r i l l 选择性培养基中，使石油烃含量达到3 0 0 m 眺g ，加入筛选得到的菌种， 3 0 、1 5 m i l l 恒温水浴培养7 天。培养结束后取2 i i l l 菌液移入石油烃含量为5 0 0 m 眺g 的选择性培养基中继续培养。如此逐步提高培养基中石油烃的含量直至1 5 0 0 0 i i l 眺g 。 2 2 5 菌种的鉴定： 2 2 5 1 形态观察 将分离得到的石油烃降解菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，观察菌落的菌苔 形态和颜色的变化。挑取菌细胞均匀涂布在载玻片哂纳感，用1 0 1 0 油镜观察菌体 形状并用标尺测定菌体的大小。 2 2 5 2 生理生化特性实验 1 革兰氏染色实验 ( 1 ) 染剂： 结晶紫混合液：甲液： 结晶紫2 o g 乙醇( 9 5 ) 2 0 n d 乙液： 草酸铵0 8 9 蒸馏水 8 0 i i l l 将甲、乙两液混合，静置4 8 h 后过滤使用。 碘液： 脱色液： 碘 碘化钾 蒸馏水 1 o g 2 o g 3 0 0 i i l l 先用少量( 3 5 m 1 ) 蒸馏水溶解碘化钾，在投入碘片，待碘溶解后， 加水稀释至3 0 0 m l 。 1 乙醇( 9 5 ) 2 丙酮乙醇溶液：乙醇( 9 5 ) 丙酮 复染剂：0 5 的番红 7 0 1 n l 3 0 m l 水溶液 北京化工大学硕士学位论文 番红2 5 的乙醇溶液 蒸馏水 2 0 i i l l 8 0 r i l l ( 2 ) 染色步骤 a 、用接种针挑取少许菌苔，涂布于干净的载玻片上的一滴无菌水中，风干固定。 b 、用结晶紫的混合液染l m i n 后，水洗。 c 、碘液作用1 m i n ，水洗，吸干。 d 、用9 5 乙醇或丙酮乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液至无色( 约3 0 m i l l ) 。 e 、用番红液染2 3 m i i l ，水洗，风干。 将载玻片放至显微镜下观察，细胞深紫色的为革兰氏阳性细菌，红色为革兰氏 阴性细菌。 2 运动性观察 在半固体培养基中穿刺接种，观察菌的生长情况，确定菌的运动性。 3 氮源的利用 将需要测定的氨态氮或硝态氮加入基础培养基中，浓度为0 0 5 0 1 。另一份为 不加氮源的空白对照，调p h7 2 。接种上培养了1 8 2 4 小时的菌液，于3 0 培养5 天， 比较加氮源和未加氮源的培养基浑浊度，若加氮源的培养基浑浊则为阳性。 4 荧光色素 n gb 培养基：蛋白胨2 9 ，甘油l g ，k 2 h p 0 40 1 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 1 5 9 ，琼脂1 5 9 ， 蒸馏水l o o “，p h 7 m 7 2 。 将培养2 4 小时的菌液接种于戤n gb 斜面，3 0 培养l 3 、5 后，在紫外灯下观 察有无荧光。 5 脓青素的产生 培养基：蛋白胨2 0 9 ，甘油l o g ， k 2 h p 0 40 4 9 ，m g s 0 4 7 h 2 02 0 9 ， f e s 0 4 7 h 2 0o 0 1 9 ，蒸馏水1 0 0 0 “