（遗传学专业论文）新型免疫毒素mst的表达、纯化及细胞毒性分析.pdf

声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取 得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 研究生( 签名) ： 一淄釉事聊 j 础叼。g 舻 午 新型免疫毒素r e s t 的 表达、纯化及细胞毒性分析 硕士研究生：蔡华伟 导师：卢晓风 中文摘要 免疫毒素因具有细胞选择性杀伤活性而在一些疾病治疗中显示出广 阔的应用前景。免疫毒素通常由识别片段和杀伤片段组成，识别片段决 定分子对细胞的选择识别特性，杀伤片段决定分子的杀伤效率和作用方 式【l 】。活化t 细胞是介导移植排斥的重要细胞，选择性清除活化t 细胞 可能减轻移植排斥反应。活化t 细胞表面诱导性表达t 淋巴细胞相关毒 性抗原4 ( c 1 i a _ 4 ) 分子，因此，利用针对c t l a 4 的单链抗体为识别 片段，融合能够作用于细胞膜的通道形成杀伤片段，构建的免疫毒素可 能选择性清除活化t 细胞，具有被开发为新的免疫抑制剂的潜力。 根据这一设想，本研究分别选择了抗小鼠c t l a - 4 单链抗体m s 和 能在真菌细胞膜上打孔的抗真菌肽t 为识别片段和杀伤片段，设计了表 观分子量大约为3 4 k d 的新型免疫毒素r e s t ；通过基因工程手段，先后 在原核大肠杆菌和真核毕赤酵母系统中进行表达；进而分离纯化重组蛋 白，并对其细胞杀伤活性进行了初步分析。结果发现： 1 ) 将r e s t 基因插入原核大肠杆菌表达系统p q e 3 0 载体中，2 8 c 条 件下，经o 1m m o l a , i p t g 诱导，表达菌超声破碎后，其上清经n i - n t a 亲和层析，可以获得少量的可溶性m s t 蛋白；多数m s t 蛋白以不可溶 的包涵体形式表达，包涵体沉淀用6 m 盐酸胍进行溶解，然后在8 m 尿 素存在的情况下经n i n t a 分离纯化，可获得大量r e s t 包涵体蛋白；在 4 。c ，5 0r a mt r i s - h c l ，lm u r e a ，0 8ml - a r g i n i n e ，2m mg s h ，0 2 四纠友坐亟监塞 m m g s s h ，p h 8 0 条件下透析复性4 8 h ，约7 0 包涵体蛋白可以被复性， 但是，在去除复性液中残留变性剂的过程中，蛋白损失较大，最终蛋白 浓度大约只有o 1 m g m l 左右。 2 ) 由于包涵体蛋白复性困难，重复性差，因此本论文迸一步选择能 够分泌表达重组蛋白的真核毕赤酵母体系对m s t 进行表达。将m s t 基 因插入p p i c 9 k 后再通过电穿孔转入毕赤酵母g s l l 5 ，长出的单克隆经3 轮培养后进行g e n e t i c i n 。y p d 平板筛选，从l m g m l 的g e n e t i c i n 固y p d 板上获得了多拷贝重组子；在2 8 o ，2 8 0 r p m 的条件下培养至o d 6 0 ( 卜- 2 - 6 ， 浓缩1 0 倍后，利用3 甲醇的b m m y 诱导9 6 h ，从1 0 0 m l 培养上清中可 获得0 1 m g 目的蛋白。 3 ) 活性分析发现，从大肠杆菌细胞质内分离纯化的可溶m s t 在0 5 ， 1 和2u m 浓度下，对小鼠淋巴瘤细胞( e l 4 ) 的杀伤率分别为3 6 0 扯1 1 2 ， 4 4 0 o _ + 3 8 ，6 4 ：t ：9 1 ；从包涵体复性获得的m s t 在o 5 ，l 和2u m 浓 度下对e l 4 的杀伤率分别为2 4 0 硅1 3 1 ，4 5 - - t = 1 0 1 ，6 2 0 硅1 0 ；而从 毕赤酵母表达体系中获得的r e s t 在l u m 浓度下对e l 4 的杀伤率为 3 7 5 垃2 。而单链抗体m s 在这些浓度下对e l 4 没有明显杀伤作用。 上述结果表明，m s t 在大肠杆菌中以可溶和包涵体形式表达，但主 要为不具活性的包涵体；在毕赤酵母p i c 9 k 体系中以可溶蛋白形式表达， 但产量不高，大约每升诱导培养基可获得l m g 蛋白；活性分析发现，不 同来源的m s t 对e l 4 细胞均表现了一定的杀伤，表明该免疫毒素的设计 是可行的。在今后的工作中，尚需进一步优化m s t 的表达条件，获取大 量的蛋白，对其体内外细胞杀伤活性及特异性进行研究，确定其抗移植 物排斥效果及作为新型免疫抑制剂的可能性。 关键词：免疫毒素；免疫抑制剂；单链抗体；c t l a 4 ；大肠杆菌表达系 统；毕赤酵母表达系统；细胞毒性 e x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o na n dc y t o t o x i c i t y o fn o v e ll m m u n o t o x i nm s t 舰s c a n d i d a t e ：c a ih u a w e i s u p e r v i s o r -l hx i a o f e n g a b s t r a c t ： i m m u n o t o x i n sh a v et h e p o t e m i a li nd i s e a s et h e r a p yf o ri t ss e l e c t i v e k i l l i n go fs o m ec e l lp o p u l a t i o n s s i n c ea c t i v a t e dtc e l l sp l a yac e n t r a lr o l ei n t r a n s p l a n t a t i o n 哟e c t i o n , a ni m m u n o s u p p r e s s i v es t r a t e g yi st op r o d u c e i m m u n o t o x i nt h a tc o u l d s e l e c t i v e l y d e l e t ea c t i v a t e dtc e l l s c t l a 4i s i n d u c t i v e l ye x p r e s s e d o ns u r f a c eo fa c t i v a t e dt c e l l s t h e r e f o r e , c t l a 4 - m e d i a t e di m m u n o t o x i n s m i g h t b e d e v e l o p e d a s n o v e l i m m u n o s u p p r e s s a n td u et ot h e i ra b i l i t yt os e l e c t i v e l yd e l e t ea c t i v a t e dtc e l l s b a s e do nt h i s c o n c e p t ，an o v e li m m a n o t o x i nc a l l e dm s tw a s c o n s t r u c t e db yf u s i n gap o r e - f o r m i n ga n t i f u n g a lp e p t i d ett ot h ec - t e r m i n a l o ft h ea n t i - c t l a 4s e f v a n dt h eg e n ee n c o d i n gr e s tw a se x p r e s s e di n p r o k a r y o t i ca sw e l l 邪e u k a r y o t i cs y s t e m t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a s p u r i f i e da n di t sc y t o t o x i c i t yt oc t l a 4 - p o s i t i v ee l 4c e l l sw a sd e t e c t e d t h e m a i nr e s u l t si n c l u d e ： 1 ) i nt h i sr e s e a r c h ，w ec o n s t r u c t e dt h ee x p r e s s i o nv e c t o r sp q e - m s tf o r p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ni ne c o l im 1 5 i m m u n o t o x i nr e s tw a sm a i n l y e x p r e s s e d 嚣i n s o l u b l ei n c l u s i o nb o d i e s o n l yas m a l la m o u n t , a p p r o x i m a t e l y o 1 m g lo f s o l u b l em s tw a sp u r i f i e df r o mt h ec y t o p l a s mo f m s t - p r o d u c i n g 6 四21 l 态芏亟监塞 c e l l s a f t e ri n d u c e db yo 1 m mi p t ga t2 8 f o r5 h 。w h e a l s ，s e v e r a l m i c r o g a m s o fm s ti n c l u s i o nb o d i e sw a s p u r i f i e df r o mp r e c i p i t a t e o f p r o d u c i n gb a c t e r i aa f t e rs o n i e a t e d t h ei n c l u s i o nb o d i e sw e r ed i s s o l v e di n 6 mg u a n i d i n e h c ia n dp u r i f i e db yn i - n t au n d e rd e n a t u r e dc o n d i t i o n s u b s e q u e n t l y , t h ei n c l u s i o n b o d i e sw e r er e f o l d e di n r e f o l d i n g b u f f e r c o n t a i n i n g5 0m m t r i s h c l ，1mu r e a ，0 8m l - a r g i n i n e ，2m m g s h ， 0 2m m g s s h ，p h 8 0 ，a t4 cf o r4 8 h a b o u t7 0 i n c l u s i o nb o d i e sc o u l db e r e f o l d e di n t os o l u b l ep r o t e i n h o w e v e r , i nt h ef u r t h e rp r o c e s so fr e m o v i n g d e n a t u r a n tb yd i a l y s i s a g a i u sp b s ，c o n s i d e r a b l ep r o p o r t i o no fp r o t e i n p r e c i p i t a t e d 。a n d w eg e tt h es o l u b l e p r o t e i n a tt h ec o n c e n t r a t i o no f o 1 m g m lf i n a l l y 2 ) w ef u r t h e rc o n s t r u c t e dt h ee x p r e s s i o nv e c t o r sp p i c 9 k - m s tf o r e u k a r y o t i ep i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o nt oa v o i dt h ep r o b l e mo f i n c l u s i o nb o d y p r o t e i nr e f o l d i n g y e a s tc e l l sa l et r a n s f o r m e db ye l e e t r o p o r a t i o na n dt h e n m u l t i - c o p i e so fi n s e r t s w e l es c r e e n e do ng e n e t i c i n 。y p dp l a t e s a f t e r s m a l l s c a l em e t h a n o li n d u c t i o n ，e x p r e s s i o nc o n d i t i o n sa r eo p t i m i z e d f i n a l l y , w e g e t1m gm s t f r o m1l i t e rc u l t u r ea f t e ri n d u c e db y3 m e t h o n a l 3 0 f o r 9 6 h 3 ) c u l t u r e dm o u s ec t l a - 4p o s i t i v ec e l le i aw a su s e dt od e t e c tt h e c y t o t o x i c i t yo fr e c o m b i n a n tm s t t h es o l u b l em s tf r o me c o l im 1 5s h o w s k i l l i n gr a t eo f3 6 0 箱：1 1 2 ，4 4 v 硅3 8 ，6 4 - q ：9 1 t oe l 4a tc o n c e n t r a t i o n o f0 5 ，1a n d2u m r e s p e c t i v e l y t h em s tr e f o l d e df r o mi n c l u s i o nb o d i e s p r o d u c e db ye c o l im 1 5s h o w sk i l l i n gm t eo f2 4 1 3 1 ，4 5 址1 0 1 ， 6 2 士1 0 t oe l 4a tc o n c e n t r a t i o no f 0 5 ，1a n d2u m i n d i v i d u a l l y a n dt h e k i l l i n g r a t eo fs o l u b l e p r o t e i nf r o mp i c h i ap a s t o r i at o e i ac e l l si s 3 7 5 0 硅2 2 a tc o n c e n t r a t i o n1u m h o w e v e r , n oo b v i o u sc y t o t o x i c i t yo f 7 s c f v ，n a m e l ym s ，a tt h es a m ec o n c e n t r a t i o nw a sd e t e c t e di nt h i sr e s e a r c h t h ea b o v er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a ts i n a i la m o u n to fs o l u b l em s t c o u l d b ep r o d u c e db yb o t he c o l ia n d p i c h i a p a s t o r i 皿a n dh i 曲l e v e lo f m s tc o u l d b ee x p r e s s e da si n c l u s i o nb o d i e si ne c o l i t h ec y t o t o x i c i t yo f m s tt o c t l a 4 - p o s i t i v ee l 4s u g g e s t st h a tr e s tm i g h td e l e t ea c t i v a t e dtc e l l s b u t t h e e f f i c i e n c ya n ds p e c i f i c i t yo f r e s tn e e dt ob ei n v e s t i g a t e di nf u t u r e k e yw o r d s ：c t l a - 4 ，s c f v ，i m m u n e t o x i n ，e c o l ie x p r e s s i o ns y s t e m ， p i c h i a p a s t o r i ae x p r e s s i o ns y s t e m ，c y m t o x i c i t y 3 四川盘堂亟迨塞 新型免疫毒素r e s t 的 表达、纯化及细胞毒性分析 硕士研究生：蔡华伟 导师：卢晓风 刖置 t 淋巴细胞简称t 细胞，是人体免疫系统重要的效应细胞之一，也是 介导移植物排斥的主要细胞。正常情况下人体内绝大部分t 细胞处于静 息状态，在接受同种异体器官细胞移植后，t 细胞被激活而介导免疫排 斥反应【2 】。由于现行免疫抑制剂不能对静息t 细胞和活化t 细胞进行选 择性杀伤，长期使用必然会导致移植受者整体免疫力下降，无法抵抗移 植后感染，也容易导致恶性肿瘤发生。因此，选择性清除活化t 细胞而 非所有t 细胞才是更加安全、有效的免疫抑制策略【3 1 。同时，研究表明， 活化的t 细胞还与自身免疫性疾病的发生等有密切联系m5 1 。目前，能够 特异性清除活化t 细胞的免疫毒素正在研究之中。 活化t 细胞表面诱导性表达细胞毒性t 淋巴细胞相关抗原4 ( c y t o t o x i e t - l y m p h o c y t ea s s o c i a t e da n t i g e n - 4 ，c t l a - 4 ) 。迄今为止，c t l a 4 的确切作 用机制尚未完全阐明，但从已有研究可以看出，根据c t l a 4 构建的相 关抗体融合蛋白能抑制t 细胞依赖的抗体反应，具有免疫调节功能【6 】。 此外，对于免疫耐受的诱导，感染性疾病，肿瘤防治等方面，研究c t l a 4 相关免疫毒素都具有广泛的前景【7 ，8 ，9 】。 抗体以其与抗原特异性结合的能力作为免疫毒素导向片段具有天然 9 的优势，但固有单克隆抗体分子量大，免疫原性强，不易生产等特点制 约了它的应用。单链抗体保持了亲本抗体的抗原亲和力和特异性，组织 穿透力强，易于制备，在免疫毒素的导向片段的构建中更优于完整抗体 1 1 0 l 。 现有杀伤片段主要是致病菌毒素、植物毒素功能片段和核糖体抑制 蛋白等。这些通过抑制胞内蛋白合成或代谢导致细胞凋亡的毒素，容易 诱导机体产生抗性【1 1 1 ；因此，现在的研究倾向于利用能在细胞膜上形成 通道导致细胞内容物泄露而死亡的小分子通道形成蛋白，肽作为杀伤片 段，使细胞不易通过改变细胞膜结构和组成而产生抗性【1 2 1 。 因此，利用针对c n a - 4 的单链抗体( a n t i c t l a 4s c f v ) 为识别片 段，融合能够作用于细胞膜的通道形成肽为杀伤片段，构建的免疫毒素 r e s t 可能选择性清除活化t 细胞。在本研究中，利用抗小鼠c 1 r i a - 4 单 链抗体作为免疫毒素的导向片段，利用膜孔道形成效应蛋白t 作为杀伤 分子，构建抗小鼠c t l a 4 单链抗体免疫毒素融合蛋白( m s t ) ；在原核 大肠杆菌体系和真核毕赤酵母体系中进行表达，并取得一定量的活性蛋 白；观察r e s t 在体外对c t l a - 4 阳性细胞e l 4 的杀伤作用，为进一步对 其体内活性及特异性研究奠定基础。 需要特别说明的是，本研究中构建免疫毒素r e s t 所使用的杀伤片段 t 是一种昆虫抗真菌肽，由3 6 个氨基酸组成。发现这一抗真菌肽的小组 确定其通过在真菌细胞膜上打孔导致细胞内容物泄露而杀菌。本论文所 设计免疫毒素r e s t 的专利申请工作正在进行之中。受专利申请的限制， 在专利申请被受理之前，尚不能公布这一抗真菌肽的序列及其它信息。 因此，本论文中仅用该抗真菌肽英文的第一个字母t 替代。 1 0 参考文献 1 p a s t a nlh a s s a nrf i t z g e r a l dd j , k r e i t m a ni l l i m m u n o t o x i nt r e a t m e n to f c a n c e r a m l ur e vr e e d 2 0 0 7 ；5 8 ：2 2 1 - 3 7 r e v i e w 2 a z u m ah c h a n d r a k e ra ，n a d e a ukh a n c o c kw wc a r p e n t e rc b ，t i i n e yn l ，e t a 1 b l o c k a d eo f t - c e l lc o s t i m u l a t i o np r e v e n t sd e v e l o p m e n t o f e x p e r i m e n t a lc h r o n i cr e n a l a l l o g r a f tr j e c t i o n p r o cn a t l a c a ds c iu s a1 9 9 6 ；9 3 ：1 2 4 3 9 - 1 2 4 4 4 3 a r i ap , p o w e l ld jj r , m a k e ra v , e ta 1 s e l e c t i v ee l i m i n a t i o no fh u m a nr e g u l a t o r yt l y m p h o e y t e s i n v i t r o w i t h t h er e c o m b i n a n ti m m u n o t o x i nl m b - 2 j i m m t m o t h e r 2 0 0 6 ，2 9 ( 2 ) ：2 0 8 - 2 1 4 4 f l a v i ov i n c e n t i la n dm i c h a e ll u g g e n ，tc e l lc o s t i m u i a t i o n ：ar a t i o n a lt a r g e ti n t h et h e r a p e u t i ca r m a m e n t a d u mf o ra u t o i m m u n ed i s e a s e sa n dt r a n s p l a n t a t i o n 。 a n n u a l r e v i e wo f m e d i c i n ev 0 1 5 8 ：3 4 7 - 3 5 8 ( v o l u m ep u b l i c a t i o nd a t ef e b r u a r y2 0 0 n 5 w a r w i c k - d a v i e sj ，w a t s o n a j ，g f i f f mg e k r i s h n as ，s h a t t o c ki l l e n h a n c e m e n to f m y c o b a c t e r i u mm b e r c a l o s i s - i n d u c e dt u m o r n e c r o s i sf a c t o ra l p h ap r o d u c t i o nf r o m p r i m a r yh u m a nm o n o c y t e sb ya l la c t i v a t e dt - c e l lm e m b r a n e - m o d i a t e dm e c h a n i s m i n f e c ti m m u n 2 0 0 1n o v ；6 9 ( 11 ) ：6 5 8 0 7 6 j b l u e s t o n e , e s t c l a i r , l t u r k a , c t l a 4 i g ：b r i d g i n gt h eb a s i ci m m u n o l o g yw i t h c l i n i c a la p p l i c a t i o n i m m u n i t y ，v o l u m e2 4 ，i s s u e3 ，p a g e s2 3 3 - 2 3 8 7 a l e g r em l ，f a l l a r i n oe m e c h a n i s m so f c t l a - 4 i gi nt o l e r a n c ei n d u c t i o n c u r tp h m - m d e s 2 0 0 6 ，1 2 ( 2 ) ：1 4 9 - 1 6 0 8 f i n c kb k , l i m l e yp s ，w o f s yd t r e a t m e n to fr o u t i n el u p u sw i t hc t l a 4 i g s c i e n c e 1 9 9 4 ；2 6 5 ( 5 1 7 6 ) ：1 2 2 5 7 9 l e a c hd r , k n m a m e lm f ，a l l i s o n 1 p e n h a n c e m e n to f a n t i t u m o ri m m u n i t yb y c t l a - 4b l o c k a d e s c i e n c e 1 9 9 6m a r2 2 ；2 7 l ( 5 2 5 6 ) ：1 6 9 】 1 0 t a z 2 z r ip l ，p o l i t ol b o l o g n e s ia ，e ta 1 ，i m m u n o t o x i n sc o n t a i n i n gr e c o m b i n a n t a n t i - c t l a - 4s i n g l e - c h a i nf r a g m e n tv a r i a b l ea n t i b o d i e sa n ds a p o r i n ：i nv i t r or e s u l t s a n di nh v oe f f e c t si na na c u t er e j e c t i o nm o d e l t h ej o u m a lo f i m m u n o l o g y ，2 0 0 1 ，1 6 7 ： 4 2 2 2 1 1 m c c - r a t hm s ，r o s e n b l m nm g p h i l i p sm r c ta 1 i m m u n o t o x i nr e s i s t a n c ei nm u l t i d r u g r e s i s t a n tc e l l s c a n c e rr e s , 2 0 0 3 ，6 3 ( 1 ) ：7 2 1 2 r i c h a r dm e p a n d ，h a n sj v o g e l ，d i v e r s i t yo fa n t i m i c r o b i a lp e 皿d e sa n dt h e i r m e c h a n i s m so f a e t i o n , b i o e h i m i c ae tb i o p h y s i e aa e t a1 4 6 2 ( 1 9 9 9 ) i1 - 2 8 四删盍芏亟圭监塞 实验流程图 四删左堂亟监塞 第一部分 m s t 大肠杆菌原核表达 及体外细胞毒性测试 大肠杆菌表达体系是建立最早，也最为成熟的表达体系。这个系统 的优点之一是外源基因表达水平远高于其他表达系统，且与真核表达系 统相比，e c o l i 生长迅速，利于在短周期内完成纯化、分析和蛋白功能检 测；对许多蛋白质具有很强的耐受能力；遗传背景清楚、培养操作简单； 容易导入外源d n a ，需要d n a 量低；该表达系统还具有获得容易，整 体成本低廉等优点，因此e c o l i 表达系统目前在生物学研究中被广泛应 用。 本研究在可获得的基础上，首先选择了e c o l i 表达系统，进行m s t 蛋白的大肠杆菌原核表达。选用q i a g e n 公司p q e 系列表达载体p q e 3 0 和相应表达菌株m 1 5 ，进行分子构建，蛋白表达、分离纯化等操作，期 望获得可溶的活性蛋白。 1 r e s t 大肠杆菌原核表达质粒构建 1 1 材料 1 1 1 细菌和载体 大肠杆菌x l l 一b l u e 为本实验室保存菌种；大肠杆菌m 1 5 ( q i a g e n 公司) 。 抗c t l a - 4 单链抗体基因及其噬菌体载体p h e n l 由m a r i a p i a p i s t i l l o 教授惠赠；克隆载体p b l u e s e l e c tp h a g e m i dv e e t o r ( b b iu s a ) ；表达载体 1 4 p q e 3 0 ( q i a g e n 公司) 。 1 1 2 主要试剂 小量质粒抽提纯化试剂盒q i a p r e ps 1 hm i n i p r e p 础t 、胶回收试剂盒 q i a q u i c kg e le x t r a c t i o nk i t ( q i a g e n 公司) ；p l a t i m u m p f xd n a 聚合酶 ( i n v i t r o g e n ) ；p c r 引物( 上海i n v i t r o g e n 公司合成) ；限制性内切酶 ( t a k a r ab i o t e e h 大连宝生物工程公司) ；t 4d n a 连接酶( r o c h e ) ；琼 脂糖( b i o r a d ) ；g o l d v i e w 荧光染料( 北京赛百盛公司) 。 酵母提取物( o x i o d ) ；胰蛋白胨( o x i o dl t d ) ；i p t g ( 异丙基b d - 硫代半乳糖苷) ( p r o m e g a ，u s a ) ；t r i s ( b b i ) ；t r i t o nx1 0 0 ( b i n - r a d ) ； 尿素( b b i ) ；盐酸胍( b b i ) ；l 一精氨酸( l - a r g i n i n e ) ( a n 1 r e s c o ) ；谷胱 甘肽氧化型和谷胱甘肽还原型( a m r e s c o ) ；牛血清白蛋白( b i o - r a d ) ； d n a m a r k e rd l 2 0 0 0 、蛋白m a r k e r ( f e r m e n t , a s ) ； q i a g e n n i - n t as u p e r f l o w ( q i a g e n ) ；透析袋( 排阻分子量3 ，0 0 0 。 s n a k e s k i n ，p i e r c e ) ；超滤离心管( 排阻分子量3 ，0 0 0 ，c e n t i p l u s ，a m i c o n i n c ) ：蛋白质含量测定试剂盒( b i n r a dd ep r o t e i n a s s a yk i t ) ；p r o - m a t r i x p r o t e i n r e f o l d i n g k i t ( p i e r c e 公司) ；r g s h i s h r p c o n j u g a t e ( q i a e x p r e s s d e t e c t i o na n da s s a y ) ；e c l 。 1 1 3 主要仪器和设备 超纯水处理系统( m i l l i p o r e ) ；7 0 低温冰箱( s a n y 0 ) ；制冰机 ( s a n y o ) ；s a n y ol a b oa u t o c l a v em l s 3 0 2 0 自动高压蒸汽灭菌器； a i rt e c h 超净工作台( 苏净集团安泰公司) ；h z q f 1 6 0 全温振荡培养箱； h z q f 1 0 0 振荡培养箱( 哈尔冰东联电子技术开发有限公司) ；r t e 一1 1 1 恒温水浴( n e s l a bi n s t r t n n e n t s ，i n c 1 ；超声破碎仪( 宁波新芝，j y 9 2 i i d 随机8 0 m m 变幅杆) ；常温台式离心机( e p p e n d o r f ) ：低温冷冻台式离心 机( b e c k m a nc o u l t e r ，a l l e g r a2 5r ) ；低温冷冻落地离心机( b e c k m a n c o u l t e r ，a v a n t ij - 2 5c e n t r i f u g e ) 磁力搅拌器( 德国i k a ，r e t b a s i c c ) ； 高效液相色谱仪( a k l ap u r i f i e r 1 0 ，a m e r s h a mp h a r m a e i ab i o t e e h ) ；电 泳仪( b i o r a d ，p o w e r p a c2 0 0 ) ；核酸电泳槽( b i o r a dm i n i s u bc e l l g t ) ；蛋白质电泳槽( b i o - r a dm i i l ip r o t e a n3c e l l ) ；w e s t e r n 湿法转移模 块( m i n it r a n s b l o t e l e c 仃o p h o r c t i ct r a n s f e rc e l l ) ；核酸电泳凝胶成像系 统( b i o r a du n i v e r s a lh o o di i g e ld o c t me q ) ；蛋白质电泳凝胶成像系 统( b i o - r a d ，f l u o r - s t mm u l t i l m a g e r ) ；紫外、可见分光光度计( s h i m a d z u ， u v - 1 6 0 1 p c ) ；微量分光光度计( a m e r s h a m ) ；酶标仪( b i o p a d ) ；m e t t l e a n a l y t i c a l b a l a n c e s a e l 0 0 电子分析天平( m e t t l e r - t o l e d o 仪器上海有限公 司) ：电子分析天平( s 舢i u u s ，p 2 2 1 s ) ； 1 2 方法 1 2 1r e s t 原核表达基因的构建 m s t 蛋白原核表达的分子构建涉及到的实验技术是经典的分子克隆 操作，包括引物设计、p c r 反应、限制性酶切反应、d n a 片断的回收 连接、大肠杆菌感受态制备、转化、阳性克隆筛选鉴定、基因测序、质 粒提取、核酸琼脂糖电泳等，具体实验操作步骤见相应试剂盒说明书、分 子克隆实验指南【3 刀等。 技术路线流程图见图1 1 6 l p h a t - m s f f s a c z l t i k p n i l 球 l _ 一m s 一 tm y n jl 3 a m h i s ac i k p i l i p h a t - m s r ， u p q e 3 0 - m s t 图1p q e 3 0 - m s t 构建流程 1 ) 导向片段m s 基因的克隆 以本室前期构建的p q e 3 0 m s 为模板，根据m s 基因序列设计引物， 引入克隆所需的b a m h i 和s a c i 位点，并去掉c 端的终止子： p l 5 - g a c t g g a t c e g a c g t c a t g a t g a c a c a g t c t e c t t - 3 p 2 5 - g t c a g g t a c c g g c t g a g g a g a c g g t g a c c a - 3 用高保真的p l a t i m u mp f xd n a 聚合酶( i n v i t r o g e n ) 进行p c r 扩增， p c r 扩增条件如下：9 4 1 0 m i n 后，9 4 4 5 s e e ，5 0 l m i n ，6 8 2 m i n ， 共3 0 个循环。p c r 扩增将获得导向片段基因，并引入相应酶切位点。p c r 1 7 产物经小量胶回收试剂盒( q i a g e n ) 纯化后，以b a m h i s a c i 双酶切， 然后克隆到p h a t 载体( c l o n t e c h ) ，测序鉴定，命名为p h a t - m s f ( u s i o n ) 。 2 ) 杀伤片段基因的获得 t 基因为人工合成，合成时基因两端引入克隆所需s a e i 和k p n l 位点。 3 ) 重组免疫毒素m s t 大肠杆菌表达质粒的构建 合成的t 基因以s a c i k p n i 双酶切后，回收纯化t 基因片段，然后连 接到经同样酶切的p h a t - m s f 中，构建为p h a t - m s t 。再以b a m h i k p n i 双酶切p h a t - m s t ，回收m s t 基因片段，然后连接到经bm h i k p n i 双 酶切的p q e 3 0 载体( q i a g e n ) 中，测序正确后得大肠杆菌表达质粒 p q e - m s t 。 1 2 2r e s t 在大肠杆菌中的诱导表达 1 ) 表达质粒p q e 3 0 m s t 转化入表达菌株e c o l im 1 5 ，然后用含有 a m p ( 1 0 0 p g m 1 ) 和k a n0 0 j _ t # m 1 ) 的l b 平板进行筛选( 下文中出现的相应 p q e m s t 诱导培养基内抗生素浓度同此处) 2 ) 挑取单克隆接种3m ll b ( a m p ，g a n ) 液体培养基，3 7 ，2 8 0 r p m 振荡培养过夜； 3 ) 过夜菌按l ：1 0 0 接种于2 0 l i l l 新鲜l b ( a m p ，k a n ) 液体培养基， 3 7 振荡培养至o d 5 5 0 达1 0 ； 4 ) 加入1 p t g 至终浓度0 1m m ，3 7 ，振荡培养开始诱导，加入i p t g 前取样为诱导前样品； 5 ) 诱导5 小时后样品于4 ，8 0 0 0 9 离心1 0 m i n 收集菌体； 6 ) 菌体用5 0r a mt r i s - h c l ( p s8 0 ) 按1 0 m l g 重悬，然后加入蛋白酶 抑制剂苯甲基黄酰氟( p h e n y l m e t h y l - s u l f o n y lf l u o r i d e ，p m s f ) 至终浓度 为1 m m ；冰浴条件下超声破碎( 功率3 0 0 w ，工作2 s ，间隔8 s ) 3 0 m i n ； 7 ) 4 ，1 5 0 0 0g 离心1 5m i n 分别收集破菌上清和沉淀； 8 ) s d s p a g e 和w e s t e r nb l o t 分析蛋白表达情况。 1 2 3r e s t 诱导可溶蛋白的分离纯化： 1 ) 2 8 c ，2 0 0 r p m ，诱导1 0 h 后的的菌体超声破碎后，4 。c ，1 5 0 0 0 9 ， 离心2 0 m i n ，收集上清； 2 ) 上清于1 0 倍体积5 0r a mt r i s h c l ( p n8 o ) 中透析过夜； 3 ) 上清与n i - n t a 胶按v ：v = 3 0 ：1 混合，并加入n a c i 至终浓度为 0 5 m ，4 c 结合2 h ： 5 ) 将与蛋白结合后的n i - n t a 层析填料灌入层析柱，待蛋白样品流 尽后，加入5 - 1 0 倍柱体积w a s hb u f f e r ( 5 0m mt r i s - h c l ( p h8 o