（遗传学专业论文）eb病毒转化的b淋巴细胞永生细胞株长期传代后的遗传稳定性.pdf

论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果论文中除了特别加以标注和致谢的地方外， 不包含其他人或其它结构已经发表或撰写过的研究成 果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文 中作了明确的声明并表示了谢意。 作者签名： 日期： 论文使用授权声明 本人完全了解中国协和医科大学有关保留、使用学位 论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论 文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内容， 可以采用影印，缩印或其它复制手段保存论文，保密的论 文在解密后遵守此规定。 作者签名：导师：日期： 中困医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 颂j ：研究生学位论文 中文摘要 用e b 病毒转化外周血b 淋巴细胞建立的永生细胞株，因其可以在传代培 养的条件下，源源不断地为各种遗传性疾病、免疫学、细胞生物学研究提供d n a 和细胞而在基础生命科学研究中受到重视本实验的目的是检测传代培养的永生 细胞株在长期传代的过程中细胞和分子遗传学方面能否保持稳定，这关系到评价 永生细胞株提供d n a 的科学研究实验结果准确性的重要问题。 本实验从染色体、高突变微卫星位点及端粒酶活性三方面选取1 0 株永生细 胞株对永生细胞株的细胞和分子遗传学特征进行检测。在染色体方面，细胞株每 隔1 0 代，即1 0 代、2 0 代时，取出进行染色体标本的制备，统计细胞株分 裂相及亚二倍体、超二倍体和多倍体的发生率。在微卫星位点检测方面，从核基 因组和线粒体基因组上分别选取突变率 0 0 9 的1 3 个位点及d 1 0 0 p 区高突变 的2 个位点，对细胞株的血样及每隔l o 代取出的细胞抽提的d n a 用p c r 扩增 进行变性后，以聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纵向比较，检测在这些高突变的位点区 域是否有突变的发生。在细胞株端粒酶活性检测方面，将1 0 株细胞株在培养过 程中的不同代次取出，以h e l a 细胞株的细胞提取液作为端粒酶实验的阳性对照， 进行端粒酶活性检测。 检测结果表明，本研究室采用e b v 转化b 淋巴细胞建立的永生细胞株在传 代培养的3 0 代之内遗传特征是稳定的。继续传代培养后，细胞株的生长速度减慢， 细胞分裂相减少，其中细胞株y a 0 5 6 和y a 0 4 3 分别在3 0 代和6 0 代后分裂相出现多 倍体，而y a 0 2 2 5 和y a 0 2 3 0 在5 0 代后死亡。1 0 株细胞株中，y a 0 2 6 2 传至6 0 代时在 位点d 1 3 s 3 1 7 检测出突变，其余细胞株8 0 代以前1 5 个高突变s t r 位点未检测出 有突变的发生。所有细胞株在8 0 代前( 包括8 0 代) 未检测出端粒酶活性。 4 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 硕士研究生学位论文 a b s l 。r a c 。l 。 b l y m p h o i dc e l l sf r o mh u m a np e r i p h e r a lb l o o dc a n b et r a n s f o r m e di n t oa c t i v e l y p r o l i f e r a t i n gi m m o r t a l i z e dc e l ll i n eb ye p s t e i n b a r rv i r u s ( e b v ) t h ei m m o r t a l i z e d c e l ll i n e ，够s o u r c e so fd n aa n dc e l l s , a 糙u s e dw i d e l yi nr e s e a r c h e si ne t i o l o g y ， i m m u n o l o g ya n dc e l l u l a rb i o l o g y t h e r e f o r e ，i no r d e rt oe n s u r er e p r o d u c i b l er e s u l t s a n dc o n t i n u i t yi nr e s e a r c ho fl i f es c i e n c e ：i ti si m p o r t a n tf o ri m m o r t a l i z e dc e l ll i n et o r e m a i ni t sg e n e t i cs t a b i l i t y , e v e na f t e ral o n gs u b c u l t u r ep r o c e s s i nt h ep r e s e n ts t u d y ，t h eg e n e t i cs t a b i l i t yi n c l u d i n gc h r o m o s o m ed i p l o i d y ， m i c r o s a t e l l i t ed n aa n dt e l o m e r a s ea c t i v i t yw e r ee v a l u a t e d w ec a l c u l a t et h e f r e q u e n c i e so fh y p e r d i p l o i d , h y p o d i p l o i da n dp o l y p l o i d yo fi m m o r t a l i z e dc e l l l i n e w i t ht h ec h r o m o s o m eb a n d i n gt e c h n i q u e se v e r y10p a s s a g e s f o r13s t rl o c iw i ma m u t a t i o nr a t e o 0 9 i nn u c l e a rg e n o m ea n d2s t rl o c i 、v i n lah i g h - f r e q u e n c y m u t a t i o ni nd l o o po fm i t o c h o n d r i a lg e n o m e ，t h ea m p l i c a t i o np r o d u c t so fd n a e x t r a c t e df r o mt h eb l o o da n dt h ec e l l l i n ee v e r y10p a s s a g e sw e r ed e t e c t e db y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( p a g e ) d u r i n gt h es u b c u l t u r e i n gp r o c e s s ，t h e t e l o m e r a s ea c t i v i t yi nt h ec e l ll i n e sw e r ed e t e c t e db yt e l o m e r a s ea s s a yk i t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei m m o r t a l i z e dc e l ll i n er e m a i n e dg e n e t i c a l l ys t a b l e w i t h i n3 0p a s s a g e s a f t e rt h e3 0p a s s a g e s ，t h eg r o w t hr a t e so fc e l ll i n e ss l o w e dd o w n , t h en u m b e ro fc e l lc y c l ep h a s e sd e c r e a s e d t h ec e l ll i n e sy a 0 5 6a n d4 3c h a n g e di n t o p o l y p l o i d ya f t e r3 0a n d6 0p a s s a g e s ，a n dt h ec e l ll i n e sy a o2 2 5a n d2 3 0d i e da f t e rt h e 5 0p a s s a g e s n om u t a t i o nw a si d e n t i f i e di n15h i g h f r e q u e n c ym u t a t i o ns t rl o c i b e f o r e8 0p a s s a g e s ，e x c e p tc e l ll i n ey a 0 2 6 2 o n em u t a t i o nw a sd e t e c t e di nt h es t r l o c u sd 13 s 317o ft h ec e l ll i n ey a 0 2 6 2a tt h ep a s s a g e6 0 t h et e l o m e r a s ea c t i v i t yw a s n e g a t i v eb e f o r e8 0p a s s a g e s 5 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 硕一 ：研究生学位论文 前言 从1 9 9 3 年至今，以中国医学科学院医学生物学研究所为课题负责单位，与 国内多个科研机构合作，已建立了中国4 2 个民族( 含5 8 个群体) 的永生细胞库， 共计3 1 1 9 株永生细胞。这是我国唯一的、目前世界上最大的人类多民族永生细 胞库，是中国人类基因组计划的重要组成部分。 永生细胞株指的是原代培养物培养成功后，可继续传代下去，并且通过传代 可无限增殖持续生存的细胞系。用e b 病毒转化外周血的b 淋巴细胞建立的永生 细胞株，因其可以在传代培养的条件下，源源不断地为疾病基因定位、基因多样 性等相关领域研究提供d n a ，而在基础生命科学研究中受到重视。 e b 病毒( e p s k i n b a n f i r u s ，e b v ) 是一种嗜b 淋巴细胞的疱疹病毒，属疱 疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属病毒。e b v 是线性双链d n a 病毒，包裹于核衣壳内， 基因组长1 7 5 k b ，含近1 0 0 个编码基因。e b v 感染b 淋巴细胞后，其d n a 发生 环化，成为受染细胞染色体体外能复制的附加成分，并一直潜伏于b 细胞内， 使b 淋巴细胞转化为类淋巴母细胞系。在细胞转化过程中必需的几种产物为： e b 病毒核抗原1 ( e bn u c l e a ra n t i g e n 1 ，e b n a 1 ) 、e b 病毒核抗原2 ( e bn u c l e a r a n t i g e n - 2 ，e b n a - 2 ) 、e b 病毒核抗原- 3 ( e bn u c l e a ra n t i g e n 一3 ，e b n a - 3 ) 、潜伏 膜蛋白( 1 m e n tm e m b r a n e p r o t e i n ，l m p ) 。e b 病毒通过膜糖蛋白g p 3 2 0 2 2 0 和c r 2 附着在b 细胞上，引起b 细胞的激活，使受感染的b 细胞从细胞周期的 g o 期进入g 1 期，并伴有细胞编码的b 细胞活化抗原( 如c d 2 3 和自细胞移动抑 制因子等) 的合成和释放，这种由病毒附着所引起的初期激活作用产生迅速，在 此基础上，随着病毒颗粒穿入细胞内，建立潜伏感染，使细胞的活化进一步加剧， 引起细胞r n a 合成，抗体分泌，d n a 复制和细胞分裂。在e b 病毒引起b 细胞 活化后，即导致细胞无休止的增生，转化为永生的类淋巴母细胞系。 目前，已有研究报道对采用e b 病毒转化外周血b 淋巴细胞的方法建立的永 生细胞株进行转化前后细胞和分子遗传学方面的检测，结果表明转化后的细胞株 染色体绝大部分是正常的二倍体核型( 9 4 6 ) ，所检测的1 5 个s t r 位点以及x 染色体上的a m e l o g e n i n 、d e s t r o p h i n 基因分析结果显示，转化前后细胞株的相 应d n a 区域无变化，认为采用该方法不会影响永生细胞株的遗传特征】。 本研究的目的是检测传代培养的永生细胞株，在长期传代的过程中细胞和分 6 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所硕士研究生学位论文 子遗传学方面是否保持稳定，这是关系到需要永生细胞株提供d n a 的科学研究 实验结果准确性的重要问题。本研究通过细胞染色体水平二倍性检测、分子水平 高突变s t r 位点检测以及细胞培养过程中端粒酶活性测定等方法对人类永生细 胞株进行全面的细胞特性研究，以回答保存的永生细胞传多少代后其细胞生物学 特征及遗传特征是否保持稳定，并检测永生细胞株在传代过程中随着代次的增加 各方面特性的变化趋势以及特征，为今后的相关研究提供科学依据。 一、实验材料、方法及仪器设备 ( 一) 、主要试剂及配方( 除特别注明外，均为国产分析纯试剂) l 、r p 1 6 4 0 培养基( g i b c o 公司) 1 0 4 9 r p m l l 6 4 0 培养基置于三角瓶内，1 0 0 0 m l 蒸馏水充分溶解，加入2 9 n a h c 0 3 ，使p h 值达到7 1 7 2 左右。溶液颜色为桔红色。 2 、 抗菌素 青霉素和链霉素浓度为1 0 0 0 0 u m l 。生理盐水溶解青霉素和链霉素，过滤灭 菌后，小瓶分装，2 0 ( 2 保存。使用时，每1 0 0 m l 完全培养基加l m l 。 3 、抗凝剂 所用抗凝剂为肝素钠。每l m l 血加2 5 单位肝素钠抗凝。 4 、谷氨酰胺 谷氨酰胺5 8 4 6 9 加蒸馏水2 0 0 m l ，小瓶分装，2 0 0 保存。每l o o m l 培养基加 0 5 1 o i m 。 5 、胎牛血清( g i b c o 公司) 6 、淋巴细胞分离液( p h a r m a c i a 公司) 分装在1 0 m l 试管内，每管4 m l ，避光保存。使用前，用3 7 ( 2 水浴加温。 7 、环孢霉素( 瑞士s s n d i m e m 公司) 每5 0 m l1 6 4 0 培养基j n a , 2 0 9 l5 0 m g m l 环孢霉素原液。 8 、e p s t e i n b a r rv i r u s ( e 1 3 v ) 制备 培养b 9 5 8 细胞，传代，逐步增加培养液至需要的毫升数。加入淋巴细胞前， 0 2 p m 孔径滤膜过滤。 9 、二甲基亚砜( d i m e t h y ls u l f o x i d e ) 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所硕二l 研究生学位论文 用于细胞冷冻保存，需避光保存。 1 0 、全培养液 r p m l l 6 4 0 全培养液内含l ( v ) 青霉素和链霉素，2 5 ) 小牛血清，1 ( v v ) 谷氨酰胺溶液，p h 值为7 0 - 7 2 。 l l 、冻存液 5 0 m l1 6 4 0 全培养液加入4 0 m l 小牛血清和1 0 m l 二甲基亚砜。 1 2 、r p m l l 6 4 0 洗液 9 6 m li 心m i l 6 4 0 加入4 m l 青霉素和链霉素。 1 3 、低渗液 0 0 7 5 mk c i ，称取5 5 9 9 的k c i 溶于1 0 0 0 m l 的蒸馏水中。 1 4 、固定液 甲醇：冰醋酸为3 ：1 1 5 、磷酸缓冲液 0 0 6 7 mk h 2 p 0 4 ：4 5 5 9 9k h 2 p 0 4 溶于5 0 0 m l 蒸馏水 0 , 0 6 7 mn a 2 h p 0 4 ：4 7 3 3 5 9n a 2 h p 0 4 溶于5 0 0 m l 蒸馏水 1 6 、g i e m s a 染液 配制g i e m s a 母液：取1 0 9g i e m s a 粉及少许的优质丙三醇于研钵中，充分研 磨至无颗粒( 约3 - - , 5 小时) 后，加丙三醇至3 3 m l ，置于5 6 c 温箱中保温2 小时，待充分溶解后，取出，再加入3 3 m l 甲醇混匀，封闭保存于棕色瓶中。 g i e m s a 工作液：取0 0 6 7 mk h 2 p 0 4 1 3 7 m l ，0 0 6 7 mn a 2 h p 0 4 3 6 3 m l ，混匀后， 取4 5 m l 加5 - 6 m l g i e m s a 母液。 1 7 、0 2 5 胰酶( t r y p i n ) 原液 0 2 5 9 胰酶加生理盐水1 0 0 m l ，混匀，4 c 过夜，次日分装成小瓶，2 0 c 保存 备用。 胰酶工作液：0 2 5 胰酶( t r y p i n ) 原液4 m l ，加生理盐水4 6 m l ，用5 n a h c 0 3 调p h 至7 0 。 1 8 、5 n a l - - i c 0 3 称取5 0 9 的n a h c 0 3 溶于1 0 0 m l 蒸馏水中。 1 9 、秋水仙素液配制 8 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所硕士研究生学位论文 l g m l 秋水仙素原液：取秋水仙素1 0 m g 加无菌蒸馏水l o m l ，混匀。 lo p g m l 秋水仙素工作液：l g m l 秋水仙素原液l m l ，加无菌蒸馏水。 2 0 、蛋白酶k ( 德国m e r c k 公司) 2 1 、r t a qd n a 聚合酶( 日本t a k a r a 公司) 2 2 、m g c l 2 ( 日本t a k a r a 公司) 2 3 、d n t p ( 日本t a k a r a 公司) 2 4 、1 0 b u f f e r ( m 9 2 + f r e e ) ( 日本t a k a r a 公司) 2 5 、溴乙锭( 上海s a n g o n ) 2 6 、溴酚蓝( 上海s a n g o n ) 2 7 、琼脂糖( 上海s a n g o nb b i ) 2 8 、乙醇( 广东汕头市西陇化工厂) 2 9 、d l 2 0 0 0 ( 日本t a k a m 公司) 3 0 、丙烯酰胺( 上海s a n g o n b b i ) 3 l 、甲叉双丙烯酰胺( 上海s a n g o n ) 3 2 、 i r i s ( 上海s a n g o n ) 3 3 、过硫酸胺( 美国a m r c s c o ) 3 4 、t e m e d ( 美国a n l r e s c o ) 3 5 、硼酸( 上海华舜生物工程有限公司) 3 6 、饱和酚( 上海s a n g o n ) 3 7 、4 0 丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺贮备液 称取丙烯酰胺1 9 9 ，n ，n 亚甲双丙烯酰胺1 9 ，加去离子水至5 0 m l ，搅拌至 完全溶解，装棕色瓶内于冰箱中4 c 避光保存备用。 3 8 、3 0 丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺贮备液 称取丙烯酰胺2 9 9 ，n ，n - 亚甲双丙烯酰胺l g ，加取离子水至5 0 m l ，搅拌至 完全溶解，装棕色瓶内于冰箱中4 c 避光保存备用。 3 9 、5 x t b e 凝胶缓冲液 t r i s 碱5 4 9 ，硼酸2 7 5 9 ，2 0 m l0 5 m o l le d t a 溶于1l h 2 0 中( p h s 0 ) 4 0 、1 0 x t b e 凝胶缓冲液 啊s 碱1 0 8 9 ，硼酸5 5 9 ，4 0 m l 0 5 m o l le d t a 溶于i l h 2 0q 3 ( p h 8 0 ) 9 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 硕上研究生学位论文 4 l 、1 0 ( w n ) 过硫酸铵 过硫酸铵1 0 m g ，加去离子水至l m l ，每周新配一次，4 。c 避光保存。 4 2 、t e m e d ( n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺) 4 c 避光保存 4 3 、0 5 m o l le d t a 1 8 6 9e d t a ，加双蒸水至1 0 0 m l ，调p h 至8 0 4 4 、1 0 聚丙烯酰胺凝胶( 1 5 m 1 ) 配制 试剂加入量 h 2 0 6 0 m l 3 0 聚丙烯酰胺 5 0 m l 5 x t b e一4 0 m l 1 0 过硫酸氨 1 1 0 “l t e m e d l o 山 4 5 、1 2 聚丙烯酰胺凝胶( 1 5 m 1 ) 配制 试剂加入量 h 2 0 5 9 m l 4 0 聚丙烯酰胺 4 5 m l 5 x t b e 4 6 m l 1 0 过硫酸氨 1 1 0 “l t e m e d 1 0 9 l ( - - ) 、仪器设备 l 、离心机 c e n t r i f u g e5 4 1 7 ( 德国e p p e n d o r f 公司) c e n t r i f u g e5 8 1 0 r ( 德国e p p e n d o r f 公司) h f l 2 0 ( 日本精工株式会社) 2 、p c r 仪( 美国b i o r a d ) 3 、水平电泳仪p o w e rp a c 3 0 0 ( 美国b i o r a d ) 4 、垂直电泳仪( 美国b i o r a d ) 5 、s y n g e n e 凝胶自动成像分析仪( 英国s y n o p t i c s 公司) l o 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 硕上研究生学位论文 6 、脱色摇床( 江苏海门其林医用仪器厂) 7 、水浴锅( 德国m e m m e r t ) 8 、显微镜( 德国o l y m p u s ) 二、研究对象 随机选取永生细胞库中1 0 株细胞株。这1 0 株细胞株均为来源于健康个血样 用本实验室建立的e b 病毒转化b 淋巴细胞的方法建立的永生细胞株。 表1 永生细胞株名称及建株时间 细胞株名称建株时间 y a 0 0 3 2 y a 0 0 3 3 y a 0 0 4 3 y a 0 0 4 6 y a 0 0 0 6 y a 0 0 5 6 y a 0 2 3 3 y a 0 2 2 5 y a 0 2 3 0 y a 0 2 5 2 2 0 0 6 年1 0 月2 6 日 2 0 0 6 年1 0 月2 6 日 2 0 0 6 年1 0 月2 6 日 2 0 0 6 年1 0 月2 6 日 2 0 0 6 年1 0 月2 6 日 2 0 0 6 年1 0 月2 6 日 2 0 0 6 年l o 月2 6 日 2 0 0 6 年l o 月2 6 日 2 0 0 6 年1 0 月2 6 日 2 0 0 6 年1 0 月2 6 日 三、实验方法及实验结果 ( 一) 、e b 病毒转化b 淋巴细胞后的传代培养 ( 二) 、传代培养细胞的染色体二倍性研究 1 实验方法 1 1 细胞株每隔1 0 代，即1 0 代、2 0 代时，取出进行染色体标本的制备 ( 1 ) 将培养到所需代次的细胞株取出，在终止培养前2 小时向培养瓶中加入 1 0 9 9 m l 秋水仙素工作液8 5 - 9 5 p l ，摇匀后，3 7 c 继续培养； ( 2 ) 3 7 c 培养2 小时后，取出培养瓶，轻轻摇匀细胞，将细胞悬液转入1 0 m l 离心管中1 6 0 0 转分钟，离心6 分钟，取出小心弃去上清； ( 3 ) 低渗：向试管中加入8 m l3 7 c 预热的0 0 7 5 mk c l ，用吸管悬浮细胞，3 7 l i 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所硕士研究生学位论文 水浴低渗1 5 分钟； ( 4 ) 预固定：低渗后每管沿管壁加入现配的固定液( 甲醇：冰醋酸，3 ：1 ) l m l ，用吸管轻轻混匀细胞后，1 6 0 0 转分钟，离心6 分钟，小心弃去上清； ( 5 ) 固定：每管加入固定液8 m l ，用吸管轻轻混匀细胞后，固定3 0 分钟，1 6 0 0 转分钟。离心6 分钟，小心弃去上清： ( 6 ) 第二次固定：每管加入固定液6 m l ，用吸管轻轻混匀细胞后，固定3 0 分 钟，1 6 0 0 转分钟。离心6 分钟，小心弃去上清； ( 7 ) 向试管底部的细胞沉淀加入适量固定液，轻轻悬浮细胞，以细胞悬液颜 色为毛玻璃状为佳； ( 8 ) 事先准备水浴锅，预热到8 4 c ，并在水面上放置饭盒盖，使其预热； ( 9 ) 从预冷的冰水中取出玻片一张，分开滴2 滴细胞悬液后，立即将其放置 于饭盒盖上，计时1 分钟2 0 秒左右，取出放于玻片架上晾干； ( 1 0 ) 在显微镜的暗视野下观察玻片上染色体的分散程度，酌情进行改进。若 合适，则进行余下片子的制备； 1 2 染色体标本g 显带的制备 ( 1 ) 胰酶消化液的配制：在染缸中加入各2 5 m l 的0 0 6 7 m 的k h 2 p 0 4 和 n a 2 h p 0 4 ，并从冰箱中取出4 c 保存的o 2 5 胰酶，加2 m l 胰酶到染缸，混匀后， 置水浴锅中3 7 温热； ( 2 ) 缓冲液的配制：在染缸中加入各2 5 m l 的0 0 6 7 m 的k 】- 1 2 p 0 4 和n a 2 h p 0 4 ； ( 3 ) g i e m s a 染液的配制：取0 0 6 7 mk h 2 p 0 41 3 7 m l ，0 0 6 7 mn a 2 h p 0 4 3 6 3 m l ， 混匀后，取4 5 m l 加5 - 6 m l g i e m s a 母液； ( 4 ) 将在8 0 c 烤箱中烤过2 h 的玻片置胰酶消化液中消化2 0 秒左右后，立即放 于缓冲液中； ( 5 ) 将玻片从缓冲液中取出后，置于g i e m s a 染液中8 分钟： ( 6 ) 流水冲洗； ( 7 ) 将玻片置于玻片架上晾干。 1 3 显微镜下观察 2 实验结果 2 1l o 株细胞株在3 0 代之前染色体特征 1 2 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 硕士研究生学位论文 ( 1 ) 染色体二倍性分析 1 0 株细胞株培养至1 0 、2 0 、3 0 代时分别取出，按常规染色体制片方法进行 染色体的制片，每株细胞株计数5 0 个分裂相，每隔1 0 代1 0 株细胞株共计数5 0 0 个分裂相，统计超二倍体、亚二倍体及多倍体的发生率( 表2 ) 。 表2 细胞株中超二倍体、亚二倍体及多倍体的发生率 ( 2 ) 染色体g 显带结果表明，细胞株在1 0 、2 0 、3 0 代时的二倍体核型是正常 的。( 见图1 ) 。 蓍器墨毒蠢善 鼙；嚣蠹。妻 基毫 雾嚣鬟 算 聪蚕 墨蚤砖 誊霉t i 暮叠羹零鑫 螽参l 第1 0 代 誊硒卜婚：引器，： 图刚豳蔺豳 中国医学科学院北京协和! 登堕堕兰圭塑堂婴塑堕 堡兰堕窒生兰垡笙兰 _ _ _ _ - 一。 蓦豢嚣嚣 纛黪爨轰嚣 第2 0 代 嚣慧嚣襞薹连 嚣 蕊嚣嚣嚣蒜援誊嚣嚣嚣嚣嚣孕茹 豁爨袁巷6饕鼍 纛蕊舞荐 嚣嚣蓉 秘簋纛旺舀 第3 0 代 图1 细胞株1 0 、2 0 、3 0 代的染色体核型 2 21 0 株细胞株在3 0 乖龟吟嘀名也 ( 1 ) 染色体二倍性分析 如表3 所示，l o 株细胞株在3 0 代后生长速度变慢，细胞数量变少，细胞的 分裂相也随着传代时间的增加逐渐变少，超二倍体、亚二倍体及多倍体的发生率 明显增加。 1 4 镶孑移缵醢疆移锺遮彦【枣k薯， 0 移稳抟 稿勰缝# 魄碜势秘疆 麓鬈赣饕 鸺霹遮骤 嚣薅薹够抟 麓，穗 嚏裹 哕镰种 簟童 蹬鬟辅j缓褥痧麓 磐莽蠢囔疗珏蕴翟 缱毳 a 舅酸。葑 缝羲搿 譬矗疆蠢甜缈黪狂热珏 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 硕士研究生学位论文 表3 细胞株4 0 代后二倍性分析表 代次分裂相数 超二倍体亚二倍体多倍体 在4 0 代以后，y a 0 5 6 的分裂相为多倍体。 。由于细胞生长速度不一致，在踟代时仅统计了y a 0 6 、y a 0 4 3 、y a 0 5 6 、y a 0 2 6 2 细胞株的染色体 二倍性相关数据。 表4 细胞株y a 0 5 6 二倍性分析表 代表在分析的分裂相中无此类型的分裂相 p 2 0 分裂相照片 甏r 霹，f p 4 0 分裂相照片 图2 细胞株y a 0 5 62 0 代和3 0 代以后的分裂相照片 1 5 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 硕上研究生学位论文 ( 三) 、传代培养细胞高突变s t r 位点检测 l 实验方法 1 1 血样和细胞株d n a 的提取 1 2 核基因组中高突变s t r 位点的选择 献s t rt a n d e mr e a p e a td n ai n t e m e td a t a b a s e ( h t t p ：| | w w w e s t l 。n i s t 。g o v | b i o t e c h s t r b a s e m u t a t i o n h t m ) q b 选取高突变( 突变率 o 0 9 ) 的1 3 个s t r 位 点，对核基因组进行微卫星不稳定性检测，引物序列来自n c b ip u b m e d ，见表 5 表5 核基因组高突变s t r 位点引物序列及突变率 1 3 p c r 扩增 反应体系2 0 1 z l 1 6 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所硕。i ：研究生学位论文 反应物 h 2 0 1 0 x b u f f e r 2 5 m mm g c l 2 2 5 m m d n l l p 1 0 u m 上游引物 1 0 u m 下游引物 r t a q 酶 d n a 样本 加入量( p 1 ) 1 1 4 2 o 1 6 1 6 0 8 0 8 o 1 6 2 1 4 反应条件 热盖温度1 0 0 c 预变性 9 4 2 r a i n 变性9 4 3 0 s - 1 i 复性 5 6 - - - - 6 6 c4 5 s 3 0 次循环 l 延伸 7 2 3 0 s 后延伸 7 2 6 m i n 1 5 线粒体基因组d 1 0 0 p 区s t r 位点的选择 d 1 0 0 p 是线粒体基因组m s i 发生的热点区域。本实验在d l o o p 区选取了 文献报道的2 个高突变的s t r 位点进行相关检测，见表6 。 表6d - l o o p 区高突变s t r 位点序列 反应体系2 0 1 反应物 h 2 0 10 x b u f f e r 2 5 m mm g c 2 2 5 m md n t p 1 0 u m 上游引物 1 0 u m 下游引物 1 7 加入量 ( p 1 ) 1 1 3 2 o 1 6 l 1 l 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所硕：上研究生学位论文 rtaq酶0i d n a 样本 2 1 7 反应条件 热盖温度1 0 0 3 c 预变性9 5 2 m i n 变性 9 5 c3 0 s 、 i 复性 6 0 c4 0 s 3 0 次循环 l 延伸7245s j 后延伸 7 2 6 m i n 1 8p c r 产物琼脂糖电泳的检测 从血样及1 0 株细胞株抽提的d n a 在特定位点进行p c r 扩增后，先进行琼 脂糖电泳的检测，看是否有需要的目的条带的扩出，并初步判断p c r 产物的大 概浓度，以便进行下一步的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。 将挡板插入胶槽的两端； ( 1 ) 取3 0 9 琼脂糖置于三角瓶中，加入1 5 0 m lix t b e 缓冲液，充分混合后， 在微波炉中加热2 m i n 3 0 s ： ( 2 ) 将烧瓶拿出冷却到用手摸时不烫手，加1 0 9 l 的溴乙锭，摇动烧瓶至混匀， 注意尽量不要有气泡的产生： ( 3 ) 将琼脂糖迅速倒入胶槽，并根据需要插上梳子，仔细检查有无气泡，室温 放置l 小时后，拔去胶槽两侧的挡板及梳子，并将凝胶放入预先加满 l x t b e 缓冲液的电泳槽中； ( 4 ) 将p c r 产物5 u l 加6 x l o a d i n gb u f f e r3 u l ，混匀后，用移液器加入上样孔中； ( 5 ) 1 5 0 v 电泳2 5 m i n ； ( 6 ) 取出胶块，在紫外成像仪下照相，分析结果。 1 9p c r 产物1 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测 ( 1 ) 将清洗后晾干的玻璃板的两端用夹子夹住后，固定于灌胶的架子上； ( 2 ) 将加过1 0 1 a 1t e m e d 的丙烯酰胺混合液，用l m l 的移液器沿玻璃板的顶端 缓慢的加入，直至加满； ( 3 ) 立即插入梳子，并仔细观察梳子下方是否有气泡，若有则需重新插梳子； 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所硕上研究生学位论文 ， ( 4 ) 室温聚合1 小时以上，将玻璃板从架子上取出并放入胶槽中，加入1 x t b e 缓冲液，在缓冲液没过梳子顶端时，小心拔出梳子，并用注射器冲洗胶孔， 以去除可能存在的未聚合的丙烯酰胺； ( 5 ) 电压1 2 0 v 预电泳3 0 r a i n ； ( 6 ) 将细胞传至1 0 、2 0 、3 0 代时抽提的d n a 扩增的p c r 产物与血样抽提的 d n a 扩增的产物分别取5 1 x l 与变性剂5 9 l 混合后，p c r 仪中9 5 c 1 0 m i n ， 迅速取出置于冰上，上样1 0 t t l ； ( 7 ) 1 2 0 v 冰浴电泳2 4 0 r a i n ： ( 8 ) 将胶板从电泳槽中取出，放入托盘中，打开玻璃板，并加蒸馏水在托盘中， 水平震荡托盘直至凝胶与玻璃板完全分开： ( 9 ) 小心将凝胶放入溴化乙锭中，浸泡1 0 m i n ； ( 1 0 ) 取出，在紫外成像仪下照相，分析结果。 2 实验结果 同一细胞株样品以血样抽提的d n a 扩增的p c r 产物作为阴性对照，将细胞 传至1 0 、2 0 、3 0 、4 0 8 0 代时抽提的d n a 扩增的p c r 产物与血样抽提的d n a 扩增的产物同时变性后，上样电泳。如果1 0 、2 0 、3 0 、4 0 8 0 代时抽提的d n a 扩增的p c r 产物与阴性对照电泳后的条带无差异，说明所检测的s t r 位点未发 生变化，反之，s t r 位点在长期传代培养中发生了突变。 2 1 核基因组微卫星不稳定性检测结果 ( 1 ) 1 0 株细胞株除y a 0 2 6 2 外，在8 0 代以前核基因组高突变的1 3 个s t r 位点 p c r 扩增后变性经1 2o , p a g e 电泳分离，均未发现各位点有条带的增加或减少， 见图3 。 1 9 中旧i 九f 1 。i 型 蔓! 坐翌堕竺堕! ! ! ! ! 兰生塑堂塑! i 堕 竺! ! 型! ! 生兰丝堡兰一 _ _ _ _ 一一_ _ _ - - _ 一 1 2345 678m 5 0 0 b p 2 5 0 b p 1 0 0 p 图3 ：部分细胞株y a 0 0 4 3 、y a 0 0 4 6 、y a 0 0 0 6 、y a 0 0 5 6 在核基因组高突变位点 d 1 9 s 4 3 3 p c r 产物变性后p a g e 电泳结果 注：1 、3 、5 、7 为细胞株y a 0 0 4 3 、y a 0 0 4 6 、y a 0 0 0 6 、y a 0 5 6 血样抽提的d n a p c r 扩增产物变性后电泳结 果，2 、6 、8 为细胞株y a 0 0 4 3 、y a 0 0 0 6 、y a 0 0 5 6 花8 0 代细胞株抽提的d n ap c r 扩增产物变性后i u 泳结 果，4 为y a 0 0 4 6 住7 0 代鱼l l 胞株抽提的d n ap c r 扩增产物变性后i 乜泳结果，m 为分r 量标准带d l 2 0 0 ( 2 ) 细胞株y a 0 2 6 2 在高突变位点d 1 3 s 3 1 7 在6 0 代时检测出有突变发牛见图4 。 l23m 5 0 0 b p 2 5 0 b p 1 0 0 b p 图4细胞株y a 0 2 6 2 在核基因组高突变位点d 1 3 s 3 1 7 p c r 产物变性后p a g e 电 泳结果。 2 0 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 硕： ：研究生学位论文 注：i 、2 、3 为细胞株y a 0 2 6 2 分别在5 0 、6 0 、8 0 代时抽提的d n a 在位点d 1 3 s 3 1 7 p c r 扩增产物变性后 电泳结果，m 为分子量标准带d l 2 0 0 0 。 2 2 线粒体d l o o p 区微卫星不稳定性检测结果 1 0 株细胞株在8 0 代以前，线粒体基因组d l o o p 区2 个高突变的s 1 r 位点，p c r 扩增后变性经1 2 p a g e 电泳分离，均未发现各位点有条带的增加或减少，见图5 。 23456m 5 0 0 b p 2 5 0 b p l o o b p 图5 部分细胞株在位点d 31 0 经p c r 产物变性后p a g e 电泳图 注：l 、3 、5 为细胞株y a 0 2 2 5 、2 3 0 、2 6 2 血样抽提的d n a 在位点d 3 1 0 扩增产物变性后胶图，2 、4 、6 为 细胞株y a 0 2 2 5 、2 3 0 、2 6 2 分别在5 0 、5 0 、舳代时在位点d 31 0 扩增产物变性后胶图，m 为分子量标准带 d l 2 0 0 0 。 表71 0 株细胞株高突变s t r 位点检测代次、检测结果 检测结果血样1 0 5 0 代6 0 代7 0 代7 5 代8 0 代 y 枷3 2一一一n n y a 0 0 3 3一一一一一一 ya0043 y a 0 0 4 6一一一一一n 1 0 0 0 6一一一一一一 y 的0 5 6一一一 一 一一 僦3 3一 一 一n n 眦2 5一 nnnn 帕2 3 0一一nnnn 帕2 6 2一 +n+ 注：+ 为该细胞株在该代次检测出突变，一为该细胞株在该代次未检测出突变，n 为未进行该细胞株该代次 的检测。 2 i 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所硕上研究生学位论文 ( 四) 传代培养细胞端粒酶活性检测 采用t o y o b o 公司( 日本) 的t e l o c h a s e r 试剂盒( t e l o m e r a s ea s s a y l ( i tb ys t r e t c hp c rm e t h o d ，c o d en o ：t l k - 1 0 1 ) 检测。培养细胞的细胞数控制 在1 o 2 5 x 1 0 4 个每次实验，阳性对照为h e l a 细胞株，阴性对照为试剂盒 中所附的裂解液( 1 y s i ss o l u t i o n ) 。 l 实验方法 1 1 阳性对照h e l a 细胞的培养 ( 1 ) h e l a 细胞的复苏：将装有h e l a 细胞的冻存管从液氮中取出后，迅速 放入4 0 左右的水中，不停晃动，直至完全融化； ( 2 ) 在无菌超净台中，用吸管将冻存管中的细胞吸至试管中，并加入1 0 m l 无血清的m e m 培养基，轻轻吹打细胞后，1 0 0 0 转分钟，离心1 0 分 钟； ( 3 ) 倒去上清，将细胞沉淀用含5 血清的m e m 全培养基吹打散后，吸 至5 0 m l 培养瓶中，并加m e m 全培养基至1 5 m l ； ( 4 ) 将培养瓶放于3 7 温箱中，培养2 - - 3 天； ( 5 ) 待细胞长满后，倒去培养基，用p b s 洗一遍后，加入0 2 5 的胰酶 l m l ，倒放静置，待培养瓶上细胞贴壁面细胞开始脱落，呈现纱窗样 时，迅速倒去培养基，并用l m l 含5 血清的m e m 全培养基吹打冲 洗贴壁细胞，将吹打下的细胞对半分后加入1 5 m l 全培养基，3 7 温 箱培养。 1 2 细胞计数 ( 1 ) 用吸管吹打培养瓶中的细胞，尽可能将细胞吹散： ( 2 ) 用移液器吸取1 0 u l 的细胞悬液，沿细胞计数板的边缘注入； ( 3 ) 在显微镜1 0 x 物镜、1 0 x 目镜下，对细胞计数器中的9 个 大方格中各5 个格即共1 0 个格进行计数； ( 4 ) 合计1 0 个大方格的细胞数( 每室5 个，共2 室) ，算出l x l 0 。3 m l 中 的细胞数： ( 5 ) 根据要求每次实验培养细胞的细胞数控制在1 0 2 5 x 1 0 4 个，吸取 相应砌数的细胞悬液至1 5 m l 离心管中，备用。 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 硕上研究生学位论文 1 3 培养细胞提取液的配制 ( 1 ) 按所需量事先取出裂解液( 每个样品2 0 0 p 1 ) 和p b s ( - ) 于冰上冷却； ( 2 ) 用纸巾将胰蛋白酶处理过的培养细胞进行吸干，然后用适 当的培养基重新悬浮，进行细胞计数。 ( 3 ) 当细胞数达到所需要求时，将该部分细胞悬液移至微量离 心管，在2 3 ，0 0 0 转分钟状态进行3 分钟离心后，除去上清培养 基： ( 4 ) 加入l m l 冰浴的p b s (