（细胞生物学专业论文）调控高尔基体可塑性及动力学蛋白质的分子功能研究.pdf

中国科学技术大学博士学位论丈 摘要 高尔基体是一个细胞器，它加工在粗糙面内质网上核糖体合成的蛋白质，再 分拣和包装，然后运输到细胞内不同部位。为此高尔基体的功能在细胞生命活动 中起着至关重要的作用。自十九世纪高尔基体的发现以来，我们对高尔基的功能 及其在细胞生长过程中的动力学规律有了长足的认识，但我们对其组装及功能调 节的分子机制并不清楚。二十世纪七十年代开始的酵母遗传学为我们了解真核细 胞高尔基体的功能与组装奠定了良好的基础。近期完成的人类基因组草图为我们 研究人类细胞高尔基体的分子组成及其功能奠定了物质基础。 在芽殖酵母里，y i p l p 和y i f l p 是内质网到高尔基体运输中早期分泌途径的 两个不可缺少的基因。这里我们报道和鉴定人源的y i f l 基因( h s y i f l ) 。序列分 析显示同其他的y i p l 家族成员类似，h s y i f l 包含几个跨膜区域。双色免疫荧光 实验显示h s y i f l 和高尔基体标记蛋白g s 2 7 有同样的定位。为了研究h s y i f l 的 功能，我们进行了酵母双杂交实验，发现h s y i f l 与酵母y i p l p 基因的同源物 h s y i p l a 结合。另外我们的免疫共沉淀实验也验证了它们的相互作用。而且免疫 荧光实验表明h s y i f l 与h s y i p l a 在细胞中有相同的定位。值得注目的是，过量 表达缺失n 端胞质区域的h s y i p l a 突变体，破坏了h s y i f l 的高尔基体定位。暗 示h s y i p l a 促使了h s y i f l 定位到高尔基体上。在研究h s y i f l 的功能中，我们 还使用了h s y i f l 突变体。过量表达缺失n 端的h s y i f l 突变体，导致高尔基体 的坍塌以及内质网膜的积聚，暗示h s y i f l 可能参与内质网到高尔基体运输过程。 因此，我们推断h s y i p l a 与h s y i f l 相互作用且决定h s y i f l 高尔基体定位，并 且象酵母中y i f l p y i p l p 复合体功能一样h s y i f l h s y i p l a 复合体参与内质网到 高尔基体运输过程。虽然h s y i f l 参与内质网到高尔基体运输过程的分子机理还 不清楚，但是我们的研究支持了酵母和人中囊泡运输机制是保守的这样一个观 点。 真核细胞在漫长的进化过程中诞生出一些种属特异性的分子调控机制。在利 用比较基因组学的基础上，我们采用蛋白质组学的方法剖析人类( 细胞) 高尔基 体的分子组成及可能的修饰与调节规律。在解析动点蛋白质组的研究中，我们发 现了一个新的高尔基体蛋白g p a p ( g o l g ip r o t e i na s s o c i a t e dw i t h p l k l ) 。免疫荧 中国科学技术大学博士学位论文 光实验显示g p a p 和高尔基体标记蛋白共定位。序列分析显示与其他许多高尔基 体因子一样，g p a p 是一个含有卷曲螺旋结构的蛋白。我们的实验证实g p a p 分 子中间的超螺旋结构决定了其高尔基体定位。另外g p a p 有几个潜在的p l k i 磷 酸化位点，暗示g p a p 的活性可能受细胞周期调控。为了证实g p a p 与p l k l 的 相互作用，我们进行了g s tp u l l d o w n 以及免疫共沉淀实验，很有意义的是实验 验证了我们的假设，g p a p 在体内和体外都与p l k l 相互作用。 中国科学技术大学博士学位论文 a b s t r a c t t h eg o l g ia p p a r a t u si sac y t o p l a s m i co r g a n e l l ei n v o l v e di nt h ep r o c e s s i n g p r o t e i n sp r o d u c e do nt h er i b o s o m e so ft h er o u g he n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ( e r ) ，a n d s o r t i n ga n dp a c k a g i n go fp r o t e i n sf o rt r a n s p o r tt oav a r i e t yo f c e l l u l a rl o c a t i o n s h e n c e ， g o l g ii se s s e n t i a lf o rl i v i n gc e l l s s i n c et h ed i s c o v e r yo f t h eg o l g ii n1 9 t hc e n t u r y , w e h a v em a d eag r e a tp r o g r e s si nu n d e r s t a n d i n gt h ed y n a m i cb e h a v i o ra n dt h ef u n c t i o no f g o l g i t h em e c h a n i s mu n d e r l y i n gi t sa s s e m b l yp r o c e s s e sa n df u n c t i o nr e g u l a t i o n ， h o w e v e r , i ss t i l lc l o u d ys of a r a p p e a r i n gi n19 7 0 s ，y e a s tg e n e t i c se s t a b l i s h e dag o o d f o u n d a t i o nf o ru sb i o l o g yl e a r n e r si ns t u d y i n gt h ef u n c t i o na n da s s e m b l yo fg o l g ii n e u k a r y o t i cc e l l s m o r e o v e r , h u m a ng e n o m ed r a f tw h i c hw a sf i n i s h e dr e c e n t l ya l s o p r o v i d e su sp l e n t yo f d a t ai na d d r e s s i n gt h i si s s u e y i plpa n dy i f lpa r ee s s e n t i a lf o rt r a n s p o r tf r o me rt og o l g is t a c kd u r i n gt h e e a r l ys e c r e t o r yp a t h w a yi nb u d d i n gy e a s t h e r ew er e p o r tt h e i d e n t i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no fh u m a ny i f l ( h s y i f l ) s e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e st h a th s y i f l ， l i k em o s to f t h eo t h e ry i p lp r o t e i nf a m i l ym e m b e r s ，c o n t a i n sm u l t i p l et r a n s m e m b r a n e s e g m e n t s d o u b l ei m m u n o f l u o r e s c e n c es t u d yr e v e a l e dac o d i s t r i b u t i o no fh s y i f l w i t hg o l g im a r k e rs u c ha sg s 2 7 t od e l i n e a t et h ef u n c t i o no fh s y i f l ，w ec o n d u c t e da y e a s tt w oh y b r i da s s a ya n di d e n t i f i e da ni n t e r a c t i o nb e t w e e nh s y i f la n dh s y i p la ，a h u m a nh o m o l o go fy e a s ty i p l p i na d d i t i o n ，o u rp u l l - d o w na s s a yv a l i d a t e st h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nh s y i f la n dh s y i pla m o r e o v e r ，o u ri m m u n o f l u o r e s c e n c es t u d y d e m o n s t r a t e st h ec o d i s t r i b u t i o n o f h s y i f la n d h s y i p l a s i g n i f i c a n t l y ， o v e r e x p r e s s i o no fm u t a n th s y i p l al a c k e dc y t o s o l i cr e g i o nd i s r u p t st h el o c a l i z a t i o n o fh s y i f lt ot h eg o l g i ，s u g g e s t i n gt h a th s y i plas p e c i f i e st h el o c a l i z a t i o no fh s y i f l t ot h eg o l g i t oe l u c i d a t et h ef u n c t i o no fh s y i f l ，w eu s ed e l e t i o nm u t a n th s y i f l o v e re x p r e s s i o no fct e r m i n u so fh s y i f li n d u c e db r e a k d o w no ft h eg o l g ia p p a r a t u s a n da c c u m u l a t i o no fe r ，s u g g e s t i o n i n gh s y i f lm a yi n v o l v e si ne r t og o l g it r a n s p o r t t h e r e f o r e ，w ec o n c l u d et h a th u m a ny i p lai n t e r a c t sw i t ha n dd e t e r m i n a t e st h e l o c a l i z a t i o no f h s y i f lt ot h eg o l g ia p p a r a t u sa n dh s y i f l h s y i p l ac o m p l e xi n v o l v e d i ne rt og o l g it r a n s p o r ts i m i l a rt ot h a to fy e a s ty i f lp y i plpc o m p l e x w h i l et h e i v 中国科学技术大学博士学位论文 m o l e c u l a rf u n c t i o no fh s y i f l u n d e r l y i n ge rt og o l g it r a n s p o r tr e m a i n st ob e d e l i n e a t e d ，o u rs t u d ys u p p o r t san o t i o nt h a tt h ev e s i c u l a rt r a n s p o r tm a c h i n e r yi s c o n s e r v e db e t w e e ny e a s ta n dh u m a n e u k a r y o t i cc e l l sh a v ed e v e l o p e ds p e c i a lm o l e c u l a rr e g u l a t i o nm e c h a n i s mf o r i n d i v i d u a ls p e c i e sd u r i n gl o n g - t e r me v o l u t i o np r o c e s s e s o nt h eb a s i so fc o m p a r a t i v e g e n o m i c s ，w ei n t r o d u c ep r o t e o m i c si n t h ed i s s e c t i o no fm o l e c u l a rc o m p o s i t i o n ， p o t e n t i a lm o d i f i c a t i o n ，a n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fg o l g ih u m a nc e l l s i n o u r a t t e m p tt os e q u e n c eh u m a nk i n e t o c h o r ep r o t e o m e ，w ei d e n t i f i e da n dc l o n e dan o v e l g o l g ig e n e ，g p a p ( g o l g ip r o t e i na s s o c a t e dw i t hp l k1 ) ，w h i c hl o c a l i z e dt ot h eg o l g i c o m p l e xw i t hs p e c i f i cg o l g im a r k e rb a s e do no u ri n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c e e x p e r i m e n t s s e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tg p a pi s ac o i l e d c o i lp r o t e i n ，l i k e sm o s t o ft h eo t h e rg o l g i n s o u re x p e r i m e n tr e s u l tr e v e a l st h a tt h ec o i l e d - c o i ld o m a i n ，w h i c h i sl o c a t e di nt h em i d d l eo ft h em o l e c u l e ，d e t e r m i n e st h eg p a p sg o l g il o c a l i z a t i o n g p a pb e a r ss e v e r a lp o t e n t i a lp l k1 p h o s p h o r y l a t i o ns i t e s ，w h i c hh i n tt oap o s s i b l e r e g u l a t i o no fg p a pa c t i v i t yb yc e l lc y c l em a c h i n e r y t ot e s ti fg p a pi n t e r a c t sw i t h p l k1 ，g s tp u l l d o w na n di m m u n o p r e c i p i t a t i o ne x p e r i m e n t sw e r ep e r f o r m e d s i g n i f i c a n t l y ，t h e s ee x p e r i m e n t sv a l i d a t e o u r h y p o t h e s i s a n dd e m o n s t r a t ea n a s s o c i a t i o nb e t w e e np l kla n dg p a pi nv i t r oa n di nv i v o v 中国科学技术大学博士学位论文 b f a d a p i e r e r e s e r g i c f t c d g f p g s t i p i f m g c n s f p l k l p m s f s d s p a g e s n a p s n a r e t m d u p r w b y 2 h 缩略词表 b r e f e l d i na 4 6 d i a m i d i n o 2 p h e n y l i n d o l e e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m e re x i ts i t e s e r - g o l g ii n t e r m e d i a t ec o m p a r t m e n t f o r m i m i n o t r a n s f e r a s ec y c l o d e a m i n a s e g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n g l u t a t h i o n est r a n s f e r a s e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n i m m u n o n u o r e s c e n c e m o t o t i cg o l g ic l u s t e r n e t h y l m a l e i m i d es e n s i t i v ef a c t o r p o l o 1 i k ek i n a s e1 p h e n y l m e t h y l s u l p h o n yf l u o r i d e s d sp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s o l u b l en s fa t t a c h m e n tp r o t e i n s n a pr e c e p t o r t r a n s m e m b r a n ed o m a i n u n f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s e 纾台s t e r nb l o t y e a s tt w o h y b r i d 中国科学技术大学博士学位论文 第一章：文献综述 高尔基体装置( g o l g ia p p a r a t u s ) 第一部分：高尔基体的构架与功能 高尔基体在经典的分泌途径中占据着重要地位。它接收来自内质网新合成的 肽段，对它们进行翻译后的修饰加工之后分泌到目的地( m e l l m a n & s i m o n s 1 9 9 2 ) 。高尔基体内腔中的酶复合物使得分泌物连接上各种不同的精细的糖基。 在内质网中同样会进行糖基化过程，它的目的主要是协助新生肽段的正确折叠， 而在高尔基体中的修饰过程则更为复杂( h e l e n i u s a e b i2 0 0 1 ) 。高尔基体中的糖 基转移酶催化蛋白质糖基化，使得蛋白质更加多样化，以执行不同的生理功能， 如适应和新生免疫反应( v a r k i1 9 9 8 ；r u d de ta 1 ，2 0 0 1 ) 。本质上说，高尔基体是一 个渐进工厂( k i r s c h n e r & g e r h a r t1 9 9 8 ；g a g n e a u x & v a r k i1 9 9 9 ) 。高尔基复合体是 鞘磷脂的生物合成场所，也扮演着富含甘油脂的内质网和富含固醇和鞘磷质的质 膜之间过渡的角色( h o l t h u i se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。固醇必须被及时从内质网中泵出，因为 它的累积会改变膜的流动性，也可能干扰新生多肽的转运( b r e t s c h e r m u n r o 1 9 9 3 ) 。 在三维空间上，高尔基体由一摞平行的紧密叠置在一起的扁平的膜池所组成 ( r a m b o u r g c l e r m o n t1 9 9 7 ；l a d i n s k ye ta 1 ，1 9 9 9 ) 。高尔基体的两面都是由小管 和囊泡广泛连接成的网状结构，分别称为顺面网( c g n ，c i s g o l g in e t w o r k ) 和反 面网( t g n ，t r a n s g o l g in e t w o r k ) ( 图1 1 ) 。顺面网接收来自内质网的合成的蛋 白质，而反面网将已完成修饰加工的蛋白质分泌到目的地。高尔基体的结构在真 核生物的进化过程中是相当保守的。在早期的真核生物的进化中，高尔基体可能 来自与内质网或者质膜( b l o b e l1 9 8 0 ；h e l e n i u s & a e b i2 0 0 1 ) 。比较早期分支的真 核生物的基因组，有可能使我们认识高尔基体的进化起源；也可能最近的真核生 物的共同祖先已经拥有了精细复杂的分泌途径( d a c k s & d o o l i t t l e2 0 0 1 ) 。 中国科学技术大学博士学位论文 在植物和低等动物的细胞中，高尔基体以许多分散的小摞存在于胞质中。 而在哺乳动物细胞中，高尔基体一般是近核的、近中心体的网状组织，分散的小 摞通过连续的管状结构连接成膜池，形成紧密的相互连接的带状结构。高尔基体 带的精确走向，可以反映细胞表面胞吐作用的区域，比如朝向迁移细胞或细胞创 伤的前沿，以及与细胞毒素t 细胞偶联的防御细胞( k u p f e re ta 1 ，1 9 8 2 ，1 9 8 3 ) 。高尔 基体的这种长程的有序结构依赖于细胞骨架，并受r h o - g t p a s e 的调节 ( n o b e s a n d h a l l1 9 9 9 ) 。与在组织和细胞水平上结构反映功能一样，细胞器的结构 也影响其功能。但是，高尔基体的结构如何有利于它的功能还不明确。因为我们 不可能精确的操纵高尔基体的结构，所以尽管人们提出了一些假说( r o t h m a n 1 9 8 1 ；f a r q u h a r1 9 8 5 ；m e l l m a n & s i m o n s1 9 9 2 ；b r e t s c h e r & m u n r o1 9 9 3 ；h e l e n i u s & a e b i 2 0 0 1 ) ，但是支持这些假说的证据并不确定。这一方面还有待于进一步研 究探索。 图1 1 内质网与高尔基体示意图 2 中国科学技术大学博士学位论文 第二部分：细胞周期中高尔基体的动力学 一：间期的生物合成 在细胞分裂间期，高尔基体的复杂结构必须进行复制，为其适当分离到两个 子细胞中做准备。这一过程是怎样发生的，以及它受哪些因素的调节，依然是个 谜。许多来自不同生物的电子显微镜和荧光图片表明，这个过程中高尔基体横向 生长，然后从中间分裂( t r o y e r a n dc a m e r o n1 9 8 0 ；g a r c i a h e r d u g oe ta 1 ，1 9 8 8 ；h a g e r e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。然而，哺乳动物的高尔基体是在g l ，s 和g 2 期持续生长，还是 像核d n a 和细胞中的磷脂一样只在s 期复制，还不得而知。有趣的是，内质网出 口处的数量在g 1 和g 2 期加倍( h a m m o n d & g l i c k2 0 0 0 ) ，可能是对分泌输出增加的 信号做出的反应。严格调控的复制可能发生在s 期，并且需要许可因素保证它在 一个细胞周期中只复制一次。s 期中磷脂量的加倍与d n a 复制无关，因为d n a 复 制的抑制不影响磷脂的积累，而抑制磷脂的合成对于d n a 复制也没有影响( b o g g s e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。类似地，用d n a 合成的抑$ 1 j 齐l j a p h i d o c o l i n 使细胞不能从g 1 期转换到 s 期，并不能阻断g o l g i 的生物合成。而高尔基体的持续生长伴随着细胞体积的增 加。将细胞从a p h i d o c o l i n 的抑制作用中释放出来，细胞进入正常的有丝分裂期， 与未经a p h i d o c 0 1 i n 处理过的细胞相比较，分裂期高尔基簇( m g c s ，m i t o t i cg o l g i c l u s t e r s ) 的数目与高尔基体和细胞的大小成比例的增长( s h i m ae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。因此， 细胞和高尔基体的大小似乎是紧紧偶联在一起的。尽管我们还不清楚细胞的体积 是如何收到调控的，但是它反映了细胞外竞争性因素和细胞内下游的转录网络复 杂的相互作用( c o n l o n & r a f t1 9 9 9 ) 。 胞质分裂之前高尔基体复制的机制和调节，可能与适应分泌需求而调节细胞 器的组成和数量的机制密切偶联。高尔基体腔室的表面和体积的增减，与通过高 尔基体的膜流量相一致( g r i f f i t h se ta 1 ，1 9 8 9 ；r a m b o u r g & c l e r m o n t1 9 9 7 ； m o f i n g a n e te ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这一点在不同类型的细胞中也很明显，例如，胰腺的 外分泌细胞中高尔基体的表面和体积很大，而在分泌量极少的网质红血球细胞中 高尔基体就很小。简单的说，任何细胞器的生物合成都需要细胞相应地增加组成 其的蛋白和脂类的合成。对于高尔基体来说，这包括一系列的过程，在内质网中 合成的物质输入到高尔基体中，高尔基体调节鞘磷脂的合成，以及在高尔基体胞 中国科学技术大学博士学位论文 质面的膜上外周膜蛋白质复合物的装配。在内质网中合成的高尔基体成分到达高 尔基体顺面网的囊泡小管簇( v t c s ，v e s i c u l o t u b u l a rc l u s t e r s ) ( p r e s l e ye ta 1 ，1 9 9 7 ； s c a l e se ta 1 ，1 9 9 7 ；m a r r ae ta 1 ，2 0 0 i ) ，然后依靠蛋白蛋白( n i l s s o ne ta 1 ，1 9 9 3 ， 1 9 9 4 ，1 9 9 6 ；s l u s a r e w i c ze ta 1 ，1 9 9 4 ；b a r re ta 1 ，2 0 0 1 ) 矛1 1 蛋白。脂类相互作用 ( b r e t s c h e r & m u n r o1 9 9 3 ；m u n r o1 9 9 8 ) ，通过回收和主流结合的机制，分拣到高 尔基体中的适当位置。高尔基体的鞘磷脂合成和从顺面到反面固醇浓度( 即双分 子层的厚度) 的增加，有助于依照跨膜域的长度区分跨膜成分( m u n r o1 9 9 8 ) 。因 此，合成的鞘磷脂从高尔基体中的输出，有利于它的生化和形态上的极性的建立 ( b r e t s c h e r m u n r ol9 9 3 ；h o l t h i u se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 高尔基体成分随着分泌物从t g n 离开高尔基体( o r c ie ta 1 ，1 9 9 7 ，1 9 9 8 ， 2 0 0 0 a ，b ) 。相对的顺行膜流与逆行膜流使得膜表面物质成分达到很好的动态平衡 ( l i p p i n c o t t s c h w a r t ze ta 1 ，2 0 0 0 ) 。尽管有这样的平衡，高尔基体结构仍然保持稳 定的形态和生化的极i 生( f a r q u h a r1 9 8 5 ；n i l s s o ne ta 1 ，1 9 9 3 ；o r c i e t a 1 ，1 9 9 8 ； l a d i n s k ye ta 1 ，1 9 9 9 ) 。高尔基体基质蛋白可能调整或维持高尔基体的极性( w a r d e ta 1 ，2 0 0 1 ；y o s h i m u r ae ta 1 ，2 0 0 1 ；p f e f f e r2 0 0 1 ) ，尽管有如此巨大的膜流存在 ( w h i t ee ta 1 ，2 0 0 1 ) ，基质拥有精细的自我组织和装配的特。 生( k i r s c h e re ta 1 ，2 0 0 0 ， m i s t e l i2 0 0 1 ) ，可以动态地维持高尔基体的坚固电荷( w a r de ta 1 ，2 0 0 1 ；m a r r ae ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。 高尔基体的识别与融合很大程度上依赖于膜融合过程：首先，囊泡在不同分 隔之间转运( 异型融合) ；其次，相同拷贝的融合( 同型融合) 以维持某一分隔 膜的边界。高尔基体异型融合受n s f ( n e t h y l m a l e i m i d es e n s i t i v ef a c t o r ) 的调控 ( m a l h o t r ae ta 1 ，1 9 8 8 ) ，同型融合可能受p 9 7 的调控，这两者都是高度保守的a a a a t p a s e ( p a t e l & l a t t e r i c h1 9 9 8 ) 。倘如封闭的膜上有其特异性的标记，那么分隔里 的内容自然不同。分割的识别部分程度上是由于s n a r e ( s o l u b l e n e t h y l m a l e i m i d es e n s i t i v ef a c t o r ( n s f ) a t t a c h m e n tp r o t e i n ( s n a p ) r e c e p t o r ) 家族蛋 白的同类相互作用的特异性而达到的( s c a l e se ta 1 ，2 0 0 0 ) ，即囊泡上单一的 v s n a r e 特异地与其同类的、受体膜上的t s n a r e 三个成分相互作用( p e l h a m 2 0 0 1 a ) 。这种相互作用被称为反一s n a r e 复合体或s n a r e 夹，将囊泡引导至靶膜 上，或是引起自发的膜双分子层融合( c h e ne ta 1 ，1 9 9 9 ；m c n e we ta 1 ，2 0 0 0 ) ，或是 4 中国科学技术大学博士学位论文 向下游成分发出信号而直接催化融合( u n g e r m a n ne ta 1 ，1 9 9 8 ；p e t e r se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 然而，特异性是受囊泡拴系调节的，这是融合之前的、独立于s n a r e 的另一过 程，它需要一些膜外周蛋白的活性，如长的纤维状蛋白或大的多蛋白复合体，并 且受r a b g t p a s e 调节( z e r i a la n dm c b r i d e2 0 01 ) 。 转录网络可以感受到对于细胞器功能需求的波动，引起编码相应蛋白的基因 表达的改变，从而达到细胞器成分合成的同步增j j h ( n u n n a r i w a l t e r1 9 9 6 ) 。例 如未折叠蛋白反应( u p r ，u n f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s e ) ，在内质网腔中，跨膜激酶 i r e l p 的腔内域感受到未折叠蛋l 刍( p a t i l & w a l t e r2 0 0 1 ) ，将这一信息传递到细胞质 中，并直接促进转录因子h a c l p 的翻译，而h a c l p 负责一系列补偿蛋白的上游调 控( t r a v e r se ta 1 ，2 0 0 0 ) ，包括内质网分子伴侣蛋白、转移装置、糖基化或脂类合 成的酶以及所有分泌途径中囊泡转运蛋i 刍( t r a v e r se ta 1 ，2 0 0 0 ) 。u p r 引起协调的 内质网高尔基体中蛋白质和膜的生物合成( c o xe ta 1 ，1 9 9 7 ；t r a v e r se ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 进一步说，与转录网络相似的过程在u p r 中可能调节内质网和高尔基体的生物合 成，并且与细胞体积的增加和细胞周期的阶段相一致。对于细胞体积的控制和增 加分泌的信号的精确了解，也许有助于阐明细胞器的生物合成是如何被引发和调 控的。 高尔基体是否能独立的产生? 如果在实验中使高尔基体膜几乎缺失，则新的 高尔基体膜可以非常缓慢地重新形成( f l i c k i n g e r1 9 6 8 ；z o r ne ta 1 ，1 9 7 9 ；m a n i o t i s a n ds c h l i w a1 9 9 1 ) 。相反，如果细胞质中的高尔基体膜完全缺失，尽管它们周围 或近或远处存在连续的膜系统，高尔基体基本上不再可能重新形成( p e l l e t i e re t a 1 ，2 0 0 0 ；k l u m p e r m a n2 0 0 0 ) 。分泌物，女h c d 8 和v s v g ，通常被包装进c o pi i 囊 泡，从内质网中出来，以v t c 的形式在微管上移动( p e l l e t i e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这些v t c 进一步成熟为c o pi p 1 1 5 阶段( p e l l e t i e re ta 1 ，2 0 0 0 ) ，在进入顺膜池之前最终成熟 ( s c a l e se ta 1 ，1 9 9 7 ；m a r r ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。然而在这种情况下，v t c 仍然停留在前一 阶段，可能是因为缺少顺高尔基体基质成分g m l 3 0 和g r a s p 6 5 ，而它们是促进 v t c 最后阶段成熟进入顺高尔基体膜池的( m a r r ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。如果先用b f a ( b r e f e l d i na ) 处理，使得高尔基体基质成分分散开来，当b f a 被洗掉时，高尔基 体在细胞质中可以重新形成( p e l l e t i e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。b f a 是一种真菌代谢物，它可 以阻止核苷变成a r f l g t p a s e ，并导致结合在高尔基体膜上的a r f i 和c o pi 的 中国科学技术大学博士学位论文 丢失( l i p p i n c o t t s c h w a r t ze ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这引起高尔基体自身的酶转移到内质网和 高尔基体基质蛋白分散在细胞质d o ( s e e m a n ne ta 1 ，2 0 0 0 a ) 。值得注意的是，洗净 b f a 后高尔基体的重新形成并不是前面所说的独立的生物合成，因为它是在已经 存在的高尔基体基质结构的存在情况下发生的( s e e m a n ne ta 1 ，2 0 0 0 a ) 。这样看高 尔基体似乎是可以自我复制和分割的自主性细胞器。 相反地，如果将靠近核的内涵体从细胞质中排出，它可以从来自早期内涵体 和细胞质因子的囊泡中独立地重新生成( s h e f f e ta 1 ，2 0 0 2 ) ，这与晚期内涵体来自 于早期内涵体是类似的( m e l l m a n1 9 9 6 ) 。这种细胞器膜系统独立组装的可能性的 不同，可能反映了与功能相连的结构复杂性的不同。因为高尔基体具有多种功能， 如糖基化和鞘磷脂的生物合成，以及分拣和内涵体的外排等，所以，像内涵体这 样的简单结构可以独立合成，而精细的高尔基体结构则需要自动复制和分裂。 因此，有效构建高尔基体的所有信息可能不只限于遗传物质中，而是有些外 部遗传信息存在于高尔基体结构中，或是在高尔基体膜池中预先存在模板，它可 以沉淀新合成的物质( l e w i n1 9 9 8 ) 。用去污剂抽提高尔基体膜后，高尔基体基质 成分中蛋白质的构架仍然存在( s l u s a r e w i c ze ta 1 ，1 9 9 4 ；n a k a m u r ae ta 1 ，1 9 9 5 ；f a t h e ta 1 ，1 9 9 7 ) ，它可能就是这种高尔基体模板( s e e m a n ne ta 1 ，2 0 0 0 a ，2 0 0 2 ；p f e f f e r 2 0 0 1 ：l o w e2 0 0 2 ) 。 二：前期 对于活细胞和固定的细胞的超结构和荧光分析，使我们可以深入了解在哺乳 动物细胞有丝分裂期高尔基体结构的动态变化。细胞分裂前期开始时，近核的紧 密堆积的高尔基体条带碎片化，形成许多小摞移动至围绕在核周围( l u c o c qe ta 1 ， 1 9 8 7 ；m i s t e l ia n dw a r r e n1 9 9 5 ；s h i m ae ta 1 ，1 9 9 7 ，1 9 9 8 ；z a a le ta 1 ，1 9 9 9 ；j o k i t a l oe t a 1 ，2 0 0 1 ) 。高尔基体的迁移与中心体的极向运动相符合，可能反映了这一阶段微 管在空间上的重新分布。高尔基体在中心体附近的分布依赖于完整的微管骨架， 且由动力蛋白( d y n e i n ) 维持( c o r t h e s y t h e u l a ze ta 1 ，1 9 9 2 ) 。用n o c o d a z o l e 阻断微 管，使得高尔基体碎片化成许多小摞，重新分布在细胞外围，一般接近于内质网 出口处( r o g a l s k ie ta 1 ，1 9 8 4 ；c o l e e ta 1 ，1 9 9 6 ；s h i m ae ta 1 ，1 9 9 8 ；h a m m o n d g l i c k2 0 0 0 ) 。事实上，由于y 一微管蛋白能够附着在高尔基体的胞质面，所以高尔 中国科学技术大学博士学位论文 基体可以为微管组装成核，这强调了前期高尔基和中心体迁移之间的密切关系 ( c h a b i n b r i o ne ta 1 ，2 0 01 ) 。 。 三：前中期到后期：有丝分裂高尔基体簇( m g c ) 作为高尔基体遗传单元 中期开始后核附近的高尔基体的命运成为最近讨论的主题( s h i m ae ta 1 ，1 9 9 7 ， 19 9 8 ；j e s c h & l i n s t e d t19 9 8 ；f a r m a k ie ta 1 ，19 9 9 ；z a a le ta 1 ，19 9 9 ；p r e s c o t te ta 1 ， 2 0 0 1 ；j o k i t a l oe ta 1 ，2 0 0 1 ；j e s c he ta 1 ，2 0 0 1 b ) 。前中期开始时，核附近的高尔基体 碎片化成为散布排列的管状囊泡簇，称为m g c s ( m o t o t i cg o l g ic l u s t e r s ) ( l u c o c q e ta 1 ，19 8 7 ，19 8 9 ；l u c o c q w a r r e n19 8 9 ；p y p a e r te ta 1 ，19 9 3 ；m i s t e l i & w a r r e n 1 9 9 5 ；s h i m ae ta 1 ，1 9 9 7 ，1 9 9 8 ；z a a le ta 1 ，1 9 9 9 ；j o k i t a l oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。这一形态改变 与高水平的c d k l 激酶活性相一致，同时c d k l 促使核膜解体和微管重构( n i g g 2 0 0 1 ) 。高尔基体同源或异源的融合过程可以改变从堆积的高尔基体膜池n d , 管 和囊泡簇的动态平衡，而分裂期高尔基体的碎片化恰好抑制了这一过程( w a r r e n 1 9 9 3 ) 。m g c s 确切的形态组成在不同类型的细胞中不同。在h e l a 细胞( l u c o c qe t a 1 ，1 9 8 7 ) ，p t k - 1 细胞( s c h r o e t e re ta 1 ，1 9 8 5 ) ，腮腺细胞( t a m a k iy a m a s h i n a1 9 9 1 ) ， n r k 细胞( b u r k ee ta 1 ，1 9 8 2 ；s e e m a n ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 矛i 甲状腺上皮细胞 ( z e l i g s w o l l m a n1 9 7 9 ) ，这些小簇由直径为5 0 7 0n m 大小的囊泡组成；而在l 9 2 9 成纤维 细胞( m o s k a l e w s k i & t h y b e r g1 9 9 0 ) ，黑素瘤细胞( m a u l &