（生物化学与分子生物学专业论文）胆红素氧化酶的制备及应用.pdf

摘要摘要胆红素氧化酶( b i l i m b i n o x i d a s e ，简写为b o d ，e c 1 3 3 5 ) 是一种临床诊断用酶，通过它检测人体内胆红素水平可判断是否患有肝脏等疾病。本实验以露湿漆斑菌( 朋伽历口c f “肌加，珧l 掰，埘r ) 为原材料，经过冷冻干燥浓缩，d e a e s e p h a r o s e 阴离子交换层析对膨豫b o d 进行了分离纯化，获得电泳纯。实验测定其分子量约为5 1 k d 、等电点为4 5 ，希夫试剂染色证明其为糖蛋白。这些生化特性都与疣孢漆斑菌( 坳咖p c f 姗zw “c 肠， 彳y ) b o d 不同，而且稳定性更佳。根据g e n b a n k 中b o d 基因和多酚氧化酶的保守区序列设计简并引物，利用p c r从膨职的染色体d n a 中扩增得到长度为1 2 k b 的基因片段。通过序列比对，朋豫b o d与b o d 基因相似性可达9 5 3 5 。本实验还建立了一活性染色法，该方法通过b o d 能够特异地将胆红素氧化成胆绿素的原理，利用酶与底物的特异反应，可以在凝胶上进行底物染色来直接显示酶的活性区带。这种活性染色可以采用胆红素直接溶入分离胶后电泳( 胆红素p a g e ) ，也可以在电泳后置于胆红素溶液中染色( p a c e 胆红素) 。其中p a g e 胆红素方法在2 0 m i n 后即在凝胶上出现深绿色的b o d 条带，随着时间延长，凝胶上的绿色酶条带逐渐扩散，最终形成透明条带：而运用胆红素p a g e 的方法则在1 2 h 后才能在凝胶上看见透明的b o d 所在的条带。相比之下，前者更为简便、快速、灵敏。利用膨职b o d ，测定人血清总胆红素，胆红素浓度为o 7 0 “g m l 的范围内线性基本保持良好，初步证明m 豫b o d 具有临床应用前景。关键词露湿漆斑菌胆红素氧化酶离子交换层析分离纯化活性染色基因a b s t r a c ta b s t r a c tb i l i m b i no x i d a s e ( b o d ) i sak i n do fe n z y m ei i lc l i n i c a ld i a g n o s t i c s i th a sb e e nu s e dt od e t e m i n em e 锄o u n to f b i l i m b i ni ns e r u mf o r t h ec l i i l i c a l i n v e s t i g a t i o no fl i v e r i nt h i ss t u d y w eh a do b t a i n e db o da se l e c t r o p h o r e s i sp u r i t ) ，b ym e a n so ff r e e z e d r yc o n c e n 咖ea n dd e a e c e l l u l o s ec h r o m a t o g r a p h y 舶mf e n l l e n t a t i o nb r o t ho f 岣粕历p c f 删，0 ，眺l 撒( 艘r ) t h er e s u l ts h o w e dt h a tm o l e c u i a rw e i g h t so fm 豫b o d 、2 l s51 l c o m p a r i n gw i t hb o df 而m 蜘施p c f 甜，1w 玎w 甜切( ，删b o dw 笛d i f r e r e n c ei nm em o l e c u 妇、v e i g h t ，i s o e l e c t r i cp o i n ta n ds t a b i l i 吼a c c o r d i n gt ot h ee n c o d i n gs e q u e n c eo ft h e l l yb o dg e n ea n dp o l y p h e n o lo x i d a s eg e n ei l lt h eg e n b 锄k ，t l l ed e g e n e r a t ep r i m e r s 、v e r ed e s i g n e da n dm e1 2 k bd n a 五陬g m e n t 哪o b t a i n e df 西m 脚b o d sd n ab yp c ra l _ n p l i f i c a t i o n d n as e q u e n c i n gs h o 、v e d ，t 1 1 es e q u e n c eh a dr e l a t i v e l ym g hs i m i l 撕t y ( 9 5 3 5 ) 、玑t l l 汀y b o d i i lt l l i ss 吣d y ，w ea l s o f o u i l dt h ea c t i v e - b a n do fb i l i m b i n 似i d a s ei np a g ec o u l db ed e t e c t e de a s i l yw l l i c hw 弱b a s e do no x i d a t i o no ft h eb i l i m b i ni n t 0b i l i v e r d i nb yt h ee n z y m e ，a n d 也eb a n db e c a m ee i t h e rg r e e no rt r a i l s p a r e n t t h eo n l yd i 绦：r e n c ew a st os t a i nt h eg e li nt h eb i l i r u b i ns o l u t i o nf o r2 0m i n u t e sa r e rt h ee l e c t r o p h o r e s i sa u l dt h eg r e e nb a n d so ft h eb i l i m b i no x i d a s ec o u l db eo b s e r v e do nt h eg c l w i t ht h et i m ep r o l o n g ，也e 擎e e nb a n d so ft h eb i l i r i b i no x i d a s ei i lt h eg e l 铲a d u a l l yb e c a m e 饿m s p a r e n t o fc a u s et h em e t h o dc o u l db ep r o c e s s e db ya d d i n gb i l i r u b i ni n t 0p o l y a c 巧l a m i d eg e i ( b i l i n l b i n - p a g e ) t o o ，m et r a n s p a r e n tb a n d so ft h eb i l i r u b i no x i d a s eo nt h eg e lc o u l da l s ob eo b s e r v e d ，b u tt h eg e ln e e dt ob ep l a c e di i lt h ed 砌o mf o r12h o u r s c o m p a r ep a g e - b i l i r u b i na n db i l i r u b i n p a g e ，m ep a g e - b i l i m b i na c t i v e - s t a i n i n gm e m o di sm o r ec o n v e i l i e n t ，f 瓠ta n ds e n s i t i v e w bu s e d 4 刀2b o da sar e a g e n tt od e t e m l i i l e ds e r u mt o t a lb i l i m b i n w h e nb i l m l b i nc o n c e n t r a t i o no fs e n l mt o t a lb i i i r u b i nw 鹤i i lm n g eo f0 7 0pg m l ，t h ec h a n g eo fo d 4 5 0w a sl i n e 札s o 脚b o dc a l lb eu s e da sar e a g e n tt 0d e t e m l i n es e m mt o t a lb i l i m b i ni nm ec l i i l i cd i a g n i s i s 1 ( e yw o r d s ：拟弘凇珐e c f “掰，d r 翕妇俄；b i l i r u b 洫o x i d a s e ；i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o 铲a p h y ；p u r i f i c a t i o n ；a c t i v e s t a i l l i n g ；g e n eh河北大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。作者签名：弦! 焦日期：墅芝星年l 月止日学位论文使用授权声明本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本学位论文属于1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。2 、不保密舀。( 请在以上相应方格内打“”)保护知识产权声明本人为申请河北大学学位所提交的题目为( 阳钮秦晕弘晦角 j 刊备恿声同)的学位论文，是我个人在导师姨蛳桶) 指导并与导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。声明人：噜伟日期：2 业g 年l 月上l 日作者签名：整2 隆日期：2 丝呈年l 月卫日导师签名：日期：础年厶月! 至日第1 章序言第1 章序言1 1 胆红素1 1 1 胆红素简介胆红素是铁叶琳化合物在人体内的代谢产物之一，主要来源于衰老红细胞崩解后的血红蛋白，随胆汁排泄。工业上主要是从胆汁中提取得到胆红素。它是淡橙色或深红棕色的单斜晶体，在生理条件下难溶于水，可溶于苯、氯仿及二硫化碳等有机溶剂中，微溶于乙醇和乙醚，也可溶解在热的乙醇与氯仿的混合液中。因分子中有两个丙酸基侧链，故胆红素是弱酸，易溶于碱。其钠盐易溶于水，但钙盐、镁盐、钡盐，则不溶于水。其干燥固体较稳定，氯仿溶液置暗处也较稳定，在碱液中或遇三价铁离子则不稳定易发生氧化和异构化。胆红素可与甘氨酸、丙氨酸或组氨酸结合，加血清蛋白、维生素或e d t a可使胆红素稳赳。结构上胆红素为一类线形四吡咯衍生物( 见图1 ) ，存在多种异构体。生物体内由血红素分解代谢产生的胆红素为q ，一般所称的胆红素就是指胆红素q ，其分子式为c 3 3 h 3 6 0 6 n 4 ，分子量是5 8 4 6 5d a l t o n 。胆红素在血清中有三种存在形式：未结合胆红素( u i l c o n j u g a t e db i l i m b i n ，u b ，即游离胆红素) 、结合胆红素( c o 匈u g a t e db i l i m b i nc b ，单葡萄糖醛酸c b m 和双葡萄糖醛酸胆红素c bc 之和) 以及6 胆红素( 白蛋白共价连接胆红素，6b i l i m b i n ，b6 ) f 2 】。c b 不太稳定，容易脱掉葡萄糖醛酸转化为u b 。临床检测采用重氮试剂法，又将胆红素分为直接胆红素( d i r e c tb i l i m b i n ，d b ) 和间接胆红素( 1 1 1 1 d i r e c tb i l i m b i l l ，d b ) ：直接胆红素即直接与重氮试剂起反应的胆红素，包括c b 和b6 ，间接胆红素即u b 。胆红素各组分间的关系：t b ( t o t a lb i l i n l b i n ) = u b + c b + b6tb=db+ubdb=b6 + c b 【3 】河北大学理学硕七学位论文闻接腮红素直接膪红襄嗣l 艇红素及胆红索8 一葡萄糖醛酸苷的结构f i g 1s t r u c t u r eo fb ili r u b i n1 1 2 胆红素分析测定的意义自从s c h m o r 氏1 9 0 4 年提出胆红素脑病以来，人们对胆红素的毒性和危害己有较多了解。凡是胆红素的生成过多或使肝细胞对胆红素的摄取、结合、排泄过程发生障碍，造成胆红素代谢紊乱【4 1 ，都可使血中胆红素浓度增高，出现高胆红素血症，最终导致黄疽【5 】。所有新生儿胆红素聚集水平均高于成年人，其中2 0 的婴儿出现黄疽。由于胆红素结合在细胞膜及线粒体膜上，会造成不同组织中的细胞死亡。在临床上，胆红素毒性可引起智力降低、脑瘫痪、耳聋或死亡。在人和动物的研究中，核黄疽的产生，部分也与胆红素的浓度及暴露于胆红素中的时间长短有关【6 】。因而，血清胆红素测定成为临床医学的一项重要的常规检验项目，是黄疽性疾病诊断和鉴别诊断的一项重要指标，对了解黄疽的深度及疾病的发展均有一定意义。另一方面，胆红素偏低表明人体缺铁( 贫血) ，胆红素偏低还与冠心病心绞痛有关。p a p a d a l ( i s 等f 7 】比较了4 4 3 个早期异常脂血症病人血清胆红素的浓度，其结果也支持血清胆红素和白蛋白偏低与心血管疾病密切相关。此外，胆红素能抑制脂质过氧化反应，在功能上是一种过渡性的重要抗氧化剂，是活体所不可缺少的，胆红素浓度过低也会增加动脉粥样硬化形成的危险性、心脏病的发病率以及糖尿病肾病的发生【8 - 9 】。因此，血清胆红素成分分析在肝胆疾病及溶血性疾病等的诊断、鉴别诊断和预后判断等方面均有很重要的临床意义。胆红素在体内和体外对细胞都有毒性，胆红素正常的生理浓度为1 7 1 1 7 1l lm 0 1 几，血浆胆红素浓度过高可能引起黄疽病和胆红素血症；若浓度高于3 0 0l im 0 1 l ，可能导致神经机能障碍和脑组织细胞功能损伤；另一方面，胆红素既是助氧剂( p r o o x i d a n t ) ，又是抗氧化剂( 锄t i o x i d a n t ) ，它的抗氧化活性主要在于能清除体内的自由基，如过氧离子2第l 章序言( 唧x i d e 锄i o n ) 和超氧自由基( p e r o x i d er a d i c a l s ) ，能抑制脂质过氧化及抑制嗜中性白细胞的过氧化产生【埘。i l k a y a a 等【l l 】研究了胆红素对白细胞的抗氧化作用，发现在生理条件下高浓度的胆红素才具有抗氧化作用。胆红素也是牛黄的主要成分，而牛黄是名贵中药材，具有镇静、解热、降压、促进红血球新生等药理作用，在中医学中得到广泛的应用，目前已有2 0 0 多种中成药含有牛黄或人工牛黄，因而牛黄中胆红素含量是中成药的重要质量指标。因此，胆红素的分析测定在临床、生命科学领域和医药研究中都具有重要意义。1 1 3 血清胆红素的测定方法测定血清胆红素的分析方法很多，如重氮法( d i 锄m e d ) ，直接分光光度法( d n c ts p _ e 咖p h o t o m e 哪，荧光法( n u o r i l i l e t r i cm e m o d ) ，伏安法( v o l t 觚皿e 呦，极谱法o l a m 雄r a p h y ) ，氧化法( o x i d 撕0 nm e m o d ) ，液相色谱法，以及酶法( 朗z y m a l j cm e m o d )除酶法以外，其他方法都是较常规的方法。1 1 3 1 常规方法重氮法是基于胆红素与重氮磺胺酸的反应，广泛用于测定血清总胆红素和直接反应胆红素，2 0 世纪8 0 年代有报道指出重氮试剂不仅与结合胆红素反应也与部分游离胆红素反应，因此所测定的血清中直接反应胆红素的浓度包括结合胆红素和一部分游离胆红素，而且只有7 6 8 9 的6 胆红素被测定为直接反应胆红素【1 2 】。分光光度法也是常用的测定胆红素的分析方法，k t e 臌等【1 3 】利用直接分光光度法测定胆红素总量。该方法的建立是基于多波长吸收，同时还使用了血液气体分析器m 1 0 0 dg a s 觚a l y z 砷，可以准确测定含有不同数量的游离和结合胆红素的样品。荧光法中有报道利用荧光碎灭法进行测定，也有报道利用胆红素和白蛋白在磷酸中的反应进行荧光分析测定。最近k 锄v ak 曲a l l i 等【1 4 】报道利用胆红素和醋酸锌在二甲亚砜溶液中发出的荧光测定了血清中总胆红素浓度。液相色谱法也是常用的方法之一。q 、b 、y 和6 种胆红素最初就是由k n e l l z l e 等【1 5 】通过柱色谱分离后而提出的高效液相色谱法是目前较常用的方法。c r o s i 舻a i l i 提【1 6 】出血清总胆红素浓度的提高，只能反映夏科氏肝硬变晚期的情况，而结合胆红素与胆汁郁积的程度密切相关。为了评估结合胆红素与肝硬化的关系用高效液相色谱法分组检测a 4 例病人中的胆红素含量，发现肝硬化越严重，结合胆红素和总胆红素值越高，但病3河北大学理学硕十学位论文情较轻的对照组中，有肝硬化的病人其结合胆红素的值明显高于无肝硬化的病人而总胆红素的量却没有区别。因此，对于严重的肝硬化，结合胆红素和总胆红素都都相关：但结合胆红素在夏科氏肝硬变中，是胆汁郁积的准确标记。1 1 3 2 酶法酶法是1 9 8 1 年m 嗽。和a l 【a 【1 7 。1 8 1 提出的具有高度特异性的方法。该法是利用胆红素氧化酶( b i l i m b i n o ) 【i d 舔e ，简写为b o d b o x ，e c 1 3 3 5 ) 作为测定胆红素的基础，b o d 催化胆红素氧化经历两个过程：过程1 ：b o d 通过分子氧催化胆红素氧化为胆绿素，反应中产生过氧化氢和水，斟l l r u b i n+ 1 1 1 2 0 2b i l i v e r d i n+ h 2 0过程2 ：胆绿素再被氧化为一种未知物。该过程很复杂，对胆红素的测定主要是基于胆红素最大吸收峰( 约4 5 0 咖) 的减少，酶法是一种较新的方法，也在不断进行优化，通过酶法可以选择测定不同类别的胆红素。1 1 3 3 荧光酶法酶反应与分子荧光结合来测定胆红素是目前较新颖的分析方法。y o l 积d a 等【1 9 l 利用酶的内源荧光以及利用化学修饰酶提出荧光酶法结合多变量校准方法测定胆红素的浓度。b o d 与荧光素衍生物f s 形成化学修饰酶( b o d f s ) ，该物质的最大激发和发射波长分别为4 8 7 咖，5 2 0 i l m 修饰酶的荧光随着胆红素的浓度和类别的改变而变化，因此可一步同时测定直接胆红素和总胆红素浓度。1 1 3 4 传感器近几年利用b o d 制造出了电化学电流传感器( e l e c 们c h e i i l i c a l 锄p e r o m e t r i cs e i l s o r )和光纤传感器( 助e ro p t i cs 饥s o r ) ，用于水溶液和血液中胆红素的分析，在这些传感器中，b o d 薄膜附着于碳电极表面或附着在光纤传感器的末梢。当酶氧化胆红素时，分子氧的减少量就间接表明了胆红素的浓度。“x u 印i n g 等【2 川制作了微型的光纤胆红素生物传感器，用来快速分析血清中的胆红素浓度，该方法是基于钉菲咯琳配合物的荧光碎灭，4第l 章序言而该配合物的荧光强度又与分子氧浓度有关，从而间接测定胆红素，检测线性范围为10 7 m o 儿，响应时间约为1 0 秒，标准偏差为3 。1 1 4 胆红素与酶法测定相关的生化特性1 1 4 1 吸收光谱溶液中胆红素的紫外可见光吸收谱在可见光区域，于4 5 0 衄左右为中心显示一个强吸收( e 5 5 0 0 0 ) 。胆红素在紫外光区域2 8 0 m 附近有一小的吸收，在氯仿溶剂中还能发出微弱的荧光【2 。1 1 4 2 溶解度胆红素在低于p h 7 o 的水溶液中几乎不溶，在非极性的有机介质中的溶解度很小，其溶解度随溶剂的极性增加而增加，芳香族溶剂比脂肪族的溶解性好，不对称结构能促进溶解。1 1 4 3 不稳定性胆红素、胆绿素的不稳定性给临床检测和研究等带来诸多不便，其稳定性问题很早就引起了一些人的关注【2 2 2 5 】。主要以下三种作用使其稳定性丧失：1 氧化分解：分子氧有助于胆红素的氧化分解，即使在暗处，只要有痕量的分子氧存在，亦可使碱性p h 条件下水溶液中的胆红素因自氧化而分解成胆绿素及二吡咯化合物，同时还可发生歧化反应，生成胆红素i i iq 、q 等异构体。光、痕量的过渡金属离子及其他金属离子都可促进胆红素q 的氧化反应。自氧化反应可被e d l a 抑制但不能中止，歧化反应可被谷胱甘肽和半胱氨酸等抑制。2 光解作用：在光照条件下，水溶液的胆红素可分解为胆绿素、甲基乙烯基顺丁烯二酰亚胺、血色酰亚胺、联吡咯二醛等光解产物，且能异构为多种几何异构体，如4 z 1 5 e 、4 e 一1 5 z 和4 e 1 5 e 等异构体。在氯仿溶液中，胆红素光解为各种单吡咯和二吡咯化合物及胆绿素。新生儿的高胆红素血症及黄疸采用光解疗法就是基于胆红素的光解作用。3 水解作用：室温下，胆红素在p h1 1 1 1 5 的水溶液中可迅速水解而生成多种衍生物，在p h7 9 的水介质中，胆红素可从结合的部分的c 1 位顺序迁移到2 、3 和4 位，从而失去胆红素的原有性质。有文献报导甘露醇等对胆红素有较好的稳定作用2 6 1 。另外，增大浓度、避光、低温等都可增加其稳定性【1 1 。5河北大学理学硕十学位论文1 2b o d1 2 1b o d 的发现1 9 6 9 年b m d e r s 等首先在荷兰猪脑中发现一种能催化胆红素氧化的物质，其后很多学者在不同的物种中，对此酶都有发现，y 0 k o s u k a 、w u 【2 7 】、m u r a 0 【1 7 】和1 1 k a l l a s l l i 等【1 3 1 分别在鼠的内分泌液、食用双孢蘑菇似彩r f c 凇6 坪，d 朋s ) 、漆斑菌属( 蚴帕肪p d 聊1 )真菌和在微紫青霉 ，l 剃厅删豇刀腑伽口如聊) 中发现该物质，因其催化胆红素氧化，所以被称为b o d 。1 2 2b o d 的组成和性质研究最清楚的是m y b o d 。妙b o d 全酶由蛋白质、二价铜离子和部分碳水化合物组成。蛋白质由1 7 种氨基酸组成，其中不含半胱氨酸；赖氨酸和蛋氨酸含量较低，每个分子中不到1 0 个残基；天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸含量较高，它每个分子中包含有一个i 型铜，一个i i 型铜，两个型铜【2 8 】。m u r a o 等经s 印h a d c xg 1 0 0 凝胶过滤后，估测得膨yb o d 分子量为5 2 k d a 【m 。从氨基酸序列推出成熟肽的分子量是5 9 9 5 4d a ，而s d s 电泳估计出的分子量为6 4 k d a 。b o d 的等电点为4 1 左右，米氏常数各文献报道相差很大，在4 6 5 1 9 0i lm o 儿之间。b o d 对含有四吡咯的化合物有特异性反应，能被二价铁离子、氰化钾、叠氮化钠和硫脲等物质抑制。1 2 3b o d 的氧化反应a l ( a 等【2 9 】用b o d 与胆红素反应，研究其反应机理和产物生成。b o d 的催化过程是利用分子氧作为电子受体，有水生成的氧化反应。b o d 是一种多铜氧化酶。i 型铜介导电子从底物传到其他铜位点。i i 型铜和两个型铜形成三核中心，氧分子被束缚在此中心，并被还原为两个水分子。娜m 鸹a 等f 3 伽的研究表明，b o d 的催化作用是对于被束缚在蛋白质上的铜离子的二级反应，供体结构为c u s s n 2 ( s = c y s ，s = m e t ，n = h i s )类型，与铜蓝蛋白情况一样。经电子吸收光谱及薄层色谱技术测定结果表明，胆红素被氧化生成胆绿素，胆绿素进一步氧化成部分淡紫色色素物质，这些物质尚待进一步鉴定。1 2 4b o d 的底物特异性胆红素含有四吡咯，b o d 对含有四吡咯的底物和漆酶的底物具有反应特性。但其氧化胆红素的速度比氧化其它底物的速度更快。b o d 在对含有四吡咯的底物的反应性上与漆酶不同：含有四吡咯的底物被漆酶氧化的很有限，但被b o d 氧化得很快【3 i 】。据；第1 章序言报道在碱性条件下b o d 可氧化一些漆酶的底物，然而来自 2 4 g 4 的b o d 对漆酶的底物显示出较高的特异性【3 2 1 。1 2 5b o d 的纯化1 9 8 1 年日本学者s m u m 0 和n t 觚a k a 从微生物代谢产物中发现并制出电泳纯b o d ，1 9 8 2 年他们又报告了了b o d 的纯化工艺和特性。经以下四个步骤，b o d 得到分离纯化：( 1 ) 硫酸铵沉淀；( 2 ) 活性炭吸附处理；( 3 ) q 垣s 印h a d 弧a - 5 0 柱层析；( 4 )s 印h a d e xg - 1 0 0 凝胶过滤。经上述方法处理后，可在聚丙烯酰胺凝胶电泳上得到单一的谱带，即达电泳纯。国内，1 9 8 8 年我国卫生部临床检验中心与中国科学院微生物所协作成功地从椰中分离和纯化出可供临床应用的b o d 【3 3 1 。1 9 8 9 年中科院沈阳应用生态研究所的张淑贤、苏风岩等【蚓筛选出一株产b o d 活性较高的觚r ，并对漆斑菌属、链霉菌属、弗兰克氏菌几个不同种类微生物产b o d 的能力进行了研究，王菊君【3 5 】对疣孢漆斑菌结合紫外和化学方法做了诱变，使其产酶能力提高了3 _ 4 倍。1 2 6 分子方面研究进展现在m yb o d 已经商品化，而对b o d 的基因克隆又成为一个热点。k a t a o k ak 等测定了从肘y 中纯化出来的b o d 的部分氨基酸序列，将此基因在酵母菌中表达，然而b o d 的表达水平相当低( 少于2 0 u l 培养液) ；s t s u s l l is l l i i i l i z u 削将b o d 基因在米曲霉中表达，获得的重组酶蛋白与原来的酶一样，都包含三类铜离子配体，但有所突变。通过吸光度分析突变三类铜离子配体，进一步证明了铜离子配体对酶活的重要性。圆振二向色谱分析，其二级结构与原酶相似。该酶的分子量为6 3 l ( d a ，酶具有原酶8 0 的活性，可能由于它只有两条n 端连接的糖链，而原酶还有一条o 端连接的糖链，而糖链又是酶活所必需【3 7 1 。2 0 0 3 年做e s l l is 删和2 0 0 5 年k ak 分别建立了b o d 基因的巴斯德毕赤酵母( 甲醇酵母) 为宿主的新表达系统，从而避开了在米曲霉中表达的不足。该系统利用甲醇诱导b o d 的合成，并分泌到胞外获得重组b o d 。同时对重组b o d 进行了纯化和性质鉴定，还与天然b o d 作了比较：重组的新酶具有与原酶一样的较高酶活，但原子吸收光谱反映出两者铜离子配体有所差异【3 8 。9 】。2 0 0 5 年，张雷等研究b o d及其突变体在胆红素血症中的应用，他们认为配位的氨基酸对保持充足的b o d 及其变异体活性中心的完整性和酶活具有重要的意义，重组的b o d 远比突变体的活性高，而7河北大学理学硕士学位论文钌掺杂的有助于在突变体形成酶活中心【删。1 2 7b o d 的应用b o d 催化胆红素氧化成胆绿素，它被用来测定血清中胆红素的聚集来诊断黄疸。它还可以用来清除胆红素干扰以精确的测定临床的其它标记物。酶法测定胆红素在美国和日本研究较多。p e 田，【4 1 1 和d o 啪a s 【4 2 】于1 9 8 6 ，1 9 8 7 相继报告用b o d 测定t d 和d b 成功。他们的方法是测t d 时将反应p h 控制在8 左右，同时使用阴离子表面活性剂s d s 和胆酸钠加速反应，测d b 的方法主要是将酶反应的p h 降到4 _ 5 时，b o d 只与d b 起反应。1 9 9 8 年k l d s a l ( a 掣4 3 】报导一种选择性测定c b 新的酶法，测c b 而不是d b ( 即不测b6 ) 更适合临床应用，并提出使用抑制剂在测c b 时避免u b 的参与。d o u m 嬲】介绍一种用b o d 两点法检测c b 的方法，在o 1 m o 。的甘氨酸缓冲液( p h l o o ) 中，测定4 6 0 i 】m 处吸光度的变化，结果表明：b o d 法检测c b 的特异性高，并且可避免使用h p l c 或干化学法。在国内，1 9 9 1 年刘宏等【4 5 谰b o d 对胆红素进行了测定，并与其它方法进行了对照。结果表明此法测定胆红素不但特异性高，且测定线性范围宽，重现性好，操作简单，抗干扰性强，与其它方法有较好的相关性。1 9 9 3 年，卫生部临检中心与北京发酵工业研究所合作研制出了应用b o d 测定血清t b 和d b 的试剂盒。郭健等用此试剂盒测定血清c b ，结果表明：此反应有较好的特异性，结果较重氮法准确。本世纪江苏省肿瘤防治研究所的赵建华、王毓三等【4 6 4 7 】对其研究较多，2 0 0 3 年他们发现在苯二甲酸缓冲液( p h 5 5 ) 中，当有氟化钠( n a f ) 和n - 乙酰半胱氨酸o a c ) 存在时，b o d 选择性地氧化c b ，而在此反应条件下6b 和u b 不被b o d 氧化。2 0 0 4 年他们将此法用在自动生化分析仪上，经过大量比对实验后认为酶法血清c b 的全自动分析方法，具有操作简单、快速和节省试剂等特点，优于重氮法d b 的测定，是临床肝胆分泌功能状况的一项灵敏的指标，有推广应用价值。起初人们通过b o d 测定体内t b 来监测人体内的血清水平【4 引。后来人们了解到测定c b 比测定u b 和t b 能够更明确地反映生理病理条件。后又发现体内的几种胆红素在不同的p h 值和某些试剂存在下，会选择性的与b o d 结合。如，在p h8 0 、十二烷基磺酸存在的条件下测定总胆红素：在p h3 7 时，测定c b ；在p h1 0 0 时，测定u b 【例。运用此方法可分步决定血清中胆红素各种成分的含量。而k l 鹏s a l 【ak 等f 删提出在p h5 58第1 章序言和氟化钠、n 乙酰半胱氨酸存在下，b o d 只选择性的c b 。然后再结合重氮试剂法测定胆红素的其他成分，进而明确其各成分含量。在2 0 0 0 年，m o m o t 0y 等【5 1 】报道了一种是用液体稳定剂测定c b 的新型酶试剂，在p h 值5 0 ，存在亚甲基膦酸三钠、乙二胺四乙酸二钠锰盐、条件下，通过在4 5 0 r l i i l 被氧化吸收值得下降来检测，这种试剂与b o d一起能够保存一年以上，这种试剂具有良好的反应性、可辨性、可测定性、精确性。而抗坏血酸与血红素都不影响测定结果。实践证明与其它方法相比较，b o d 法有明显优势，它特异性强、灵敏度高、重复性好，对溶血、脂血等抗干扰性强，操作简单，适用于自动化测定。但是b o d 成本昂贵，如果酶的来源、纯度、稳定性等问题得到解决，将有希望替代其它方法，成为今后胆红素测定的常规方法。b o d 在临床上作为辅助试剂，在监测过程中消除干扰应用也较多。例如监测肌氨酸酐，可通过b o d 清除体内胆红素的干扰来检测体内的肌氨酸酐【5 2 1 ；使用b o d 清除胆红素，在过氧化氢和过氧化物系统中检测色原体氧化酶活性【5 3 】；因为胆红素被氧化成胆绿素后，胆绿素对胆固醇的监测影响相对较小，因此还可用b o d 消除血清中胆红素的干扰，来检测血清中胆固醇的含量；过去通过检测果糖胺作为检测血糖的指标，但是果糖胺受到胆红素的干扰，因此，通过b o d 消除胆红素的干扰；由于血红素和胆红素重叠的吸收条带，通过b o d 可消除胆红素对血红素的干扰【5 4 1 。b o d 除了上述在临床检验上用于测定胆红素的含量，为黄疽生成的病理分析提供详细的信息外，还可用来治疗黄疽疾病。黄疸，是一种以胆红素在血液和组织中过量积累为特征的疾病，约1 3 的新生儿发生此病。对于新生儿黄疸，常规的治疗方法有光疗法和换血法。最近几年用一种含有被固定硝酸纤维素膜上的b o d 的体外血液过滤器被推荐用于去除血液中的黄疸毒，得到了一定的发展【5 5 1 。2 0 0 4 年k 锄gc 报道：由于以线连接的b o d 生物电催化不受葡萄糖等有机物的干扰，并且有极高的灵敏性。所以它优于纯铂作为从氧到水的四电子的电解还原作用，。但是它的不足就是在很短的时间内酶活丢失，采用固定化酶技术把酶固定在尼龙膜上可以提高在血清中的稳定性【矧。酶通过修饰可以提高稳定性，降低在药物应用中的抗原性反应和延长半衰期，c o m f o r ta r 等【5 7 】用自m v 分离出的b o d ，通过聚乙二醇修饰，经静脉注射到大鼠体内，发现其在血清中的半衰期比未经修饰的b o d 长2 0 倍，注射经聚乙二醇修饰的b o d 仅一次后，体内高胆红素水平明显降低，且能维持1 2 4 8 小时。s u 西k 等【5 8 】研究发现采用一种聚乙二醇( p e g ) 修饰的b o d ，与o河北大学理学硕十学位论文未经修饰的b o d 比较，未经修饰的b o d 的半衰期为2 5 m i l l ，而经聚乙二醇修饰的b o d半衰期为1 9 0 n l i i l ，未经修饰的b o d 经静脉注射后，患黄疸病的大鼠中血清胆红素的水平下降不显著；而p e g b o d 经静脉注射后，使血清中胆红素水平显著下降，并且这种作用能保持3 小时。这种经修饰的b o d 可被用来治疗患黄疸病动物的胆红素毒性。所以，经聚乙二醇等修饰的b o d 对治疗高胆红素血症具有潜在的价值。但对于人体应用尚在进一步研究中。该技术一旦应用可望取代换血法对黄疽的治疗，在临床上使危急状态的黄疽疾病得以缓解。另外，b o d 还可用于粪便的处理而不引起环境污染及制成合成洗涤剂用于婴儿尿布的清洗。1 3 研究目的和意义传统观念一直认为胆红素是人体内的一种有害代谢产物，近一个世纪以来，临床上一直把血中胆红素含量作为肝、胆、胰疾病的诊断指标。但随着近年来，随着人们研究的不断深入，发现胆红素不只是体内的一种有害代谢产物，在一定的浓度下，它还是一种内源性强抗氧化剂，具有保护作用，因此，如何调控和测定体内胆红素浓度显得至关重要。本课题在前期研究中证明，幽限b o d 的稳定性优于m y b o d ，具有开发应用价值。本研究旨在确立一套比较简便可行的分离纯化工艺，对啪傻b o d 进行分离纯化，并通过性质研究探讨其作为诊断试剂盒工具酶应用上的可行性。对于b o d 的性质研究，虽然很多文献都有报道，但是差别很大，而且并不全面，这在很大程度上限制了胆红素氧化酶的应用。本课题在分离出b o d 后，将对其性质作详细研究。近年来，随着发酵工程和分子生物学的发展，采用基因工程手段来提高酶的活性、改善酶的性质、降低酶的成本己经成为可能。本文利用基因工程技术，克隆得到b o d的部分基因，为使其克隆表达打下基础。l o第2 章b o d 产生菌的发酵与鉴定第2 章b o d 产生菌的发酵与鉴定2 1 引言觚r 为常见的植物致病菌，造成大豆叶斑和严重疫病，影响产量且每年都会发生。目前研究多集中于椰生产b o d ，而有报道称肘豫在众多产酶菌种中产酶活性最高。本课题组从中科院微生物所引进菌种觚r 3 1 9 6 7 、m n 通过实验比较两个菌种，发现啪唿比产的b o d 更稳定。本章在原工作的基础上，进一步认识优化和稳定其发酵产b o d 条件及酶活测定方法，为下一步的工作奠定基础。2 2 材料与试剂2 2 1 实验材料菌种：彬( 本实验室保存) ，姗r ( 购自微生物所) 。2 2 2 主要试剂与仪器胆红素q d a c q 2 3 9 3 ( 第二军医大学校办上海卫辉化学试剂) ；高速冷冻离心机( s i g m a 2 k 1 5 ) ；电泳仪( b i o 黜m o d e l2 5 0 2 5 ) ；分光光度计( u n i c o 2 l o o ) ；摇床( 江苏海门其林医用仪器) ；隔水式电热恒温培养箱( 上海跃进医疗器械厂)2 2 3 培养基的配制固体土豆培养基：土豆汁2 0 ，葡萄糖2 ，琼脂1 5 ，液体土豆培养基：土豆汁4 0 ，葡萄糖o 5 2 3 实验方法2 3 1 胆红素氧化酶的鉴定2 3 1 1b o d 产生菌的形态观察将试管保存菌种用接种针挑少许，接入配好的液体培养基中，1 8 ，m i l l 培养至出现单个菌丝球，挑起单个菌丝球接入固体培养基平板上，2 8 温箱培养4 d ，观察菌落形态。2 3 1 。2 菌种的转接与活化采用将单个菌丝球接入平板土豆培养基中。此法优点：( 1 ) 比普通三区画线方法生长快：( 2 ) 缩短活化时间；( 3 ) 比普通三区画线方法更易得到单菌落，方便接种。河北大学理学硕十学位论文2 3 1 3b o d 产生菌- 啪限的发酵培养菌种的发酵是在5 0 0 i l ：l l 三角瓶中进行的，将三角瓶中装入1 0 0 n l l 液体土豆培养基，自然p h ，接入单孢子菌液，2 6 ，1 8 c h l p m 旋转培养接种液体培养基的具体操作步骤：取两支长满孢子的斜面，各倒入5 m l 无菌水，用接种针刮取其孢子。将孢子液倒入无菌的有玻璃珠的5 0 m l 的小三角瓶中，充分旋转，打碎粘联的孢子。将打碎成单孢子的孢子液通过滤纸过滤到另一个无菌小三角瓶中。取0 5 m l 加入装有4 5 m l 的无菌水的试管中，振荡摇匀。依次逐级稀释到一定稀释度，( 1 0 r 6 ) 。取不同稀释度的孢子液5 0 0ul 接入装有液体土豆培养基的5 0 0 i 】：l l 三角瓶中。分别取1 0 r 6 、l o 5 的孢子液1 0 0i ll 涂布平板各作一个平行，根据平板上长菌落的情况与所接的稀释度计算出接种量。将接有孢予液的三角瓶在摇床上振荡培养，培养条件是：2 6 ，1 8 眦m i n 。待发酵培养一定时间后，将发酵液离心，取上清作为粗酶液，取性状良好的菌丝球接入土豆平板培养基上培养，作为下次实验的菌种。2 3 1 4 脚接种量与发酵时间对酶活的影响分别取稀释度为1 0 0 、1 0 1 和l o 。2 的孢子悬液5 0 0ul 接种于5 0 0 l i l l 三角瓶装有的1 0 0 m l 液体土豆培养基中，从4 8 h 开始，每隔2 4 h 测定酶活，确定最佳接种量与最佳发酵时间。2 3 2b o d 活测定方法2 3 2 1 胆红素贮存液及其缓冲液的配制胆红素贮存液：在2 o i l l g 胆红素中加入o 5 m l 甲醇，混匀，再逐滴加入o 5 m lo 2 m o 。的n a 2 c 0 3 溶液，使其完全溶解。缓冲液：p h 8 1o 0 5 m o l l t r i s 。h c l ，内含5 0 l 】 1 i t l o l i 。甘露醇。2 3 2 2 胆红素吸收光谱查阅文献，选择胆红素合适的波长，明确其对应的摩尔吸光系数。2 3 2 3 酶活测定方法在比色杯中加入p h 8 1 t h s h c l 缓冲液3 m l ( 2 5 保温) ，加入胆红素贮存液3 0 i ll ，酶液l oul ，立即混匀并在分光光度计上读出汕i n ，代入酶活计算公式：1 2第2 章b o d 产生菌的发酵与鉴定酶活力单位( u l n l ) =垒垒圣星堕签墼荃! 塑q4 样品体积n其中，a 为每分钟的变化值，a = ( 舢一a s ) 。反应总体积单位为m l ，样品体积单位为l ll ，n 光径为1 c m 的比色杯，胆红素4 5 0 = 5 5 0 0 0l 1 m o l 。1 锄一。2 3 2 4 测定胆红素自氧化曲线将胆红素贮存液用p h 8 1 t r i s h c l 缓冲液稀释l o 倍，取3 m l 放入比色皿中，常温下放入分光光度计中，每隔l o s 读数一次。2 3 2 5m 豫产d 的鉴定与发酵粗酶液聚丙烯酰胺电泳分析将觚r 粗酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) ，以初步了解粗酶液中蛋白情况。其中浓缩胶、分离胶的浓度分别为4 、1 2 。具体操作步骤如下：( 1 ) 胶的配制( 浓度为1 2 凝胶)浓缩胶的配制：3 0 胶o 2 4 m lp h 6 7t r i s h c l 缓冲液o 5m lt e m e d5i ila p s ( 1 0 )2 0 pl加水至2m l分离胶的配制：3 0 胶2 o m lp h8 9t r i s h c l 缓冲液1 2 5m lt e m d4ula p s ( 1 0 )3 0 pl加水至5m l电泳缓冲液和样品液的配置5 天然电泳样品液的配制lm o l l 的p h6 8 t r i s h c l 的缓冲液3 o m l ；甘油5 0 ；5 o m ll 溴酚蓝0 0 5 o 5m l1 3河北大学理学硕+ 学位论文加蒸馏水定窖至l o m l 。( 2 ) 灌胶及电泳采用1 姗的平板点样，1 0 0 v 电压开始电泳。待样品跑出浓缩胶将电压调为1 5 a v 。直至溴酚兰距离胶的下端约为o 3 处停止电泳，进行染色。2 4 结果和讨论24 1b o d 产生菌的形态观察由图2 12 2 可见，观察菌脓与对照苗胍它们的菌落形态和孢子的形态、所产生的色素等都有很大不同，因此从外观上很容易直接辨别出这两种菌株。图2 l 删的菌落图22 脓的菌落f 远2 l c o l o n y o f 枷7f 蟾2 0c o l 锄y o f 加r2 4 2 酶的定性实验在2 个比色杯中分别加入3 m