（细胞生物学专业论文）大蒜细胞周期中rrna前体剪切位点的研究.pdf

一7p -, i w - ， r i ￥ 夕 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 五l = 疆 日期：22 f 翌：笪：之 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：益i ：臼! 日 期：壶咝：厶罗 学位论文作者毕业后去向z 工作单位t 通讯地址： 指导教师签辄一纽 日 期：望幽 电话： 邮编： ，卜， 一 。步 ? ， 11 i i r jj j f ： + ；：j t：? 、lml 笠j 、- ；膏j 。! j 煎辨 ，+ j ， j ：1 - f 醅 磐 ，i ，i 、- - 。，j r ，t 。 j ! h ：j ，。! i ：”! ：一! l ) ，j 二 j i ? 如”，i ，一、：0 u ：一! “f ， 一 一l ! t7 ；i 、i 三 tj 。 ：i t ： + 二j 、j ：； 0i ：o i - o t j j j 。j ：， | 8 。1 弋 f ? ，、一 ：_ - 、， 一 ，f，t0 o q 小， j、 ， u 摘要 核仁是真核细胞内r r n a 转录和核糖体亚单位装配的场所，包括三种基本结构组分： 纤维中心( f c ) 、致密纤维组分( d f c ) 和颗粒组分( g c ) 。r r n a 前体的剪切加工是发 生在核仁处的一项重要活动，f i b r i l l a r i n 和u 3s n o r n a 是参与r r n a 前体剪切的两种重 要因子，它们共同参与了p r o r r n a 的5 e t s 和1 8 sr r n a 的剪切过程。因此，研究 f i b r i l l a r i n 和u 3s n o r n a 在核仁中的分布可以为r r n a 前体的剪切加工位点和剪切产物 转运的研究提供间接依据。本文以大蒜为材料，通过免疫标记和原位杂交的方法，在电 子显微镜下观察细胞周期过程中f i b r i l l a r i n 和u 3s n o r n a 的分布变化，从而来进一步了 解r r n a 前体剪切加工的位点及变化。研究结论如下： 1 、在核仁中，f i b r i l l a r i n 主要分布在靠近f c 的d f c 区域，g c 区也有少量的分布，而 在f c 中无f i b r i l l a r i n 分布，且在细胞周期的g 2 期时，核仁中f i b r i l l a r i n 的密度达到 最大。 2 、在核仁中，u 3s n o r n a 也主要分布在靠近f c 的d f c 区域，g c 区有少量u 3 的分布， 而在f c 中无u 3s n o r n a 分布，且在细胞周期过程中，s 期和g 2 期的核仁中u 3 s n o r n a 的密度较大。 t ，3 、通过f i b r i l l a r i n 和u 3s n o r n a 在细胞中的分布情况可推测r r n a 前体的早期剪切事件 主要发生在靠近f c 的d f c 区域和g c 区域，同时剪切活动在s 期和g 2 期时较为 活跃。 关键词：核仁；f i b r i l l a r i mu 3s n o r n a ；r r n a a b s t r a c t t h en u c l e o l u si st h ed o m a i ni nw h i c ht r a n s c r i p t i o na n da s s e m b l yo fr i b o s o m e st a k ep l a c e i ne u k a r y o t e s ，i ti s c o m p o s e do ft h r e eb a s i cs u b c o m p a r t m e n t s ：f i b r i l l a rc e n t e r s ( f c ) ，d e n s e f i b r i l l a rc o m p o n e n t ( d f c ) a n dg r a n u l a rc o m p o n e n t ( g c ) p r o c e s s i n go fp r e - r r n ai so n eo f t h em a j o re v e n t st a k i n gp l a c ei nt h en u c l e o l u s f i b r i l l a r i na n du 3s n o r n aa r et w oi m p o r t a n t r r n as p l i c e o s o m a lf a c t o r s t h e ya r es u g g e s t e dt ob ee s s e n t i a li nt h ef i r s tc l e a v a g es t e po ft h e 5 e t ss e q u e n c ei nt h ep r o c e s s i n go fp r e - r r n a i d e n t i f i c a t i o no ff i b r i l l a r i na n du 3i nt h e n u c l e o l u sp r o v i d e sap i e c eo fi n d i r e c te v i d e n c ef o r p r e - r r n ap r o c e s s i n g s i t ea n d t r a n s p o r t a t i o no fp r o c e s s i n gp r o d u c t s i nt h i sr e p o r t ，s u b n u c l e o l a rd i s t r i b u t i o no ff i b r i l l a r i n a n du 3s n o r n ai nt h en u c l e o l u so f a l l i u ms a t i v u mw e r es t u d i e db yi ns i t uh y b r i d i z a t i o na n d i m m u n o e l e c t r o nm i c r o s c o p yd u r i n gc e l lc y c l e s ow ec a ng e tt h ei n f o r m a t i o no fp r e r r n a p r o c e s s i n gs i t ei nt h ec e l lc y c l e t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w ： 1 i nt h en u c l e o l u s ，f i b r i l l a r i nw a sm a i n l yl o c a l i z e di nd f cr e g i o n s ，e s p e c i a l l yw h e r ei tn e a r t h ef c s t h eg cw e r es l i g h t l yl a b e l e d ，b u tf cw e r eu n l a b e l l e d i ng 2p h a s en u c l e o l i ，t h e f i b r i l l a i nl a b e l l i n gs i g n a l sc o m et oah e a d 2 i nt h en u c l e o l u s ，u 3s n o r n al o c a l i z e di nd f cr e g i o n s ，e s p e c i a l l yw h e r ei ta b u t st h ef c s 。- t h eg cw e r eal i t t l el a b e l e d ，b u tf cw e r eu n l a b e l l e d i nsa n dg 2p h a s e ，t h eu 3s n o r n a l a b e l i n gs i g n a l sw e r eh i 曲l ye n r i c h e di nd f c 3 t h ef i b r i l l a r i na n du 3s n o r n al a b e l l i n ge x p e r i m e n t sp r o v i d et w op i e c e so fi n d i r e c t e v i d e n c e si n d i c a t e dt h a tp r e r r n as p l i c i n gt o o kp l a c ei nt h er e g i o n so fd f ca n dg c ，a n d p r e r r n ap r o c e s s i n gw a s m o r ea c t i v ei nsa n dg 2p h a s e k e yw o r d s ：n u c l e o l u s ；f i b r i l l a r i n ；u 3s n o r n a ；r r n a 覃 q 值乍 1，? 目录 中文摘要i 英文摘要i i 目录：i i i 第一部分引言1 一、核仁的超微结构1 二、核仁的组成2 三、核仁的周期变化3 四、 核仁中p r e r r n a 剪切位点的研究3 第二部分实验材料与方法7 一、实验材料7 二、实验方法7 第三部分结果与分析_ 。9 一、核仁内f i b r i l l a r i n 的分布。9 二、核仁内u 3s n o r n a 的分布1 0 ， 。 三、实验图片和说明1 2 j第四部分讨 论一19 一、 f i b r i l l a r i n 在细胞周期中的分布变化。19 二、u 3s n o r n a 在细胞周期中的分布变化，2 0 第五部分结论。2 2 参考文献2 3 致谢，2 6 f j f 墨 一 ， 1lj ii ， 一 东北师范大学硕士学位论文 第一部分引言 核仁是真核细胞间期细胞核中最显著的结构，是细胞内生产核糖体的机器，是r r n a 合成和核糖体亚单位装配的场所。核仁在细胞的生命活动过程中起着非常重要的作用， 核仁的功能与核仁的超微结构以及基因的多副本特点密切相关【l ，2 j 。核糖体的生物发生主 要是在核仁内，是一个十分复杂的过程，包括：核糖体基因的转录；核糖体r n a 前体 的剪切与修饰等加工成熟过程；r r n a 与5 s rr n a 及大量相关的核糖核蛋白的组装【3 , 4 】。 有关核仁结构与其功能之间的关系引起了国内外许多研究者的极大关注，在有关方面也 做了大量研究。研究发现核仁的功能不仅限于r r n a 的转录合成，现已发现核仁还具有 其它方面的功能，包括几种小r n a 的核苷酸的修饰、信号识别颗粒的生物合成，以及 对细胞周期、细胞衰老、肿瘤发生等的调控功能【5 6 j 。 、 目前，关于核仁的研究主要包括以下几个方面：1 、r r n a 基因在核仁中的分布；2 、 r r n a 在核仁中转录的定位；3 、p r e r r n a 在核仁中剪切修饰等加工过程的确切位置：4 、 核仁中众多蛋白质和小分子r n a 的作用；5 、核仁的解体、重构等动态变化与细胞分裂 的关系【7 , 8 , 9 , 1 0 。 核仁的形态学特点是与其生物学功能相适应的，核仁的结构相当复杂，自从上世纪 6 0 年代末m i l l e r 等应用离体核仁铺展技术直观地看到了核糖体基因( r d n a ) 的转录形 象类似“圣诞树”结构以来，应用相差显微镜、透射电镜、免疫标记、d n a 原位杂交、 细胞化学以及电镜自显影等技术，已经证明核仁内的r r n a 的合成、剪切和加工，以及 核糖体前体的装配是一个向量过程【1 1 , 1 2 , 1 3 】。关于r r n a 前体的转录和剪切加工位点已有 许多学者做了大量的研究，但对于其精确位置的研究迄今为止仍然存有许多争议。 一、核仁的超微结构 了解核仁的结构是研究核仁功能的基础，在电子显微镜下观察到的核仁不同于细胞 内的其他细胞器结构，它没有膜包被，并且在核仁的内部也不像其它细胞器那样具有典 型的结构模式【1 1 。随着电子显微镜分辨能力的发展，人们发现不同的细胞类型和不同的 细胞代谢状态下，核仁的大小、形态和结构也会发生相应的变化。尽管如此，在透射电 镜下观察到的核仁内部结构都由以下几部分组成【l 1 4 j ： l 、纤维中心( f i b r i l l a rc e n t e r , f c ) 纤维中心是核仁中最早被观察到的形态结构，它在电子显微镜下呈现多个近似圆形 的低电子密度区域，而r e c h e r 等人首先将这种结构区域称为纤维中心【l5 1 。后来又经过 连续切片和三维重构技术证明了f c 是近似球形的结构。纤维中心中含有r d n a 、r n a 聚合酶i 和一些转录结合因子，有研究认为f c 是r r n a 基因的存储位点。r i s u e n o 等人 里。 东北师范大学硕士学位论文 根据纤维中心中染色质的集缩程度和状态不同，将纤维中心分成染色质弥散分布的同质 性纤维中心( h o m o g e n e o u sf i b r i l l a rc e n t e r s ，h of c ) 和染色质集缩成浓密状的异质性纤维 中心( h e t e r o g e n e o u sf i b r i l l a r , c e n t e r s ，h e tf c ) 1 , 1 6 j 。 i i 2 、致密纤维组分( d e n s ef i b r i l l a rc o m p o n e n t , d f c ) 致密纤维组分部分或全部包围在f c 的周边，呈半月形或环形，它是核仁超微结构 中电子密度最高的区域，通常染色较深易被识别。研究发现d f c 中含有许多特异性结 合的蛋白，包括：f i b r i l l a r i n 、核仁素( n u c l e o l i n ) 、a g n o r 蛋白等l l 】。早期人们普遍认 为r r n a 转录发生在d f c 区【3 1 ，有研究者采用定位转录活动相关蛋白的方法来间接确定 r r n a 转录位点，发现转录相关的酶主要分布在f c 斟1 7 】。近期有也有人提出r r n a 转 录主要发生在f c 和d f c 的交界处，而转录产物主要在d f c 处加工【1 8 】。关于r r n a 基 因在核仁中转录及加工的精确位点仍有争议。 3 、颗粒组分( g r a n u l a rc o m p o n e n t , g c ) 颗粒组分是由直径1 5 n m 左右的颗粒组成，通常分布在纤维中心的外侧直至核仁的 近边缘部位。其主要成分是核糖核蛋白，因此可被r n a s e 和蛋白酶消化。r r n a 的某些 加工步骤、以及与核糖体蛋白装配成核糖体亚单位等过程主要发生在颗粒组分区，所以 g c 代表核糖体亚单位成熟和储存的位剧。 除了上述三种基本结构外，在电镜下观察超薄切片时也会发现核仁被或多或少的染 色质包围，这部分染色质称为核仁相随染色质( n u c l e o l u s a s s o c i a t e dc h r o m a t i n ，n a c ) 。 其中，部分染色质深入到核仁内，称为核仁内染色质( i n t r a n u c l e o l a rc h r o m a t i n ) ，而另 l 一部分包围着核仁，称为核仁周边染色质( p e r i n u c l e o l a rc h r o m a t i n ) 【l 】。当用r n a s e 和 。 d n a s e 处理核仁后，在电镜下观察到的核仁残余结构称为核仁基质( n u c l e o l a rm a t r i x ， n m ) 或核仁骨架。而在高等植物细胞的核仁中经常会观察到一个或几个近似呈球形腔 隙，称为核仁液泡( n u c l e o l a r v a c u o l e ，n v ) 。与f c 不同，它没致密纤维组分包裹，其 内部含有核糖体前体颗粒类似物和纤维成分。目前，对其功能的研究还没有统一的结论 【1 9 】 o 二、核仁的组成 核仁是一个高度动态变化的结构，其组成成分也很不稳定，随着细胞类型和生理状 态而发生明显的变化。但一般来说，核仁的主要成分包括有d n a 、r n a 、蛋白质和一 些酶类等【4 】。其中蛋白质是核仁的主要组分，它参与了核仁功能的诸多事件。除了传统 上核糖体生物发生作用外，一些研究发现，核仁还具有其他方面的功能，如：信号识别 颗粒的生物发生、m r n a 转运、控制端粒酶活性和调节细胞周期掣1 4 1 5 1 。最近关于核仁 蛋白质组的研究已成为热点，驻留在核仁处的许多与细胞功能相关的蛋白质与核糖体的 生物发生不相关。近期的研究也发现，核仁蛋白质组随时间的改变使细胞的生长条件也 发生改变。这些研究表明，核仁是一种高度动态的整体，它的蛋白组成适应细胞的代谢 状况。a n d e r s e n 与其同事以及另一个实验室的研究人员应用质谱学技术，在纯化的h e l a 2 东北师范大学硕士学位论文 细胞核仁中共鉴定出3 5 0 种不同的蛋白，其中大约一半的核仁蛋白展现出至少一种已知 的功能，这些蛋白与核糖体的生物发生，m r n a 代谢和其它细胞过程相关。而在鉴定出 的这些蛋白质中，大约有4 8 8 的蛋白没有表现出明确描述的功能。因而这些核仁蛋白 的功能还有待了解【1 9 2 0 。 除蛋白质外，r n a 也是核仁的主要结构成分，它多与蛋白质结合，以核糖核蛋白 的形式存在。核仁中的小分子r n a 称为核仁小分子r n a ( s m a l ln u c l e o l a rr n a ， s n o r n a ) ，一些研究表明s n o r n a 与r r n a 前体的剪切加工和核糖体亚单位的装配等活 动有关。但是关于核仁小分子i a 的种类和对细胞生命活动的调控等仍有许多问题有 待解决1 2 1 , 2 3 j 。 三、核仁的周期变化 在真核细胞周期过程中，核仁又是一个高度动态变化的结构。在有丝分裂期间出现 周期性的消失与重建。在有丝分裂的g 2 m 时期，所有的r n a 合成停止，各种转录酶 和转录因子离开r d n a ，d f c 和f c 处的d n a 开始解集缩，核仁先变小，随着染色质 凝集核仁逐渐消失。在前期末，核仁彻底消失。在核膜破裂后细胞进入中期，并直至后 期细胞中没有核仁。原来分布在核仁处的物质一部分分布在新形成的染色体外周，另一 部分分布在细胞质中，在染色体的n o r s 附近分布有一些和转录有关的物质。在有丝分 裂末期，染色体解集缩，其外周的物质重新聚集在一起形成前核仁体，r d n a 的转录重 新开始，而参与r r n a 剪切、加工的各种物质被重新招募在他们周围。最后前核仁体在 n o r s 周围融合成正在发育的核仁【l 一。 四、核仁中p r e r r n a 剪切位点的研究 真核生物r r n a 基因在基因组内串联排列重复数百次，并且主要集中在核仁内，在 r d n a 分子中，转录区( t r a n s c r i b e ds p a c e r s ) 与非转录区( n o n t r a n s c r i b e ds p a c e r s ，n t s ) 交 替排列。每个r r n a 基因的转录单位由r r n a 聚合酶i 先将其转录成r r n a 前体。前体 大小约4 5 s 。新生的r r n a 前体与某些蛋白质结合，形成巨大的核糖核蛋白前体 ( p r e r r n p ) 。从哺乳动物细胞核内提取到了几种大小不同的p r e r r n p ，其中最大的是 8 0 s 前体【2 1 1 。这些r r n a 前体通过不同的剪切、加工途径形成成熟的1 8 s 、5 8 s 和2 8 s r r n a ，然后2 8 s 和5 8 sr r n a 与在核质中转录并被转运至核仁中的5 sr r n a 装配成核 糖体的大亚单位，再与由1 8 sr r n a 形成的小亚单位一起装配成核糖体。而r r n a 前体 的剪切加工这一过程主要在核仁中进行f 1 , 4 , 2 2 j 。 r r n a 前体的转录区除了1 8 s 、5 8 s 和2 8 或2 5 sr r n a ，还包括一个5 端引导序列， 即5 外部转录间隔( 5 e x t e r n a lt r a n s c r i b es p a c e r ，5 e s t ) ，和一个短的3 端外部转录间 隔( 3 e x t e r n a lt r a n s c r i b es p a c e r ，3 e t s ) ，以及位于1 8 sr r n a 、5 8 sr r n a 和2 5 sr r n a 之间的两个转录间隔( i n t e r n a lt r a n s c r i b es p a c e r ，i t s l ，i t s 2 ) 。不同的生物的剪切加工 3 东北师范大学硕士学位论文 途径有所不同，对哺乳动物和酵母细胞中r r n a 前体的剪切加工过程研究相对较多，而 对植物细胞中这一事件的研究相对较少【2 3 , 2 4 。在哺乳动物细胞中，r r n a 前体的剪切过 程主要包括四个步骤：首先在5 端切除非编码序列，即5 e s t ，生产4 1 s 中间产物； 再将4 l s 的r n a 剪切成2 0 s 和3 2 s 两段，2 0 s 中含有18 sr r n a ，而3 2 s 中含有5 8 s 和2 8 sr r n a ；2 0 s 剪切成1 8 sr r n a ； 3 2 s 剪切切成5 8 s 和2 8 sr r n a 2 。不同的 真核生物中，r r n a 前体的加工过程也有所不同，但每个转录单位内各r r n a 的排列顺 序和加工过程是非常保守的。通过同位素标记中间产物和分子原位杂交后的电镜观察等 实验，都表明r r n a 前体剪切加工的机制在整个真核生物中都是保守的。而在r i a 前 体剪切和加工过程中有很多不同的蛋白因子和小分子核仁r n a ( s n o r n a ) 参与，使剪 切加工过程得以顺利而准确的完成【2 1 , 2 6 。 关于r r n a 前体在核仁中剪切的位点的研究，早期有研究者采用电子显微镜放射自 显影技术，用h 3 - u t p 短时间标记r r n a ，发现标记信号只出现在d f c 区域，而当标记 时间加长时，在g c 区也发现了信号 2 5 , 2 7 , 5 8 】。上个世纪9 0 年代，有人采用原位杂交技术， 发现在小鼠和豌豆细胞的d f c 区域中有5 e t s 探针的标记信号出现，在人类细胞中， 5 e s t 的标记信号则出现在f c 和d f c 区域；而对i t s l 和i t s 2 的原位杂交发现标记信 号主要在豌豆的d f c 区域中出现，在人类细胞的d f c 和g c 区域中出现。p u v i o n 等研 究人员以h e l a 细胞为材料，对5 e t s 、1 8 s 、2 8 sr n a 进行原位杂交，发现它们主要分 布在核仁的d f c 区域。对于r r n a 前体剪切的确切位置仍不是很清楚【2 8 , 2 9 , 3 0 。 随着对核仁中r r n a 前体剪切加工过程的研究，人们发现有很多相关蛋白质及其它 小分子物质参与了r r n a 前体的剪切和修饰，特别是大量核仁小分子r n a ( s n o r n a ) 的发现【3 1 , 3 2 】。近年来相继发现了2 0 0 多种s n o r n a ，它们稳定地存在于核仁内，长约 6 0 - 4 0 0 个核苷酸，序列上也相对比较保守。大部分脊椎动物和植物s n o r n a 均是由某些 基因的内含子编码的，由于它们自身没有启动子，因此其表达需要依赖宿主基因的转录。 它们能与特定的蛋白质如核仁纤维蛋白( f i b r i l l a r i n ) 或自身免疫抗原等结合，生成 s n o r n p 。s n o r n p 是一类调控分子，参与r r n a 前体的剪切加工，并指导r r n a 中核糖 与碱基的修饰。研究发现几种s n o r n p 中都含有f i b r i l l a r i n l 2 1 2 3 】。s n o r n a 根据其结构可 以分为b o xc d 类和b o xh a c a 类，通过对这两类s n o r n a 的结构分析和遗传学研究， 证实它们分别具有指导特定位点的核糖甲基化和尿嘧啶转换的功能。b o x c d 类的 s n o r n a ，在5 端有b o xc ( u g a u g a ) ，3 端有b o xd ( c u a g ) ，两端有4 6 n t 的反向 重复系列，形成碱基互补配对的颈环结构，有利于蛋白质的结合。b o xc 的下游还有一 个b o xd ，b o xd 和b o xd 之间含有b o xc 。它们的顺序是c d c d 。b o xd 或b o xd 的上游都有一段序列，可与r r n a 前体内的8 1 0 n t 保守序列互补，进而指导r n a 的2 一o 一核糖甲基化修饰。b o xh a c a 类，整个分子形成两个颈环结构，由一条单链的铰 链区r n a ( 含保守的a n a n n a ，b o xh ) 连接。3 端上游有a c a 或类似的a g a ，a u a 结构。绝大多数h a c as n o r n a 参与指导r n a 假尿嘧啶化修饰，即指导r n a 分子由 尿嘧啶向假尿嘧啶的转换。还有一类是m r p r n a ，它是核蛋白分子r n a s em r p 的唯一 核酸成分，仅发现于真核生物体内，在所有真核生物2 5 s 一2 8 sr r n a 的产生中发挥作 4 1咯fj。- 、 东北师范大学硕士学位论文 用【2 1 , 3 3 , 3 4 , 3 5 】。对s n o r n a 的一系列研究也帮助解决了长期以来有关r r n a 转录加工中的 许多问题，大大加深了人们对核糖体生物发生过程的了解。 r r n a 前体的剪切加工过程依赖部分s n o r n a 以及相关蛋白质的参与。s n o r n a 与 相关蛋白结合成s n o r n p 才能发挥作用。迄今为止，已经证明了有7 种s n o r n a 参与了 r r n a 前体的加工成熟，包括有u 3 、u 8 、u 1 4 、u 1 7 ( 酵母的s n r 3 0 ) 、u 2 2 、s n r l 0 ( 酵 母) 和7 - 2 m r p 。有研究表明，这些s n o r n a 的缺失将会阻断r r n a 前体的剪切加工， 最终导致细胞生命活动的终止【3 6 】。u 3s n o r n a 是最早发现的一种核仁小分子r n a ，但 最初多在动物细胞和酵母中发现新的s n o r n a ，直到1 9 8 5 年，k i s s 等人采用了适合植物 材料的含有低分子量r n a 的细胞核提取法，从蚕豆细胞中提取出s n o r n a ，同年鉴定 出与动物和酵母细胞中的u 3 同源【3 1 , 3 7 】。u 3s n o r n a 广泛存在于从低等真核生物到脊椎 动物的各类真核生物中，它在核质中合成，并被输送到核仁处发挥作用，是参与r r n a 前体剪切加工的各种因子中最重要的一种【4 2 1 。目前已有实验证实在酵母、爪蟾和哺乳动 物中u 3s n o r n a 对p r e r r n a 的剪切是必需的。u 3s n o r n a 通过与5 e t s 以及1 8 sr r n a 互补配对的功能区来行使其功能，因而对p r e r r n a 的早期剪切，即1 8 sr r n a5 e t s 的 切割具有重要作用【3 8 , 3 9 , 5 3 】。因此，鉴定u 3s n o r n a 在核仁中的位点能够为r r n a 前体剪 切位点和剪切产物转运的研究提供间接的证据。u 3 已作为一种r r n a 前体剪切的追踪 标记，但直至现在，对u 3 在核仁内的确切分布仍没有统一的结论。b e v e n ( 1 9 9 6 ) 等和 l a z d i n s ( 1 9 9 7 ) 认为u 3 定位在d f c 区 4 0 , 4 t , 4 3 】，p u v i o n d u t i l l e u l ( 1 9 9 1 ) 等认为u 3 弥 散分布在g c 区 4 4 , 4 5 1 ，还有人提出u 3 分布在f c 斟2 羽。龙鸿等采用原位杂交技术来研 究了豌豆核仁中u 3s n o r n a 的分布和转运，利用放线菌素d 处理豌豆根部分生区细胞， 使r d n a 转录受到抑制，观察到u 3s n o r n a 分布在d f c 和g c 区内，从而提出r r n a 前体的剪切主要发生在d f c 和g c 区域，剪切产物从围绕f c 的区域向周边转运1 4 6 。 核仁纤维蛋白( f i b r i l l a r i n ) 是一种重要的r r n a 剪切因子，在r r n a 前体的剪切过 程中起着必不可少的作用。已有实验证明，f i b r i l l a r i n 参与了r r n a 前体的剪切【4 川。 f i b r i l l a r i n 是核仁中的一种重要蛋白组分，存在于多种不同种类的细胞中，进化上具有 高度的保守性，其分子量为3 3 3 8k d 。f i b r i l l a r i n 上存在着3 个r n a 结合区域，分别 位于f i b r i l l a r i n 的中部、富含甘氨酸的n 端，以及c 端的0 t 螺旋区 4 8 , 4 9 】。f i b r i l l a r i n 上的 r r n a 识别序列使其不仅可以与其它蛋白质相结合，也可以与一些小分子核仁r n a 上 的特定位点相结合，如：与u 3 、u 8 、u 1 3 、u 1 4 、u 1 5 等上的b o xc ( u g a u g a ) 和 b o xd ( c u g a ) 相结合。这些蛋白质和r n a 共同组成剪切复合体，在r r n a 前体的剪 切加工中具有着重要的作用【5 5 】。已有实验表明f i b r i l l a r i n 与u 3 、u 1 4 、n u c l e o l i n 组成的 复合体在5 e t s 和1 8 sr r n a 的剪切过程中起到关键作用【5 0 5 1 j 。因此，对f i b r i l l a r i n 在细 胞间期核仁中分布的研究可以为r r n a 前体的剪切提供间接证据。关于f i b r i l l a r i n 在间期 细胞核内的定位，o c h s 等( 1 9 8 5 ) 人通过人类自身免疫血清法鉴定表明该蛋白主要分 布在f c 和d f c 区域【5 2 】。而s h a w 和b r o w n 等( 1 9 9 6 ) 采用原位杂交和免疫标记技术对 豌豆细胞核仁中r r n a 的转录和剪切过程进行了研究，并在共聚焦显微镜下观察到 f i b r i l l a r i n 和u 3 、u 1 4 的标记信号主要出现在d f c 的特定区域，并提出r r n a 前体的剪 5 东北师范大学硕士学位论文 切主要发生在d f c 斟4 4 , 5 4 】。龙鸿等( 2 0 0 2 ) 利用i t s l 探针原位杂交标记和抗核仁纤维 蛋白单克隆抗体免疫标记技术，并结合放线菌素d 阻断r d n a 转录的方法，对豌豆细胞 中r r n a 前体剪切位点进行了研究，发现r r n a 前体剪切发生在核仁的d f c 和g c 区， 而f c 处没有标记信掣5 5 】。由此可见，对f i b r i l l a r i n 分布位点的研究还没有统一的结论。 另外，f i b r i l l a r i n 在核仁重建过程中起到重要作用。近期研究表明，细胞在g 2 期开始时， f i b r i l l a r i n 以及的核仁内的其他蛋白逐渐从核仁向细胞核的周边运动，并集聚到开始发生 凝集的染色体外周，当细胞进入到分裂期时，开始了核仁解体1 5 6 】。在有丝分裂过程中， f i b r i l l a r i n 一部分分布在染色体周边，而另一部分存在于细胞质中，有研究者通过免疫荧 光标记和免疫共沉淀等方法发现在分裂期，还有一部分f i b r i l l a r i n 定位在纺锤体两极的 中心体部位。在分裂后期，f i b r i l l a r i n 在前核仁体包装成核仁的过程中也起到重要作用 5 2 ，5 6 ，5 7 】 o 综上所述，了解r r n a 前体在核仁中转录、剪切力n - r _ 的确切位置是认识核仁功能的 基础。u 3s n o r n a 和f i b r i l l a r i n 组成的复合物在r r n a 前体剪切过程中起到了重要的作 用，而定位它们在核仁超微结构中的位点，可以为r r n a 前体剪切位点的研究提供间接 证据，同时也为理解核仁的结构与功能的关系以及生物体内高效而有序的核糖体生成机 佴 f t 东北师范大学硕士学位论文 第二部分实验材料与方法 一、实验材料 高等植物大蒜( a l l i u ms a t i v u m ) 鳞茎，置于水中2 3 。c 左右暗培使其萌发生根，当根 长至1 5 2 厘米时，切取根端分生组织作为实验材料。 二、实验方法 ( 一) 低温包埋 l 、取材：待大蒜根尖长至1 5 2 厘米时，切取根端分生组织。 2 、固定：将材料迅速放入2 5 戊二醛和4 多聚甲醛固定液( o 1m o l lp b s 缓冲液配 制，p h = 7 4 ) 中，4 固定2 小时。 3 、漂洗：样品由o 1 m o f l p b s ( p h = 7 4 ) 漂洗3 次，每次3 0 分钟，再由双蒸水漂洗3 次，每次3 0 分钟。 4 、脱水：样品经3 0 、5 0 、7 0 、9 0 、1 0 0 7 , 醇系列脱水，每次各l 小时。 5 、浸透：样品在浸透液l ( 乙醇：k 4m - - 2 ：1 ) ，浸透液2 ( 乙醇：k 4m = i ：i ) ，浸透液3 ( k 4 m ) 中各浸透1 2 小时，在k 4m 中浸透6 0 小时( 室温1 2 小时，0 c 2 4 小时，一3 0 。c 2 4 小时) 。 6 、聚合：样品置于盛有k 4 m 包埋剂的胶囊中，在紫外光照下，- - 3 0 c 下聚合3 天，室! 一 温聚合3 天。 7 、切片：采用l k b 5 型超薄切片机切片，切片厚度为6 0 8 0 n m ，切片用有支持膜的镍网 捞取后，室温干燥。 ( 二) f i b r i l l a r i n 免疫电镜标记 试剂与药品： 1 、饱和n a l 0 4 溶液：用双蒸水配制。 2 、p b s t g ：0 0 1 m o l lp b s ( p h = 7 4 ) ，0 2 t w e e n 2 0 ，o 0 1 5 m o l l 甘氨酸。 3 、一抗：鼠源抗f i b r i l l a r i n 单克隆抗体( 购于a b c a m 公司) 。 4 、二抗：羊抗鼠i g g 一胶体金，直径5 r i m ( 购于s i g m a 公司) 。 实验步骤： 1 、样品经饱和n a l 0 4 溶液处理3 0 分钟，双蒸水洗4 次，每次5 分钟。 2 、o 1m o l l 盐酸处理l o 分钟，双蒸水洗4 次，每次5 分钟，o 0 1m o l lp b s t g ( p h = 7 4 ) 洗4 次，每次5 分钟。 3 、1 b s a ( o 0 1m o l lp b s t g 配制，p h = 7 4 ) 封闭1 5 分钟。 4 、第一抗体标记：抗f i b r i l l a r i n 抗体按l ：1 0 0 比例稀释( o i b s a - p b s t gp h = 7 4 ) ， 7 东北师范大学硕士学位论文 将抗体液加于样品上，在湿盒中4 c 过夜，取出湿盒，室温下继续作用1 小时，o 0 1m o l l p b s t g ( p h = 7 4 ) 洗3 遍，每次5 分钟，o 0 1m o l lp b s t g ( p h = 8 o ) 洗3 遍，每次5 分钟。对照组用稀释液代替。 5 、第二抗体标记，羊抗鼠抗体培g 偶联5 n m 胶体金按1 ：2 0 比例稀释( o i b s a p b s t g p h = 8 o ) ，加数滴于样品上，在湿盒中室温下作用2 小时。0 0 1 m o l lp b s ( p h = 8 o ) 洗 3 次，每次5 分钟，0 0 1 m o l l p b s ( p h = 7 4 ) 洗3 遍，每次5 分钟，双蒸水洗三次，每 次5 分钟。 6 、样品经5 醋酸铀染色1 0 m i n ，双蒸水洗3 次，每次5 分钟。室温干燥。 7 、在h i t a c h i 7 5 0 0 型透射电子显微镜下观察。 ( 三) u 3s n o r n a 探针原位杂交 核仁小分子u 3s n o r n a 的探针由上海生工公司合成，是与u 3s n o r n a 序列互补的 d n a 序列，其序列如下： 5 - g t t c t c t r c c c t c t c a c t c c c c a a t a c g g a g a g a a g a a c g a t c a t c 从t g g c t g 3 为了进行原位杂交反应，在其5 端修饰以生物素( b i o t i n ) 试剂与药品： l 、去离子甲酰胺。 2 、硫酸葡聚糖：浓度为5 0 ，双蒸水配制。 3 、5 0 i - t l 杂交液的配制：( 单位：l x l ) 去离子甲酰胺 2 5 硫酸葡聚糖 l o 2 0 x s s c5 u 3 探针8 双蒸水 2 4 、胶体金偶联链霉亲和素，直径1 0 n m ( 购于s i g m a 公司，n o s 9 0 5 9 ) 实验步骤： 1 、在在有切片的镍网上滴加2 p l 左右的杂交液，3 7 c 下温育4 小时。对照组加不含探 针的杂交液。 2 、磷酸缓冲液洗涤3 次，每次5 分钟。 3 、在镍网上滴加胶体金偶联链霉亲和素( 1 ：2 0 ，0 o l m o l lp b s 缓冲液稀释，p h = 8 o ) 室温下作用3 0 分钟左右。 4 、杂交后的镍网用磷酸缓冲液洗3 次，每次5 分钟，再用双蒸水洗3 次，每次5 分钟， 自然干燥。 5 、5 的醋酸铀染色l o 分钟，双蒸水洗涤，自然干燥。 6 、在h i t a c h i 7 5 0 0 型透射电镜下观察，加速电压8 0 k v 。 8 馐 r 【 奢 i ! l j 东北师范大学硕士学位论文 第三部分结果与分析 一、核仁内f i b r i l l a r i n 的分布 电子显微镜下观察大蒜根尖分生组织细胞的超薄切片，可以清楚地看到核仁的3 个 基本结构，即：低电子密度区域的纤维中心( f c ) ，部分或全部包围在f c 周边高电子 密度的致密纤维组分( d f c ) ，以及由直径1 5 n m 左右的颗粒组成的颗粒组分( g c ) ( 图 1 ) 。实验分为两组，实验组用抗f i b r i l