（化学工艺专业论文）胸腺肽微胶囊的制备工艺和性能研究.pdf

墅垦查堕查兰堡主堂垡堡奎 ， 摘要 为了寻找适于多肽分了吸收，免疫学e “有效”、“安全”且服用方便的口服制剂本 课题以胸腺肽为模趔药物选用不同方法、不同囊材制各药物微胶囊。以聚乳酸为囊材，采用 复相乳液法制得了胸腺肽聚乳酸微球；以药用明胶为囊材，采用乳化交联法制备了胸腺肽明 胶微球；采用乙基纤维素为囊村，采用液中干燥法分别制备了胸腺肽乙基纤维素微囊。 通过差热分析证明载药微胶囊已较好形成，通过测定粒径火小及分布，测定微囊药物的 禽量，从而计算得到了微球的载药量、包封率及体外释药曲线，并考察了其稳定性。综合讨 沦了各影响冈煮对微胶囊表面形态，囊心药物缓释作用的影响。利用正交实验方法优化了制 备t 艺，制备得到了能人幅提高胸腺肽的药物释放胜能，增强疗效的微胶囊。 复相乳液法制备胸腙肽聚乳酸微球的最佳_ t 艺为聚乳酸溶液浓度s5 ( w ) ，内水相油相 比l 1 0 ，内水相胸腺肽药物浓度1 ( w ) ，初乳搅拌速度9 5 0r r a i n 一，初乳乳化剂浓度o8 ( w 1 ， 乳化温度15 。c ，初乳乳化时间5 m i n ，挥发揽拌时间5 h ，外水相明胶浓度o5 ( w ) ，所制备的 胸腺肽聚乳酸微球外观为米色，平均算术粒径为1 3 8 2 口m ，载药量为o 。1 9 6 9 m g 胸腺肚粉m g 微胶囊，包封率8 0 6 7 ；前期平均累积溶出度l 3 u , t i s 3 的平方根号良好的线性关系属t ”2 级释放，符合h i g u c h i 方程，q = 2 4 7 2 7 7 + 2 0 3 4 6 8 7 t “2 ( r = 0 9 9 6 ，n = 1 0 ，p 00 0 0 1 ) ，后 期释药速度变慢，变平缓；释药半衰期为2 9 5 m i n 。 乳化交联法制备胸腺肽明胶微球的展佳工艺为明胶溶液浓度为】2 5 ( w ) ，超卢乳化时 间为4r a i n ，搅拌速度为8 0 0r m i n 一，乳化荆用蹙为o ，5 2 ，溶解oi g 胸腺肽的水用量为5 m l ， 所制备的胸腺肤明胶微球外观为淡黄色，平均粒径为1 4 6 6 肚m ，载药量为o18 9 9r n g 胸腺肽 粉m g 微胶囊，包封率8 0 4 4 ；前期平均累积溶出度与时间的平方根黾良好的线性关系， 属i “2 级释放，符合h i g u c h i 方程，o = 1 5 2 5 9 1 + 3 0 0 0 9 6t “2 ( r = 0 9 9 3 ，n = l l ，p 0 0 0 0 1 ) ， 后期群药速度变慢、变平缓，最后随着微球骨架的全部溶蚀产生了末端溶蚀效应：释药半 衰期为1 3 0m i n 。 液中干燥法制备胸腺肽乙基纤维素微胶囊的最佳工艺为乙基纤维素丙酮溶液浓度为 2 5 5 ( w ) ，搅拌速度为9 5 0r - r a i n 一，挥发温度为3 5 ，乙基纤维素胸腺肽的质营比为到】， 埂月日酸镁占溶液重量比为i 5 ( w ) ，所制各的胸腺肽乙基纤维素微胶囊外观为米白色，平 均粒径为5 2 9 5 肚m ，载药量为o2 0 3 0m g 胸腺肽粉m g 微胶囊，包封率7 9 8 3 ：前期甲均 累积溶出度与时间的平方根呈良好的线性关系，属t ”级释放，符合h i g u c h i 方稃，q = 6 8 8 5 9 + 3 4 8 2 9 1 t ”2 ( r = 0 9 9 4 ，n = 1 0 ，p 0 0 0 0 1 ) ，后期释药速度变慢、变平缓，最后随着微球 骨架的全部溶蚀产生了末端溶蚀效应；释药半衰期为8 0m i n 。 结果表明：复相乳液法制备的胸腺肽聚乳酸微球平均粒径最小，载药枯和包封率符合要 求，释药半衰期虽k ，为胸腺肽原药的4 3 倍，并且具有良好的生物相容性和曲液相容性， 鼠有良好应用前景。作者希望所获得的制备方法利_ 丁艺可以推广到类似的药物或化学物质的 微胶囊化过程中，使之具有研究的可延续性。 关键诃：胸腺肽，微胶囊，微球，聚乳酸，复相乳液法，明胶，乳化交联法，乙基纤维素 液中干燥法 型些 查壹奎兰堕主丝堡壅 一一 a b s tr a c t i no r d e rt oo b t a i nak i n do fc o n v e n i e n to r a ld o s a g ef o r m so fp r o t e i n ，w h i c hc a nb ea b s o r b e d f u l l ya n di s o f f i c i e n ta n ds a f e ，t h em e d i c a m e n tm i c r o c a p s u l e so ft h y l n o p e p t i d ea r ep r e p a r e db y u s i n 2s e v e r a ld i f f e r e n tm e t h o d sa n dv e s i c l em a t e d a l s t h y m o p e p t i d e p o l y l a c f i ca c i dm i c r o s p h e r e i sp r c p a l e db yd u p l i c a t e l a t i c e sm e t h o da n dp o t y l a c t i ca c i di su s e da ss h e l lt h y m o p e p t l d e g e l a t i n m i c r o s p h e r ei sp r e p a r e db y e m u l s i f i c a t i o nc h e m i c a l c r o s s l i n em e t h o da n dg e l a t i ni su s e da ss h e l l t h y m o p e p t i d e e t h y l c e l l u l o s em i c r o c a p s u l ei sp r e p a r e db yi n t r a l i q u i d d e s i c c a t i o nm e t h o da n d e t h y l c e l l u l o s ei su s e da ss h e l l t h ef o r mo ft h em e d i c a m e n tm i c r o c a p s u l a so ft h y m o p e p t i d ea r ep r o v e db yd t a a n dt h e t h y m o p e p t i d ec o n t e n ta n dp a c k a g er a t i oo fm e d i c a m e n tm i c r o c a p s u l e so ft h y m o p e p t i d ea n dd r u g r e l e a s ei nv i t r oa r ec a l c u l a t e db ym e a s u r i n gp a r t i c l es i z ea n ds i z ed i s t r i b u t i o n ，a n db ym e a s u r i n g t h em e d i c a m e n tc o n t e n t a n ds t a b i l l t yo ft h em i c r o c a p s u l ei sa l s om e a s u r e d 。t h ei n f l u e n c eo f s e v e r a lf a c t o r $ o nt h es u r f a c ec o n f o r m a t i o no ft h em i c r o c a p s u t ea n dt h es u s t a i n e de f f e c to ft h e m e d i c a m e n ta r ed i s c u s s e ds y n t h e t i c a l l y o r t h o g o n a ld e s i g ni su s e dt oo p t i m i z et h et e c h n o l o g yo f p r e p a r a t i o n t h em i c r o c a p s u l ew h i c hc a nb eu s e dt oi m p r o v et h eb i o a v a i l a b i l i t ya n dc u r a t i v e e f 论c to f t h y m o p e p t i d ei sp r e p a r e d t h eo p t i m a l p r e p a r a t i o nt e c h n o l o g y o ft h e t h y m o p e p t i d e - p o l y t a c t i c a c i d m i c r o s p h e r e p r e p a r e db yd u p l i c a t e - l a t i c e sm e t h o dt i r et h a tc o n c e n t r a t i o no fp o l y l a c t i ca c i di s 55 ( w ) ，r a t i oo f w a t e rp h a s et oo i lp h a s ei s1 i 0 ，c o n c e n t r a t i o no ft h y m o p e p t i d ei nt h ew a t e rp h a s ei st ( w ) ，m i x s p e e d i nt h ee l e m e n t a r yl a t e xi s9 5 0r m i n ，c o n c e n t r a t i o no fe m u l s i o ni so 8 ( w ) ，t e m p e r a t u r ei n t h eu l t r a s o n i ce m u l s i f i c a t i o ni s1 5 ，e m u l s i f i c a t i o nt i m ei s5 r a i n ，v o l a t i l i z a t i o nt i m ei s5 h ，a n d c o n c e n t r a t i o no fg e l a t i ni nt h ee x t e r n a lw a t e rp h a s ei so5 ( w ) t h y m o p e p t i d e p o l y l a c t i ca c i d m i c r o s p h e r ei se c r u ，t h ea v e r a g ea r i t h m e t i cg r a n u l a r i t yd i a m e t e ri s138 2 m ，a n dp a c k a g er a t i oo f t h y m o p e p t i d e p o l y l a c t i ca c i dm i c r o s p h e r ei s 8 0 6 7 r e l a t i o nb e t w e e nt h ep r o p h a s ea v e r a g e c u m u l a t er e l e a s eq u a n t i t ya n dt h es q u a r er o o to ft i m ei sl i n e a r t h ed r u gr e l e a s ei nv i t r oc a nb e d e s c l i b e d b y m o d e lo f h i g u c h ie q u a t i o n q = 2 ，4 7 2 7 7 + 2 03 4 6 8 7 t ”2 ( r = o 9 9 6 ，n = 1 0 ， p 0 0 0 01 ) ，w i t ht h et l ，2i nv i t r oi s2 9 5 m i n f h eo p t i m a lp r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yo ft h et h y m o p e p t i d e - g e l a t i nm i e r o s p h e r ep r e p a r e db y e m u l s i f i c a t i o nc h e m i c a l c r o s s l i n em e t h o da r et h a tc o n c e n t r a t i o no f g e l a t i ns o l u t i o ni s 12 5 ( w ) ， u l t r a s o n i ce m u l s i f i c a t i o nt i m ei s4r a i n ，m i xs p e e di s8 0 0 r 。r a i n 。q u a n t i t yo f e m u l s i o ni so 5 9 ，a n d q u a n t i t yo fw a t e ru s e dt od i s s o l v e0 ，1gt h y m o p e p t i d ei s5 m l ，t h y m o p e p t i d e - g e l a t i nm i c r o s p h e r e i s f l a x e n ，t h ea v e r a g ea r i t h m e t i c g r a n u l a r i t y d i a m e t e ri s 1 4 6 6 “m ，a n dp a c k a g er a t i o o f t h y m o p e p t i d e g e l a t i nm i c r o s p h e r ei s8 0 4 4 r e l a t i o nb e t w e e nt h ep r o p h a s ea v e r a g ec u m u l a t e r e l e a s eq u a n t i t ya n dt h es q u a r er o o to f t i m ei sl i n e a r = t h ed r u gr e l e a s ei nv i t r oc a nb ed e s c r i b e db y m o d e lo f h i g u c h i e q u a t i o n ，q 2 1 5 2 5 9 1 + 3 0 0 0 9 6 t “2 ( r = 09 9 3 ，n = 1 1 ，p 外水相明胶浓度。 根据直观分析，制备微球的优选组合为a 2 8 3 c 4 d 2 e 3 ，即聚乳酸溶液浓度5 ( w ) 、内 水柑例j 相比1 1 0 、初乳搅拌速度1 0 0 0rm i n 一、初乳乳化剂浓度0 8 ( w ) 及外水相明胶浓度 o 5 ( w ) ，以此丁艺制备t h t p m s 微球。结果详见表2 2 。 2 1 2 胸腺肽聚乳酸微球的测试 1 载药微胶囊形成的验证： 采用摹示热分析实验验i 止，丁作条佴：扫描温度为4 0 4 0 0 ，量程5 “v ，升湍速率 为j o c r a i n ”，纸遮为l o o m m r a i n 一气氛为氦气，分别测得药物、空自囊材、载药微球的 茅热分析曲线，根据其热吸收峰进行探讨、验证。 2 微胶囊载药量的测定： 根据中国生物制品规程一部( 1 9 9 5 年版) 微量法( i o r y 法f o l i n 酚试剂) 测定 微球中胸腺肽含量，三种胸腺肽微胶囊刮采用以f 同种方法测定。 原理：受向质多肽分了中龠育肽键及酪氪酸和色氢酸等残基能与r o l i n 一酚试剂起氧化还原 反应生成兰色化合物，在一定浓度范嗣内，其呈色反应( 兰色) 的深浅与蛋白质浓 度呈线性关系，故可以进行比色测定。 仪器：7 2 1 型分光光度汁；t g 3 2 8 a 电光分析灭平； 实验中所用的溶剂均为分析纯试剂。 步骤：f o i n 一酚法测定微胶囊中胸腺肽的含量 ( 1 ) 碱性性铜溶液( 试剂) 的配制( 国标法) ： a ) 称取n a 0 h3 9 ，加水l o o m t 溶解，并称取1 5 9 无水碳酸钠加入到上述溶液中，溶 解。标为溶液a ： b ) 称取酒石酸钾0 i 5 9 ，加水2 0m l 溶解，再称取瓦水硫酸铜0 0 7 5 9 ，加入并溶 解，为溶液b ： c ) a 、b 溶液台并加水使终体积为t 5 0m i ，将溶液从鼍筒中转移到试剂瓶中，贴 上标签。 ( 2 ) 配置2 0 0m l0 0 3 m 的磷酸盐缓冲液： a ) 准确称取十二水台磷酸氢二钠1 8 9 1 3 9 ，二水合磷酸二氢钠0 1 1 2 4 9 ，混合倒八 小烧杯； b ) 加蒸馏水溶解后倒入2 5 0m 1 量筒，将量筒液面升至2 0 0m l 轰l ! 度： c ) 将溶液从量筒中转移至盐水瓶，高雎蒸汽消毒后，贴上胶布及标签。 ( 3 ) f o l i n 试剂的配制 a ) 将钨酸钠( n a z w o 2 h 2 0 ) l o o g ，铝酸钠( n a 2 m 0 0 1 2 h z o ) 2 5 9 ，水7 0 0 m l ，8 5 磷酸5 0 m l ，浓盐酸l o o m l ，置于1 5 0 0 r a l 磨口圆底烧瓶中，充分溶解混匀厉接l 磨口玲凝管，回流1 0h ； b ) 往上述溶液中加入硫酸锂1 5 0 9 ，水5 0 m l 及溴液数滴，开口煮沸1 5 m i n 驱除 过量的溴，冷却后稀释至1 0 0 0 m l ； c ) 将得到的溶液过滤+ 所得的微黄绿色滤液为f o l i n 试剂，贮于棕色瓶中备用 ( 4 ) 配制f o l i n 操作液( 需临用前配制) ； a ) 量取4m 1 f o l i n 试剂，加入27m l 水得到6 7m ll n 的f o l i n 溶液 b ) 往67m l1 n 的f o l i n 溶液中再加入5 36m i 水( 8 倍) 得到6 03 l i i f i o i n 操 作液。 1 7 壁垒查童奎堂堡主堂垡堡茎 ： ( 5 ) 标准曲线的测定： a ) 取牛血清白蛋白标准品1 28 r a g 用00 3 m 磷酸盐缓冲液( p h = 78 ) 配制成0 3 m g 蚩l 气m l 的标准蛋白溶液； b )取6 支试管，分别编号，按表2 3 所示依次加入各溶液 表2 3 c ) 将上述溶液于5 56 c 水浴t p 准确加热5m i i l ，用水冷却1 0m i n 在6 5 0n m 处测定 吸光度a ； d ) 以标准蛋向浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，并计算得出标准曲线的回归 方程 3 微囊样品的含量测定 精密称取定茸的优化t 艺的微球( 相当于2 5 m g 胸腺肽原药) ，于研钵q t 研到，用上述磷 酸盐缓冲液溶解，用高速离心机离心5 mj n ，吸取上层清液用磷酸盐缓冲液于5 0 m 容量瓶中 定容。用上述方法同样测定其吸光度a ，通过标准曲线回归方程得出样品蛋白浓度c 。 实验所用的胸腺肽原料的蛋闩含量为0 3 6 4 5m g 蛋n m g 胸腺肽粉。则微囊中样品的蛋 白含餐浓度c 通过计算换算成微胶囊中的胸腺肽含量，井山下式计算微胶囊f 内载药量和包封 率。 载药量= ( 微胶囊中胸腺肽含量微胶囊总质餐) x1 0 0 包封率= ( 微胶囊中胸腺肽含量，所授的胸腺肽质置) 1 0 0 4 体外释药实验 根据2 0 0 0 版药典规定【6 ，采用浆板法测定溶出度。 仪器：z r c 一4 型智能溶出实验仪，7 2 1 型分光光度汁，t g 3 2 8 a 电光分析天平 精密称取胸腺肽微胶囊定量( 相当于3 0 r a g 胸腺肽原药) 3 份和胸腺肽原药3 0 r a g3 份。分 别装入v i s k i n g 透析膜后放入6 个装有2 0 0m lp h 值为68 的人工肠液的溶出杯中，水浴叵 温f ( 3 7 0 o 5 ) ，搅拌速度7 5r m i n ；两者都分别在不同的八个时段时取样井及时 补充相同体积的释放液于溶“1 杯中；样液立即以2 0 0 0r m i n 的速度离心2m j l l ，吸取上清 液定容后，同上以l o w r y 法测定其含量计算载药微球和原药的累移 释药百分数( 其中载药 微球以同法操作的不含药物空白微球为参照) ，以累积释药量嘶对时间t 作图，得到微胶囊 内药物的体外释放曲线图。 5 微球中药物的稳定性1 6 l j 热稳定性实验： 取胸腺肽微胶囊适量置于带密封盖的瓶中，分别于室温f 和4 0 c 恒温箱中，在o 、1 0 、 3 0 、9 0 d 分别采样，观察其外观、色泽的变化：9 0 d 后连同原始样品一起采用1o w y y 法作胸 腺肽禽鞋的定量检查。 邹良东南大学硬士学位论文 2 2 结果与讨论 1 t h t p m s 的表面形态分析 选取优化 艺制备的t h t - p m s 微囊产品，利用带测微尺的o l y m p u s 光学显微镜观察 6 0 0 个微球，以每2 “m 为一间隔所含微球个数除以微球的总个数得微球的频率，以频率为 纵坐标，粒径为横坐标，绘制粒径分布图，计算平均算术粒径得1 3 7 8 肚m 。见图2 1 。 享 、 搽 、 衄 褂 曝 0481 2 1 62 02 42 8 粒径分布u m 图2 - 1t h t p m s 粒径分布图 t h r - p m s 的外观为米白色微球，样品喷金罱用扫描电镜观察发现微球外观圆整，火小较均 图2 - 2t h t - p m s 的扫描电镜照片 1 9 0 8 6 4 2 o 8 6 4 2 0 邹良东南大学硕士学位论文 2 载药微胶囊形成的验证： 通过差热分析实验分别测得胸腺肽药物、聚乳酸空白囊村、胸腺肽聚乳酸微球的差示热 分析曲线图。山图中可以看出胸腺肽原药在1 4 0 1o c ； n2 2 9 9 分别有两个热吸收峰：而胸 腺肽聚乳酸微球只在3 3 6 5 有一热吸收峰，在前面温度段无明显热吸收峰：聚乳酸空白囊 i b a ：胸腺肽原药；b ；聚乳酸空白囊材；c ：胸腺肽聚乳酸微球； 图2 - 3 差热分析曲线图 材只在3 6 2 2 有一热吸收峰，在前面温度段无其余热吸收蜂；表明药物不是与囊村的简单 物理混合或存在于微球表面，而是被很好地包裹在微球的内部，说明载药微球已经形成。 3 标准曲线的建立 蛋白质的禽量测定方法较多，常用的有克氏定氮法，紫外吸收法和l o w r y 的f o i i n 一酚 试荆法等。其中克氏定氮法易受非蛋白含氮物的干扰，且测定手续繁杂，费时多，检 i 灵敏 度低；紫外吸收法虽方法简便，但检山限较高( 5 0 口g 以上) ；l o w r y 的f o l i n 一酚试剂法是 根据蚩白质( 或多肽) 分子中所含肽键和酪氨酸、色氨酸等