（细胞生物学专业论文）可逆乙酰化对酵母ssa4基因转录调控的分子机制研究.pdf

摘要 真核生物与原核生物基因组结构的最大差别是真核生物的基因组紧密压缩和包装 在染色质结构中。染色质的高级结构是真核生物基因转录进行的障碍，为了使基因转录 正常进行，核心组蛋白的结构必须发生改变。近年来人们发现了能够通过改变染色质构 型来影响( 活化或抑制) 基因转录的蛋白质复合物，统称为核小体重塑复合物( n u c l e o s o m e r e m o d e l i n gc o m p l e x e s ) 。g c n 5 ( g e n e r a lc o n 仃o ln o n d e r e p r e s s i b l e5 ) 是s a g a 这种在酵母中主 要的转录相关h a t 复合物的接触反应亚基，主要的作用靶位为组蛋白h 3 ，通过乙酰化修 饰发挥重要作用。我们选取h s p 7 0 家族船刃基因，通过r e a l t i m er t - p c r ，染色质免疫沉 淀，免疫共沉淀，r t - p c r 等实验技术进行分析证明组蛋白乙酰转移酶g c n 5 可以结合到 s s a 4 基因的启动子区，通过调控启动子区组蛋白h 3 的乙酰化水平，对基因的转录调控发 挥作用。并且我们发现，h d a c 也参与了黜卅基因的转录调控，在t s a 处理的野生型菌 株和组蛋白去乙酰化酶缺失突变菌株中检测船觯基因的表达情况，证明酵母中组蛋白去 乙酰化酶r p d 3 对甜口彳基因的表达具有明显的调控作用。总之，可逆的组蛋白乙酰化修饰 对船口4 基因的转录调控具有十分重要的作用。组蛋白乙酰转移酶g c n 5 直接参与了黜卅基 因的转录调控，它与组蛋白去乙酰化酶的拮抗作用决定了舳卅基因的转录状态。本论文 对热休克基因船卅转录调控的研究，为进一步深入探讨其转录机理提供了有价值的实验 证据。 关键词：组蛋白乙酰化修饰；g c n 5 ；转录；s s a 4 基因；组蛋白去乙酰化 a b s t r a c t t h ee u k a r y o t i cg e n o m ei sp a c k a g e di n t oc h r o m a t i n ，w 1 1 i c ha c t sa sac o n s t a l l tb a m e rt o t r a n s c r i p t i o na i l do m e rc e l l u l a rp r o c e s s e st h a tr e q u i r ea c c e s st od n a t h e r e f o r et h es t r l l c t u r e o fc h r o m a t i nh a st 0b em o d i f i e db e f o r ea c t i v et r a i l s c r i p t i o nc a j lp r o c e e d g c n 5 ( g e n e r a l c o n t r o l n o n - d e r 印r e s s i b l e5 ) i st h e c a t a l y t i c s u b u n j to fs a g a ( s p t a ( k g c n 5 一a c e t y l t m s f e r a s e ) ， ai n 勾o rt i 独s c r i p t i o n r e l a t e dh a tc o m p l e xi n y e a s t h i s t o n eh 3i st h ep r i m a 巧t a 唱e tf o rb o t ho fm ec o m p l e x ，a n dt h ec o n l p l e xd i s p l a ys i g n i 6 c a n t 如n c t i o r 谢r e d u n d a n c y w ec h o s e 黜口4 a l sm et a 唱e tg e n ef o rb i o c h e m i c a la 1 1 dm o l e c u l a r s t u d i e s o l l rr e s u l t si n d i c a t e dt h a th i s t o n ea c e t y l a t i o nw a sr e q u i r e df o rm es s 口4t r m s c r i p t i o n a c t i v a t i o n h i s t o n ea c e t y l t m s 诧r a s e s ( h a n ) g c n 5a f j 陷c t e d s 船口彳g e n et m s c r i p t i o na i l di t s h a t a c t i v i t yw a sr e q u i r e df o rt l l e 缸1 c t i o no fr e g u l a t i n gt r a i l s 嘶p t i o n t l l et i i a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o r y 缸1 c t i o no fg c n 5w a sd i r e c tb e c a u s ei tc o u l db er e c n l i t e dt 0 船卅g e n e t h eh a t s m o d u l a t e dt 1 1 et r a n s c 订p t i o no f 船口4g e n e st h r o u 曲a f l e c t i n gt h ea c e t y l a t i o ns t a t u so fl l i s t o n e h 3 o u rd a t aa l s os h o w e dt h a tt h em i a1 e v e lo f 舳口4g e n ew a si n c r e a s e di nt h ec e l l st r e a t e d w i t ht s ao rt h ec e l l sw i t ht h ed e l e t i o no f1 1 i s t o n ed e a c e t y l a s e s ( h d a c s ) ，i n d i c a t i n gt h a t h d a c sw e r ei n v 0 1 v e di nm et r 舭s c r i p t i o no f 船口4g e n e d a t ap r e s e n t e di nt h i sr e p o r tp r o v i d e 如r t h e ri n s i g h tm t oa i l dd i r e c te v i d e n c eo fm ef 叽c t i o n so fg c n 5i l l 蚴鼬口4g e n e 仃i m s c r i p t i o n a l i ny e a s t k e yw o r d s ： l l i s t o n ea c e t y l a t i o n ；g c n 5 ；t r a l l s c r i p t i o n ；s s a 4 9 e n e ；m s t o n ed e a c e t y l a t i o n h 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所 取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均 己在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：孚l 篷l 日期：卫巳土j l 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学 位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全 文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版 发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：蕴：重厘1 日 期：! 足：【：迓 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名： 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 引言 一、本论文的研究背景和立题依据 g c n 5 ( g e n e r a l c o n t r o l n o n r e p r e s s e dp r o t e i n5 ) 是1 3 n a t (g c n 5 一r e l a t e d n a c e t v l t m s f e r a s e ) 家族的一种典型的组蛋白乙酰转移酶，它对于一些基因的转录是必 需的【1 0 9 。1 1 3 】，在酵母中包括三个结构域：n 末端的结构域，h a t 结构域和c 末端的溴 区( b r o m o d o m 咖) 。其中c 末端的溴区( 与a 抛相互作用的区域) 和h a t 结构域 ( 在体内进行受体介导的转录激活的区域) 是酵母g c n 5 的功能结构域。g c n 5 可以使 启动子区的组蛋白乙酰化，通过使启动子区的染色质结构松散或者为转录因子的招募 提供特异的结合位点来促进转录的进行【l 9 。 h s p 是一组可溶的胞内蛋白质家族，具有“分子伴侣”活性。却基因与其所编码的 蛋白质存在于所有细胞的整个生命活动中，在胞内有不同的定位，包括原核生物的细胞 质和真核生物的细胞质、细胞核、内质网( e r ) 、线粒体和叶绿体。热休克蛋白的基因表 达调控是一种特殊的调控模式，在基础水平和诱导水平两个层次上进行调节。在热休克 基因的表达调控过程中，组蛋白乙酰化修饰的作用以及染色质构型的变化情况还不明 确。何种h a t 和h d a c 参与了办s p 基因的表达? 组蛋白乙酰化修饰在热休克基因表达调控 中的作用机制是什么? 这一系列的问题尚需进一步的研究。 二、本文的研究内容和意义 本论文拟在已有的工作基础上，利用染色质免疫沉淀，免疫共沉淀，r 1 伸c r 等实 验技术进行分析，首先确定g c n 5 能否调控船卅基囱7 的表达，是否通过参与组蛋白的乙 酰化修饰，从而在分子水平上了解组蛋白乙酰转移酶、染色质修饰和各种转录相关因子 与却基因表达的关系，阐明组蛋白乙酰转移酶参与却基因表达调控的机制。为进一 步的研究提供了依据。 东北师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 一、染色质重塑与转录调控 大量研究表明真核生物的染色质结构在转录调控中起重要作用。目前己发现了两类 高度保守的能改变染色质结构的复合物：( 1 ) 组蛋白修饰酶类重塑复合物和( 2 ) 依赖 a t p 的染色质重塑复合物。早在三十多年以前，人们就已经知道组蛋白赖氨酸残基的乙 酰化与转录激活有关。最近的研究表明，许多转录调控子( t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r s ) 是组蛋白乙酰转移酶或组蛋白去乙酰化酶。与d n a 特异结合的转录因子招募组蛋白乙酰 转移酶和去乙酰化酶到启动子处，从而激活或抑制转录。这些结果有力地支持了这样的 结论，即：组蛋白乙酰化和去乙酰化在转录调控中起重要作用。最近也发现了依赖a t p 的染色质重塑复合物参与转录调控的分子机制。另外，人们已经发现一些依赖a t p 的染 色质重塑活动与组蛋白去乙酰化酶有关。在到目前为止研究过的复合物中，依赖a t p 的 染色质重塑复合物增强了组蛋白去乙酰化酶的活性。这表明这两类复合物能够协同作用 来完成对转录的精确调控。 ( 一) 核小体结构和转录 真核生物细胞核中的d n a 被包装成高度有序的染色质结构。染色质的基本结构单位 是核小体。核小体是由1 4 6 b p 的d n a 缠绕组蛋白八聚体而形成的。组蛋白八聚体包括h 2 a ， h 2 b ，h 3 和h 4 各两个分子。核小体、连接d n a 和组蛋白h 1 组成了染色质的基本重复单 位。核小体阵列( a r r a y s ) 进一步包装成高度有序的染色质结构。染色质包装的结果之 一是阻止调控转录的d n a 结合蛋白与启动子接近。生化和遗传证据表明核小体通常是抑 制转录的。然而，染色质结构是动态的，它经历重塑后导致转录的激活或抑制。近年 来人们发现了一类能够通过改变染色质构型来影响( 活化或抑制) 转录的蛋白质复合因 子，统称为核小体重塑复合物( n u c l e o s o m er e m o d e l i n gc o m p l e x e s ) 。目前了解得比较 清楚的染色质重塑复合物主要是以下两大类起不同作用的蛋白质家族。 ( 二) 组蛋白修饰酶类重塑复合物 组蛋白的翻译后修饰所引起的染色质结构的改变在真核生物基因表达调控中发挥 着重要的作用，这些修饰包括组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等乜1 。其中研 究得最清楚的是核心组蛋白尾部的乙酰化。早在三十多年以前，人们就把组蛋白乙酰化 和真核细胞的转录激活联系在一起口1 。乙酰化发生在核心组蛋白氨基末端尾部保守的赖 氨酸残基上，例如h 4 的第8 位和第1 6 位赖氨酸，h 3 的第9 位和第1 4 位赖氨酸等。乙 酰化是怎样使d n a 更易于接近转录因子的目前还不十分清楚，流行的观点是组蛋白乙酰 化中和了其氨基末端赖氨酸残基的正电荷，削弱了组蛋白与d n a 的亲和力；另外，组蛋 白乙酰化也可能作为一种信号，改变相邻核小体上组蛋白与组蛋白间的作用以及组蛋白 和转录因子间的作用。这其中任何一种改变均可能影响核小体的结构，产生一个更加开 放的染色质环境，有利于转录因子的结合，从而促进转录h 1 。核心组蛋白n 一端尾部赖氨 2 东北师范大学硕士学位论文 酸残基的乙酰化修饰是可逆的，组蛋白去乙酰化酶( h d a c ) 可修饰组蛋白的去乙酰化， 导致染色质集缩，并抑制基因的转录。 ( 三) 依赖a t p 的重塑复合物 这是一类能够改变核小体结构的蛋白质复合物，它们的活性依赖于a t p 的水解。其 中有的被证实可以通过增强核小体d n a 与转录装置的可接触性而激活转录。依赖于a t p 的重塑复合物被称为s w l 2 s n f 2 复合物。已鉴定的s w l 2 s n f 2 复合物有四类：s w i s n f ， i s w i ，c h d 和i n 0 8 0 畸1 。在s w i s n f 和i s w i 两类的s n f 2 区的c 一末端或者有一个溴区或 者有一个s a n t 区。在c h d 类复合体的n 一末端有两个相邻的染色区。i n 0 8 0 类除了s n f 2 区没有任何保守的基序，而且s n f 2 区有一个很长的插入序列。 尽管目前对依赖a t p 的重塑复合物作用的确切机制尚不完全清楚，但已获得了一系列有 意义的信息。w o r k m a n 和k i n g s t o n 7 提出了依赖a t p 的重塑复合物作用的3 种方式：( 1 ) 重塑复合物水解a t p 产生能量使其在d n a 链上移动的同时使d n a 与核小体产生位移 ( t r a n s l o c a t i o n d e p e n d e n tr e m o d e l i n g ) ；( 2 ) 使d n a 在组蛋白核心上的缠绕路径改 变但不影响核心的构型( r e m o d e l i n go fd n ac o n t a c t s ) ；( 3 ) 改变组蛋白核心从而改 变d n a 一组蛋白的接触方式( r e m o d e l i n go fo c t 锄e rs t r u c t u r e ) 二、组蛋白密码假说( h i s t o n ec o d eh y p o t h e s i s ) 在核心组蛋白的n 一端尾部含有2 5 4 0 个保守的氨基酸残基，并游离于核小体之外。 对核心组蛋白n 一端尾部的转录后修饰有很多种，其中包括乙酰化，磷酸化，泛素化，甲 基化和a d p 核糖基化等等。1 9 6 4 年，a 1 l f r e y 等人口3 首次发现，进行活跃转录的常染色质 的核心组蛋白是高度乙酰化的，而转录不活跃的异染色质的核心组蛋白是低乙酰化的， 由此推测，核心组蛋白n 一端尾部的乙酰化和去乙酰化与转录活性密切相关。目前已证实， 在真核细胞中存在着两类酶复合物一组蛋白乙酰转移酶( h i s t o n ea c e t y l t r a n s f e r a s e s ， h a t s ) 和组蛋白去乙酰化酶( h i s t o n ed e a c e t y l a s e s ，h d a c s ) 哺13 1 。这两类酶复合物通 过对核心组蛋白进行可逆修饰来调节核心组蛋白n 一端尾部的乙酰化水平，从而调控转录 的起始等过程。 1 组蛋白乙酰基转移酶和去乙酰化酶 1 1 组蛋白乙酰基转移酶的分类 人们很早就已经注意到乙酰化与基因活化有着密切的关系。h e b b e s 等人n 钔发现乙酰 化的组蛋白主要分布在对d n a s e i 敏感的染色质区。组蛋白的高乙酰化是活跃转录的标志 乜射。组蛋白的乙酰化过程是一个与基因活性诱导和抑制密切相关的动态过程，高乙酰化 标志活跃转录而低乙酰化则与转录抑制相关n 5 一引。 东北师范大学硕士学位论文 表1 1 乙酰转移酶家族 家族名称家族成员作用底物 g c n 5重组的g c n 5 对游离组蛋白h 3 ( 1 4 ) 作用较强，对h 4 ( 8 ，1 6 ) 作用较弱，对核小体组蛋白无作用 超家族p c a f 重组的p c a f 主要乙酰化h 3 ( 1 4 ) ，h 4 ( 8 ) + 作用弱，对游离 和核小体内组蛋白均有作用；还可乙酰化m i g l 7 ，m i g i ( y ) ， 激活因子p 5 3 ，t a t ，转录因子t f i 工e 和t f i i f 等非组蛋白 h a t lb 型h a t ，在体外可乙酰化h 4 ( 1 2 ) e l p 3重组产物乙酰化所有四种核心组蛋白 h p a 2在体外实验中优先乙酰化h 3 ( 1 4 ) ， h 4 p 3 0 0除可强烈乙酰化四种组蛋白外，对h m g i ( y ) ，激活因p 5 3 ， p 3 0 0 c b pc b pg a t a 一1 ，核受体共激活因子s r c 一1 ，a c t r ，t i f 2 ，t f i i e 和 t f ii f 等均起作用 s a s 2在体外实验中，s a s 3 可强乙酰化游离组蛋白h 3 ，h 4 ，对h 2 a s a s 3 作用弱 家族 e s a l 在体外可乙酰化游离组蛋白h 2 a ，h 3 和h 4 ，对h 4 ( 5 ) 4 作用较 强，不能乙酰化核小体组蛋白 m o f 在体外对h 4 作用较强，对h 2 a 和h 3 作用较弱 t i p 6 0重组的t i p 6 0 可乙酰化游离的h 2 a ，h 3 和h 4 ，对核小体组蛋 白作用较弱 m o z在体外，m o r f 优先乙酰化h 3 和h 4 ，更适于乙酰化核小体中 m o r f 的组蛋白 h b 0 1游离的h 3 ，h 4 ，对核小体组蛋白作用弱 s r c l重组的s r c 一1 既可乙酰化游离的组蛋白h 3 ，h 4 ，又可乙酰化 核受体共核小体中的h 3 ，h 4 激活因子a c t r重组的a c t r 既可乙酰化游离的组蛋白h 3 ，h 4 ，又可乙酰化 核小体中的h 3 ，h 4 t i f 2具有潜在的h a t 活性 t a f i 1 2 5 0在体外实验中可乙酰化h 3 ( 1 4 ) + 和h 4 在体外既可乙酰化游离的组蛋白h 3 ，h 4 ，h 2 a 又可乙酰化核 t f 工i i c j 、体中的h 3 ，h 4 ，h 2 a 尽管人们很早就发现了乙酰化与基因活跃转录的关系，但由于一直未能找到乙酰转 移酶，因此对乙酰化参与基因转录机制的了解十分有限。1 9 9 6 年，b r o w n e l l 等人研究出 一种新的蛋白质分离方法，并以四膜虫核提取物为实验材料，首次分离得到了组蛋白乙 酰转移酶一c n 5 。现在，研究者们已从酵母n ，果蝇n 8 l ，玉米n 叫等生物体中分离得到 了不同的乙酰转移酶( 详见表1 1 ) 。并依据其分布特点分为a 型和b 型乙酰转移酶。a 型 4 东北师范大学硕士学位论文 乙酰转移酶分布在核内，主要参与基因转录。b 型乙酰转移酶主要分布在细胞质中，乙 酰化新合成的游离组蛋白1 。组蛋白乙酰转移酶按其结构特点可分为不同的家族( 见表 1 1 ) 。它们在组蛋白尾部的作用位点见图1 1 1 2 组蛋白乙酰基转移酶复合物 在已经鉴定和分离的h a t 中，许多重组的h a t 在体外实验中只能够乙酰化游离的 组蛋白，对组装在核小体中的组蛋白却没有乙酰化作用。这些现象表明在体内存在其他 因子参与核小体组蛋白的乙酰化。它们通过与h a t 的相互作用，来调节酶与底物的特 异性识别。近年来，一些乙酰基转移酶复合物的发现证实了这一推测【2 。现将已分离得 到的乙酰基转移酶复合物总结如表1 2 。 表1 2 乙酰基转移酶复合物的种类及组成 2 组蛋白去乙酰化酶的分类 2 1 组蛋白去乙酰化酶的种类 二十世纪七十年代，研究者利用一种去乙酰化酶的抑制剂，首次在酵母中发现了两 种组蛋白去乙酰化酶h d a l 和r p d 3 ，它们都是一种转录负调控因子【2 2 1 。目前已有很多种 类的h d a c 在不同的物种中被鉴定出来。根据它们与酵母h d a c 的同源性，将其归为三 大类：与酵母的r p d 3 相关的h d a c 被称为c 1 a s sih d a c ；与酵母的h d a l 相关的h d a c 被 称为c l a s si ih d a c 。这两类组h d a c 的活性都受到组蛋白去乙酰化酶抑制剂的抑制作用 【2 3 1 。第三类是与酵母中的转录沉默因子s i r 2 同源的类s i r 2h d a c ，它与前两类h d a c 在 序列的结构和催化机制上有很明显的差别【2 4 1 。组蛋白去乙酰化酶的分类参考表1 3 。 东北师范大学硕士学位论文 表1 3 组蛋白去乙酰化酶家族，改自s a n t o s r o s a 【5 3 】 2 2 组蛋白去乙酰化酶复合物 组蛋白去乙酰化酶h d a c l 和h d a c 2 是研究较深入的两种h d a c 。目前已经鉴定 出三个含有h d a c l 和h d a c 2 的组蛋白去乙酰化酶复合物，分别为s i n 3 ，n u r d 和 c o r e s t 复合物【2 5 1 。s i i l 3 复合物中的核心由h d a c l 2 和组蛋白结合蛋白i a p 4 6 4 8 组 成，它们无论在体内还是在体外，都是稳定相连的【2 6 1 。n u r d 复合物的核心与s i n 3 复 合物中的核心相同，都由h d a c l 2 和r b a p 4 6 4 8 组成，另外该复合物中还有m t a 2 ， c h d 3 和c h d 4 蛋白。c o r e s t 复合物中也含有h d a c l 2 ，但不含有r b a p 4 6 4 8 ，而是另 外含有c o i 也s t 和p 1 1 0 。 除了h d a c l 和h d a c 2 外，其它一些h d a c 也存在于组蛋白去乙酰化酶复合体和 辅抑制因子蛋白复合体中。目前的研究表明，h d a c 3 ，4 ，5 和7 相互作用，直接与核 辅抑制因子n c o r 和s m r t 相关【2 7 - 3 0 1 。而h d a c 4 ，5 和7 具有共同的n 末端延伸，可 直接与m e f ( m y o c y t ee n h a n c i n gf a c t o r ) 家族转录因子的m a d sb o x 区相作用【3 1 。3 引。目 前已知的组蛋白去乙酰化酶复合物的种类及组成见图1 4 。 6 东北师范大学硕士学位论文 m ) a c l 2 j s i n 3 复合物n u r d 复合物 c 0 r e s t 复合物 m e c p 2 i k a r o s r e s t n c o i u s m r t m a d l r e s t z n f 2 1 7 皿a c 3 j n c o r s m r t h d a c 3 m e f 2 图1 4 真核生物的组蛋白去乙酰化酶复合物 总之，h a t 对组蛋白的乙酰化可中和组蛋白上的正电荷，使d n a 结构更加松散、 开放。因此，转录因子、调节因子复合物和i a 合成酶可更加接近d n a ，使基因更 加容易表达其活性。而h d a c 的作用相反，它可通过对组蛋白去乙酰化，使d n a 结 构更加紧密，从而抑制某些基因的转录表达。h d a c 除通过对组蛋白去乙酰化来抑制 基因的表达，它还可同时对转录因子如p 5 3 、g a t a 2 1 、t f e 和t fi i f 进行去乙酰 化作用，调节基因的表达。h d a c 还可参与细胞周期的调控，其中i m 对转录因子e 2 f 的转录抑制就是通过募集h d a c l 和h d a c 2 来实现的。 三、热休克蛋白及h s p 7 0 家族简介 ( 一) 热休克蛋白简介 1 热休克蛋白的发现 热激蛋白h e a ts h o c kp r o t e i n ( h s p ) 又称热休克蛋白或应激蛋白( h e a ts t r e s sp r o t e i n ) ， 是细胞在应激原( 如高温) 刺激下所生成的一组蛋白质。h s p 首先是在果蝇体内发现的， 1 9 6 2 年，砌t o s s a 发现，若将果蝇的培养温度从2 5 升高到3 0 ，3 0 分钟后就可在多丝染 色体上看到蓬松现象( 或称膨泡p u f ) 。表明这些区域基因的转录加强并可能有某些蛋 白质合成的增加【3 5 】。1 9 7 4 年，t i s s e r e s 从热激果蝇幼虫的唾液腺等部位分离到6 种新的蛋 白质，即h s p 【3 6 1 。1 9 9 2 年h o 刑池提出h s p 是一种分子伴侣的理论【3 7 1 。 2 热休克蛋白的分类 h s p 的分类一般按其相对分子量、结构及其功能可分为：h s p l l o 、h s p 9 0 s 、h s p 7 0 、 h s p 6 0 和分子量在1 5 3 0 k d 之间的s h s p ( s m a l lh s p ，低分子量热激蛋白) 3 8 】五个家族。也 有研究者按相对分子质量的大小及同源程度将热激蛋白分为h s p 9 0 、h s p 7 0 、小分子h s p 及泛素4 个家族【3 9 1 。除热激外，正常状态的细胞中表达的h s p 是组成型的，称为h s e ( h e a t 7 m k 眦 东北师范大学硕士学位论文 s h o c kc o 印a t ep r o t e i n s ) 。h s e 和诱导型h s p 在结构和功能上很难区分，统称h s p 。此外， u b i ( u b i q u i t i n ，遍在蛋白) 和p d i ( p r o t e i nd i s u l t h j d e i s o m e r a s e ，蛋白质二硫键异构酶) 也 被认为是热激蛋白。 3 热休克蛋白的生物学功能 h s p 是一组可溶的胞内蛋白质家族，具有“分子伴侣 活性。却基因与其所编码 的蛋白质存在于所有细胞的整个生命活动中，在胞内有不同的定位，包括原核生物的细 胞质和真核生物的细胞质、细胞核、内质网( e r ) 、线粒体和叶绿体。h s p 占正常总胞内 蛋白质的5 ，但在应激状态下能升高到1 5 或更多。h s p 作为高度保守的“分子伴侣 ， 在细胞内广泛地参与许多复杂的功能活动。h s p 的生物学功能广泛性不仅表现在应激条 件下维持细胞必需的蛋白质空间构象， 保护细胞生命活动，确保细胞生存；而且在蛋 白质聚集折叠、跨膜运输和转位、细胞骨架及核骨架稳定等方面也发挥着重要调节作用。 它们参与细胞凋亡、热耐受、免疫调控、抗肿瘤及病毒感染等病理生理过程，进而从多 个方面影响着生物体寿命的长短。主要h s p 家族及其功能见表1 5 。 表1 5 主要h s p 家族及其生理功能【4 0 】 泛素泛素蛋白质降解 蔷羹了眢妻羔鎏霍霎詈 ( 二) 热休克蛋白的表达调控 热休克蛋白的表达调控是一个精细而复杂的过程。其基因表达包括基础水平表达和 诱导表达两个层次，代表了一类转录调控方式，是研究真核基因转录调控的一个良好模 型。 1 热休克基因的顺式作用元件 热休克基因的顺式作用元件包括g a g a 元件、h s e 和启动子。其中g a g a 元件和 h s e 是影响热休克基因表达的两个重要元件。g a g a 元件由一些( c t ) n ( g a ) n 重复序列 组成，它的缺失会减弱t f 。d 和h s f 与相应序列的结合，造成停顿的i 蝌a 聚合酶i i 水 平的降低，影响f z s 口基因的基础表达和诱导表达【4 1 4 2 1 。h s e 存在于热休克基因的上游 片段中，是数个反转重复的n g a a n 五核苷酸核心序列的组合，其中n 代表在进化上保 r 东北9 币范大学硕士学位论文 守性较差但很重要的碱基，具有增强子的作用。h s e 至少含有两个n g a a n 单位才对h s f 具有较强的结合力，其连接方式可以是头一头相连( n g a a n n t t c n ) 或尾一尾相连 ( n t t c 皿g 心1 ) 。热休克基因的启动子区通常包括t a t a 盒、g c 丰富区和c a a t 盒三 种元件。在正常生理条件下，热休克基因的基础水平的表达是由启动子区介导的。启动 子区的任何一个元件的存在均可维持j z 印的基础水平表达。在应激状态下，转录是通过 h s e 和启动子区共同作用活化的。 2 热休克基因的反式作用因子 除通用转录因子外，g a g a 因子和h s f 因子是坳基因表达的两个主要的反式作 用因子。g a g a 因子是一种通用的、组成型表达的转录因子，在热休克基因和其他一些 与发育相关基因的5 上游序列中较常见。在热休克基因表达中，g a g a 因子通过与 g a g a 元件的结合在启动子区建立开放的染色质结构，破坏其下游的核小体结构，使其 下游序列中的启动子迅速与对蛆聚合酶i i 形成转录起始复合物。该复合物向下游转录 约2 5 b p 左右遇到尚未破坏的核小体结构而停止转录并停顿在该处，形成一个局部开放 的启动子状态。g a g a 因子在染色质结构水平加强它的功能，有助于维持开放的启动子 状态。对j l z 印7 d 启动子序列的分析表明g a g a 因子与n u r f 相连，可以体外打破组装 的染色质模板，染色质结构的打破依赖于g a g a 因子与g a g a 元件的结合【4 五删。g a g a 因子通过重塑染色质以利于其它转录因子与相应调控序列的结合( 这些因子本身不能穿 过核小体结构，如h s f ) 。 h s f 因子也称为热休克因子，在热休克基因的诱导表达中起关键性的作用【4 5 1 。在 正常的生理条件下，h s f 在细胞质内以单体的形式存在，通常与泛素小分子或h s p 结合， 没有诱导活性。热激时，h s f 与泛素或h s p 蛋白分离，单体被磷酸化，形成三聚体，获 得较高的d n a 结合活性，与却基因上游的h s e 序列稳定结合，诱导却基因的快速 转录。 3 组蛋白乙酰化修饰与j i l 印基因表达调控的关系 由于向印基因表达调控的特殊模式，组蛋白乙酰化修饰在其表达过程中的作用一直 以来受到国内外研究者的关注。 g a r c i a b e m e i o 等人【4 6 】以u 9 3 7 细胞为材料，研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁 酸盐除了可以诱导细胞分化、凋亡外还可以诱导却加基因的表达。加入c a m p 促进剂 ( c a m p i n c r e a s i n ga g e n t s ) 可以抑制丁酸盐诱导的办印加基因的表达。比较c a m p 促进 剂对c a c l 2 诱导的却加基因的影响，他们认为丁酸盐诱导的却加基因的表达并不是 因为乙酰化对基因表达的影响而是由于丁酸盐作为一种胁迫因子造成的。d e c k e r t 等人【4 7 l 在酵母中的研究发现在热激情况下，不同启动子处的乙酰化水平并不相同。h s f 活化的 却舵和枷舛启动子处的组蛋白乙酰化水平下降，而且与启动子交联的总组蛋白量也 发生下降。他们认为这一现象是由于热休克基因的转录因子占据了启动子处，造成核小 体缺失的结果。由此，他们认为不同的转录激活因子在不同的启动子上的作用形式是不 同的，乙酰化并不是转录激活的必要条件。 与前面的研究者不同，另一些研究者通过不同的实验材料和方法观察到了不同的实 9 东北师范大学硕士学位论文 验现象。n i 曲t i n g a l e 等人【4 8 发现热休克因子h s f 与乙酰化的染色质的结合能力明显高 于与未乙酰化的染色质的结合能力。l i 等人【4 9 】在爪蟾卵中的研究发现却加重要的转录 因子n f y 可以与转录辅激活因子p 3 0 0 相互作用，并将p 3 0 0 招募至启动子处。o v a k i m 等人【5 0 】发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理可提前爪蟾发育过程中却3 d 的表达时相。最 近的研究表明组蛋白乙酰基转移酶c b p 作为染色质修饰复合物t a c l 的主要成员参与 了果蝇热休克基因的表达调控【5 1 1 。由此可见，组蛋白乙酰化修饰与热休克基因表达的 关系逐渐明确，但组蛋白乙酰化修饰在热休克基因表达调控中的作用以及乙酰化修饰与 其他组蛋白修饰的关系还不清楚，有待于进一步探讨。 ( 三) h s p 7 0 家族研究简介 1 h s p 7 0 家族的分类及生物学特性 h s p 7 0 家族( 分子量为7 2 k d a 8 0 k d a ) 成员最多，共有2 1 种蛋白质，是一组在进化上 高度保守的热休克蛋白。大致可分为以下4 种：第1 种是h s p 7 0 ，也称为h s p 7 2 ，通常在正 常细胞中并不表达或表达量很少，但是在热应激或其它应激原的作用下，表达迅速增加， 属于诱导型h s p 7 0 ；第2 种为h s c 7 0 ( h e a ts h o c kc o 印a t e7 0 ) ，也称为h s p 7 3 ，是哺乳动物细 胞内的结构蛋白，在所有的细胞内均能表达，并且受热诱导，属于结构型h s p 7 0 ；第3 种是g r p 7 8 ( g l u c o s e r e g u l a t e dp r o t e i n7 8 ) ，这种蛋白存在于内质网腔内；第4 种是g r p 7 5 ， 主要位于线粒体内；g i 心7 8 和g r p 7 5 在应激时稍有表达，它们在细胞内分别以分子伴侣 的形式发挥作用。 h s p 7 0 家族具有以下生化特点：它们的氨基端具有弱的a t p a s e 活性，与肌肉的肌 动蛋白结构很相似；当a t p a s e 被激活时，可与伸展的多肽结合；还可以保护各种酶 免受热损伤，使聚合的蛋白质解聚1 5 2 1 。 2 h s p 7 0 家族的基因结构及特点 脚7 0 基因没有内含子，转录一旦启动就可产生出成熟的训刚a 来快速表达h s p 7 0 ， 防止应激原对h s p 7 0m r n a 前体的影响，从而保证了机体对h s p 7 0 的需要。h s p 7 0 基因 在进化上具有高度保守性，人类h s p 7 0 氨基酸序列与果蝇h s p 7 0 氨基酸序列的同源性为7 3 ，与大肠杆菌诱导型h s p 7 0 ( 即d n a k ) 氨基酸序列的同源性为4 7 。 h s p 7 0 的结构主要由一个n 端高度保守的4 4 l a 的a t p a s e 功能域( a t pb i n d i n g d o m a i n ) 和一个分子量为2 5 k d a 的c 端区域组成。c 一端区域又可分为一个保守的1 5 k d a 的 多肽结合功能域和一个不保守的靠近c 端的1 0 k d a 的可变区功能域。s t e v e n s e n 等【5 3 j 还发 现h s p 7 0 中可能存在c a m 结合肽段，位于2 5 7 2 7 7 ，共2 1 个氨基酸残基，称为l t s 。比 较各种生物的l l t s 序列发现l t s 是高度保守的。例如小鼠h s p 7 0 和人h s p 7 0 中l 1 序列完全 相同。 3 h s p 7 0 家族的生物学功能 3 1 分子伴侣功能 蛋白质的折叠过程需要一些辅助元件的参与，这些元件被称为分子伴侣( m o l e c u l a r c h 印e r o n e s ) 。分子伴侣本身不参与折叠的形成，而是通过减少不正确的折叠途径来加速 其翻转过程。h s p 7 0 也是这种分子伴侣之一，它参与蛋白质的折叠直至多肽的合成完成， 1 0 东北师范大学硕士学位论文 使蛋白质可以沿着折叠的通路进行，并以a t p 依赖的方式结合未折叠多肽链的疏水区以 稳定蛋白质的未折叠状态，再通过有控制的释放帮助其折叠。h s p 7 0 还具有帮助蛋白质 完成细胞内转移的功能：h s p 7 0 能够和一些细胞中的蛋白质结合，帮助这些蛋白质穿过 内质网腔或线粒体膜；并且细胞内有很多蛋白合成后即和h s p 7 0 暂时结合，以保证其适 宜的结构状态【5 引。 3 2 参与细胞耐热和细胞保护 在各种细胞器中，核仁和细胞膜对热特别敏感。h s p 7 0 广泛存在于细胞骨架和核骨 架内，与核仁和细胞膜结合，从而提高细胞对高温的耐受力。研究发现，通过热应激产 生的热耐受也伴随着对其它刺激因素如缺氧和低温的耐受，如果先用这些应激刺激处理 诱导h s p s 的产生同样也可以表现为对高热的耐受。也就是说，由一种应激诱导h s p s 表达 后，不仅产生对这种刺激的耐受，也对其它的刺激同样产生耐受。l e e 研究发现，h s p 7 0 的过量表达可以调节和抑制间质金属蛋白酶( m a t l 奴m e t a l l o p r o t e i n a s e s ，m m p s 应激时产 生的一种丝氨酸蛋白酶，能加速细胞死亡和组织损伤) 来减少细胞、组织在应激情况下 ( 缺氧) 的损伤【5 引。 3 3 抗细胞凋亡作用 有害应激如热应激、氧化应激等可以导致细胞凋亡( 印o p t o s i s ) 。应激诱导的细胞凋 亡需要激活细胞内应激激酶( j m ln t e m i n a lk i n a s e ，k ) 。研究发现，细胞内h s p 7 2 水平 的增高可以阻断信号通路，抑制应激诱导的州k 激活，从而减少细胞的凋亡【56 。h s p 7 2 还能抑制另一种应激激酶p 3 8 ( h o g l ) 的活性，但当h s p 7 0 家族的单克隆抗体存在时，这 种抑制作用就会消除，p 3 8 的活性提高，造成细胞损害。因此在应激状态下，细胞内h s p 7 0 家族基因表达水平的增加，可抑制应激激酶激活，防止细胞凋亡【57 。 东北师范大学硕士学位论文 第二章可逆乙酰化对基因s s a 4 的调控 一、实验材料与方法 i 实验材料 ( 一) 质粒 p r s 3 1 6 一h e l p 3 、p r s 3 1 6 一h e l p 3 h a t 一，p r s 3 1 4 ( 由s v e j s t m p 教授惠赠) ( 二) 抗体 1 一抗：兔抗g c n 5 抗体购自s a n t ac m z 公司； 兔抗p n a p i i 抗体和兔抗乙酰化组蛋白h 3 抗体购自u p s t a t e ； 兔抗e l p 3 抗体由d r s v e j s 劬p ( m e c h a l l i s m so fn a j l s c r i p t i o nl a b o r a t o 巧， c a i l c e rr e s e a r c hu kl o n d o nr e s e a r c hi i l s t i t u t e ) 惠赠； 兔抗组蛋白h 3c 一末端抗体由d r a l a i nv e r r e a u l t ( 1 1 1 s t i t u t ef o rr e s e a r c hi n i n u n l l l l o l o g ya n dc a n c e r ，u i l i v e r s i t yo fm o n t r e a l ，c a l l a d a ) 惠赠； 兔抗h s f 抗体由d lg r o s s ( d 印鲫c m e n to fb i o c h e 删s t 哆a 1 1 dm 0 1 e c u l a r b i 0 1 0 9 y ，l o u i s i a i l a s t a t eu 1 1 i v e r s i t yh e a l t l ls c i e n c e sc e n t e r ) 惠赠。 2 二抗：辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔i g g 的二抗购自北京中杉金桥生物技术有 限公司。 ( 三) 试剂 鲑精d n a 蛋白a 琼脂糖珠子和c h i p 试剂盒购自u p s t a t e 公司；r n a 提取试剂盒 和逆转录试剂盒购于p r o m e g a 公司；构建质粒过程中所使用的各种限制性内切酶，d n