（细胞生物学专业论文）藻蓝蛋白亚基光动力作用效果及在体内分布规律的研究.pdf

摘要 光动力学疗法( p d t ) 作为一种新型医疗手段，在多种疾病的治疗过程中起到了越米越 重要的作用，特别是对部分肿瘤的治疗效果明显。藻蓝蛋白( c - p c ) 为螺旋藻中重要的捕 光蛋白，由a 及b 距基组成。本实验研究表明，c p c 亚基可以在4 小时内渗透到人部分的 细胞中。当给予2 2 3 2j e r a 2 的照射强度时，c p c 亚基介导的p d t 对所检溯的c o s 7 、c 6 、 s 1 8 0 、s p 2 o 等细胞有较好的抑制作用，抑制率分剐达到1 7 8 、2 6 2 、3 3 8 及7 8 6 。 本文还系统地研究了c p c 亚基在小鼠和胎鼠代谢分布的惰况：在成年小鼠内，c c 亚基主要分布在胃，小肠、上皮代谢旺盛的部分，但不能通过血脑屏障；对于胎鼠来说， c p c 亚基比较容易通过胎盘屏障进入胎鼠体内，且代谢分布与成年小鼠分布相似。 关键词：p d t ，藻蓝蛋白皿基，细胞抑制作用，体内分布，细胞。 a b s t r a c t p d tw h i c hw o r k sa sa l li m l o v a t i v em e d i c a lm e t h o dh a sp l a y e dam o r ea n dm o r e i m p o r t a n tr o l ei nm a n yd i s e a s et h e r a p i e se s p e c i a l l yi ns o m ek i n d so ft u m o r s c - p ci s t h ek e yp h o t o c a p t u r ep r o t e i no fs p i r u l i n ap l a t e n s i s 。c o n t a i n saa n dbs u b u n i t s b a s i n go u rs t u d i e s ，c - p cs u b u n i t sc a l lp e n e t r a t ei n t om o s to f c e l ll i n e sw i t h i n4h o u r s w e l lp c de f f e c tc a l lb es 湖i nc o s 7 、c 6 、s 1 8 0 、s p 2 0c e l ll i n e s i f 酉v e i l2 2 3 2 j c n l 2i r r a d i a t i o nd o s e 。t h es u p p r e s s i o nr a t er e a c h e s1 7 8 、2 6 2 、3 3 8 a n d7 8 6 r e s p e c t i v e l y t h ed i s t r i b u t i o no fc p cs u b u n i t sh a sb e e na l s os t u d i e di nm a t u r e da n d f e t a lm o u s eb o d ys y s t e m a t i c a l l yo u re x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a tc - p cm a i n l yl o c a t e d a tb l o o m ym e t a b o l i s mt i s s u e s ：s u c ha ss t o m a c h , s m a l li n t e s t i n e ，a n dl i v e r , e t c o u r s t u d i e sa l s op r e s e n t e dt h a tc p cs u b u n i t sc a n tp e n e t r a t eb l o o d - b r a i nb a r r i e ri nm a t u r e m o u s e s t u d i e si nf e t a lm o u s es h o w e dt h a tc p cc a np e n e t r a t ep l a c e n t a lb a r r i e re a s i l y , a n dt h ed i s t r i b u t i o no f c p ci sq u i t et h es a n l ea si nm a t u r e dm o u s e k e yw o r d s ：p d t , c - p cs u b u n i t , c e l ls u p p r e s s i o ne f f e c t , d i s t r i b u t i o n nv i v o ， c a n c , e rc e l ll i n e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获噱徵蕊其他教育机构 黼鲐咯砚蝴期：坤年钾。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解旅数参磊关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授喀酗学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 学位论文作者签名：淫f ；坦 导师签名：凿摇 签字日期：苫7 年bj 月。) 日 签字日期： 1 年占月，日 工作单位 通讯地址 电话 邮编 绪论 绪论 光动力学疗法 光动力学疗法( p h o t o d y n a m i e t h e r a p y ，p d t ) ，是一种新型医疗技术，经过 多年研究，这种治疗方法已经在年龄相关性黄斑变性病、银屑病、p t c a ( 经皮 冠状动脉成形术) 术后再狭窄及类风湿性关节炎显示出独特的疗效，特别是在一 些肿瘤的治疗方面，光动力学疗法有着其显著的优点。 在这个治疗系统中，光敏剂、激发光源起到了核心的作用。其基本原理在于： 光敏剂在吸收了合适波长的激活光后，从基态转变为激活的单线态，再与氧起反 应，产生高活性单线态分子，后者与分子氧起反应，产生激发态反应性单态氧 ( a c t i v a t e ds i g l e t o x y g e n ) ，再与邻近的分子( 如氨基酸、脂肪酸或核酸) 相互 反应，产生毒性光化学产物。该作用有2 种类型：一种是光敏剂通过电子或质子 ( e - 或h + ) 的转移引起自由基的氧化还原反应，称为i 型光动力反应，由此造 成的损伤称为第1 类损伤；另一种是光敏剂将能量传递给周围的氧分子使其成为 单线态氧，称为第1 i 类损伤。在这两种光动力反应过程中会产生一些对生物体有 害的活性物质( r e a c t i v eo x y g e ns u b s t a n c e ，r o s ) r o s 是指含氧而且高度化学活 性的一些分子，如单线态氧，超氧阴离子，羟自由基及过氧化氢等。这些物质能 够通过破坏细胞的d n a 、骨架结构、膜系统等达到促使细胞凋亡或者死亡的目 的。 影响光动力疗法的几个主要因素 p d t 系统中存在着三个基本要素即光敏剂( p h o t o s e n s i t i z e r ) 、光源0 i g h t $ o l l r o e ) 、组织氧浓度( o x y g e n ) 光敏剂 光敏剂是一种本身( 或其代谢产物) 能选择的浓集于要作用细胞的化学物质， 它( 或其代谢产物) 在适当波长光的激发下能产生光动力效应而破坏靶细胞。光 敏剂是p d t 的核心物质。光动力疗法的提出、发展及应用都是随着光敏剂的发 展而逐渐完善的。 早在本世纪初人们就发现了“血卟啉”的光毒效应，5 0 年代，s c h w a r t z 发 现起光毒效应的不是血卟啉本身，而是其中的血卟啉寡聚混合物杂质，所以就提 纯到了血卟啉衍生物( h p o ) ，8 0 年代初又从h p d 中分离出具有较强光生 藻蓝蛋自甄基光动力作用效果及在体内分佃规律的研究 物活性的部分，并称其为光敏素i i ( p h o t o f r i n ，i i ) 。h p d 和光敏素i i 都属于 第一代光敏剂，也是目前为止仅有的在临床应用光敏剂。虽然在临床上取得了肯 定的疗效，但仍有很多不足之处，如成分复杂、组成不定、皮肤光敏副作用大等 缺点等。由于第一代光敏剂的以上不足，人们开始了第二代光敏剂的研究。 在新型光敏剂的开发研制中需要注意的是光敏剂不但可以在疾病的治疗中 发挥作用，同样在疾病的诊断中也有明显的优势。而且各种疾病又有各自的特点， 对光敏剂的要求就会不同。例如诊断用药就要求光敏剂有良好的荧光特性，但同 时最好不产生光动力效应。治疗肿瘤的用药则要求不但杀伤效应强，而且光漂白 速率要慢，这样在整个治疗过程中能始终保持光敏剂的有效杀伤浓度。我们在治 疗鲜红斑痣的过程中却发现如果光敏剂的光漂白速率快则可能有利于减少表皮 的光敏反应。这是因为鲜红斑痣是一种血管病变。表皮的光敏剂漂白完之后，血 液中的光敏剂却源源不断的供给到血管内皮细胞。这样表皮的光敏剂浓度保持在 一个较低的水平，而血管内皮细胞则能始终保持在适当的治疗浓度。从而提高了 光敏剂的选择性。同样，不同的疾病对光敏剂的其他参数的要求也不相同。随着 光敏剂研究的发展，不同的临床用途要求不同的光敏剂与之相匹配。 在以往的光敏剂研制过程中，人们把更多的注意力放在了光敏剂吸收波长的 红移上。随着光动力疗法的进一步研究，我们发现一味的追求光敏剂吸收波长的 红移并不一定是所有光敏剂的终极取向。比如，我们在治疗鲜红斑痣的过程中就 发现，如果治疗的波长太长，穿透深度太深，反而会引起真皮层的损伤，导致瘢 痕形成。 同样评价一种光敏剂的好坏，不应只停留在它的杀伤效应和治疗波长的红移 上，而是要综合考虑到它在临床对适用疾病的疗效上。所以新型光敏剂需要在这 几方面下工夫。组分单一，结构明确。方便给药，缩短给药到治疗的时间。 排泄快、毒、副作用小，避光时间短。有较高的作用效率，产生足够的r o s 。 在病变组织上被选择性吸收，对健康组织应不吸收或少吸收。与相应的治疗 疾病有匹配的作用波长。发展多种光敏剂，适应临床的不同用途。 目前，国内外第二代光敏剂研究概况：这些第二代光动力治疗药物大多为卟 啉、卟吩类化合物的衍生物，其它还有金属酞菁、稠环醌类化合物、以及生物体 内合成卟啉的原初化合物6 一氨基乙酰丙酸( a l a ) 等。目前不下十种药物已 2 绪论 经进入了临床试验阶段。值得一提的是我国自己研制的光敏剂竹红菌素( 包括 竹红菌甲素h a ，和竹红菌乙素h - b ) 是从竹红菌中提取出来的稠环醌类化合 物。多年以来，中国科学院化学研究所的科研人员对竹红菌素进行了大量的、卓 有成效的研究。目前，竹红菌素已经在临床上被应用于多种皮肤病的光动力治疗。 带有特定结构修饰的竹红菌素在光动力治疗肿瘤和抗病毒方面表现出优越的性 能。 光源 良好的光源是光动力治疗不可或缺的条件。在早期的光动力研究中人们采用 的是普通光源。但是，随着激光的发明，人们在研究中逐渐开始采用激光作为光 源。激光以其单色性好、方向性好、亮度高、相干性好的优点而有力的推动了光 动力的研究。 各种适用于不同治疗的激光器纷纷面世。但是，激光器的输出功率一定要足 够大才能达到治疗效果。现在应用在临床的有铜、金蒸气激光器、氩离子激光器、 染料激光器、半导体激光器等等。 在光动力治疗中，激光的波长、功率密度和能量密度对治疗的效果有很大的 影响。不同的波长对组织有不同的穿透深度，所以在光敏剂的研制过程中人们总 是追求吸收光谱的红移，以期增加治疗的深度，彻底杀伤肿瘤细胞。而不同的波 长对不同的肿瘤组织的穿透是不同的。 在p d t 治疗的过程中，吸收光谱有时和最佳作用光谱不一致，即最大吸收 波长，不一定就是最佳治疗波长。这有可能是在治疗中最大吸收波长对光敏剂的 光漂白作用也很强，另外，在体情况下，体内各种成分对光敏剂也可能有影响， 而导致最佳治疗波长和最大吸收波长的不一致。 此外，由于生物体内红血球的存在和光散射等原因，不同波长的光对组织的 穿透深度是不同的。总的来说，波长越长对组织的穿透越深。比如p h o t o f r i n 的 最大吸收在6 3 0 n m ，在此波长的光照射下，药物可以被活化。而这一波长的光 穿透组织的深度 o 5 c m 。如果波长是7 0 0 n m 深度就接近o 8 c m ，8 0 0 n m 的 光可达l e n a 。 光对组织的穿透深度在肿瘤的治疗中有很有意义，因为此时的光动力效应的 深浅主要取决于光的穿透深度。但是，对于同一种光敏剂而言随着光波的红移， 藻蓝蛋白雏基光动力作用效粜及在体内分布规律的研究 光子的能量降低，r o s 的产率也降低了许多，影响了治疗效果。 组织氧浓度 氧是光动力作用的三个要素之一，是参与光动力作用的重要反应物，组织中 氧的浓度对光动力的效果起着很重要的作用。 在研究中人们发现组织中氧消耗的速率如果大于6 | im s ，组织就不能从 循环系统及时补足氧，使得组织中的氧浓度持续下降，这样就使季导单态氧的产率 下降，光敏剂的杀伤效率就会下降。所以，当其他条件一定时，氧浓度就成为决 定光动力效应的主要因素。 在光动力治疗中发现肿瘤在相同的光剂量和药物剂量而不同的功率密度情 况下，疗效差异很大。在能量密度同为3 6 0 j e r a 2 而功率密度分别为5 0 m w e m 2 和2 0 0 m w c m 2 的治疗中，前者的疗效要优于后者。另外在在实验中还发现，照 光3 0 秒，。然后间断3 0 秒接着照光的疗效要明显优于连续照光组。当功率密度 大时，氧耗非常迅速，而毛细血管的氧运输来不及补充耗去的氧，所以杀伤效应 和杀伤半径都较低功率密度的治疗组要差。再看间断照光组，由于组织有时间补 充耗竭的氧，而增强了杀伤效果。还有应该注意的情况是当p d t 杀死一部分细 胞后，那么整个组织的氧耗必然降低，从而提高了其他细胞的氧浓度，结果增强 了杀伤效应。 在研究光动力对肿瘤的杀伤效应时，人们发现肿瘤血管的破坏是光动力的很 重要的效应之一。不难想象血管中的氧浓度要远远高于肿瘤组织中氧的浓度，这 可能是氧在光动力治疗中起重要作用的有力佐证。当然一旦肿瘤组织的血管被破 坏，血供即停止，氧的补充也就停止了。在治疗血管性疾病时的确应该注意到以 上现象，例如在鲜红斑痣的治疗中，由于是血管组织所以氧含量很高，所以容易 取得比较理想的效果。 螺旋藻及藻蓝蛋白 螺旋藻 螺旋藻是一类低等值物，在分类上属于蓝藻门( c y a n o p h y t a ) 、段殖藻目 ( o s c i l a t o r i a l e s ) 、颤藻科( o s c i l a t o r i a c e a e ) 螺旋藻属( s p i r u l i n a ) ，目前全世界已 知螺旋藻有5 0 余种，但目前国内外工厂化生产的螺旋藻只有钝顶螺旋藻 ( s p i r u l i n ap l a t e n s i s ) 和极大螺旋藻( s p i r u l i n am a x i m a ) 两种。它们原产于中美 4 绪论 洲和非洲的碱性湖泊中。螺旋藻是一种多细胞的原核藻类，细胞中没有真正的细 胞核。因藻丝呈螺旋形而得名，钝顶螺旋藻呈蓝绿色，多细胞型，细胞近方形， 细胞宽6 - 8 微米，长2 - 6 微米，螺旋疏松弯曲，螺旋宽2 6 3 6 微米，螺间距4 3 5 7 微米。藻丝长2 0 0 5 0 0 微米，末端不尖细或略尖细，末端细胞宽圆形。 螺旋藻的医药和保健功效与它独特的化学组成有直接的关系。 1 螺旋藻中的脂肪酸主要是亚油酸和y 一亚麻酸，它们分别占藻体干重的 1 2 4 和1 0 4 。两者都是不饱和脂肪酸，不会形成胆固醇，能起到降低血浆胆 固醇水平的作用，特别是y 一亚麻酸，其效果是前者的1 7 0 倍。亚油酸也是人体 的必需脂肪酸，它通过e f a 途径可生成y 一亚麻酸，并最终生成前列腺素，从 而参与调节人体的各种基本生理过程。临床研究已证实，y 一亚麻酸有助于治疗 心脏病、肥胖症、关节炎、锌缺乏特异反应性皮炎、胶原病、月经前紧张症、多 发性硬化症等，而酒精中毒、躁郁性心脏病，些老化症状以及精神分裂症、糖 尿病并发症也与y 一亚麻酸缺乏有关。此外，近年还发现y 一亚麻酸还能抑制癌 细胞的繁殖。美国癌症研究所也发现，螺旋藻中的糖脂具有抗艾滋病病毒的功效。 2 螺旋藻多糖与糖蛋白也有重要的生理功能，华南师范大学生物技术研究 所经多年研究发现，螺旋藻水溶性多糖和糖蛋白均有抗辐射、抗氧化、提高机体 免疫力、促进淋巴细胞转化和抑制癌细胞增殖作用。在对螺旋藻多糖抗辐射的机 理研究中发现，其抗辐射作用与核酸内切酶的活性和d n a 损伤修复酶的增强效 应有关。螺旋藻多糖不但对细胞无毒性，而且具有增强骨髓细胞的增殖能力，促 进骨髓造血功能，提高白细胞水平，提高巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，增加t 淋巴细胞的数量和消除免疫抑制剂的抑制作用等。同时，螺旋藻多糖与糖蛋白还 能改善脂类代谢，降低血浆胆固醇水平，对胃及十二指肠溃疡有一定的辅助疗效。 可以相信，随着研究的深入，螺旋藻多糖与糖蛋白将在保健延衰、预防医学及临 床医学上有广阔的应用前景。 3 螺旋藻还含有极其丰富的维生素和活性物质，尤其是维生素的含量特别 高，其1 3 一胡萝b 的含量每克就超过2 0 0 0 个国际单位。流行病学的研究表明， 人体大量摄入胡萝p 素可大大减少患癌症的危险。还有一项研究表明，摄取维生 素a 原，即1 3 胡萝h 素，比直接摄取来源于动物性食物的维生素a ，患癌症 率更低。人体肌体老化的表现也与某些维生素缺乏症相似。螺旋藻中除含维生素 藻蓝蛋白死基光动力作用效果及在体内分靠规律的研究 a 原和b 族较高外，维生素e 的含量也较丰富，它作为一个维生素库，也起着 抗老延衰的作用。同时，螺旋藻还含有超氧化歧化酶( s o d ) 等抗氧化和抗老化 酶类。 此外，由于螺旋藻的营养价值高，又含有丰富的生物活性物质，因此除了作 为功能性保健食品和医药上的应用外，在优质的高蛋白饲料、食品添加剂以及在 高级化妆品方面的开发都具有潜在的应用前景。目前全世界已有5 0 多个国家正 式批准将螺旋藻用于食品或食品添加剂。我们相信，随着人类对螺旋藻的认识、 研究的提高和加深，它对2 l 世纪人类的生活和健康产生重大的影响。 藻蓝蛋白 藻蓝蛋白( p h y c o c y a n i n ，p c ) 是螺旋藻中所含有的一种重要的捕光色素蛋 白。分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色，并发出紫色荧光，在波长6 1 5 n m 左 右具有特异吸收峰，可以用o d 6 1 5 o d 2 s 0 表示其纯度。因其水溶性、无毒、清亮可 爱且着色力强等优点，藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。藻蓝 蛋白还可作为细胞和分子的荧光标记物，在免疫检测、荧光显微术、流式细胞仪 技术等方面有很好的应用前景【2 ，3 】。此方面已有许多文献报道在蓝绿藻、螺旋藻 方面，m o r e n o 和b r e j c 等人对藻胆蛋白做了很多研究【3 】o 天然存在的藻蓝蛋白可以聚合体( a b ) 3 的形式存在。其分子量一般在3 0 k d 左 右，由2 个亚基组成，亚基分子量都在1 5 k d 左右，a 亚基由1 6 2 个氨基酸组成， 1 3 亚基由1 7 3 个氨基酸组成。并由开链四毗咯化合物和脱辅蛋白通过硫链键结合 【4 】。三维结构见图1 a 所示。通过扫描隧道显微方法，可以发现清楚地观察到 c p c 分子中央的孔洞及蛋白质链折叠。从其中的一个分子还可以看出c p c 分 子环状排列的亚基分成3 块，每一块呈“弯月”构象( 见图1 b ) i s 。 图1 ：图a ：p c 分子( ob ) 3 两面观。将a 图翻转1 8 0 度得b 图。图b 是扫描隧 道显微镜得到的图片。 f i g u r e1 ：f i g u r ea ：t w ov i e w so ft h em o l e c u l a rs u r f a c eo ft h ep c ( a b ) 3t n m m e l 6 绪论 f i g u r ebc a nb eg o tb yt u r n i n gf i g u r ea1 8 0d e g r e e f i g u r e1 3 ：s t mi m a g eo fc 2 p ci n s p i r u i n ap a t e n s i sw i t hf i l t e rt r e a t m e n t 在中性条件，藻蓝蛋白的激发光谱在5 9 0 r i m 和6 3 5 t t m 有个激发。在6 3 5 n m 激发光下，其最大荧光发射光谱峰位于6 5 0 n m 处【6 1 。见图2 。 】， 图2 图a 所示为藻蓝蛋白的激发光光谱，图b 为藻蓝蛋白的荧光发射光谱。 f i g u r e2 f i g u r eai st h ea c t i v es p e c t r ao fp c ，a n df i g u r ebi st h ef l u o r e s c e n c e i r r a d i a t i o ns p e c t r ao fp c 藻蓝蛋白具有一定的医疗价值，最近的研究表明，藻蓝蛋白可以刺激人b 一 淋巴细胞的增殖反应，提高机体的免疫力，催进动物血细胞再生等。螺旋藻藻蓝 蛋白还具有消炎活性，而且对神经性的损伤也具有保护作用。 3 藻蓝蛋白的分离方法 螺旋藻藻蓝蛋白的提取常分为蛋白溶出和蛋白沉淀两个过程。藻蓝蛋白是属 于胞内蛋白质，要使其溶出首先要破碎细胞的细胞壁、细胞膜使其以溶解的状态 溶于提取液中，再采用适宜的方法将其沉淀，在提取过程应保持蛋白的活性。目 前的研究状况表明，螺旋藻藻蓝蛋白的提取还处于实验研究阶段。其提取方法也 不尽相同。归纳起来，细胞破碎的方法有：反复冻融法、化学试剂处理法、溶胀 法超声波法和组织捣碎法5 种，蛋白质沉淀方法有：盐析法、结晶法、等电点沉 淀法和超滤法等4 种方法。在细胞破碎方法中，由于溶胀法提取周期较长，超声 波法提取率较差等，较常用的是反复冻融法和化学试剂处理法，但两者间也存在 一定的差别。林红卫【”喇用十二烷基硫酸钠( s d s ) 破坏钝顶螺旋藻细胞膜提取藻 蓝蛋白，提取率高达9 8 ，并明显优于用冻融法提取的对照组。张以芳1 4 1 等用 k c l 和溶菌酶联合作用于螺旋藻细胞壁提取藻蓝蛋白，破壁率达9 5 以上，并与 冻融法比较，认为冻融法只适用于少量样品的制备大剂量的样品很难快速冻融， 而溶菌酶法则适用于大量藻蓝蛋白的制备。化学试剂法由于加入化学试剂使后期 纯化处理的难度增加且操作不好易引起蛋白变性，而冻融法操作简单、方便。因 藻蓝蛋自亚基光动力作用效果及在体内分布规律的研究 此，实验中较常用冻融法提取少量的藻蓝蛋白。在实际操作中，经常是几种方法 混合使用，以使藻蓝蛋白尽可能地溶出。如高天荣( 】5 】、王勇【6 1 等采用反复冻融法 和超声波法使螺旋藻的细胞壁破裂。林红卫【1 6 1 等采用洗涤循环冻融法提取螺旋藻 藻蓝蛋白，结果显示：用t w e e n 2 0 作为提取试剂提取率可达6 5 ，较缓冲液循 环冻融法高。 细胞破碎后，藻蓝蛋白的溶于提取液中，这时选择适当的方法进行沉淀是相 当的重要。等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性，通过调节 溶液- p h 值至藻蓝蛋白的等电点，使藻蓝蛋白溶解度下降而析出沉淀。张以芳 1 4 1 、 汤朝晖i i7 】等曾用此法进行沉淀藻蓝蛋白。但是，一般认为藻蓝蛋白对p h 较为敏 感，沉淀时p h 控制不好易引起蛋白变性。文献报道较多的还是采用盐析法进行 藻蓝蛋白沉淀，其沉淀效果也得到普遍认可。硫酸铵溶液是常用的盐溶液，张以 芳等也曾用硫酸镁、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵等盐溶液与硫酸铵溶液进行盐析比 较，结果表明，硫酸铵盐析效果好，其它几种盐析效果较差。但是关于硫酸铵的 盐析浓度存在多种看法。较多的是采用5 0 饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀【1 6 ” 1 9 1 ，也有采用3 0 6 0 的饱和度，林红卫等甚至采用7 0 8 0 的硫酸铵溶液。 胡一兵 2 0 l 等采用不同浓度的硫酸铵溶液建立分段梯度盐析分离纯化钝顶螺旋藻 的藻蓝蛋白，效果良好。h w s i e e m a n 【2 ”研究认为采用不同浓度的硫酸铵溶 液盐析还可以将藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白分开而彭卫民【2 2 】研究却认为无法用硫酸 铵盐析将藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白分开。尽管如此，在螺旋藻中提取藻蓝蛋白都要 用硫酸铵处理以得到藻蓝蛋白的粗提物。 螺旋藻藻蓝蛋白的提取物中杂质蛋白的含量很高，面藻蓝蛋白的纯度比 ( a 6 2 0 a 2 8 0 ) 要达到4 0 以上才具有实际应用价值因此，还必须对粗提物进一 步的分离纯化，清除杂质蛋白，提高藻蓝蛋白的纯度。目前文献报道的纯化方法 有羟基磷灰石柱层析法、凝胶层析法、离子交换法及较少使用的硅藻土柱层析法 等。在实际应用中常常是两种或两种以上的方法同时使用才能收到较好的效果 韦萍【2 3 】等将藻蓝蛋白的粗提液分别通过d e a e s e p h a d e xa 2 5 和羟基磷灰石 ( h y d r o x y a p a t i t e ，h a ) 吸附上柱，并将藻蓝蛋白部分的洗脱液再一次进行h a 柱 层析后过g 一1 5 0 柱的方法从极大螺旋藻中提取藻蓝蛋白。结果表明，采用自制的 羟基磷灰石二次上柱可得到试剂级的藻蓝蛋白，纯度比达4 1 8 ，再经过g 1 5 0 绪沦 柱层析可得成分单一的藻蓝蛋白。胡一兵 2 0 l 等采用羟基磷灰石层析和s e p h a d e x ( 3 - 1 0 0 凝胶层析得到纯度比大于5 0 的藻蓝蛋白。殷钢1 2 4 】等采用s e p h a c r y ls - 2 0 0 凝胶层析和羟基磷灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行分离纯 化，得到藻蓝蛋白纯品。张成武【l8 】等将经过两次h a 柱层析纯化的藻蓝蛋白再经 一次s e p h a d e xg 一1 0 0 柱层析过滤纯化可得电泳纯的藻蓝蛋白。殷钢f 2 习等还研究 了采用d e a es e p h a r o s eff 离子交换和羟基磷灰石吸附从钝顶螺旋藻中分离纯 化得到藻蓝蛋白，经等电焦鉴定该藻蓝蛋白为电泳纯。殷钢等曾采用羟基磷灰石 和s e p h a d e xg 1 0 0 进行柱层析，分离纯化出纯度比为4 7 1 的藻蓝蛋白。彭卫民 等 2 2 1 用羟基磷灰石柱层析法对螺旋藻中藻胆蛋白进行纯化获得纯度较高的藻蓝 蛋白。林红卫等【l6 】先用硅藻土5 4 5 柱分级洗脱、再用d e a e - 纤维素离子交换法 进行纯化从螺旋藻中获得纯度比为4 1 的藻蓝蛋白。张建平等 2 6 】先用羟基磷灰石 柱层析再过s e p h a d e xg 1 5 0 的葡聚糖凝胶层析柱得到较纯的藻蓝蛋白。 4 藻蓝蛋白光动力学研究进展 藻蓝蛋白作为一种具有良好开发前景的新型光动力学药物，是一种高效的无 毒副作用光敏剂。然而，用分子量较大的天然态藻蓝蛋白处理癌细胞或体内注射， 其有效成分并不高。而选用藻蓝蛋白酶解片段( 分子量小) 作为抗肿瘤细胞的光 敏剂，不但可以避免血卟啉类光敏剂具有的皮肤光毒性缺陷，还能够克服植物性 来源的藻蓝蛋白分子易在体内产生抗体的不利因素。 近年来，随着对海洋生物利用资源利用研究的加深，藻蓝蛋白在医学保健等 方面的功效也逐渐被人们发现。王勇切，张成武【8 1 ，关燕清【9 】等发现藻蓝蛋白对 人宫颈癌细胞h e l a ，人血癌细胞株h l - 6 0 ，k - 5 6 2 和u 9 3 7 ，肝癌细胞7 4 0 2 有抑 制作用。美国哈佛医学院s c h w a r t z 和s k l a r 发现螺旋藻藻蓝蛋白对癌细胞有抑制 作用；蔡心涵等研究了螺旋藻藻蓝蛋白对激光疗法的增敏作用；张成武等报道了螺 旋藻藻蓝蛋白对小鼠急性放射病的防护作用潢蓓、王光策等人用胰酶酶解p c 得 到分子量较小的色基多肽对肿瘤细胞杀伤作用明显。藻蓝蛋白带有荧光，可用作 荧光活性物质，在荧光活性检测上的应用前景十分可观。 程又奇等【l o 】对钝顶螺旋藻的抗突变作用进行了研究。结果表明：钝项螺旋藻 在20 0 0m g k g 剂量下，对环磷酰胺所致小鼠骨髓细胞微核增加有拮抗作用( p o 0 5 ) 。 c a ix i n h u a t “】通过试验证明，藻蓝蛋白在对肿瘤的光治疗中可以起到增敏的 作用。黄蓓等1 2 1 纯化出藻蓝蛋白的三个组分，分别为c p l 、c p 2 、c p 3 。在浓度 为1 0 01 1g m l ，照射剂量2 8 8 j e r a 2 时，藻蓝蛋白对肿瘤细胞的杀伤率达 6 9 2 - - 8 0 2 。同时也证明，藻蓝蛋白的酶解产物介导的p d t 可以对小鼠移植 瘤( s 1 8 0 ) 有4 6 - - , 8 1 的抑瘤率。 5 本实验目的与意义 本课题通过： 1 藻蓝蛋白亚基的制备和鉴定获得达到实验纯度要求的藻蓝蛋白样品。 2 并在此基础上开展藻蓝蛋白亚基在细胞渗透特征的研究 3 藻蓝蛋白亚基介导p d t 对细胞抑制作用 4 在小鼠体内分布规律的研究。 为藻蓝蛋白作为光动力学疗法有效药物提供理论依据。 1 0 第一章藻蓝蛋臼砭基鲍硝备与鍪定 第一章藻蓝蛋白亚基的制各与鉴定 1 1 藻蓝蛋白c p c 的提取 1 1 1 实验材料与试剂 材料：钝顶螺旋藻 试剂：s e p h a d e ) 【( - 2 0 0 、丙烯酰胺、n ，n 甲叉双丙烯酰胺( x i a m e ns a n l a n d c h e m i c a l sc o m p a n yl i m i t e d ) 仪器：c e n t r i f u g e5 4 1 7 r 高速冷冻离心机( e p p e n d o r f ) 、y c l 层析实验冷柜 ( 北京仪诚科技公司) 、电子天平( 北京赛多利斯仪器系统有限公司) 、蛋白质电 泳仪、电泳槽( 上海天能科技有限公司) 、冰箱( 美菱) 、w h 2 微型旋涡混合仪 ( 上海沪西分析仪器厂有限公司) 、各型微量加样器( 上海医用激光仪器厂) 、 z h w y - 2 1 0 2 c 全温度恒温培养振荡器、紫外可见分光光度计( u l t r o s p e e 3 1 0 0 p r o ) 、电脑全自动样品采样仪( 上海青浦沪西仪器厂) 、h l = i s 恒流泵( 上海青清沪 西仪器厂) 、h d 一9 3 1 型紫外检测仪( 上海金达生化仪器厂) 、 层析柱 ( 2 6 c m x 5 0 c m ，) 1 1 2 细胞粗提 反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余细胞液的盐浓度的同时，发生溶 胀破碎。冻融所得溶液分两次在1 4 0 0 0 r p m 下高速离心t 5 m i n ，用小烧杯收集上 清，弃去沉淀。 硫酸铵的分步沉淀 称取( n h 4 ) 2 s 0 4 固体粉末，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液 的( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度达到2 5 。在1 4 0 0 0 r p m 下高速离心1 5 r a i n ，离心沉降后，取 得上清液。 再称取( n h 4 ) 2 s 0 4 固体粉末分多次缓慢加入上清液，边加边搅拌，使溶液 的( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度达到4 5 。在1 4 0 0 0 r p m 下高速离心1 5 m i n ，离心沉降后，取 沉淀，弃去上清液。测o d 5 6 5 ，o d 2 8 0 ，o d 6 2 0 透析除盐 剪取约2 5 c m 长的透析袋，放入含i n a h c 0 3 和l m m o f l e d t a 中煮沸 骧蓝蛋白亚基光动力作用效果及在体内分布规律的研究 l o m i n ( 从水沸开始计时) ，然后捞出透析袋用蒸馏水洗净，再次放入 l m m o l l e d t a 中煮沸l o m i n ，蒸馏水洗净 将取得的沉淀溶于2 m m o l l ( p h 6 8 ) 的p b s ( 力i l k 的p b s 液体尽量的少，能全 部转移沉淀为目的) ，将溶解沉淀的溶液倒入层析袋中。放入 2 0 m m o f l ( p h 6 8 ) p b s 中，4 c 下透析6 h 。 1 1 3 过柱纯化 以s e p h a d e x - - g 2 0 0 为填充料，装1 0 e r a 高的层析柱。用2 0 m m o l l ( p h 6 8 ) p b s 平衡3 个柱体积。加入上述透析截留液，收集颜色深的几管。收集吸集峰为6 2 0 n l n 的蓝色条带，冷冻干燥成千粉，一2 0c 保存。经光谱扫描可知，该样品有藻 蓝蛋自的6 2 0 n m 特征峰( 见图4 a ) 。用p b s 溶液配制5 m g m l 的藻蓝蛋白溶液， 置室温下5 天。s e p h a r o s eg 7 5f f 经蒸馏水及p b s 预处理后，将上述藻蓝蛋 白溶液过柱层析。收集样品冷冻干燥得藻蓝蛋白亚基组分( 见图4 b c ) 。 1 2 。考马斯亮蓝法测蛋白质浓度 1 2 1 制作标准曲线 配制考马斯亮蓝g 一2 5 0 溶液，按表1 操作： 表1 考马斯亮蓝配制方法 t a b l e1p r e p a r a t i o no fc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u eg - 2 5 0s o l u t i o n 考马斯亮蓝g 一2 5 0 l o o m g 9 5 乙醇 5 0 r a l 8 5 磷酸 1 0 0 m l 蒸馏水定容至1 0 0 0 m l 制作标准曲线，步骤如下：取7 支试管，按表操作，得标准曲线。取2 0 1 ：1 样品加8 0 u l n a c l 和5 m l 考马斯亮蓝，测得其a 5 9 5 n m = 0 2 7 9 。代入公式得出层析后藻蓝蛋白浓度为2 5 8 5 m g m l 如表2 、图3 所示 表2 标准曲线制作方法 t a b l e2p r e p a r a t i o no fs t a n d a r dc u r v e 1 2 第一章藻蓝蛋白亚基的制备与鉴定 试管号 o 12 345 6 标准b s a j m l o 0 0 1 o 0 2o 0 3 0 0 40 0 50 0 6 n a c l m lo 1 0o 0 9o 0 80 0 70 0 6 0 0 50 0 4 考马斯亮蓝r a l 5 m l 摇匀，l h 内以0 号试管为空白对照，在5 9 5 a m 处比色 a 5 9 5 m oo 1 1 0 0 1 6 30 2 1 40 2 9 10 3 2 30 3 6 5 图3 经考马斯亮蓝法检测，藻蓝蛋白浓度为2 5 8 5 m g m l 。 f i g u r e3c o n c e n t r a t i o no fc - p ci s2 5 8 5 m g m lc a l c u l a t e df r o mc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u ea s s a y 1 3 聚丙烯酰胺法( p a g e ) 检测藻蓝蛋白亚基含量 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由 丙烯酰胺( a c r ) 和交联剂n ，n 一甲叉双丙烯聚酰胺( b i s ) 聚合而成。a c t 和 b i s 单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应戴手套，避 免接触皮肤，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法 和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺c a p ) ，催化剂是四甲基乙二胺 ( t e m e d ) ；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引 发自由基团。采用不同浓度的a 饼、b i s 、a p 、t e m e d 使之聚合，产生不同孔 径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。 1 3 1 试剂和器材 试剂 分离胶缓冲液：t r i s h c l 缓冲液p h 8 9 ：取1 n 盐酸4 8 m l ，t r i s3 6 3 9 ，用无离 子水溶解后定容至1 0 0 m l 。 浓缩胶缓冲液，t r i s h c l 缓冲液p h 6 7 ：取l n 盐酸4 8 m l ，t r i s5 9 8 9 ，用无离子 藻蓝蛋白巫基光动力作用效果及在体内分布规律的研究 水溶解后定容至1 0 0 m l 。 电泳缓冲液，t r i s 甘氨酸缓冲液p h 8 3 ：称取t r i s6 9 , 甘氨酸2 8 8 用无离子 水溶解后定容至1 l 。用时稀释1 0 倍。 3 0 a c r - - b i s 贮存液：3 0 9a c t , 0 8 9b i s ，用无离子水溶解后定容至1 0 0 m l ，不 容物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。 考马斯亮蓝r 2 5 0 t e m e d ：1 0 过硫酸铵( 新鲜配制) ；2 5 蔗糖溶液；o 0 5 溴酚蓝溶液，7 冰乙酸溶液。 器材 夹心式垂直板电泳槽，凝胶膜( 1 3 5 1 0 0 1 5 m m ) ，直流稳压电源( 电压 3 0 0 - - 6 0 0 v ，电流5 0 一1 0 0 m a , 移液管( 1 ，5 ，1 0 m 1 ) ，烧杯( 2 5 ，5 0 ，1 0 0 m 1 ) ， 细长头的滴管，l m l 注射器以及6 号长针头，微量注射器( 1 0 1 a l 或者5 0 i _ t l ) ， 培养皿( 直径1 2 0 r a m ) ，玻璃板( 1 3 x 1 3 e r a ) ，玻璃纸两张，目光灯一台。 1 3 2 操作方法 安装夹心式垂直板电泳槽 夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，这种电泳槽两侧为有机玻璃制成 的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶膜，该膜由一个u 形硅胶框，长与短 玻璃板及样品模槽板所组成。电泳槽由上贮槽，下贮槽和回纹状冷凝管组成，两 个电极槽与凝胶模之间靠贮液槽螺丝固定，各部分按下列顺序组装： 1 ) 装上贮槽和固定螺丝稍钉，仰放在桌面上。 2 ) 将长短玻璃分别插到硅相框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 3 ) 将已插好玻璃板的凝胶膜平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 4 ) 将下贮槽的销孔对准己装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋 紧螺丝帽。 竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1 琼脂，其目的是为了封住空隙，凝固后的琼脂中应该避免有气泡。用蒸馏水试验 封口处是否漏水。 1 4 第一章藻蓝蛋白诬基的制各与装定 制备凝胶板 1 ) 分离胶制备：取a e r - b i s 储备液5 0 m ht r i s h c i 缓冲液p h 8 92 5 m l ； 去离子水1 2 3 9 m l ；t e m e do 0 2 m l 置于小烧杯中混匀，再加入1 0 0 2 m l 过硫 酸胺，用磁力搅拌器充分混匀2 m i n 。混合后的凝胶溶液，用细长头的滴管加至 长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约l c m 。用l m l 注射器 在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水( 约3 - - 4 e m ) ，用于隔绝空气， 使胶面平整。为防止渗漏，在上下贮槽中加入略低于胶面的蒸馏水。约3 0 - - 6 0 m i n 凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。用滤纸吸去多余 的水，但不要碰破胶面。如需预电泳，则将上下贮槽的蒸馏水倒去，换上分离胶 缓冲液，1 0 m a 电流电泳l h ，终止电泳后，弃去分离胶缓冲液，用注射器吸取浓 缩胶缓冲液洗涤胶面数次，即可制备浓缩胶。 2 ) 浓缩胶制备：取a c r - b i s1 0 m l ；t r i s ，h c l 缓冲液p h 6 71 2 5 m l ；去离子水 7 6 4 m l ；t e m e d0 0 1 m l ；1 0 a p0 2 m l ，用磁力搅拌器充分混匀。混合均匀后 用细长头的滴管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内( 及分离胶上方) ，距短玻 璃板上缘o 5 c m 处，轻轻加入样品槽模板。在上下贮槽中加入蒸馏水，但不能超 过短玻璃板的上缘。在距短玻璃板1 0 e r a 处用日光灯或太阳光照射，进行光聚合， 但不要造成大的升温。在正常情况下，照射6 7 m i n ，则凝胶由淡黄透明变成乳 白色，表明聚合作用开始。继续光照3 0 m i n ，使凝胶聚合完全。光聚合完成后放置 3 0 - 6 0 m i n ，轻轻取出样品模槽板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的液体，加 入稀释1 0 倍的p h 8 3 的t r i s 一甘氨酸电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约o 5 c m ， 即可加样。 加样 取藻蓝蛋白亚基样品4 0 m g m l0 1 m l ，2 5 蔗糖溶液0 1 m l ，0 0 5 溴酚蓝溶 液0 0 5 m l 混合后，用微量注射器取5 9 l 上述混合液，通过缓冲液，小心的将样 品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 电泳 将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开 电泳仪开关，开始时将电流调