（遗传学专业论文）糙皮侧耳的aflp分析及多态性片段的鉴定.pdf

糙皮侧耳的a f l p 分析及多态性片段的鉴定 专业遗传学 硕士生孟宇指导教师张义正教授 摘要 侧耳( p l e u r o t u s ) 属于白腐真菌类除了具有食用价值外冈其可以通过 分泌木质素降解酶、漆酶等从而有效地氧化木质素和芳香族污染物，最终将其 矿化为二氧化碳和水，因此在生物制浆，纸浆生物漂白，环境保护，节约能源 等方面有重要的研究意义和应用价值。糙皮侧耳( p l e u r o t u so s t r e a t u s ) 为侧耳属 的模式年4 ，代表着该属的主要形态特征。目前本实验室已经进行了有关于侧耳 菌产生木质素降解酶的活性及产量等的研究，并筛选出了相应的木质素降解酶 高产菌株。 本论文开展了以下几方面进行了研究并获得了相应结果：1 为了在较短 时间内获得大量菌丝体以提取总d n a ，对糙皮侧耳的不同培养条件进行了对 比。初步确定了该真菌的最佳液体培养条件为c m a 液体培养最适培养温度 为2 5 。2 对糙皮侧耳的a f l p 分析条件进行了筛选和优化，发现e 一3 m 3 引物组合扩增获得的片段数罱最多清晰度高，片段大小分布也较均匀其中 又以引物对e a g c m c a t 和e a g c m a c c 得到的扩增效果最好，是最适 合做糙皮侧耳a f l p 分析的引物组合。3 制作了糙皮侧耳的a f l p 指纹图谱， 对其中的多态性片段进行了统计和分析，发现菌株p 1 7 和杂3 相似性程度最 高，达到了8 1 ：菌株侧5 与其它糙皮侧耳菌株亲缘关系相对最远。4 回收 并克隆了部分菌株的多态性片段，完成了其中两条片段的序列测定和分析，两 条片段的大小分别为1 0 9 9 b p 和6 7 9 b p 。确定大小为1 0 9 9 b p 的片段上具有。一个 阅读框。将这两条片段用b l a s t 与本实验室已有的木质素降解模式菌一黄孢 原毛平革菌全基因组进行序列比对，未发现有同源性的片段：再输入g e n e v i b a n k ，用b l a s t 做序列比对，也未发现有与之同源性较高的其它物种的片段。 5 对a f l p 聚类分析所得到的相似性结果与常规从形态结构、生理特点等表 型性状分类的方法进行了印证。 关键词：糙皮侧耳 a f l pd n a 指纹图谱遗传多样性多态性片段 聚类分析 v i i a f l p f i n g e r p r i n t i n ga n a l y s i so f p l e u r o t u so s t r e a t u s a n d s e q u e n c e i d e n t i f i c a t i o no ft h e p o l y m o r p h i c a f l p f r a g m e n t s m a j o r ：g e n e t i c s m a s t e r ：m e n g y u s u p e r v i s o r s ：p r o fz h a n gy i z h e n g a b s t r a c t p l e u r o t u s b e l o n g st o w h i t e r o t f u n g i i na d d i t i o n t oi t sv a l u eo ne d i b l e ， p l e u r o t u sc a l ls e c r e t el i g n i n o l y t i ce n z y m e s 、l a c c a s e st o o x i d a t i v e l yc l e a v el i g n i n a n da r o m a t i c p o l l u t a n t s t h e s ee n z y m e s a r e g r e a t l yp o t e n t i a l i n b i o p u l p i n g ， b i o b l e a c h i n go fp u l pa n dt r e a t m e n to fe n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t s ，e t c p l e u r o t u s o s t r e a t u sw h i c hd e l e g a t et h em a i nc h a r a c t e r i s t i co f g e n u sy l e u r o t u si st h em o d e o ft h eg e n u s r e s e a r c hi no u rl a b o r a t o r yh a v es c r e e n e do u ts o m ep l e u r o t u ss t r a i n s w i t h h i g hy i e l d o fl i g n i n o l y t i c e n z y m e s ，a n a l y z e dt h ea c t i v i t y a n do u t p u to f l i g n i n o l y t i ce n z y m e s s t u d i e sw e r ec a r r i e do u ti nt h ef o l l o w i n g5a s p e c t sa n dc o r r e s p o n d i n gr e s u l t s w e r eo b t a i n e d f i r s t l y , t h eo p t i m a ls u b m e r g e dc u l t u r ea n dg r o w t hc o n d i t i o n sf o rp o s l r e a l u sw e r es c r e e n e d i tw a ss h o w nt h a tt h eb e s tm e d i u mf o rpo s t r e a l u si s c m ac u l t u r ea n dt h et e m p e r a t u r ei s 2 5 c s e c o n d l y , c o n d i t i o n so ft h e a f l p f i n g e r p r i n t i n ga n a l y s i s f o r 户o s t r e a t u sw e r et e s t e da n dt h e n1 4s t r a i n so fp o s l r e a l u sf r o md i f f e r e n ta r e a sw e r ea n a l y z e dw i t ha f l pm e t h o d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h e p r i m e rp a i r s e - 3 m 一3 e s p e c i a l l y e a g c m c a ta n d e a g c m a c cc o u l dg i v em o r ea m p l i f i e dd n a f r a g m e n t st h a no t h e r s t h i r d l y , f r o mt h e f i n g e r p r i n t i n gm a po ft h ep r i m e rp a i re - - a g c m c a t , 1 8 4c l e a ra n d s t a b l ed n ab a n d sw e r ed e m o n s t r a t e d ，i n c l u d i n g1 0 1p o l y m o r p h o u sb a n d st h a ta r e a c c o u n t e df o r5 4 8 9 f o u r t h l y , t h ef r a g m e n t so ft h es t r a i npo s l r e a l u s8101w i t h v 1 1 1 a f l pf i n g e r p r i n t i n ga n a l y s i sw e r es u c c e s s f u l l yp u r i f i e da n dc l o n e di np m d l 8 - t v e c t o r t h e n ，t w op u r i f i e df r a g m e n t sw e r es e q u e n c e d f i n a l l y , t h eg e n e t i cd i s t a n c e o f14s t r a i n sw a sc a l c u l a t e da n di t sd e n d r o g r a mw a sp e r f o r m e db a s e do na f i p d a t af r o m10e 一3 m - 3p r i m e r p a i r s k e y w o r d s ：p l e u r o t u so s l r e a l u s p o l y m o r p h i cf r a g m e n t d n a f i n g e r p r i n t i n gm a pg e n e t i cd i v e r s i t y a f i 。p p h e n r o g r a ma n a l y s i s i x 致谢 在即将完成我的学业之际，我谨向这三年来在学习、 研究及生活上给予我指点和帮助的每位老师、同学和 朋友们表示深深的感谢! 这篇论文是在导师张义正教授的悉心指导下完成的， 在此首先向张老师表示衷心的感谢。张老师对科学事业 执着追求的精神，对学习l h 币 b 研卜的严谨态度，使我在 学业上获益良多；张老师对我的严格要求和谆谆教诲， 也将是我今后人生道路上永远的财富。 在三年来的学习研究过程中，我得到了王海燕副教 授、程昌风副教授、刘德明副教授、赵云副教授、向永 录老师的多方指导和启迪，在此表示真挚的谢意。 此外，我要特别感谢冯宗云师兄的大力相助：感谢师 兄蒋昌顺、肖璐、孙迅、王刚、江鸣峰、董佳里、师弟 汪松虎、王小强以及分子生物学实验室其他成员的技术 支持和实验经验交流。 感谢廖问陶同学、王海力同学、胡国库同学、李昕同 学、余风燕同学、牛冬云同学、王丽焕同学、巫雪燕同 学、沈翼同学及其他同学给予我的各种关心、支持和爱 护，对你们的帮助我会点滴铭记于心，永远不会忘记。 最后。感谢一直无私关爱、理解并支持我的家人。谨 将此论文献给一直给予我巨大支持的父母和姐姐! 孟字 2 0 0 3 年5 月 第一章糙皮侧耳的生长速率比较和鉴定 摘要 本研究选取1 4 株不同产地、不同生长速度的糙皮侧耳菌株，经由p d a 固 体培养和c m a 液体培养对比以期获得能快速、大量产生糙皮侧耳菌丝体并 无培养基杂质的方法。此外，还对不同菌株的生长速度及影响糙皮侧耳生长的 因素进行了分析比较，初步鉴定了其中的快生型、慢生型菌株。经研究发现闽 3 l 生长速度最快；义平、a x 3 、农大1 1 等为生长较快的菌株；佛罗里达、p 1 7 生长速度最慢。为下一步a f l p 分析种间多态性提供了良好的供提取总d n a 用的模板，并预期为分子生物学比较不同菌株多态性的实验结果提供形态学、 生理学上的对照。 关键词：糙皮侧耳a f l p多态性分析 l 引言 侧耳( p l e u r o t u s ) 属于白腐真菌类；糙皮侧耳( p l e u r o t u so s t r e a t u s ) 为侧耳 属的模式种，代表着该属的主要形态特征口6 1 3 7 1 。其主要分布在温带到亚热带 地区，生长迅速，产量高，味道鲜美，营养丰富，食用价值很高，在世界各地 广为栽培2 ”。除食用价值外，本身还参与了自然界中木质素降解过程 4 1 。 木质素是植物木质纤维素的主要成分之一，它是植物细胞胞间层和初生壁 的主要填充物，其产量是仅次于纤维素的最为丰富的有机物，通常在木质细胞 中占1 5 3 0 。从化学结构来看，针叶树的木质素主要由松柏醇的脱氢聚合物 构成愈创木基木质素：阔时树的木质素由松柏醇和芥子醇的脱氢聚合物构成愈 创木基紫丁香基木质素；而草木植物则是由松柏醇、芥予醇和对香豆醇的 脱氢聚合物和对香豆酸组成【l0 】【2 扪，从而使木质素成为结构复杂、稳定、多样 的且难于被微生物降解的生物大分子物质。植物的生物质，主要由木质素、纤 维素和半纤维素互相嵌和而成。木质素以衬质包裹着纤维素和半纤维素，且木 质素沉积或填充于纤维素构成的微晶纤维中，这些都阻碍了纤维素的生物降解 和利用。因此，木质素难于进行生物降解已经成为有效转化地球上最大可再生 碳源即纤维素和半纤维素的最大障碍，进而成为地球牛物圈中碳素循环的障碍 1 2 4 】。农作物秸秆凶其含有大量的纤维索和半纤维素，产量丰寓，现难在成为 继木材之后的又一大造纸原料，同时还可以作为轻化工和清洁能源的原料。高 温高压强碱法去除木质素是目前工业制备纤维素材料的主要手段，也是制浆造 纸工业污染的主要来源和高能耗的关键，特别是以植物秸秆为原料的化学制浆 工业所排出的黑液对环境危害尤大。通过酶法降解木质素的生物制浆工艺，有 助于这一难题的解决【4 儿5 。，对改善生态环境，保护森林也同样具有重要作用。 现已知自然界参与木质素降解的微生物种类有真菌、放线菌和细菌，而真 菌是最重要的一类。目前已发现的可降解木质紊的真菌有苍烟管菌 ( b e r k a n d e r a ) 【9 d 3 2 t 】、香菇( l e n t i n u l a ) 1 6 、射脉菌( p k 6 f a ) g l 1 15 1 、平 革菌( p h 盯e 加c h a e t e ) 3 1 7 1 u s l l l 9 1 2 3 1 、灵芝菌( g a n o d e r m a ) 1 16 1 、侧耳菌( p l e u r o t u s ) f 4 】【l6 1 t 7 11 2 1 1 、多孔菌( p d 咖d ，螂) 【1 6 1 【1 7 1 、密孔菌( 毋c 珂印。r “s ) 【1 4 1 、栓菌( t r a m e t e s ) 2 i t l 1u 2 等。根据真菌降解术质素时木材的变化，将其分为白腐真菌( w h i t e ，r o t f u n g i ) 、褐腐真菌( b r o w n r o tf u n g i ) 和软腐真菌( s o f l r o tf u n g i ) ，其中大型担 子真菌一一白腐菌是目前已知的自然界中对木质素具有最强降解能力的一类 真菌，它们也是已知唯一的在纯培养条件下能够将木质素最终矿化的微生物， 它们还具有降解环境污染物的能力。虽然褐腐菌、软腐菌、放线菌和细菌也能 在木质素降解过程中发挥一定的作用，但一般认为它们仅起二次陛作用【2 5 1 ， 因此白腐菌已成为研究木质素降解的首选微生物。它们可以通过分泌木质索过 氧化物酶( l i g n i np e r o x i d a s e s ，l i p s ) 、漆酶( l a c c a s e s ，l a c s ) 、锰过氧化物酶 ( m a n g a n e s e d e p e n d e n tp e r o x i d a s e s ，m n p s ) 等从而有效地氧化木质素和芳香 族污染物【1 0 】，最终将其矿化为二氧化碳和水，因此在生物制浆纸浆生物漂 白，环境保护，节约能源等方面有重要的研究意义和应用价值p ”。 目前已有关于侧耳菌产生木质素降解酶的活性及产量等研究报道，并筛 选出了相应的木质素降解酶高产菌株。本研究在此基础上选取1 4 株糙皮侧耳， 通过对其在固体和液体培养基上的不同条件下生长速率进行了对比，以在最短 时间内获得最多的培养产物，为进一步的研究掇供大量的d n a 样品。 2 材料与方法 2 1 菌株 实验蓊株为1 4 个未避行过凛妻| 三质体融合的糙皮侧耳菌株：农夫t 1 ( po , ，t r e a t u $ n 。n g d a li ) 、 义平( 只o s t r e a t u sy i p i n g ) 、佛罗里达( po s l r e a l u sf l o r i d a ) 、a x 3 ( 尸o m r e a l u s a x 3 ) 、c c e f 8 9 ( p 。o s t r e a t u s c c e f 8 9 ) 、8 1 0 1 ( 只o s t r e a t u s8 1 0 1 ) 、阚3 1 ( 尹o s l r e a l u s m i n 3 1 ) 、 女 c 一号( po s o e a l u s z a y o u n o 1 ) 、p 1 7 ( po s t r e a l u sp 1 7 ) 、侧5 ( po m r e a t u s c e 5 ) 、矮 抗5 5 8 ( po s l r e a l u s a i k a n 9 5 5 8 ) 、中蔬 o 号( po m r g a l n s z h o n g s h u n o 1 0 ) 、p 4 6 ( 户o s l w a t u s p 4 6 ) 、杂3 ( po m r e a l z t s z a 3 ) 。所钉实验酾株均购“四川省农科院凶籼室。剥j 姒川黄 孢覆毛乎鼙莹1 7 6 7 ( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mb k m f 1 7 6 7 ) ，由本实验室 保存。 2 2 主要仪器 h p s 1 6 0 二崖摇霖，l r h - 2 5 0 a 生纯培养铤。 2 。3 培养基 p d a 培养基2 7 】( 1 l ) ： 去蔽骂铃薯 2 0 0 9 蔗糖2 0 9 臻黧 l 5 - 2 0 9 水加至1 0 0 0 m l p h 妻然 马铃薯去皮，切成块煮沸3 0 m i n ，然后用纱布过滤，再加蔗糖和琼脂，加 窳至1 0 0 0m l ，1 2 1 灭蘩2 0 m i n 。 c m a 壤葵蒺f 3 2 1 ( i l ) m g s 0 4 7 h 2 0 k 王2 p 0 4 o 5 9 0 4 6 9 3 k 2 h p 0 4 磷l 二i 腺 酵母膏 葡萄糖 琼脂 浓h c i 加水至 1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 1 0 9 2 垤 2 0 9 2 0 o g 2 0 o g 0 0 5 m l 2 4 菌株的培养 菌种的培养和保存，将菌种接种于p d a 斜面上，2 5 * ( 2 培养，4 c 冰箱保存 6 个月转管一次。 2 4 1 固体培养基上生长速率对比实验 将待试茼分别接种rp d aj _ 7 ；f 养基斜丽 化再将活化历的蔺株接利j ：铀 玻璃纸的p d a 培养基平板上，2 so c 力n 光照静置培养，2 4 h 后开始每隔l d 记录 其生长速度。 2 4 2 液体培养基上生长速度对比实验0 3 3 1 在无菌条件下以大号打孔器在p d a 培养基平板上取i o c m 2 菌丝体接种 于1 0 0 m lc m a 液体培养基中；2 5 。c 2 6 c ，2 0 0 r m p 加光照摇瓶培养1 2 0 h 。称 取菌体重量。 2 4 3 不同温度对糙皮侧耳的生长速度影响3 3 l 选取闽3 l 、义平、8 1 0 1 、矮抗5 5 8 、p 1 7 、佛罗里达共6 株糙皮侧耳，接 种于l o o m lc m a 液体培养綦，分别于2 0 c 、2 5 c 、3 0 cf2 0 0 r m p 摇瓶培养 1 2 0 h ，称取菌体重量。 3 结果 4 3 1 不同菌株在固体培养基上生长速率对比 根据不同菌株生长速度问有明显差异，记录其在平板上出现菌丝体的时间 和菌丝体铺满平板时间，初步鉴定快生和慢生型菌株。实验结果见表t 1 。 表1 i不同菌株在固体培养基上生长速度比较 菌株 1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d 农大1 1 + + + + + + + + + + + 义平 - 4 -+ + + + + + + + + + 佛罗里达 4- i -十+ + + + + + a x 3 + + + + + + + + + c c e f 8 9 + + + + + + + + + 8 1 0 l + + 4 -+十+ + + + + + + 闽3 1 + + + + 十+ + + + + + + + + + 杂优1q + +斗_ i + 一+4 + + p 1 7 + + +h+ + 侧5 +十十+ + + + + + + + + 矮抗5 5 8 4-+ + 十+ + + 中蔬1 0 号 + + + 4 - + 4 -+ + + + 十+ + p 4 6 + + + + + + + + + + + 杂3 4-h+ + + + + + + + + + 1 7 6 7 ( 对 + + + + + + + + + + +十+ + + + + + l 础、 来j 1 1 现菌丝体；+ 出现菌丝体t + + 菌丝体覆盖一半平板：+ + + 蔺丝体基本覆盖甲板 + + + + 菌丝体完全覆盖平板 平板覆盖实验结果显示：闽3 1 生长速度最快，农大1 1 、a x 3 、侧5 也是 生k 较快的菌株。相反，p 4 6 、p 1 7 、佛罗犀达生长速度较慢。对照菌黄 孢原毛平革菌1 7 6 7 生长速度较糙皮侧耳整体速度更快一些。 3 2 不同菌株在液体培养基上生长速度对比 各菌栋在0 - 4 8 h 为其适应期，接种菌丝体摇瓶籍呈球狄；4 8 h 一9 6 h 为增殖 生长期，菌丝体生长数量显著增加，体现为球状菌丝体个数大大增加；9 6 h 一1 2 0 b 为稳定生长期，球校菌丝体明显增大。实验缩果见表1 2 。 裘l 。2 誉辩蓠糠雀液体培弊基上培葬1 2 0 h 詹蕾体黧麓 菌农义佛ac c8 1阅杂p l 侧矮中 p 4 杂 大平罗xe f0 13 伉75抗蔬63 株1 1里38 9 l 5 5 81 0 迭母号 重量 1 4 l1 8 90 4 41 8 20 舵1 4 52 1 31 + 0 70 2 9l 舶1 0 1n 8 80 7 30 8 5 电) 液体培养实验结梁迸一步证实：闽3 i 、a x 3 、义平为生长较茯的品种， p 1 7 、佛罗里达生长较慢。在后期进一步的实验中要达到同样的菌体重量( 以 2 0 9 为标准) ，生长较俊麓株只需要1 2 0 1 6 8 h ，雨生长较懂蘸株对需要 1 9 2 2 4 0 h ，靛异较为明显。 3 3 不同温度对糙皮侧耳的生长速度影响 以2 0 。c 、2 5 。c 、3 0 c - - 缀温度培养1 2 0 h ，或察不同菠栋在液体培养中的 生长速度，较得的生物量见袭1 3 。 表1 3不同温度下糙皮调耳的生长羹对比 菌株闺3 l义平8 1 0 l矮抗5 5 8诺罗量透p 1 7 2 0 1 8 2 91 6 5 91 3 1 91 1 1 90 2 9 9o 1 5 9 2 5 2 t 3 91 8 9 91 4 5 91 2 1 9o 4 4 9o 2 9 9 3 0 1 9 9 91 7 7 91 2 9 91 0 4 90 3 1 9o 1 9 9 由噩莨可稚，糙皮侧珲豹最适生长溢瘦仍然帮大多数囊萤一样为2 5 5 c 。 6 4 讨论 4 1 不同培养基获得产物效率比较 本实验为在较短时间内获得大量的糙皮侧耳菌丝体，先后采用了p d a 铺 玻璃纸固体平板培养及c m a 液体培养两种方法。两者相较而言，后一种方法 获得糙皮侧耳产物的速度快，产量大，为下一步提取糙皮侧耳总d n a 打f 了 良好基础。前一种方法为以往文献报道的常用方法，其优点是真菌菌丝体可以 生长在玻璃纸上，获取产物时直接从玻璃纸上分离即可。这样非常方便且不会 搀杂培养基。但是该方法菌株生长较缓慢，产量很低；通常一个平板需培养 8 d 左右才能获得0 0 5 9 - 0 1 9 菌丝体，不能满足本实验提取总d n a 的产物要求。 所以，本实验最终采用了c m a 液体培养方法获得待测菌株产物。 4 2 其他条件对糙皮侧耳培养的影响 本实验对其他培养条件进行了比较：( 1 ) c m a 液体培养基中添加少量玻 璃珠进行摇瓶培养，可以明显加快菌株的增殖速度。这是利用玻璃珠在摇瓶时 可以适当增加菌丝体与之的碰撞机会，加快菌丝体的分裂增殖，并为菌丝体最 初的生长提供依附点。( 2 ) 糙皮侧耳的液体培养，通氧量也是比较重要的影响 因素之一，摇瓶速度和装液量都不同程度对液体培养糙皮侧耳的产量有影响。 经对菌株摇瓶实验对比，采用2 5 0 m l 三角瓶装培养液1 0 0 m l ；前4 8 h 摇瓶速 度18 0 r m p ，后7 2 h 1 2 0h 摇瓶速度2 2 0 r m p ，生长效果最佳。 小结 1 采用p d a 和c m a 培养基，对1 4 个不同产地的糙皮侧耳菌株生长速度进 行了初步比较。经鉴定可知，闽3 1 、义平、a x 3 为快生型的品种：8 1 0 1 、矮 抗5 5 8 、杂优l 号、侧5 、中蔬1 0 号、c c e f 8 9 等次之：佛罗里达、p 1 7 为慢 生型品种。 2 通过不同培养基、培养温度、通氧量等对比实验，确定了本实验糙皮侧耳 向最适培养方式为液体培养，糙皮侧耳的最适液体培养条件为：2 5 下，2 5 0 m l 三角瓶装c m a 液体培养基1 0 0 m l ，前4 8 h 摇瓶速度1 8 0 r m p ，后7 2 h 1 2 0h 摇 瓶速度2 2 0 r m p ，光照培养。 第二章糙皮侧耳的a f l p 指纹分析及分析条件的优化 摘要 首先对糙皮侧耳的a f l p 分析条件进行了优化，然后利用优化条件对1 4 个来自我国不同地区的糙皮侧耳( p l e u r o t u so s t r e a t u s ) 菌株进行了d n a 指纹图 谱分析。结果表明，在合成的1 4 条引物的不同组合中，引物对e 一3 m 3 可以 产生较多n qd n a 多态片段，特别是e a g c m c a t 效果最好，利用此对引物 共获得18 4 条d n a 扩增带，多态性条带1 0 1 条，占5 4 8 9 。在此基础上， 用u p g m a 方法对所获数据进行聚类分析，计算得出不同菌株之间的遗传距 离，绘制了指纹分析树状图。 关键词：糙皮侧耳a f l p 分析d n a 指纹图谱聚类分析 1 引言 a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 是1 9 9 2 年由荷兰科学家 z a b e a u 和v o s 发展起来的一种检测d n a 多态性的新方法【2 2 】。它是在r f l p 和 r a p d 的基础上发展起来的，是r f l p 和r a p d 的结合，它克服了二者各自的 缺点，而集中了二者的长处。它既有r f l p 的可靠性，也具有r a p d 的方便 性20 1 。由于它具有重要的实用价值，一出现就被k e y g e n e 公司以专利形式买 下。| = h 于a f l p 较其它分子标记有着明显的优越性因此迅速传播开来，尽管 它已受到了专利保护，但世界上很多实验室都在努力探索在自己的研究中应用 a f l p 技术。因此z a b e a u 和v o s 不得不将其专利解密，并以论文形式正式发表 出来【2 2 1 。a f l p 被认为是迄今为止最有效的分子标记之一，不管所研究的基因 组d n a 有多么复杂，从理论上讲，用a f l p 方法都可以检测出任何d n a 之 间的多态性唧1 。 a f l p 反应程序主要包括模板d n a 制各，酶切片段扩增、凝胶电泳和聚类 分析3 个步骤： 9 1 模板d n a 制备。在进行a f l p 分析f l ；】，首先要制备高分子量( h m w l 基因组d n a 。然后用两种限制性内切酶酶切，通常一种酶的识别位点是6 个 碱基，另一种是4 个碱基，如e c o r l 雨im s e l 。选择这样两种酶共同酶切可 以产生比较小的酶切片段，经过p c r 反应扩增出的d n a 片段长1 0 0 1 5 0 0 b p 。 h m w 綦因组d n a 的成功制备和避免部分降解是a f t 。p 成功的关键，在制备 过程中要特别注意避免核酸酶及各种失活物质的污染。 d n a 酶切完成厉，经加热使限制。队内切酶失活，而把酶切片段连结到特 定的接头( a d a p t e r ) 上，形成扩增反应的模板。经过连接反应，接头和基因组 d n a 酶切片段的粘性末端之间进行碱基配对并接连在一起，该接头及其毗邻 的酶切位点这段共同顺序就存在于所有限制性酶切片段的两端，成为以后进行 p c r 扩增时引物的结台位点。a f l p 接头是一种人工合成的双链d n a ，一般 长度是1 4 1 8 个核苷酸。已有报道使用过的6 碱基内切酶接头，除e c o r t 外， 还有p s t i 接头和s a d 接头；4 碱基内切酶接头除m s e i 外，还有t a qi 接头和 s s e l 接头。 2 酶切片段的扩增。在酶切片段中接上去的接头及其毗邻的酶切位点序 列就成为以后p c r 扩增时引物结合的位点。在a f l p 反应中，引物的3 末 端有1 3 个选择性核苷酸序列。酶切片段结合位点中能够与引物上的选择性 核苷酸适当配对，被识别后用作模板而选择性地扩增出来。a f l p 引物是一种 人工合成的单链寡核苷酸，一般长度为1 8 2 0 个核苷酸。由核心序列( c o r e ) 、 内切酶位点特异序列( e n z ) 和选择性核苷酸序列( e x t ) 三部分组成。在a f l p 引物中，3 末端上选择性核苷酸数目的多少决定了a f l p 扩增产物的多少。 实验中可根据基因组d n a 的大小确定引物末端所需的选择性核苷酸数目。 般大于1 0 8 b p 的基因组d n a 可以用3 个选择性核苷酸；1 0 5 1 0 8 b p 的基因组 d n a 可以用2 个选择性核苷酸。其它6 碱基内切酶引物与e c o r i 引物类似， 4 碱基内切酶引物与m s ei 引物类似，只是各自的内切酶位点特异序列彼此不 同。 3 扩增反应的条件。胁切片段婴经过连续2 次i c r = | ：i 增，通过这样l ；l i i 步扩 增反应使产生的扩增结果更清楚、重复性更好。第1 次p c r 扩增被称为预扩 增反应( p r e a n a p l i f i c a t i o n ) ，所用的a f l p 引物只含有1 个选择性核苷酸，选 1 0 择扩静肚能较差，因此大景的扩增产物在凝胶巾往往形成连续的片。预扩增 爱馥祭 二与常规p c r 反应条件大致鞠丽。颈扩增反敷秘产物经过大量臻释箍 用作篇2 次扩增反应( 即选择性扩增反应，s e l e c t i v ea m p l i f i c a t i o n ) 的模板。选 择霞扩蹭反应掰耀静号 粝中选耩径核萤酸数羁l ! 毒多少是决定扩臻产物多多的 主要闲予。另外，引物中用作选择性核营酸的g 和c 含量也对扩增出的产物 数嚣鸯较大彩鞠。一般露言，g 和c 含量越高，扩瀣窭静产物数目筵少。逸 择性扩增构反应条件与普通p c r 有所不同，主要不同之处是复性温度，它是 采翊激发梯度p c r ，其p c r ，f ：戆l ：麓瀣复蕊( 艘慕阁6 5 ，比常筑p c r 爱 应的复性温度高1 0 ) 以期获得最佳选择性。以后复性潺度逐步降低，一直降 妥羹链效粟毁婷豹瀑凌( 一簸是5 6 。c ) ，然磊强持在遮嚷瀑瘦f 复性+ 完成其众 的p c r 循环周期。 扩增产物的凝蔽邀泳分析。选择瞧扩增产物艘在5 6 的变性聚裹臻 酰胺凝胶 p a g e 序列分析胶) 或2 琼脂糖凝胶上经过电泳分离，形成d n a 指 纹，凝胶再缀过聚类分援软嚣送毒亍续聚分援。 侧耳( p l e u r o t u s ) 属于白腐真菌类，除了具有食用价值外，因其可以通过 分泌木质素降解酶、滚酶等从而有效她氧化本质索和芳香羧污染物，最终穆箕 矿化为二氧化碳和水，因此在生物制浆，纸浆生物漂白，环境保护节约能源 等方露霾骞重要豹研究意义帮成用捡袋1 3 ”。毯皮侧骂 p t e u r o t u so s t r e a t u s ) 为铡翳 属的模式种，代表糟该属的主要形态特征 3 7 1 。目前已有荧于侧耳菌产生木 矮素终解酶的活牲及产量等研究擐遂珏9 1 3 5 i ，并筛选爨了甥嶷豹木屡素降鼹酶 赢产菌株 1 6 t 。目前夜关侧耳的a f l p 分柝寒见报道。本研究意在戢作糙皮能 耳的搬纹图谱，剩用其遗传多样性戈避一步研究已选黉出熬赢产木质素降鳃瓣 菌株克隆商效表达的木质索降解酶基因提供分子标记。 2 材料和方法 2 。l 实验材料 实验菌株为1 4 个未进行过原生质体融合的糙皮侧耳菌株，详见第一章。 蜜验幢弼熬磊& l 、e c o rl 籍鑫上海叟工( s a n g o n ) 公蠲，d n 辨、t 4d n a 连接黼，t a qd n a 聚合酶购自大连宝t l 物工程公司。所使用弓l 物由北京赛百脯 公司合成。 2 2 主要实验仪器 u v 一2 6 5 可见紫外分光光度计( 日本s h i m a d z ui n c ) ：p t c 。1 0 0 t m p c r 扩增 仪( 1 r o g r a m m a b l e t h e r m a lc o n t r o l l e r , 美国mj r e s e a r c h 1 n c ) ：u v p s g d s 8 0 0 0 型凝胶分析系统( g e ld o c u m e n t a t i o na n da n a l y s i ss y s t e m ) 2 3 实验方法 2 3 1 模板d n a 的提取 模板d n a 的制各按已述方法川进行。获得模扳d n a 后，经紫外分光光 度计、琼脂糖凝胶电泳检测合格后，调整浓度为3 0 0 n g 1 c 。1 备用。 2 3 2 模板d n a 的酶切 每个d n a 样品酶切混合液总体积为2 0ul ，包括：模板d n a5 0 0n g ，1 0 b u f f e r2 01 , 1l ，e c o ri2 0 u ，3 7 ( 2 保温酶切3 h ，7 0 保温1 5 m i n 终止反应。 d n a 片段纯化后再加入m s ei2 0 u ，1 0 x b u f f e r2 0l al ，6 5 保温酶切3 h ，8 0 保温2 0 m i n 终止反应，一2 0 c 保存。 2 3 3d n a 片段和接头的连接 每个样品反应体积为5 0ul ，包括：双酶切模板d n a5 0 0 n g ，1 0 1 1t 0 0 1 1 j 1 m s ei 接头2 0ul ，1 0um 0 1 l e c o ri 接头2 0 ul t 4d n a 连接酶2 0 u ，1 0 b u f f e r5ul ，18 连接2 h 。取连接产物1 0ul ，按1 ：1 0 比例用t e b u f f e r 稀 释后用于预扩增反应。其余的一2 0 c 保存。 2 3 4a f l p 预扩增反应 参考g i b c o b r l 公司的真菌a f l p 试剂盒说明，采用不含选择性碱基 ( + o ) 的预扩增引物每个样品反应体积为5 lpl ，包括：模板d n a5 0 ul ， 1 0 0n g ul p r i m e r e 一01 0 pl ，1 0 0n g ul p r i m e rm 一01 0 ul ，t a qd n a 聚 合酶2 0 u 1 0 m m 0 1 l - id n t p1 0 ul ，1 0 x p c r b u f f e r5 0 1 1 l ，2 5 0 m m 0 1 l m g c l 2 5 0ul ，d d h 2 03 2 ul 。 1 2 反应条件： 9 4 6 c 变性3 0 s 5 6 退火3 0 s ，7 2 延伸6 0 s ，共2 0 个循环。 预扩增反应后，取3ul 反应产物按1 ：5 0 用t e b u f f e r 稀释作为选择性扩增反 应模板。其余的一2 0 。c 保存。 2 3 5 a f l p 选择性扩增反应 经反复对比验证，本研究采用3 + 3 引物组合，即e c o ri 和m s ei 选择性 扩增引物均含3 个选择性碱基。每个样品反应体积为2 0hl ，包括：模板d n a 5 0 “l - 1 0 0 n g ul p r i m e r - e0 4ul ，1 0 0 n g l p r i m e r m0 4 l jl ，t a qd n a 聚合酶1 0 u ，1 0 m r n 0 1 u d n t p0 4ul ，1 0 p c rb u f f e r2 0ul ，2 5 0 m m 0 1 t ，一m g c l 22 0ul 。 采用梯度p c r 方法，其反应条件为：起始反应温度9 4 c 变性3 0 s ，6 8 。c 退火3 0 s ，7 2 6 c 延伸6 0 s ；以后每个循环中的退火温度逐次降低l ，经l3 个循环后降至5 6 。c ，其余条件不变，再进行2 3 个循环。 2 3 6 扩增产物的凝胶分析 扩增d n a 用2 琼脂糖凝胶电泳，o 5 溴乙锭溶液染色，g d s 照相。 3 结果 3 1 模板d n a 制各及酶切 模板d n a 参照文献【1 1 的方法制备。与其他已见报道的真菌基因组d n a 制备方法相比按该方法提取的基因组d n a 速度较快，带清晰，无降解，无 r n a 污染；说明这种方法更适合于糙皮侧耳基因组。经紫外分光光度计测定 结果o d 2 6 0 o d ：, 8 0 比值在1 8 左右d n a 纯度较高完全能满足a f l p 分析的 要求。 按a f l p 分析要求采用了常见酶切位点酶( e c o ri ) 和稀有酶切位点酶 ( m s ei ) 双酶切。e c o r i 的最佳酶切温度为3 7 c ，但m s ei 的最佳酶切温 度为6 5 。c ，在3 7 c 时仅有1 0 的酶活。所以本实验对同时双酶切和单酶切一沉 淀一单酶切方式进行了对比，从电泳结果来看后者酶切更为彻底。酶切产物片 段大小分布在5 0 1 6 0 0 b p 之间。符合a f i ，p 分析对酶切片段大小的要求。 3 2 模板d n a 片段与接头的连接 模板d n a 片段e c o ri 、m s ei 接头混合，1 6 。c 连接过夜。连接效率怕高 低主要取决于t 4d n a 连接酶的活性。用2 u 比用l ut 4d n a 连接酶的连接 效果好，主要体现在连接物预扩增效果较好。e c o ri 、m s ei 接头序列如下【3 4 1 ： e c o ri 接头：5 ，c t c g t a g a c f g c g t a c c 一3 3 c p 汀c t g a c g c a r g g t f a a 5 m s el 接头：5 g a c g a t g a g f c c l l g a g - 3 3 一t a c t c a g g a c t c a t 一5 3 3 糙皮侧耳a f l p 反应条件的优化 本实验的预扩增反应采用不带选择性碱基的e 0 和m - 0 为引物。其序列 如下： e 0 的碱基序列为5 g a c t g c g t a c c a a t t c 3 m 0 的碱基序列为5 g a t g a g t c c t g a g t a a 3 凝胶电泳结果显示，预扩增片段呈弥散型，分布范围在1 0 0 1 5 0 0 b p 之问， 扩增信号强，各样品间一致性较好，实验结果见图2 1 。为选择性扩增提供了 理想的模板，同时也说明前述的基因组d n a 的提取、酶切、连接是符合实验 要求的。 在选择性扩增反应中，一般认为e c o ri m s ei 组合适用于较小的基因 组，通常较好的真菌的引物组合为e 2 m 1 的组合形式。所使用的选择性扩增 引物是在预扩增反应使用引物的3 端再增加1 - 3 个选择性碱基，即： e c o ri 引物5 g a c t g c g t a c c a a t t cn n n - 3 7 m s ei 引物5 g a t g a g t c c t g a g t a a n n n 一3 ( 其中n 表示任何碱基，数量为1 3 个) 在术实验巾，对多种引物组合的扩增效率进行了比较，以获得糙皮侧耳 a f l