（生理学专业论文）细胞色素p4502d6基因多态性研究.pdf

细胞色素p 4 5 0 2 d 6 基因复查：堕至开究 浙江大学湖滨校区生理学 9 5 级博士研究生：陈枢青 导师：余应年教授，d rp e t e rjw e d l u n d ( 教授) 摘要 细胞色素p 4 5 02 d 6 ( c y t o c h r o m ep 4 5 02 d 6 ，c y p 2 d 6 ) 参与五十多干4 懂物的 代谢，是细胞色索类药物代谢酶中最为重要的一种。该酶的多态性现象普遍存 在。欧d i t 人种中发现有7 - 1 0 的慢代澍者，亚洲人种中慢代鲥者的发生率为1 2 。慢代谢者发现是由于其丛冈缺陷造成的。已报道的c y p 2 d 6 酶活性缺陷的 簿位基田有：c y p 2 d 6 a 是由丁第5 外显子第2 6 3 7 位a 缺火造成其后面的序列 读框位移致使酶活性缺陷：c y p 2 d 6 b 是第3 号内含子与第4 号外显予之问1 9 3 4 位g a 尖变造成酶活性缺陷；c y p 2 d 6 d 是整个c y p 2 d 6 丛冈丢火；c y p 2 d 6 e 是c y p 2 d 6 丛囚第六外显子上3 0 2 3 位a _ c 突变，导致表达产物3 2 4 h i s - - - p r o ， 引起酶活性缺陷。c y p 2 d 6 t 姓3 号外显子17 9 5 t 缺火，致使表达产物i5 1 似 t r y g l y 和1 5 2 位终止密码，造成c y p 2 d 6 不能表达完全。c y p 2 d 6 c 等位錾 因是c y p 2 d 6 基因第2 7 0 3 5 位a g g 丢失，造成了表达产物第2 8 1 位赖氨酸的 缺失，体外实验中发现其是酶活性缺陷型等位基i 困( t y n d a l e e ta 1 1 9 9 1 ) ，而其他 实验又认为c y p 2 d 6 c 不影响表达产物的活性( b r o l ye t a l j 9 9 3 ) 。d a l y ( 1 9 9 4 ) 在加 拿大世界微粒体与药物氧化大会上报道了”c y p 2 d 6 f ”。“c y p 2 d 6 f 叶日c y p 2 d 6 基因2 0 6 4 g a 突变，造成表达产物2 1 2 位上谷氨酸变成甘氨酸，从而引起酶 分子失活。第二年d a l y ( 1 9 9 5 ) 等又报道了c y p 2 d 6 * 6 ，发现c y p 2 d 6 * 6 实际上 是1 7 9 5 位t 缺失的c y p 2 d 6 t 和”c y p 2 d 6 f ”同时发生。正由于这些等位基因 的存在，造成了c y p 2 d 6 的多态性现象。本研究在此基础上，对c y p 2 d 6 的表 型分型、基因分型及其临床意义进行了更为系统深入的研究。 首先利用加大样本量，提高检测灵敏度，并将右美沙芬与其代谢产物去甲 右美沙芬分组测定，建立了新的c y p 2 d 6 表型分型法。该法对右美沙芬的检测 灵敏度可达l n d m l ，测定标准曲线在1 0 0 倍范围内呈线性，r 2 在0 9 9 5 1 0 0 0 之间。再利用等位基因特异扩增法( a s a ) 为基础建立了c y p 2 d 6 基因分型法， 测定的等位基因有c y p 2 d 6 a 、c y p 2 d 6 b 、c y p 2 d 6 c 、c y p 2 d 6 e 、c y p 2 d 6 t 和c y p 2 d 6 * 6 。测定方法快速、准确、重复性好，阳性对照和阴性对照说明实 验结果可靠并无污染问题。对1 6 8 例实验对象进行了基因分型与表型分型对照 测定，结果发现吻合率为1 0 0 。说明基因分型法可准确地预测表型分型，并能 用于临床对c y p 2 d 6 进行活性筛选。实验结果还证实c y p 2 d 6 c 对c y p 2 d 6 酶 活性的影响很小、c y p 2 d 6 * 6 与c y p 2 d 6 t 连锁，所以，临床只为预测c y p 2 d 6 酶活性，可以不必测定c y p 2 d 6 c 和c y p 2 d 6 * 6 。 对c y p 2 d 6 纯合子与杂合子快代谢者的右美沙芬代谢比率进行统计后，发 现了纯合子快代谢者与杂合子快代谢者之间在代谢比率上也有差异( 表1 ) 。 本研究提示c y p 2 d 6 基因表达时，基因拷贝数起着一定的作用。 表11 6 8 倒表型测定结果的统计数据 w t ：野生型，m ：突变型，m r ：代 身f 比率 对有c y p 2 d 6 酶缺陷型等位基因的携带者及其家属，九个家庭共3 8 人进 行了基因分型，发现c y p 2 d 6 酶缺陷呈常染色体隐性遗传，符合孟德尔第二定 律。 在临床研究时，对7 4 名抑郁症患者( 其中1 8 人对三环类抗抑郁药物有副 反应) 进行基因分型和表型分型分析( 表2 ) 。结果显示有副反应组所拥有的 c y p 2 d 6 酶缺陷等位基因比无副反应组和对照组高一倍多，说明c y p 2 d 6 基因 分型对临床预测药物作用副反应易感者有很大意义。 2 表2 两组受试者等位基因的发生频率 等位基因数 组别突变等位基因( m ) 野生等位基因( w )m ( m + w ) 在对新药临床试验中受试者进行c y p 2 d 6 基因分型时，1 3 6 位来自于肯塔 基火学的受试者是通过广告招募的，1 3 8 位来自于三个不同临床药理实验室的 受试者。两组受试者中自人所i 打的比例均大于9 0 。两组受试者的等位基因测 定结果见表3 ，c y p 2 d 6 酶缺阵；( 纯合子突变型) 者发生频率有缀显薷差异，肖塔 基大学组在1 3 6 人中发现9 人，为6 6 ：而临床药理实验室组在1 3 8 人中发现 1 人，为o 7 。两组慢代谢者发生率经x 2 检验有显著性差异( x 2 = 67 6 ，p 16 ) ，但适合于p c r 、r f l p 等使用，在3 0 0 份 样本操作中从未发现任何问题，并且提取的d n a 足够用于建立d n a 样本库。 3 c y p 2 d 6 基因分型结果 3 1 图6 - 1 1 分别是对c y p 2 d 6 a 、c y p 2 d 6 b 、c y p 2 d 6 c 、c y p 2 d 6 e 、c y p 2 d 6 * 6 、 c y p 2 d 6 t 进行a s a 分析时的结果。其中，有目的片段扩增的，说明有相对应的 等位基因存在：无目的片段扩增的，说明无相对应的等位基因存在。 9 黜 耆! 枷 蝴黼 瑚 9 d嚣03山薯。 幽6c y p 2 d 6 a 等位基因测定时的二种典型结果 t 1 ：野生掣引物；t 2 ：突变型引物：w t ，州：野生型纯合子 、i a ：c y p 2 d 6 a 杂合子：没有发现突变型纯合子a a ： m a h 、c l s 和j f k 为受试者姓名第一字母缩写 刳7c y p 2 d 6 b 等位丛i ) , i n 定时的三种典，世结贝 b 一：野生型引物：b8 ：突变型引物：w t w t ：野生删纯台1 ： b 、【：c y p 2 d 6 b 杂台子：b i b ：c y p 2 d 6 b 突变删纯合f ： w d p 、w s v 和k m f 为受试者姓名第一字母缩写 图8c y p 2 d 6 c 等位基因测定时的三种典型结果 c 9 ：野生型引物；c l o ：突变型引物；w t w t ：野生型纯合子 w t c ：c y p 2 d 6 c 杂合子；c c ：c y p 2 d 6 c 突变型纯合子： j b w 、s t p 和j v b 为受试者姓名第一字母缩写 幽9 c y p 2 d 6 e 等位基因测定时的二种典型结果 e l ：野生型引物；e 2 ：突变型引物；w t w t ：野生型纯台子 w t j e ：c y p 2 d 6 e 杂合子；没有发现突变型纯合子e e ； k t l 、r a l 和n c e 为受试者姓名第一字母缩写 图1 0 。c y p 2 d 6 * 6 等位基因测定时的三种典型结果 * 6 w ：野生型引物：* 6 m ：突变型引物：w t w t ：野生型纯合子 w t * 6 ：c y p 2 d 6 * 6 杂合子：* 6 * 6 ：c y p 2 d 6 * 6 突变型纯合子： g d b 、v s e 和r a h 为受试者姓名第一字母缩写 图1 1 c y p 2 d 6 t 等位基因测定时的三种典型结果 t 1 ：野生型引物；t 2 ：突变型引物；w t w t ：野生型纯合子 、v t 厂r ：c y p 2 d 6 t 杂合子；1 h ：c y p 2 d 6 t 突变型纯合子； d t ：一份基因丢失，另一份为c y p 2 d 6 t ；r a h 、d s e 和 1 a t 为受试者姓名第一字母缩写 3 2c y p 2 d 6 基因分型与表型分型的一致性： 本研究对1 6 8 例受试者进行了基因分型测定，并把结果与其表型分型比 较，得到了1 0 0 的正确率。图11 显示预测的表型分型与其代谢比率分布。前 排是根据基因型预测的慢代谢者，中排是杂合子，后排为预测的快代谢者。慢 代谢者的代谢比率较高，快代谢者代谢比率较低，快、慢代谢的分界值为o 3 0 5 右美沙芬代谢比率对数值 图1 2 c y p 2 d 6 表型分型及其代谢比率分布 3 3 对1 6 8 例受试者进行表型分型测定，结果经统计列于表8 。 表8 1 6 8 例代谢比率测定结果统计 w t ：野生型基因，m ：酶缺陷突变型基因 3 4 表9 为c y p 2 d 6 快、慢代谢者中，其基因型的分布及其例数。c y p 2 d 6 b 在慢代谢者中发生率最高，为8 1 4 ；c y p 2 d 6 a 为8 】；c y p 2 d 6 t 为8 1 ； c y p 2 d 6 e 也为2 3 ；c y p 2 d 6 * 6 为69 。 表9 c y p 2 d 6 快、慢代谢者中基因型的分布 w t ：野生型c y p 2 d 6 ，a ：c y p 2 d 6 a ，b ：c y p 2 d 6 b ，c ：c y p 2 d 6 c ，e ：c y p 2 d 6 e + 6 ：c y p 2 d 6 * 6 。 3 5 在我们随机组织的1 0 5 位受试者中，各种等位基因的发生率如表1 0 。本研 究测到的各等位基因发生率与欧洲白人报道的总发生率基本一致( a l v a ne t a l 1 9 9 0 ，b e n i t e ze ta 1 1 9 8 8 ，b r o l ye ta 1 1 9 9 3 ，e v a n se ta 1 1 9 8 0 ，e v e r te ta 1 1 9 9 4 a ， e v e ne ta 1 1 9 9 4 b ，g u t t e n d o r f e ta 1 1 9 9 0 ，k a g i m o t oe ta 1 1 9 9 0 ，m a g h o u be ta 1 1 9 7 7 n a k a m u r ae ta j 1 9 8 5 ) 。 表1 0 本研究各c y p 2 d 6 等位基因发生率与己报道的发生率比较 等位基因 本研究发生率 报道的总发生率 n = 总等位基因数( 2 受试者) 3 6p c r 结果重复性与质量控制： 对随机编号的已知基因型d n a 样本进行盲法基因分型分析，发现本实验 室建立的c y p 2 d 6 a 、c y p 2 d 6 b 、c y p 2 d 6 c 、c y p 2 d 6 e 、c y p 2 d 6 + 6 、c y p 2 d 6 t 等位基因测定方法重复性很好，所有测定结果与已知基因型完全一致。空白对 照实验证明，本实验室所进行的p c r 分析法无污染问题。阳性对照的结果说明 基因分型分析方法完全可信，每次分析均设置阳性对照有助于发现一些不可预 料的因素对实验的影响，从而提高结果的可信度。 4 c y p 2 d 6 基因多态性与抗抑郁药物毒副作用的相关性： 5 6 位无副反应组抑郁症患者的基因分型与表型分型结果见表1 1 。 c y p 2 d 6 a 、c y p 2 d 6 b 、c y p 2 d 6 e 、c y p 2 d 6 t 等位基因的发生率合计为2 0 5 ， 这与正常人群2 0 基本一致( p o 5 0 ；x 2 检验) 。1 8 位有副反应组的患者其基因 分型、表型分型及使用的药物和付反应情况见表1 2 。其中c y p 2 d 6 a 、 c y p 2 d 6 b 、c y p 2 d 6 e 、c y p 2 d 6 t 等位基因的发生率为4 4 4 ，显著地高于无 副反应组的患者( p o 0 5 ；x 2 检验) ( 表j 3 ) 。 表11 5 6 名无副反应组患者的c y p 2 d 6 基因型、右美沙芬代谢比率和表现型 患者编号基因型 右美沙芬代谢比率表现型 d 1 d 2 d 3 w t ，w t w 汨 w t ，w t 0 0 0 4 0 0 0 7 0 0 0 4 e m e m e m d 4 d 一5 d 6 d 一7 d 8 d 一9 d 1 0 d 1 1 d ，1 2 d - 1 3 d 一1 4 d 一1 5 d 1 6 d 1 7 d 18 d 1 9 d 2 0 d ，2 1 d 2 2 d - 2 3 d 2 4 d 2 5 d 2 6 d - 2 7 d 2 8 d - 2 9 d 3 0 d - 3 1 d - 3 2 d 3 3 d b 4 d 3 5 d 3 6 d - 3 7 d 3 8 d 3 9 d - 4 0 w t ，w t w t ，w t w t ，w t a b w t ，w t w t w t w 佃 w 佃 w t w t w “w t w t ，w t w t w t w t ，w t w t b w t ，b w t ，w t w t ，w t w t ，w t w t ，b w t w t w “w t w t ，_ a w f f w t w t w t w t ，w t w _ 【，w t w t ，w t w 佃 w “w t w t ，w t b ，b w t v t w t 厂w t w t ，w t w 仉v t w t ，w t w t ，、t o0 0 1 0 0 0 0 8 00 0 3 4 8 6 00 0 6 7 00 0 2 o 1 2 5 0 0 1 1 o0 1 0 0 0 0 3 0 0 0 6 0 0 0 4 2 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 4 4 00 0 0 5 0 0 0 2 4 0 0 0 2 3 0 0 0 4 00 0 4 0 0 0 6 4 0 0 0 3 00 0 5 0 0 0 4 0 0 0 0 4 0 0 0 9 0 0 1 7 0 0 5 0 5 0 0 1 5 00 1 7 2 4 3 0 0 0 2 4 0 0 1 0 7 o 0 0 1 0 0 0 6 0 0 0 4 0 0 0 5 e m e m e m p m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m e m p m e m e m e m e m e m e m d 4 1 d 4 2 d 4 3 d 4 4 d 4 5 d - 4 6 d 4 7 d - 4 8 d 4 9 d 5 0 d 5 1 d 5 2 d 5 3 d 5 4 d 5 5 d 5 6 w t w t b b w t b w 佃 w 佃 w t b w t b w t w t w t w t w t ，w t w 佃 w 们t w 忧 w t ，w t w 佃 w 佃 o 0 1 8 5 3 5 0 0 3 2 0 0 3 9 n d n d n d n d n d n d n d n d n d n d n d n d e m p m e m e m n d n d n d n d n d n d n d n d n d n d n d n d n d ：无数据 表1 2 1 8 名有副反应组患者的c y p 2 d 6 基因型、右美沙芬代谢比率、使用药 物和用药剂量等 患者编号基因型代谢比率备注 a d 1 a d 2 w t ，b w t ，b 0 0 1 9 0 5 9 a d 一3w t b 0 3 9 a d 一4w t w t 00 0 7 7 5 1 0 0 r a g 日n o r t r i p t y l i n e 5 0 m g 日d e s i p r a m i n e e p a r o x e t i n e 剂量无资料 7 5 m g 日v e n l a f a x i n e 1 4 个月中更换了十种抗抑郁药，其中 2 0 m g 日p a r o x e t i n e 1 0 0 m g f 3i m i p r a r n i n e 1 0 0 m g 1 3n o r t r i p t y l i n e 7 5 m g 日v e n l a f a x i n e 7 5 m g 日n e f a z a d o n e 1 5 0 m g 日i m i p r a m i n e a d 5w t w t a d 6w 似0 0 2 5 5 a d 7 a d 8 a ，b