南京大学分子生物学3-4讲.ppt

1，卫星DNA：有些高度重复DNA序列的碱基组成和浮力密度同主体DNA有区别，在浮力密度梯度离心时，可形成不同于主DNA带的卫星带，此类DNA称为卫星DNA。,2，卫星DNA的分类,分类长度重复单位染色体定位大小（bp）卫星DNA100kb数Mb卫星序列2和35整个染色体卫序列12548大多数染色体着丝点和其他异染色质区域171所有染色体着丝点（Sau3A家族）681，9，1315，21，22及Y染色体的着丝点小卫星DNA0.120kb端粒家族6所有染色体端粒高变家族924所有染色体通常靠近端粒微卫星DNA小于150bp14所有染色体,三、细胞器基因组（一）一般情况1，DNA形状及基因组大小绝大多数为环状非重复序列，少数低等真核生物为线性分子线粒体DNA为十几数十kb，叶绿体可达二百多kb2，细胞器编码的蛋白自身所需的某些蛋白质以及tRNA和rRNA,3，核基因编码的蛋白细胞器专用的蛋白质合成机器组分，及其他蛋白质。在细胞质中合成好后输入细胞器,（二）酵母线粒体基因的特点1，存在大量非编码区2，两个rRNA基因中，21SrRNA基因有一个内元3，细胞色素基因和细胞色素氧化酶亚基1基因是不连续基因,（三）人类线粒体的分子遗传学特点1，基因的组织情况（1）有37个基因13个蛋白质基因2个rRNA基因22个tRNA基因（2）DNA利用效率极高,基因排列紧密（间隔区只占DNA总长度的0.5%）有重叠基因有的基因以U或UA结尾，借助playA尾巴产生UAA终止密码子（3）有特殊的终止密码子AGA或AGG（核基因密码子为Arg）,2，转录大部分基因（28个）从重链上转录两条链的转录各产生一个转录元tRNA基因位于蛋白质和rRNA基因之间，其产物在转录后处理中的起重要作用,rRNA的合成多于mRNA重链转录产物的转录后处理比轻链转录产物更为及时,3，翻译由线粒体内的蛋白质翻译机器完成自身基因的翻译有特殊的起始密码子（AUA，AUU）mRNA的非翻译区极少对抑制原核生物蛋白质合成的抗生素敏感,四、卫星DNA的等级结构及其起源和进化（一）卫星DNA的等级结构1，小鼠卫星DNA234bp重复单位小鼠基因组DNA的EcoRII酶切60-70%的卫星DNA含有一种234bp的重复单位,2，117bp重复亚单位推测：两者由基因扩增形成，差异是基因扩增之后积累的,3，四分之一（58bp）重复亚单位最大差异为40%,4，八分之一重复亚单位分（28bp）、（30bp）两种亚单位，两者差异为61%,5，最小重复亚单位（9bp）八分之一重复亚单位由3种最小重复单位构成GAAAAACGTGAAAAATGAGAAAAAACT,三者可能来源于共同的祖先序列,（二）卫星DNA可能的进化过程1，27bp重复亚单位的形成两种亚单位只有19%的差异9bp重复亚单位经跃进式复制（saltatoryreplication）形成27bp重复亚单位随后发生突变积累,2，58bp重复亚单位的形成27bp重复单位发生跃进式复制，形成54bp二聚体插入突变形成、亚单位,3，116bp重复亚单位的形成58bp重复单位发生跃进式复制突变积累4，234bp重复单位的形成116bp发生跃进式复制突变积累,（三）重复序列一致性的形成机制1，不均等交换（unequalcrossing-over)（1）原理：姐妹染色体上的非等位重复序列之间发生配对并交换，导致非对等的交换,（2）种类：全符合的（inregister)不均等交换；半符合的(half-register)不均等交换,2，交换固定（1）概念：一系列的不均等交换将导致一种重复单位替代其他所有的卫星DNA，这个过程称为交换固定（2）过程：图2-14b,3，基因转换（1）概念：通过异源双链区内不配对碱基的修复而进行的基因矫正过程（2）过程：图2-14c,第四节基因定位与基因克隆,一、基因定位（一）连锁定位（二）原位杂交（三）染色体步行,1，基因组文库的构建基因组文库：将基因组DNA切割成宜于操作的片段，然后与适当的载体重组连接。由此建立的包含一整套基因组DNA片段的克隆群叫基因组文库,2，染色体步行（1）基本原理：通过一系列的杂交，确定按基因组原来顺序排列的相互重叠的基因组克隆（重叠群），以获得目标序列所对应的基因组DNA序列,（2）过程：标记目标DNA（探针制备）菌落杂交测定阳性克隆DNA序列亚克隆阳性克隆末端DNA序列利用亚克隆制备新的DNA探针进行新的一轮菌落杂交重复上述过程,（3）存在的问题：重复序列使步行出错；克隆过程中基因组片段的发生突变,（四）染色体跳跃染色体跳跃文库（chromosomejumpinglibrary）的制作：,（1）用识别长序列的限制性内切酶切割基因组DNA和克隆载体DNA（2）用脉冲电场梯度电泳分离DNA酶切片段（3）将DNA片段导入克隆载体，连接成环（4）用另一种限制性内切酶（载体DNA无此酶识别位点）将大部分基因组DNA切除后，再将之连接起来,二、基因克隆（一）功能克隆利用基因的产物（RNA或蛋白质）所包含的功能信息来推知相应基因的序列,（二）候选基因克隆法根据遗传疾病可能相关的生理特征，去进一步确定与这些生理特征相关的侯选基因，再在这些侯选基因中寻找与疾病表型可能相关的数据，以次确定疾病基因,（三）位置候选基因克隆法通过连锁图谱与连锁分析，先将致病基因定位于某些染色体的某一狭窄的区域，再对该区域中分布的基因位点进行筛选和确认，从而找到与疾病相关的基因。其过程为：,1，利用低密度DNA标记进行染色体扫描定位利用全基因组内均匀分布的具有一定密度的多态性DNA标记来作为连锁分析中的参考点，快速达到初步基因定位的目的,2，精确定位在目标区域内选择更多的标记作进一步分析，以确认先前的连锁分析结果，并将待克隆基因范围进一步缩小,3，确定基因从靶区域中得到的候选基因中，确定由其突变而导致发病的基因,第四章以修复作用为中心的DNA的安全保障体系,导致DNA不稳定的因素1，偶然的复制错误2，环境紫外线、电离辐射化学物质（突变剂）造成的核酸分子损伤3，外源遗传物质的侵入,保证DNA稳定性的机制1，复制修复系统2，损伤修复系统3，限制-修复系统,第一节复制修复,一、尿嘧啶糖基酶系统（一）DNA中尿嘧啶的产生1，dUTP渗入2，胞嘧啶脱氨氧化生成,（二）尿嘧啶糖基酶系统的组成1，尿嘧啶-N-糖基酶2，无嘌呤（AP）内切核酸酶3，DNA聚合酶I（PolI）4，DNA连接酶,（三）修复过程1，尿嘧啶-N-糖基酶将DNA双链中的尿嘧啶切除2，AP内切核酸酶切除无碱基核糖,3，DNA聚合酶I（PolI）在缺口（gap）的3端，以互补链为模板合成DNA链，同时其53外切核酸酶活性不断将缺口下游的5端核苷酸切除4，DNA连接酶将切刻（nick）封闭,二、错配修复系统（mismatchrepairsystem）DNA聚合酶偶尔能催化不能与模板配对的错误碱基的渗入，这种复制错误绝大多数由DNA聚合酶35校对功能立即得以修正。然而在某些条件下，会有频率为10-8的错误的不到立即纠正。错配修复系统使这种复制错误的频率降至10-1010-11,（一）错配修复系统的组成1，错配矫正酶（mismatchcorrectionenzyme）是核酸内切酶由基因mutH，mutL，和mutS所编码,可识别新生链上的错配碱基及未甲基化的GATC2，DNA聚合酶I3，DNA连接酶,（二）错配修复的过程1，错配矫正酶与未甲基化的GATC及同一条链上的错配碱基结合2，错配矫正酶在两者之间切除一段包括错配碱基的DNA单链,3，DNA聚合酶III进行缺口充填4，DNA连接酶连接切刻,（三）错配修复系统其他作用1，去除渗入DNA的碱基类似物2，在基因转换中起重要作用,第二节损伤修复,致损伤因素电离辐射紫外线化学突变剂等,DNA分子损伤的类型嘧啶二聚体碱基修饰碱基丢失链的断裂碱基交联,一、胸腺嘧啶二聚体的产生及其后果相邻胸腺嘧啶在理、化因素作用下形成二聚体，产生破坏碱基平面的环丁基,在以有胸腺嘧啶二聚体的DNA为模板时，DNA聚合酶I反复连接和切割腺嘌呤核苷酸（空耗），消耗大量dATP而不能继续复制DNA，最后导致细胞死亡,二、胸腺嘧啶二聚体修复的生物学指征（一）细菌的活存曲线（二）修复类型1，光复活（photoreactivation）只作用于紫外线照射所形成的产物只需要光复活酶（photoreactivatingenzyme）,2，暗修复除了可作用于胸腺嘧啶二聚体外，还可以修复其他类型的损伤，包括：（1）切除修复（2）重组修复（3）SOS修复（4）二聚体糖基酶修复,三、胸腺嘧啶二聚体修复的分子生物学机制(一）光复活（photoreactivation）1，光复活的定义在可见光（300nm600nm）的活化之下由光复活酶催化胸腺嘧啶二聚体分解成为单体的过程,2，光复活的过程光复活酶（PR酶）与DNA链上的胸腺嘧啶二聚体结合成复合物复合物吸收光能并切断胸腺嘧啶二聚体之间的C-C键胸腺嘧啶二聚体变为单体，PR酶从DNA上解离下来光复活作用还可以修复紫外线照射形成的其他嘧啶二聚体,（二）切除修复1，切除修复一般过程修复内切酶识别损伤引起的DNA双螺旋结构的变形，并在DNA损伤的两侧切开糖-磷酸骨架,外切核酸酶去除切刻之间的DNADNA聚合酶合成一条新的DNA链置换损伤的DNA片段DNA连接酶封合新合成的DNA片段和原有DNA链之间的切刻,2，大肠杆菌的切除修复（1）修复过程UvrA识别引起DNA双螺旋变形的损伤，并与UvrB结合UvrA解离（需ATP)，Uvr加入,UvrBC复合体在损伤DNA的两侧切开一个切刻。5端和3端离损伤位点分别为7个和34个核苷酸（需ATP）UvrD（解旋酶）解开DNA双链，释放损伤DNA片段,DNA聚合酶I进行缺口的充填最后由DNA连接酶将切刻连接起来,（2）大肠杆菌切除修复的类型短补丁修复（short-patchrepair）切除的DNA不超过30个核苷酸约占99%,长补丁修复（long-patchrepair）切除的DNA大多数在1500核苷酸左右，少数可达9000核苷酸以上约占1%,3，真核生物的切除修复（1）TFIIH打开DNA双螺旋（2）XPG内切核酸酶切开损伤的3端（3）ERCC1内切核酸酶切开损伤的5端,（三）重组修复1，除Uvr系统之外，还存在其他的暗修复系统证据1：对于uvrA-的细菌，UV致死剂量能在细胞内产生300个胸腺嘧啶二聚体。而一个未被修复的胸腺嘧啶二聚体就可使细胞死亡,证据2：recA-细菌比uvrA-细菌对紫外线更敏感2，重组修复（复制后修复）的机制（1）重组修复的姐妹链交换假说（图4-10）DNA分子的a链和b链上各有一个胸腺嘧啶二聚体并开始复制,通过二聚体后起始机制，复制出包含缺口的子链a和ba，a姐妹链发生交换，即从a链上切下a链上所缺少的一段，由DNA连接酶连接在a链上。在下一轮复制时，a链成为完整的模板,a链上的缺口由PolI和DNA连接酶补好。b链可以按同样的方式进行修复。但是a链上的二聚体如果被其他机制所修复，那么只要由DNA聚合酶I补齐就行了,（2）重组修复所涉及的基因recArecBCD其他不详,（四）SOS修复1,SOS反应细菌在DNA受损或其他因素使DNA复制受到抑制时,会产生一系列的表型变化,包括对损伤DNA的修复能力迅速增强,诱变率的提高,细胞分裂停止以及原噬菌体的诱导释放等.这些反应通称为SOS反应,2,SOS修复的概念是DNA损伤修复的一种旁路系统，它能引起DNA复制校对系统松懈,从而允许新生DNA链能够越过胸腺嘧啶二聚体（超越二聚体合成，transdimersynthesis）完成全链的合成,3,SOS修复的结果在DNA链受到损伤时仍能完成复制DNA复制的错误率增高4,RecA蛋白在SOS修复中的作用,(1)RecA蛋白的主要生化活性重组活性单链DNA结合活性蛋白酶活性(2)RecA蛋白的作用当DNA合成受阻时,细胞中的RecA蛋白大量表达并被激活,RecA是一种特异的内肽酶,只切割少数蛋白质的丙氨酸-甘氨酸之间的肽键.其识别特异性还与底物的空间结构有关.DNA合成转入正常,RecA蛋白失去蛋白酶活性,5,LexA蛋白在在SOS修复中的作用(1)LexA蛋白的作用是一种阻遏蛋白,结合于SOS系统中各基因的操作子上,使得这些基