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华南师范大学硕士学位论文答辩合格证明 学位申请人f 垄至兰蹩向本学位论文答辩委员会提交 题为必3i 豁! ;坠啦盘垒麴基鱼! 鱼垄鲤! 雏望酶预士论文, 一嗪站墨殇 。 经答辩委员套审哎,本论文答辩合格,特此证明。 学位论文答辩委员会委员( 签名) 主席 蕉壶堑 主席 茑壶坠 委员: 0 耐天址7 论文j旨导老师( 签溉 砥占月7 日 电刺激c 2 c ,:收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 缩略词表 ( a b b r e v i a t i o n ) 英文缩写英文全称 中文全称 a t pa d e n o s i n et r i p h o s t h a t e 三磷酸腺苷 c a t c a t a l a s e过氧化氢酶 c 酽+c a l c i u mi o n o p h o r e s钙离子 c y t cc y t o c h r o m ec 细胞色素c f r f r e er a d i c a l自由基 h 2 0 2h 2 0 2 过氧化氢 m d a m a l o n i ca c i d丙二醛 d n ad e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 r n ar i b o n u c l e i ca c i d 核糖核酸 n a + 。k l h t p a s en a + ,k 。a t p a s ee n z y m e 钠,钾- - a t p 酶 g p x g l u t a t h i o n 、t a t h i o nc a t a l a s e 谷胱甘肽过氧化物酶 m c km y o k i n a s e 肌激酶 s o ds u p e ro x id a n t d is m u t a s e 超氧化物歧化酶 s c s s t e l l a t ec e l l s骨骼肌卫星细胞 r o s r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s活性氧 电刺激c 2 c - z 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 电刺激c :c 。:收缩运动对自由基 代谢影响的实验研究 摘要 大量研究表明,运动应激引起自由基生成迅速增加。由于自由基高度的活泼 性与极强的氧化能力,能通过氧化作用来攻击其所遇到的许多生物分子,使机体 内大分子物质产生过氧化反应,从而引起细胞结构特别是供能的线粒体结构和机 能的破坏,导致组织细胞损害,当然机体抗氧化系统也会产生相应变化。然而由 于方法学的限制,对于运动训练中骨骼肌r o s 生成的直接证据较少,多是在分离 组织后,通过测定脂质过氧化物( m d a ) 和d n a 损伤产物而间接反映活性氧水平, 而无法直接定量测定活性氧,也无法了解刺激引起的r o s 变化的时相性和收缩强 度的量效性。本实验利用培养的c 2 c 1 2 细胞,电刺激使其产生收缩运动,以二氯 荧光素为探针,利用荧光分光光度计实时检测c 。c 。细胞内活性氧的变化,并对活 性氧引起的线粒体脂质过氧化物m d a ,氧化酶s 0 1 ) n a + ,k l a t p a s e 活性等指标进 行检测,以观察线粒体的抗氧化系统产生的变化,初步探讨收缩引起r o s 变化的 时相性。 实验结果显示: 1 以4 5v 、2 0m s 、5h z 的强度刺激肌管,细胞内r o s 生成迅速增加,在刺激 6 0 m i n 时,r o s 的量达到最高,然后缓慢下降,继续刺激到1 2 0 m i n 时,r o s 释放再次升高随后迅速下降。表明电刺激骨骼肌收缩能引起细胞内r o s 生 成增加,且在不同的时间点,增加的量不同。 2 电刺激肌管时线粒体内s o d 活性逐渐升高,至1 5 0 m i n 和1 8 0 m i n 时都与对照组 相比有显著性差异。脂质过氧化物m d a 量在9 0 m i n 时略有升高,随后下降,但 无显著性差异。表明肌管收缩能引起线粒体内s o d 活性持续升高,但对m d a 的影响却不太。 3 电刺激肌管引起胞浆内n a + ,k + - a t p a s e 活性升高,刺激至1 5 0 m i n 时活性下降, 且刺激到1 8 0 m i n 时下降的很低。表明骨骼肌长时间收缩运动引起n a + ,k + 一 a t p a s e 活性的降低。 2 电刺激c 2 c t 2 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 我们认为:以4 5v 、2 0m s 、5t l z 的强度刺激肌管,随时间延长,肌管发生 的变化与在体骨骼肌有氧运动至力竭时所引起的自由基及其代谢特征大体相符 因此,我们可使用这种刺激模式,建立骨骼肌收缩研究的细胞模型。模型的建立 将会为今后更深入的研究自由基产生机理及自由基诱导的信号转导提供新的有 价值的参考依据,也会为探讨延缓和消除自由基产生的方法,提供与在体研究 相互补充的有益平台, 关键词:自由基;c 2 c 。细胞;骨骼肌;n a * ,k * _ a t p 酶活性 电刺激c 2 c t 2 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 s t u d yo nt h eg e n e r a t l 0 no fr a d i c a li n d u c e db y e l e c t r i c a ls t i 姗l a t i o ni nc 2 c 。2m y o t u b e s a b s t r a c t p r e v i o u ss t u d i e si n d i c a t e dt h a tl o to ff r e er a d i c a ls p e c i e sare g e n e r a t e dd u r i n ge x e r c i s e f r e er a d i c a ls p e c i e sh a sh i g hv i v a c i t ya n d o x i d a t i v ec a p a c i t y ,a n dt h e ycancauset h eo x i d i z a t i o no fb i o m o l e c u l e s a n dt h i sm a yr e s u l ti nt h ed a m a g eo f c e l l s t r u c t u r e ,e s p e c i a l l yt h e s t r u c t u r ea n df u n c t i o no fm i t o c h o n d r i a a tt h es a m et i m e ,a n t i o x i d a n t e n z y m e swasa l s og e n e r a t e di ns k e l e t a lm u s c l ei nr e s p o n s et os u b s t a n t i a l e p i s o d e so fd a m a g i n ge x e r c i s eo rs e r i a lt r a i n i n gr e g i m e n s :l i t t l ed i r e c t i n f o r m a t i o ne x i s tt os u p p o r tt h eg e n e r a t i o no ff r e er a d i c a l si nt h e p r o c e s so fe x e r c i s e ,t h em a j o r i t yo ft h ee v i d e n c e ,f o ri n s t a n c e :m d aa n d d n a ,a r ed e r i r e df r o mt h ed e t e c t i o no ft i s g u ei s o l a t e df r o ma n i m a l sw h i c h i sa ni n d i r e c t i n d e xo fr o sg e n e r a t i o n a n dt h e yc a n n o td e t e c tt h ee x a c t v o l u m ef r e er a d i c a ls p e c i e sd i r e c t l ya n ds i m u l t a n e o u s l y i na d d i t i o n ,i t i sa l s od i f f i c u l tt od e f i n et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nr o sg e n e r a t i o na n d e x e r c i s ei n t e n s i t y i nt h i ss t u d y ,c 2 c 1 2wass t i m u l a t e dt oc o n t r a c ti n v i t r oa n dr o sw a sd e t e c t e dw i t hd c f hf l u o r e s c e n tp r o b e r o sa s s o c i a t e d l i p i dp e r o x i d e sm d a ,s u p e r o x i d ed i s m u t a s es o d a n dn a + ,f a t p a s ea c t i v i t i e s w e r ea l s od e t e c t e ds i m u l t a n e o u s l yi no r d e rt od e f i n et h ec h a n g e so f a n t i o x i d a n ta b i l i t yi nm i t o c h o n d r i a w ej u s ta i m e dt om a k ep i l o ts t u d y o nt h et i m ec o u r s eo fr e l e a s eo fa no x i d i z i n gf r e er a d i c a ls p e c i e so r q u a n t i t y p h a s eo ft h ec o n t r a c t i o ni n t e n s i o n r e s u l t s : 1 s k e l e t a lm u s c l em y o t u b e sd i s p l a y e dal a r g ea n dr a p i di n c r e a s ei n s u p e r o x i d ep r o d u c t i o nd u r i n gs t i m u l a t i o n ,p e a k i n ga t6 0 m i na n d1 2 0 m i n , w h i c hd e c l i n e dr e l a t i v e l ys l o w l ya f t e rs t i m u l a t i o nwast e r m i n a t e d a n d i n d i c a t et h a ts t i m u l a t e dc u l t u r e so fm y o t u b e scani n d u c ear a p i dr e l e a s e 4 电刺激c 2 c 1 2 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 o fs u p e r o x i d ea n i o n s ,b u tch ev ( ) 1u m e ( ) 1 1i n c 、e a s ei sa l s ov a r yw i t hr e 斟r d t ot i m ev a r i a t i o n 2 m i t o c h o n d r i as o da c t i v i t ywasf o u n dt oi n c r e a s et r a n s i e n t l ya f t e r t h ec o n t r a c t i l ea c t i v i t y ,t h e yw e r es t i l ls i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n b a s e l i n ea t1 5 0 m i na n d1 8 0 m i n ( p o 0 5 ) ,l i p i dp e r o x i d em d aa l s oi n c r e a s e d a t9 0 m i n ,t h e ng e n e r a l l yd e c l i n e dt oc o n t r o ll e v e l s a t l 5 0 m i na n d1 8 0 m i n 。 t h e r ew a sn oi n f l u e n c eo nm d ac o n t e n t i o nt h i si n d i c a t e dt h a tm y o t u b e s c o n t r a c tcani n d u c et h ei n c r e a s eo fs o da c t i v i t y ,b u ti th a s1 i t t l e i n f l u e n c eo nm d ac o n t e n t a f t e re l e c t r i cs t i m u l a t i o n 3 t h ea c t i v i t yo fn a + ,k + - a t p a s ew a sf o u n dt oi n c r e a s et r a n s i e n t l ya t 9 0 m i n ,t h e nd e c l i n e d ,t h ea c t i v i t yw a sl o w e rt h a nt h eb a s e l i n ev a l u e s a t1 5 0 m i na n d1 8 0 m i na f t e rt h ec o n t r a c t i l ea c t i v i t y t h i si n d i c a t e dt h a t l o n g t e r m c o n t r a c te x e r c i s ec a ni n d u c et h ed e c l i n eo ft h en a + ,k + 一a t p a s e a c t i v it y o u rr e s u l ti n d i c a t e dt h a te l e c t r i c i t ys t i m u l a t e dc u l t u r e ss k e l e t a l m u s c l em y o t u b e sw i t hw a v ep u l s e so f 2 0m si nd u r a t i o na t5h za n d 4 5 v w e l lm a yh a v et h es a m ee f f e c ta sa e r o b i ce x e r c i s et oe x h a u s t i o ni n v i v o t h u s ,o u rm o d e lb a s eo nt h es t u d yo fc 2 g 2m y o t u b e sc o n t r a c t i o nm a y b er e g a r da s a ni d e a lonei nt h es t u d yo fs k e l e t a lm u s c l ec o n t r a c t i o n t h i sf o u n d a t i o no fm o d e lm a yg i v eu sm o r ee v i d e n c et of u r t h e rours t u d y o nt h em e c h a n i s mo ff r e er a d i c a lg e n e r a t i o na n dr e l a t e ds i g n a l t r a n s u d a t i o n t h i si sa l s oa na v a i l a b i l i t yp l a t f o r mt os t u d yo ns t a yo r e li m i n a t i o nf r e er a d i c a lg e n e r a t i o n i nv i v o k e yw o r d :f r e er a d i c a l ;g c l 2 ;s k e l e t a lm u s c l e s ;n a + ,k + - a t p a s e 5 电刺激c 2 c t 2 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 l 前言 1 1 文献综述 1 1 1 骨骼肌成肌细胞c 2 c - z 及其生物学特性 成肌细胞是指胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞,包括心肌、平滑肌及骨骼 肌在内的三种肌组织,其胚胎发育都经历了由间充质细胞分化为成肌细胞,再进 一步分化为成熟肌细胞的过程。成熟个体的心肌组织与平滑肌组织都不含成肌细 胞,而骨骼肌组织中的成肌细胞则是以骨骼肌卫星细胞的形式存在。卫星细胞 位于肌纤维的肌膜与基底膜之间,通常状况下,处于相对静止和转录不活跃状态, 但当机体遇到生长、重塑或肌肉损伤等刺激时,卫星细胞就被激活,增殖并表达 肌标记物即成肌细胞。这些细胞再融合进已存在的骨骼肌纤维中,或者彼此融合 形成新的肌纤维”。 c z c 。:细胞属小鼠骨骼肌成肌细胞系,自建系以来得到很广泛的应用。离体培 养的c 2 c 1 2 细胞为球形,贴壁后绝大多数为梭形,少数有突起,为不规则状。营 养条件良好,如培养基中加入1 5 2 0 的动物血清( 即生长培养基) ,细胞以分 裂、增殖为主。一旦细胞长满整个培养瓶,相互接触时,增殖将明显受到抑制, 相邻细胞自发融合成肌小管。用分化培养基或使用外源性i g f 一1 也能促进肌小管 的形成。在c 。c 。细胞融合分化为肌管的同时,开始合成特定蛋白如肌动蛋白、肌 凝蛋白及乙酰胆碱受体等,成肌细胞变为纺锤形,细胞基质的相互作用及移形能 力随之改变,随后成肌细胞停止d n a 合成,开始融合成多核肌管,粗、细肌丝在 肌管胞浆内聚集,形成明确的肌原纤维,最后肌管发育为横纹肌纤维。在细胞分 化的4 5 天,肌原纤维包含有长达2 u m 的肌节,以及排列有序的z 线。大概分化 56 天后,细胞形成具有收缩功能的肌管”1 。分化培养6 7 天后,肌管力量发展 为0 8 8 + _ 0 1 2 u n ,随培养的进行,肌力逐渐增大“1 。肌管内f o r c e p e ar e a t i o n ( 力量一钙的关系) 处于在体骨骼肌肌原纤维的关系范围内“1 。肌管经常处于不 运动状态直到电刺激时才开始收缩,收缩时还能测出细胞兴奋的时值,强度。1 。 1 1 2c 2 c 1 2 细胞在运动医学中的应用 运动可以刺激肌细胞的生长和代谢,包括糖原的代谢、氨基酸的摄取、激 电刺激c 2 c - z 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 素的分泌以及基因转录等。业已i f 明,电刺激j 以模拟神经电活动导致骨骼肌 细胞去极化而引发细胞内c a ”水平升高,进一步通过各种信号途径来调节骨骼 肌的许多重要特性,如肌肉收缩力和肌型,线粒体增生,等。分化的c :c ,。肌管, 具有骨骼肌细胞的生化和形态学特征,在细胞收缩功能上与在体骨骼肌收缩有 许多相同点,已经证明对研究骨骼肌的代谢是有用的”1 。因此曾用c 2 c 。作为细 胞模型来研究骨骼肌的适应性变化。 1 1 2 1c 2 c 1 2 细胞在线粒体增生研究中的应用 耐力运动的一个主要适应性变化是骨骼肌氧化能力增强,这归功于线粒体 增生而引起的线粒体含量的升高。这些很可能由a t p 周转加速或线粒体a t p 合成和细胞a t p 需求以及c a ”流入之间的平衡联合作用引起的。即由于能量需 求增加,线粒体应激信号影响细胞正常程序变化,而导致线粒体增生扩散“。 生物能上的需求能够改变核对线粒体遗传上的调控,在能量代谢正常情况下, 线粒体增生随着分化而发生“。在非正常情况下,例如长期收缩运动,能连续 激活核基因表达,引起线粒体r n a 增殖。在运动恢复期间经常有m r n a 含量改 变,他们可能是收缩运动引起的转录或m r n a 稳定性的增加的结果。h o o d 1 电 刺激c 2 c :肌管,细胞产生收缩运动引起线粒体m r n a 的表达快速增加,与运动 训练或长期的电刺激在体骨骼肌,引起线粒体r n a 蛋白的表达增加相似。c o n n o r “”也发现,c 。c 。肌管收缩运动,细胞色素cm r n a 表达明显增加,并与线粒体 a t p 合成的增加是一致的。在体中增加收缩运动引起细胞色素c 转录活性也是 时间一依赖性增加。因此c o n n o r 认为,骨骼肌收缩运动中,线粒体a t p 合成速 率的变化,在诱导线粒体增生论上,通过细胞色素c 表达反应出来,可能是一 个很重要的信号。在体中过氧化物酶体增殖活性受体y 共活化物一1 ( p g c 1 ) , 也是线粒体生源论的主要调控者。在培养的肌细胞中,c a m k 能激活p g c 一1 基因 启动子,使之表达“。 因此在运动引起的线粒体生源论上,先是收缩激活a m p k 和c a m k 信号转导 通路,然后增加核编码蛋白m r n a 含量,例如细胞色素c 和线粒体转录因子a ( t f a m ) 含量;增加上游转录因子m r n a 含量,例如c j u n 和核呼吸因子一l ( n r f 一1 ) 等。t f a m 进入线粒体,控制线粒体d n a 的表达。线粒体蛋白只提供 1 3 个蛋白产物给呼吸链,但是它们在电子传递和a t p 合成是重要的。长期收缩 电刺激c 2 c 。z 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 运动能增加t f a r o 表达,加速t 、a m 进入线粒体,导敛线粒体d n a 转录和复制增 加阍。 1 1 2 2c :c ,:细胞在骨骼肌肌型研究中的应用 根据肌纤维的收缩速度,代谢特征,以及特有的基因表达模式,骨骼肌可 分为快型肌纤维和慢型肌纤维。肌型的表达是由骨骼肌外部( 收缩,神经支配) 和内部( 基因) 机制所共同决定的。长期运动训练或低频电刺激骨骼肌引起慢 肌的表达增加,相应快肌的表达受抑制;而高频刺激则相反。在神经系统的发 放和收缩中信号编码的通路上,骨骼肌基因表达的转变仍然是不清楚的。离体 实验中,通过研究单个肌纤维肌型的表达,可在能量需求和收缩的功能参数上 得出一些重要的结论。因此在c 2 c ,:细胞上的发现能够弥补研究在体肌型转换中 的不足。 m a r c ”等长时间低频电刺激培养的c 。c 。:细胞,发现甲状腺激素的转录受抑 制,快肌肌浆网c a 2 + - - a t p 酶启动子的活性下降,快肌表达受抑制。已知收缩 运动引起肌型发生改变,依赖于运动神经刺激的频率,被认为受c a ”一依赖性信 号通路控制。慢肌通过运动神经连续的刺激维持细胞内很高的钙离子浓度,而 快肌则受到不连续的刺激,钙浓度的波动很大。长期电刺激骨骼肌细胞,导致 细胞去极化而引发胞内游离c a “水平升高“”,当胞内c a ”浓度持续升高到 1 0 0 3 0 0 n m ,足够去激活一类钙调节酶,例如c a n ,c a m k ,它们共同作用,能刺 激慢肌基因启动子,激活慢肌基因表达“。在培养的细胞中,p g c 一1 在肌激酶 ( m c k ) 的驱动下表达时,也能观察到肌型的转变“。c a n 增加慢m h c 表达的能 力大部分是通过激活n f a t 来调节的。但是n f a t 并不能直接调控慢基因表达, 而需要连接到其它转录因子例如m e f 2 上才起作用“。在肌肉中慢肌和快肌基 因互相调控,当增加慢肌m h c 表达时,快肌m h c 表达则受抑制,反之亦然1 。 因此,在骨骼肌去极化引起的信号通路上,可能c a n 与m e f 2 蛋白、g a t a 家族 联合起作用,调节肌型变化。另外r a s ,m u s t r d l ,m y o g e n i n 在肌型基因表达 上也起重要作用。 1 1 2 3c 。c 。细胞在基因治疗及细胞移植上的应用 c 2 c 1 2 细胞含有骨骼肌收缩所需的蛋白,能对外源性d n a 进行稳定表达, 且分化后能形成排列有序的肌节,获得组织很好的肌原纤维。因此可在细胞分 电刺激c 2 c 2 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 化时,研究各种增长因子在细胞中的表达”。;可进行外源性e d n a 的稳定转染 实验。“,研究外源性收缩蛋白的功能;转染后的c 2 c 1 2 细胞能融合到宿主的肌 纤维内,将目的基因介导到宿主体内,能稳定表达对应的基因产物。因此应用 肌细胞为载体进行基因治疗引起了人们广泛的关注。例如肌肉萎缩、肌强直性 营养障碍( d m ) 、帕金森病及心血管疾病等都可应用肌细胞介导的转基因方法 建立细胞模型,进行初步研究。 骨骼肌和心肌在胚胎发育期有共同的前体细胞,但成熟心肌无干细胞,心 肌损伤坏死后只能有纤维组织替代。而成肌细胞移植为增加有功能的心肌细胞 数量提供了一条新途径,而且骨骼肌耐受缺血性能较心肌细胞强,能较好的适 应心肌损伤区的缺血环境,移植后也不需免疫抑制治疗。国外大量的实验研究 证明。“2 ,骨骼肌成肌细胞能移植到受损的心脏,移植的成肌细胞开始增殖, 分化,融合,形成多核肌管,肌管发育为成熟的快收缩型肌纤维,在心肌修复 过程中逐渐转变为慢收缩型肌纤维,新形成的肌纤维在适当的刺激下具有类似 心脏的工作周期,能参与心脏的收缩和舒张,替代坏死心肌。目前由骨骼肌卫 星状细胞起源,环境依赖分化形成的心肌细胞使骨骼肌卫星细胞心肌成形术具 有很大的临床应用价值。 1 1 2 4 、c 2 c 1 2 细胞的应用展望 骨骼肌能适应不同形式的运动训练依赖于收缩的力量,速度和持续时间。与 每次收缩方式相联系的应激和信号很可能激活一个能融合这种信息的信号转导 通路的网络系统。“。激活的信号转导通路通过不同机制又激活或增加转录因子的 表达。骨骼肌基因一般地被几个转录因子联合控制,也可能有其它机制的参与, 由于在体及组织研究的局限性,其中的许多机制仍不清楚。而c 2 c 1 2 细胞,具有 来源广、易培养,可控性强等特点,且在收缩功能上与在体骨骼肌收缩有许多相 同点,因此可作为研究骨骼肌细胞信号转导机制的首选模型。近年来在这方面的 研究很热。然而,对于由骨骼肌收缩引起的疲劳及其机制上,在疲劳时线粒体结 构与功能的变化上的研究很少,仍需要广大研究人员的不懈努力。随着研究的深 入,c 2 c 1 2 在骨骼肌收缩功能研究中将会得到更好的应用。 1 1 3 电刺激方法的应用 电刺激是运动生理中最常用的刺激方法,它是使用特定频率、波形和强度 9 电刺激c 2 c 1 2 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 的脉冲电流,代替人脑发出的神经冲动,诱导骨骼肌按人为要求设计的肌紧张进 行有规律的收缩运动。 已知支配慢肌的运动神经以1 0 2 0 次s 的低频率放电,而控制快肌的运动 神经以3 0 6 0 次s 的高频放电o 。因此,当用电刺激骨骼肌时,可使用不同的 强度,频率,以达到不同肌纤维募集的目的。电刺激具有能量消耗少、针对性强 和见效快等特点,且使用方便,所以在运动训练中,作为一种新的训练方法和辅 助手段,也早已受到各国体育界的重视。 1 1 3 1 电刺激能促进疲劳恢复、治疗运动损伤及改善细胞功能 研究发现,对肌肉施加2 h z l o h z 的低频电刺激,能促进训练后的肌肉恢 复和治疗运动损伤,尤其是在治疗拉伤硬结中疗效显著。7 。“:电刺激骨骼肌( 1 0 h z ,0 卜0 2 5m s ) ,能全面促进线粒体的功能,改善肌肉细胞的供能状态,引起 骨骼肌肌原纤维和肌膜线粒体中苹果酸脱氢、琥珀酸脱氢酶和柠檬酸合成酶的活 性升高,且与耐力运动成绩提高呈线性关系嘞1 ,细胞色素c 氧化酶活性。”、蛋白 含量和m r n a 表达均增加”“;电刺激能明显促进能源消耗、糖氧化、激活整体葡 萄糖的动用c 3 3 。此外还对失神经支配骨骼肌具有保护作用,能延缓肌肉萎缩1 。 1 1 3 2 电刺激能增加肌肉力量 研究表明,l o h z 低频电刺激能增加骨骼肌毛细血管的密度,加强血液供应 ( 3 5 ) ,增强肌力。6 1 ”;电刺激大鼠腓肠肌( o 1 5 一m s ,5i t z ) ,能引起胞内c a 2 + 浓度、肌浆球蛋白结构和功能发生改变,肌肉体积明显增加o “,并能有效的提高 肌肉的柔韧性,保证肌肉力量与柔韧性同步协调平衡发展1 。王保成、周里等 ( 1 9 9 5 ) 研究结果表明,刺激1 5s 、间歇2 5s 的方式对发展肌肉力量可获得更好的 训练效果。张胜年等( 1 9 9 6 ) 则发现动态力量训练中辅以电刺激更能有效地提高肌 肉力量。 1 1 3 3 、电刺激引起培养的c 2 c 1 2 骨骼肌细胞收缩 业已证明,电刺激可以模拟神经电活动引起离体培养的骨骼肌细胞收缩,导 致细胞去极化而引发细胞内钙离子水平升高,进一步通过各种信号途径来调节骨 骼肌的许多重要特性,如细胞凋亡“”1 、线粒体损伤或生物合成“3 3 等。长期低 频电刺激骨骼肌细胞,能提高n a + 一k + - a t p a s e 活性,使之对胞内n a + 的亲和力迅速 增加“,胞浆内钙离子含量波动“4 ,低频刺激还能抑制甲状腺激素的转录,使 电刺激c 2 c 1 2 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 快肌肌浆网c a ”一a t i ,酶启动f 的活性f 降;r o b e r t ”1 发现以1 6v ,1 0m s , 卜1 0h z 的强度刺激骨骼肌肌管,就能观察到肌管有规律的收缩运动,并引发c a ” 波动。一次性刺激骨骼肌肌管5u z ,6 5 v ( 1 2 v c m 2 ) ,刺激1 5 m i n e g r - 1m r n a 迅 速增加;3 0 m i n 时增加4 倍,达到最高;继续刺激到4 小时,则下降了2 倍。 表明电刺激肌管能迅速改变骨骼肌细胞的基因表达。长期刺激( 3 h d ,4 d a y ) 能 引起细胞色素氧化酶活性升高“,细胞色素cm r n a 表达明显增加,并与线粒体 a t p 合成的增加一致“。这些与在体研究的结论一致。 1 1 4 自由基及其代谢研究进展 运动医学界自2 0 世纪7 0 年代以来对自由基生命科学的研究给予了密切的关 注,并已取得了不少有价值的成果。所谓自由基,是指那些在外层轨道上具有不 成对电子的分子或原子基团。体内的自由基以含氧自由基为主,又称为活性氧 ( r o s ) ,通常包括:超氧阴离子自由基( 0 2 一) 、羟自由基( 一h 0 ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) , 氢过氧基( h o - 2 ) 、有机过氧基( r 0 0 ) 等它们的化学性质活跃,具有很强的氧 化反应能力,且对信号转导通路中氧化还原敏感的蛋白激酶有调节作用,通过影 响这些氧化还原敏感蛋白酶的活性,能够调节基因的表达”“。正常情况下,自 由基的生成和分解处于动态平衡中,不会引起细胞损伤,只有在某些非生理情况 下,自由基生成增多,超过机体的分解能力和分解能力减弱时,才会对机体造成 一定程度的损伤 自由基在正常状态下很难检测到,且低水平的自由基有利于肌肉的正常收 缩,能增加力量输出“。在剧烈运动收缩过程中,骨骼肌以累积的速率产生自由 基4 。由于自由基高度的活泼性与极强的氧化能力,能通过氧化作用来攻击其所 遇到的许多生物分子,使机体内大分子物质产生过氧化反应,从而引起细胞结构 特别是供能的线粒体结构和机能的破坏,导致组织细胞损害。“。有研究表明, 大强度运动后期,态3 呼吸速率下降,r o s 快速增加“,过多的r o s 能引起n a d h 脱氢酶的活性和线粒体内膜复合体的功能降低”“3 ,导致以呼吸链缺损和解耦联 为标志的线粒体能量转换下降。5 1 ,还会引起细胞凋亡“7 ”1 。 自由基攻击细胞膜,能降低膜流动性继而使细胞膜上的n a + _ k + _ a t p a s e 活性 下降”。f o w l e s 发现无论是2 1 m m i n 的水平跑台运动,还是l o m m i n ,坡度为 8 的耐力跑台运动至疲劳或力竭时,大鼠红肌、白肌细胞膜n a + ,k + - a t p a s e 活性均 1 1 电刺激c 2 c 一2 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 降低,红肌利白肌之问比较无差异“1 ,f r a s e r 也发现刁i 论j 量型、耐力型运动员 还是无训练者,其肌膜n a + ,k + - a t p a s e 的活性都在疲劳时被抑制,提示这种变化是 肌肉疲劳的决定因子之一。“。 剧烈运动提高骨骼肌细胞液中、细胞外空间和血管分隔间的r o s 水平,从而 提高了氧应激的生化指标水平。线粒体的主要抗氧化系统有s o d 、m d a 、g p x , 细胞色素c 等,这些抗氧化系统对防止和减轻组织自由基损伤和线粒体损伤而 引起的组织功能下降有重要作用。多数研究表明,一次急性运动可引起心肌、骨 骼肌和肝脏等组织s o d 、c a t 和g p x 等抗氧化酶的活性增高”1 。m o r a n 观察长时 间有氧运动对线粒体抗氧化能力的作用时发现:与对照组相比,2 4 周运动组大 鼠心脏总的抗氧化酶( t s o d ) 和m t s o d 、6 p x 和g r ( 谷胱苷肽还原酶) 的活性均 显著升高,而1 2 周运动组则无变化。说明长期耐力训练( 2 4 周) 能引起大鼠心 肌抗氧化酶活性增加,而短期训练( 1 2 周) 则对心脏抗氧化能力的增加作用不 大。机体抗氧化能力的提高可减轻氧自由基对线粒体蛋白质、腊类及m t d n a 的损 伤,改善线粒体氧化磷酸化功能。当然体外补充v i t a m i ne 、c 等抗氧化物质也 能显著提高骨骼肌的抗氧化能力”“ 剧烈运动时骨骼肌产生的大量自由基会对机体造成一定程度的损伤。但低水 平的自由基则有利于调节骨骼肌的收缩功能,能增加力量输出m 1 。目前,通过单 个完整肌纤维来研究r o s 调节骨骼肌收缩的可能机制已取得了一定进展,然而, 由于没有相连的肌纤维所可能产生的旁分泌作用和细胞骨架的附着对r o s 生成 的影响,现阶段采用的标本还存在着一定的局限性1 。若能系统地使用完整肌纤 维进行研究,可能有助于我们了解r o s 对肌质网c a 2 + 释放作用、肌原纤维对c a ” 的敏感性以及c a ”的再摄取作用的相对重要性,有助于解决细胞水平上长期存在 的有关氧化还原调节问题,为将来分子机制的研究奠定基础。 1 2 选题依据 正常情况下,机体内自由基的生成和分解处于动态平衡中,但在急性剧烈运 动时迅速增加,当自由基的生成超过机体的分解能力和分解能力减弱时,就会对 细胞造成一系列损伤,受损的细胞还会进一步加剧自由基的生成。这一恶性循环 使人们认识到,运动与自由基的形成是一对无法抗拒的矛盾。然而由于方法学的 电刺激c 2 c 。收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 限制,对r 运动训练中骨骼肌r o s 生成的直接证扼较少,人量证据来源j :脂质过 氧化物。“和d n a 损伤产物等的测定,多是在分离组织后,通过测定活性氧损伤的 结果间接反映活性氧水平,而无法直接定量测定活性氧虽电子自旋共振技术 ( e s r ) 可直接测定活性氧,但设备昂贵,操作复杂。以二氯荧光素作为荧光探针, 利用流式细胞仪检测白细胞、脑神经细胞内的活性氧已有报道“6 6 “,而实时检测 骨骼肌细胞活性氧产生的文献较为鲜见,聂金雷“”等也是在组织分离后提取线 粒体检测的。而二氯荧光素具有穿透细胞膜的特性,进入细胞内后,可以被细胞 内的酯酶水解,形成无荧光的还原型二氯荧光素( d c f h ) ,d c f h 不能通透细胞膜, 从而使探针很容易被装载到细胞内。本实验以二氯荧光素为探针,利用荧光分光 光度计实时检测c 。c 。肌管内产生的活性氧,可为以后研究氧应激的机制及自由基 诱导的基因调控提供更有效直观的证据。 c 。c 。:细胞是培养的小鼠骨骼肌成肌细胞,它可以在培养过程中进行分化,合 成出与在体骨骼肌细胞相同的收缩蛋白、通道蛋白及多种受体等。且电刺激可引 起分化的肌管出现有规律的收缩运动”7 ,其收缩力量一钙浓度变化曲线也与在 体骨骼肌细胞相同5 3 ,因此,可以认为该细胞是研究骨骼肌收缩功能的适宜细胞 模型。研究发现,低频电刺激肌管能迅速改变骨骼肌细胞基因表达“”1 。高频刺 激则引起肌管内钙震荡,胞内钙离子浓度增加“5 17 “。若加大电压,一次性电刺激 标准多孔板培养的c 。c ,。肌管9 0 分钟,能使细胞内葡萄糖代谢和肝糖原动员加速 ”“。由此可知,电刺激肌管能够产生与运动肌同样的收缩反应及代谢变化,而不 同电刺激强度所引起的变化却并不相同。 本实验使用培养的c :c ,。细胞,电刺激引发肌管收缩运动,检测肌管内产生的 r o s 和抗氧化酶等活性的变化,分析、对比在体骨骼肌有氧以至力竭收缩运动时 所引起的自由基代谢及n a - ,k + - a t p 酶活性的变化特征,试图建立骨骼肌收缩研究 的细胞模型,为今后更深入的研究自由基产生机理及自由基诱导的信号转导提供 新的有价值的参考依据,也为探讨延缓和消除自由基产生的方法,提供与在体 研究相互补充的有益平台。 电刺激c 2 c - 2 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 2 实验正文 2 1 材料和方法 2 1 1 材料 2 1 1 1 主要实验器械和仪器 b c m 1 0 0 0 a 型生物洁净工作台 b b 5 0 6 0c o 。孵箱 c k x 4 1 倒置相差显微镜 f a 2 0 0 4 电子天平 i o i a 一1 干燥箱 t d l 一5 型离心机 g s y i i 型电热恒温水浴锅 细胞计数板 培养瓶,培养皿,滤膜 7 2 1 分光光度计 y x 一2 8 0 手提式压力蒸汽消毒器 p h s 一2 9 a 型p h 计 b c d 1 7 9 c 冰箱 真空泵 t y c 型电刺激器 9 6 0 m c 荧光分光光度计 小型玻璃匀浆器 f i n n p i p e t t e 可调式微量移器 2 1 1 2 主要材料和试剂 c 2 c 1 2 细胞 高糖d m e m 胰蛋白酶 胎牛血清马血清 高纯度小牛血清蛋白 苏净集团安泰公司 h e r a e u s 公司 0 l y m p s 公司 上海天平仪器厂 上海市实验仪器总厂 上海安亭科学仪器厂 北京市医疗设备厂 求精生化仪器有限公司 g i b c o 公司 山东高密分析仪器厂 江阴滨江医疗设各厂 上海雷磁仪器厂 l g 公司 n a l g e 公司 成都仪器厂 上海三科仪器有限公司 威佳公司 芬兰 中国医学科学院基础医学研究所提供 g i b c o b r l s i g m a h y c l o n e s i g m a 1 4 电刺激c 2 c - 2 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 j | e f e s ,e d t a 5 i g m 8 活性氧检测试剂盒碧云天生物技术研究所( b e y o t i m eb i o t e c h n o l o g y ) m d as o d 线粒体a t p a s e 试剂盒 均购自南京建成生物工程研究所 葡萄糖,乙酸钾,无水乙醇,t r i s 饱和酚等为国产分析纯试剂 2 1 1 3 主要试剂的配制 d m e m 培养液 ( 1 ) 材料准备 三蒸水 碳酸氢钠( n a h c o 。) 青霉素注射液 链霉素注射液 d m e m 干粉( 1 3 4 9 袋) ( 2 ) 培养液配制 1 0 0 0 m l 3 7 9 1 0 0 u m 1 0 0 ug m l 1 袋 8 将d m e m 干粉加入含三蒸水的量杯中,用玻璃棒充分搅拌均匀。 b 将准备的配方材料一并加入d m e m 液中,拌匀。 c 在量杯中严格补充三蒸水总量共1 0 0 0 m l 。 ( 3 ) 无菌处理 a 将多个容量分别为l o o m l 、2 5 0 m l 的耐高压瓶及瓶塞高压灭菌处理备 用。 b 清洁超净工作台,7 5 酒精擦台面,紫外线将工作台灭菌6 0 分钟 c 清洁双手,穿无菌衣,在超净工作台中,酒精灯进行瓶口及塞子灭菌, 用漏网直径为0 2um 的漏斗形过滤器,分小瓶过滤好培养液,无菌状 态下配装好,放- - 2 0 冰箱中保存。 d 取l o m l 培养液( 无菌) 作细菌及霉菌培养。如细菌及霉菌培养有菌则 全部培养液重新处理或重新配制。如无菌则冰冻保存,使用前复温 ( 4 ) 、胎牛血清5 0 m l ,无菌状态下加入配制好的d m e m 培养液中,按1 0 浓度 新鲜配制使用。 电刺激c 2 c t z 收缩运动对自由基代谢影响的实验研究 d - h a n k 的配制 ( 1 ) 材料的准备 k c l k h 2 p 0 4 n a c l n a h c 0 3 n a h p 0 4 7 h 2 0 酚红 三蒸水 ( 2 ) d - h a n k 的配制 0 4 9 0 0 6 9 8 9 0 3 5 9 0 0 6 9 0 0 2 9 l o o o m l a 每个成分依次溶解于水中; b 用数滴5 6 的n a h c 0 3 溶液溶解酚红: c 将b
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