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大鼠脉络丛上皮细胞原代培养及分泌机制的初步研究 摘要 脉络丛是动物体内一个重要的组织，位于脑室。其分泌的脑脊液填充脑室、 蛛网膜下腔和脊椎管。脑脊液由脉络丛上皮分泌并调节，因此研究脉络丛上皮细 胞的分泌机制对于了解在生理和病理状态下脑脊液形成以及寻找相关疾病的治 疗方法都有重要意义。 本文主要以脉络丛的分泌机制为研究重点，目的是鉴定与脑脊液分泌相关的 离子转运体和通道，同时寻找能促进分泌的潜在刺激物。通过建立大鼠侧脑室脉 络丛上皮细胞体外细胞原代培养方法，使得脉络丛上皮细胞在微孔滤膜上成长融 合的单层上皮细胞。同时使用r t p c r 方法检测了脉络丛上皮细胞特异性的蛋白 t t r 的m r n a 存在，证明培养的是脉络丛上皮细胞。通过短路电流，膜片钳，r t - - p c r 等方法发现脉络丛上皮细胞顶膜面存在n a + 一k + - - a t p a s e ，基底膜面存在 n a + 一h + 交换体。脉络丛上皮细胞上存在a q p i ，不存在c f t r 。c a r b a c h o l ，肾上腺 素和多巴胺等一般上皮分泌的刺激物对脉络丛上皮细胞分泌没有明显作用。 关键词 脉络丛上皮细胞分泌机制原代培养r t - - p c r 短路电流膜片钳 l l a b s t r a c t c h o r o i dp l e x u s ，a ni m p o r t a n tt i s s u ef o ra n i m a l ，i sl o c a t e di nv e n t r i c l e s ，s e c r e t i n g c e r e b r o s p i n a lf l u i d ( c s f ) t h a tf i l l sv e n t r i c l e sa n ds u b a r a c h n o i ds p a c eo f t h eb r a i n ，a n d s p i n a lc a n a l a sc s f i ss e c r e t e da n dr e g u l a t e db yc h o r o i dp l e x u se p i t h e l i a lc e l l s ，i ti s i m p o r t a n tt os t u d yt h em e c h a n i s mo fs e c r e t i o nm e c h a n i s mi nc h o r o i dp l e x u se p i t h e l i a l c e i l sa st ou n d e r s t a n dc s fs e c r e t i o ni np h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a lc o n d i t i o na n d f i n d i n gw a y sf o rd i s e a s et r e a t m e n t t h i st h e s i sf o c u s e do nt h em e c h a n i s mo fs e c r e t i o ni nc h o r o i dp l e x u si nh o p e so fi d e n t i f y i n g r e l a t i n gi o nt r a n p o r t e r sa n dc h a n n e l sa sw e l la sf i n d i n gs t i m u l a t o r st os e c r e t i o n ap r o t o c o lf o r p r i m a r yc u l t u r eo fr a tc h o r o i dp l e x u se p i t h e l i a lc e l l sw a se s t a b l i s h e d ac o n f l u e n te p i t h e l i a lc e l l m o n o l a y e rw a sf o r m ，a n dw a s c h a r a c t e r i z e db yt h em a r kp r o t e i no fc h o r o i d sp l e x u st r a n s t h y r e t i n ( t r r ) i nr t - p c re x p e r i m e n t t oi d e n t i f yi o nt r a n s p o r t e r s ，c h a n n e l sa n ds e c r e t i o ns t i m u l a t o r s ， s h o r tc i r c u i tc u r r e n t p a c t h c l a m pa n dr t - p c rw e r ee m p l o y e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t1 n a + 一k + 一a = r p a s ee x i s t e do na p i c a ls i d eo fc h o r o i dp l e x u se p i t h e l i a lc e l l sw h i l en a + - h + e x c h a n g e r e x i s t e do nt h eb a s o l a t e r a ls i d e ；2 a q p le x i s t e di nc h o r o i dp l e x u se p i t h e l i a lc e l l sw h i l ec f t rd i d n o te x i s t 3 s t i m u l a t o r so fe p i t h e l i as e c r e t i o ns u c ha sc a r b a c h o l ，d o p a m i n ea n da d r e n a l i nh a dn o e f f e c to nc h o r o i dp l e x u se p i t h e l i a lc e l ls e c r e t i o n k e yw o r d s c h o r o i dp l e x u se p i t h e l i a lc e l l ，s e c r e t i o nm e c h a n i s m ，p r i m a r yc u l t u r e ，r t - p c r ，s h o r t c i r c u i tc u r r e n t ，p a t c h c l a m p i i i a c a e a q p c a c a m p c d n a c f r r d l q a c s f d e p c a d e n y l a t ec y c l a s e a n i o ne x c h a n g e r a q u a p o r i n c a r b o n i ca n h y d r a s e 缩略语 腺苷酸环化酶 阴离子交换器 水通道 碳酸酐酶 c y c l i ca d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e 环腺苷酸 c o m p l e m e n t a r yd n a c y s t i cf i b r o s i st r a n s m e m b r a n ec o n d u c t a n c er e g u l a t o r d i i s o o c t y l a d i n p a t e c e r e b r o s p i n a lf l u i d d i e t h y lp y r o c a b o n a t e d m e m f 1 2d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m f 1 2 d m s 0 d p c e d t a f b s g o h b s s h e p e s i s c l ( - h s o l u t i o n n h e d i m e t h y ls u l f o x i d e d i p h e n y l a m i n e - 2 - - c a r b o x y l a t e e t h y l e n ed i a m i n e t e t m a c e t i ca d d f e t a lb o v i n es e r u m h a n k sb a l a n c e ds a l i n es o l u t i o n 互补d n a 囊性纤维变性 电导调节体 己二酸二异辛酯 脑脊液 焦碳酸二乙酯 二甲亚砜 乙二胺四乙酸 胎牛血清 吉欧 h a n k s 平衡盐 溶液 n - 2 - h y d r o e t h y p i p e r a z i n e n - 2 - e t h a n e s s u l f o n i ca c i d s h o r tc i r c u i tc u r r e n t短路电流 k r e b s h e n s e l e i ts o l u t i o n n a + 一h + e x c h a n g e r v k - h 溶液 钠一氢交换体 n b c p a p b s p c r p d n a + - - h c 0 3 - e x c h a n g e r p i c o a m p e r e p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o t e n t i a ld i f f e r e n c e r t - p c rl e v e l s et r a n s c r i p t - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r t s d t t r u t r a n s e p i t h e l i a lr e s i s t a n c e s p r a g u e d a w l e y v i 钠一碳酸氢根交 换体 皮安 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反 应 跨上皮电势差 逆转录聚合酶 链式反应 跨上皮电阻 运甲状腺蛋白 酶单位 第一章绪论 脉络丛是位于高等动物脑室中特有的一种分泌性上皮结构，其主要生理功 能是分泌脑脊液( c s f ) 。脑脊液是一种维持中枢神经系统稳态( h o m e s t a s i s ) 的 重要生理液体。众所周知，由于在动物体中中枢神经系统是一个相对脆弱的组织， 因此对于这一组织的深入了解将有助于解释中枢神经系统病变与治疗，发育与衰 老等重要生理变化，以及更好的进行人为干预从而达到治疗与防止有关疾病的最 终目的。 1 1 脑脊液的生理学作用 脑脊液是位于脑室中的一种由脉络丛上皮细胞分泌加上细胞间液组成的混 合型液体。脑脊液首先由侧脑室脉络丛分泌，流经第三脑室，混合由第三脑室 脉络丛分泌的脑脊液后流入第四脑室，然后进入蛛网膜下腔。此后这一部分的脑 脊液通过蛛网膜下腔绒毛以及硬脑膜的肉芽突起被吸收进入静脉。此外部分脑脊 液进入大脑基底池后流入脊椎。这里的脑脊液最终将通过脊椎神经根部与蛛网膜 下腔类似的结构将脑脊液引入静脉系统。除了以上两种排出途径，脑脊液也可以 通过嗅束流入鼻腔和颈部的淋巴系统从而完成脑脊液循环。1 表1 1 显示了人和狗脑脊液的成分构成。通过对脑脊液中阴阳离子物质含 量，糖类、氨基酸与多肽物质的含量分析不难看出：脑脊液与血浆的成分是相似 的。这一结果从一个侧面证明了脑脊液的直接来源是血液。但是在某些离子，如 m g ”，c 1 在脑脊液中的含量却高于血液含量。这一结果暗示了脑脊液的形成过 程是建立在一个离子主动运输过程基础之上，而非单纯的离子渗透。此外从表中 还可以发现脑脊液中的葡萄糖与氨基酸含量低于血浆，蛋白质在脑脊液中的含量 也远远小于其在血浆中的含量。 s u b s t a n a ec s fo fd o gp 1 a s m ao fd o gc s po fh u m a np l a s m ao fh u m a n n a 41 5 51 5 11 5 91 4 7 k +4 63 14 6 33 8 6 m 9 2 + 0 711 6 12 2 3 c a 2 +2 91 44 72 2 8 c 1 1 2 l1 3 39 91 1 3 h c 0 ，2 6 22 5 82 6 82 3 3 g l u c o s e6 3 4 24 6o 8 a m i n oa c i d2 3o 82 6 2o 7 2 p r o t e i n 6 5 0 02 57 0 0 0 4 2 ( n a g 1 0 0 m 1 ) p h 7 47 4 7 3 9 77 3 o s m o l a l i t y 3 0 03 0 52 8 92 8 9 表1 1 ：人和狗的脑脊液成分( 单位：r a m ) ( 引d a v a o n1 9 8 7a n ds e g a l 2 0 0 1 ) t a b 1 1 c s fc o m p o n e n t si nh u m a na n dd o g ( r a v 1 ) ( f r o md a v a o n1 9 8 7a n ds e g a l 2 0 0 1 ) 脑脊液是中枢神经系统重要的构成部分，因此目前研究认为脑脊液的主要 生理功能有一下几个方面： 第一：机械支持与保护。 中枢神经系统( 包括大脑) 主要由神经元和神经胶质细胞以及其他细胞问 质组成。由于没有类似肌肉以及骨骼等强有力的支持结构，整个组织器官对于机 械冲击的耐受力是十分低的，因此在机体剧烈运动期间如何保护中枢神经系统在 一个稳定的环境中工作是一个生物体需要解决的问题。以人为例，成年人大脑重 量达到1 5 0 0 9 作用。但是由于脑脊液将整个中枢神经系统包裹在一个纯液体环境 中，大脑和脊髓处于一种准失重状态，这一重量被大大消减以致只有5 0 9 。这 生理变化的意义是重大的。常人的脑脊液如果在某些情况下大量丧失，例如脊椎 穿刺，将使得脑底部由于压迫而产生常人无法忍受到剧痛，这一病例从一个侧面 说明了生物体中枢神经系统对于脑脊液所创造的浮力环境的巨大依赖。3 。 第二：中枢神经系统内外毒素的清除。 2 在j f 常生物体中，中枢神经系统通过血脑屏障将整个系统与外周血液循环 系统分隔开来，从而形成了两个不同的体液环境，即血液环境和脑脊液环境。神 经元在其生理活动中会不免产生一些有毒物质，这些有毒物质被释放到细胞间质 后将进入脑脊液，并最后随脑脊液一起流出中枢神经系统而被清除。”1 第三：中枢神经系统的免疫保护。 由于中枢神经系统与外周血液循环相隔绝，因此过去曾认为中枢神经系统 是缺乏有效的免疫保护机制的。但是c s e r r “1 的研究表明在中枢神经系统中存在 着一个主动的免疫防卫系统，通过外周循环的t 细胞来完成对抗原的免疫防护。 而且由于血脑屏障的选择性通透比过去估计的要高，所以这一结构对中枢神经系 统的免疫以及外周环境中分子物质的调节也有非常重要的作用。 在高等动物中脉络丛位于侧脑室，第三脑室和第四脑室，是一种单层柱状 上皮。脉络丛主要由脉络丛上皮细胞，基质和穿行于基质中的毛细血管组成。位 于脉络丛的毛细血管与位于血脑屏障的毛细血管有所不同，这里的毛细血管壁并 没有形成一种紧密连接的结构。相反，在毛细血管壁上有很多小的筛孔结构，这 一结构不仅使得水分子和很多离子物质可以自由的通过这些孔洞扩散进入脉络 丛基质中，一些大分子甚至蛋白质物质也能自由通过。但是这一滤过作用通过脉 络丛上皮细胞上的紧密连接得到弥补。脉络丛本身具有适应分泌的独特结构。首 先，脉络丛上皮细胞通过褶皱形成很多指状结构，从而大大增加了脉络丛上皮细 胞与血液的接触面积。第二，脉络丛上皮细胞面向脑脊液的细胞顶膜面形成大量 微绒毛结构，这一结构也增加了分泌面积，且这些绒毛可能存在一种摆动机制而 加速脑脊液流动。此外，脉络丛上皮细胞中也含用大量的线粒体，和面积巨大的 内质网结构，这些形态结构都暗示内质网具有很强的分泌功能5 1 。 在人体中脑脊液的总含量约1 4 0 m l ，而测量得到脑脊液的分泌量为每日 6 0 0 m l ，这意味着人体的脑脊液每天会更换3 次之多。脉络丛的分泌速度0 2 m l m i n l g ，这一速率也远大于其他分泌器官或组织。以豚鼠的胰腺为例，分泌速 度为0 0 6 m lm i ng “。 1 2 脉络丛研究的最新进展 脉络丛的研究是一项古老而崭新的研究领域。无论是公元1 5 0 0 年前古埃及 关于伤员的中脑脊液的初次描述，还是维萨里关于脑脊液流动途径的研究记录， 都是对脑脊液最早的研究记录。但随着近现代生物学技术的引入，关于脉络丛的 研究又一次引起了很多研究者的注意。 1 2 1 脉络丛上皮细胞发育与衰老的研究。 关于脉络丛的发育过程的研究资料相对于其他研究领域是非常稀少的，但 是目前所得到的研究结果却是非常吸引人的。脉络丛在脑中的发育非常早，根据 解剖学研究表明甚至早于脑中血管系统的形成。当神经管在发育过程中封闭的时 候，这时在神经管中便充满了一种液体，这一液体使得整个中枢神经系统在发育 的最初阶段获得充足的营养供给。但是目前研究仍然没有表明这种液体的来源。 由于考虑到在脑的形成之初血脑屏障的结构并非十分完整，脉络丛对于血液的通 透作用是否和成体一样也有待研究，因此这方面还有很多工作要做。此外，另有 研究表明在发育阶段的脑脊液中蛋白质的含量很多，与成年动物脑脊液中蛋白质 的含量有很大不同。这一现象目前还未得到详细的解释。但是有理由相信，在脑 发育之初，由于缺乏相应的血管血液供给，此时的脑脊液可能是在脑发育过程中 主要的营养源。这一现象也和成体有区别。根据表1 1 中对于葡萄糖含量的显示 不难看出，脑脊液中葡萄糖的含量是很低的。然而脑是一个巨大的耗能器官，研 究发现在静息状态下脑几乎消耗了生物体三分之一的葡萄糖。由此推论，脑以至 于整个中枢神经系统的能源供给不可能依赖于脑脊液提供。过去曾一度认为脑脊 液是脑中主要的能源供应者，因为脑脊液环绕着整个中枢神经系统。但是对于耗 能量的计算使得这一假说无法成立。总之，对于脉络丛发育的研究仍然是一个相 对空白的新领域。 脉络丛上皮细胞的衰老研究也受到的一定程度的关注。作为脑脊液的分泌 来源，随着动物乃至人的年龄增加，脉络丛的分泌能力也有较大下降。大鼠( r a t ) 的脉络丛上皮细胞分泌脑脊液的能力随着鼠的年龄增加而发生了明显的下降，相 对于幼年( 3 m o n ) 大鼠而言，脑脊液的分泌量在衰老( 3 0 m o n ) 后下降了大约一 半。但是有趣的是脑脊液的总量却有所增加。相同的现象也出现在人体上。脉络 丛脑脊液分泌率的下降和脑脊液总体积的增加无疑是脉络丛一脑脊液系统衰老 的一种征兆，但是其生理机制尚不清楚”1 。 4 此外在衰老的脉络丛上皮细胞中乳酸脱氢酶( l d h ) 和琥珀酸脱氢酶( s d h ) 的活力随着大鼠年龄的增加而出现下降”1 ，下降率分别是9 和2 6 。这些与细 胞氧化还原反应相关的酶反应活力下降直接导致的结果可能就是依赖于能量的 分泌功能的下降。此外衰老的脉络丛上皮还出现了缓慢地钙化现象，同时脉络丛 对于氨基酸等其他一些大分子物质的通透性也有一定程度的增加。 1 2 2 脉络丛上皮细胞营养与激素的转运 脉络丛上皮细胞由于紧密连接使得离子，氨基酸与其他生物大分子很难透 过这一屏障进入脑脊液环境从而分配到整个中枢神经系统中。过去曾有研究者认 为脑脊液的主要功能是为中枢神经系统提供能源。但是考虑到脉络丛的分泌量以 及脑脊液中这些营养物质的含量不难推断出这一假说并不成立，虽然如此，但是 最近也有研究者认为可能脑脊液提供了脊髓神经根的营养需要”。 通过许多脑室灌流实验的结果发现，脉络丛中的确存在有可以转运糖类物 质以及氨基酸的转运体。在对绵羊的脑室灌流研究中发现，在脉络丛上存在着对 于蔗糖的直接转运体系，虽然其转运速率较低，但是结果显示脉络丛对于蔗糖的 主动吸收是脑脊液中蔗糖积累的主要因素1 。此外在脉络丛上也发现了四种氨基 酸转运体，分别用来转运大分子，小分子，阳性和阴性氨基酸“。”1 。这一主动 转运体系的存在暗示了脉络丛可能对脑脊液中氨基酸水平的稳态有一种主动调 节作用。由于脑脊液本身可以通过室管膜的间隙与脑神经元细胞间液发生交换， 因此脉络丛对于氨基酸转运的调节将可能有利于神经元中某些神经递质物质在 神经元与细胞问液体中产生一种浓度梯度，这一浓度梯度可能对保持神经元生理 活性有着重要意义。 近年来通过免疫组织化学、原位杂交，放射自显影等分子生物学手段在脉 络丛上皮细胞陆续发现了很多激素以及多肽的受体与作用位置。这些激素和多肽 物质中仅有一部分通过调节脉络丛上皮细胞的离子通道来影响脑脊液分泌，其他 的主要作用为一种中间介导转运体。脉络丛可能担负着一种转运作用，将多肽和 激素类物质从血液转运到脑脊液中。同时脉络丛上皮细胞本身也分泌多种多肽物 质，并负责清除某些物质，例如可溶性的b 淀粉样蛋白。”。 1 2 3 脉络丛上皮解毒与药物代谢 脉络丛作为血一脑脊液屏障担负着物质运输的阻断作用。通过解剖学发现， 脑中毛细血管与脑实质之间存在的血脑屏障主要是由毛细血管上皮细胞通过紧 密连接实现的。由于分子物质几乎无法透过细胞间紧密连接，而毛细血管上皮细 胞并不存在熟知的一些受体和离子转运体，因此脉络丛成为血液中物质与中枢神 经系统物质交换的主要场所。通过研究发现脉络丛上皮细胞对于药物代谢起着非 常重要的作用。因为从总体上说，脑并不是一个药物代谢器官，中枢神经系统中 的胶质细胞只比神经元对于药物和体外毒素的耐受能力稍强一点。因此对于药物 和毒素的代谢将主要由脉络丛上皮细胞所含的酶屏障进行代谢。在脉络丛上皮细 胞中已经发现存在有细胞色素p 4 5 0 的同工酶c y p i a l ，c y p 2 8 1 ，2 ，这些酶在药物代 谢起到氧化底物的作用。同时在脉络丛中分布的大量谷胱苷肽类物质将和前一步 产物相结合然后通过m r p 家族蛋白转运出细胞，达到解毒和药物代谢的目的“。 1 3 脉络丛上皮细胞分泌机制的研究进展 脉络丛上皮细胞拥有大量的离子通道，共转运体，和n a + 一k + - - a t p a s e 等， 这些结构的存在是脉络丛离子分泌的基础。由于目前认识到脉络丛的分泌机制比 较复杂，所以在下面将介绍一种相对简单的分泌模型帮助理解上皮细胞分泌“。 由于上皮细胞存在着细胞紧密连接，因此细胞膜上的蛋白不可能通过在细胞膜上 流动而发生位置改变。由于上皮细胞一般会处于不同的界面之间起到屏障作用， 因此按照不同的界面朝向通常把上皮细胞分为顶膜面( a p i c a l ) 和底膜面 ( b a s o l a t e r a l ) 两个不同界面。而位于这两个界面上的离子通道和转运体分布 也存在差异，因此上皮细胞便具有了一种极性。图1 1 显示了一般上皮的分泌过 程。首先，位于底膜面的n a + 一k + - - a t p a s e 通过水解a t p 产生的能量将3 个n a + 泵出细胞，同时将两个k + 泵入细胞，于是造成了上皮细胞胞内低n a + 高k + 的情 况。随后由于n a + 一k + - - 2 c 1 一共转运体的工作使得c l 一可以跨过底膜面进入上 皮细胞中。然后由于细胞内c 1 一积累而产生浓度梯度使得一部分c l 一离子可以通 过顶膜面c 1 一通道进入顶膜面从而达到了c 1 一分泌的目的。由于c 1 一在顶膜面积 累而使得顶膜面与底膜面液体之削产生了一个电势梯度，于是n a + 在这个梯度的 驱动下穿过细胞间紧密连接而分泌到顶膜面。由于n a + ，c 1 一的跨膜流动使得顶 膜面这两种离予不断得到积累，于是顶膜面溶液与底膜面溶液的渗透压差直接驱 动水通过细胞膜上的水通道或者细胞间紧密连接而从底膜面流向顶膜面，从而产 生了净的n a c l 与水的跨膜流动。 图1 1 ：一般上皮分泌机制图 n g 1 1 m o d e lo f e p i t h e l i as e c r e t i o n 脉络丛上已经发现的离子转运体，离子通道和其他分子泵浦显示脉络丛的 分泌机制要远比以上描述复杂。目前研究显示的很多离子通道与共转运体的来源 是通过免疫组化等分子生物学方法，因此对于详细解释分泌的通路，尤其是生理 机制有着一定的困难。但是在哺乳动物，如鼠，狗，羊等动物上取得的很多成果 是十分具有启发性的。 1 3 1 n a + 一k + - - a t p a s e n a + 一k + - - a t p a s e 是比较早在脉络丛上发现的离子转运体，其主要功能是在 水解一个分子的a t p 后从细胞内泵出3 个n a + ，同时泵入2 个k + 。因此结果对细 胞而言不但造成了细胞内外的浓度差，也导致了细胞膜两侧的电势差。n a + 一k + - - a t p a s e 共有、0 两个不同亚基，其中o 亚基有三个异构体，0 有两个异构 体。在脉络丛上发现的有a1 ，01 ，b2 三种不同亚基。与在很多上皮上发现的不 同，脉络丛上的n a + 一k + 一a t p a s e 分布在脉络丛的顶膜面，也是面向脑室的一面。 这一不同分别可能暗示了脑脊液中n a + 的来源“。 1 3 2n a + 一k + - - 2 0 i - 共转运体 n a + 一k + 一2 c 1 一发现是由于观察到b u m e t a n i d e 对于k + 离子分泌有很大影响， 其后的原位杂交技术以及w e s t e r n 技术证实了n a + 一k + - - 2 c 1 一共转运体( n k c c l ) 在脉络丛上皮细胞有表达。但是n k c c 2 并没有发现。虽然有免疫组化技术证明 n k c c 位于脉络从上皮细胞的顶膜面，但是与很多在脉络丛得到的其他结果一 样，这个结果与其他脉络丛实验得到的数据又有所冲突。而且，对于n k c c 在脉 络丛顶膜位置的生理作用依然不十分明确。 1 ，3 3k + 一c i - 共转运体 k + - - c 1 一交换体共有四种异构体，最早在两栖动物脉络丛中被观察到。但是 后续实验却由于无法判断d i o a 敏感型的复合物对于k + 外流或内流的影响而使 得这一结果变得扑朔迷离，难以解释。分子生物学发现k c c 在脉络丛上皮细胞 的顶膜和底膜面均有表达。通过原位杂交以及r t - - p c r 的结果显示，k c c l 在 大鼠和小鼠的脉络丛上皮细胞中均有表达。但是k c c 2 在脉络丛上并没有发现。 k c c 3 又分为a 和b 两种异构体。r t - - p c r 研究表明在大鼠脉络丛上有k c c 3 a 表达，但是k c c 3 b 没有表达。同时通过免疫组织化学研究发现在小鼠脉络丛上 依然存在k c c 4 。但是目前研究对于k c c 到底在脉络丛分泌过程中的生理学功 能依然十分不清楚【1 8 】。 1 3 4c i 一一h 0 0 。一交换体 c i 一- - h c 0 3 - - 交换体( a e ) 广泛存在于生物体细胞中，主要担负的生理功能是 调节整细胞内p h 值。目前发现的a e 异构体共有三种，a e l 主要存在于血红细 胞中，a e 3 则主要分布在神经元中，a e 2 则分靠在脉络丛。位于顶膜面的c r h c c l 3 - - 除了担负调节细胞内p h 的功能以外，可能另有一个主要的生理功能就是 向脑脊液中分泌h c o ：，一，同时使得c l - 离子流入细胞并且跨膜交换。但是也有研 究显示a e 2 在小鼠上也分布在底膜面，因此目前对于a e 的生理学作用仍然有 一定争议。 1 3 5n a + 一h c o ；一交换体 n a + - - h c o 。- 交换体( n b c ) 可以分为生电型与电中性两大类。其中生电型 n b c e 是使3 个h c 0 3 - - 离子被排出细胞同时一个n a + 被交换进入细胞，此过程中 因为有三个阴离子流出而一个阳离子流入，因此产生了电荷变化。n b c e 被认为 是一种对脉络丛上皮细胞p h 调节有着至关重要作用的调节体。电中性交换体 ( n b c n ) 型转运体中的n b c e l 通过r t - - p c r 方法已经在大鼠和小鼠的脉络丛 上发现，但是进一步关于蛋白的研究还有待继续，估计其生理作用可能与脉络丛 上皮细胞中n a + ，h c 0 3 - - 等离子的积累有关1 1 9 】。 1 3 6n a + - - h + 交换体 n a + 一h + ( n h e ) 交换体的主要作用是将细胞内的一个h + 泵出，同时将细 胞外的一个n a + 交换进入细胞。作为一种管家型( h o u s e k e e p e r ) 的离子交换体， n h e 的主要作用是调节细胞p h 变化。但是在脉络丛上皮细胞中的研究已经发现 n h e 可能与分泌n a + 过程有着一定联系。目前发现的n h e 共有8 种。其中通过 r t - - p c r 发现在猪的侧脑室脉络丛有l 型n h e ，而在大鼠的侧脑室脉络丛则没 有发现1 2 训。 1 3 7 碳酸酐酶( c a ) 碳酸酐酶( c a ) 在细胞中的主要作用是将游离在细胞质中的c 0 2 催化后与 水发生反应生成h + 和h c 0 3 - - 两种离子。虽然c a 本身并不直接参与离子跨上皮 细胞的转运，但是c a 产生的两种离子h + 和h c o 。- 却是诸多离子交换体的底物， 如上文提到的k c c 和n h e 等。c a 已经发现多种异构体，其中c a 2 通过组织 化学方法证明是存在于大鼠脉络丛中，c a 3 存在于人的脉络丛和室管膜之中。 1 3 8k + 通道 k 1 通道的主要作用首先是保持细胞膜的负电势，这一负电势直接促进了阴 离子流出细胞。此外脉络丛的k + 通道还保证了细胞通过n a + 一k + - - a t p a s e 产生 的细胞内k 离子积累可以通过通道排出细胞而不导致k + 过载。k + 可能也参与 了脑脊液的离子分泌过程，确切的说是离子跨脉络丛从脑脊液向血液流动，这可 能导致了脑脊液中k + 离子含量低于血液的结果。 目前通过膜片钳研究得到的结果发现脉络丛的k + 通道分两种：一种时间依 赖性外向整流通道k v ；一种是非时间依赖的内向整流通道k i r ，随后的分子生物 学研究表明在脉络丛中有内向型整流通道k i t 7 1 1 22 1 。 1 3 9 阴离子通道 在脉络丛上皮细胞中还发现了有阴离子通道存在。目前通过膜片钳证实在 脉络丛上皮细胞中存在有内向型整流通道和体积敏感性两种阴离子通道。曾经有 研究人员认为阴离子通道可能是c f t r ( 囊性纤维变性电导调节体) ，但是通过 对比c f t r 敲除小鼠与正常小鼠脉络丛上皮细胞的全细胞电流发现结果并不支 持这一假说，而且通过对离子通透性顺序的研究也发现脉络丛上皮细胞中的阴离 子通道也不属于c i _ c 一2 【2 3 】。 1 3 1 0 水通道 此外脉络丛上皮细胞中还有水通道存在，免疫组织化学以及r t - - p c r 方法 都说明了上皮细胞中存在水通道a q p l 和a q p 4 ，其中a q p l 被确定分布在脉络 丛的顶膜面丽a q p 4 的分布尚不清楚。 1 3 1 1 脉络丛上皮细胞分泌可能机制 关于脉络丛上皮细胞分泌可能机制总结如下。由于脉络丛上皮细胞中n a + 一k + - - a t p a s e 和c a 酶共同作用产生了最初的分泌动力。n a + k + - - a t p a s e 通 过水解a t p 造成细胞内的n a + 浓度降低，从而产生了底膜面n a + 离子浓度高于 细胞的浓度梯度差。同时碳酸酐酶( c a ) 在细胞内将c 0 2 与h 2 0 转化成h + 与 h c o 。- 两种离子。通过位于细胞底膜面的n h e 交换体将n a + 离子交换进入细胞 而将h + 排出细胞。这个过程完成了n a + 从基底膜面向顶膜面的分泌。同时脉络 丛上皮细胞底膜面的c l _ h c o , - 交换体( a e ) 将碳酸酐酶的另一产物h c o 。一 排除细胞而将基底膜侧的c 1 一交换进入细胞，使得c l - 在细胞内积累。然后c l _ 以一种顺浓度差的方式从项膜面的相关通道或者转运体运出，完成分泌。伴随离 1 0 子分泌而建立的渗透压差将带动水从顶膜面流入后，由顶膜面的a q p l 水通道分 泌。l t - l 夕b ，位于项膜面的n k c c 转运体还起到回收多余的c l _ 作用。而位于顶膜 面的k + 通道也将调节由n a + 一k ，一a t p a s e 和n k c c 带入上皮细胞多余的k + 。 目前对于高等动物( 如鼠，兔等) 脉络丛分泌机理的研究仍然多集中于分 子水平。由于分子生物学对于某些现象无法解释，如共转运体转运离子的方向， 因此此方面研究还有待深入进行。关于脉络丛上皮细胞的研究仍然在起步阶段， 因此有很多实验结果还有待重复和假说有待证实。 1 3 1 2 囊纤维变性电导调节体( o f t r ) 囊纤维变性电导调节体( c f r r ) 是目前在人体组织太部分上皮细胞上发现 的一种重要的离子通道蛋白。在人体中编码这一蛋白的基因位于人第七对染色体 长臂3 1 ( 7 q 3 1 ) 上，此基因包括约2 3 0 k b 的d n a 。表达后的蛋白由5 个结构域 ( d o m a i n ) 组成共1 4 8 0 个氨基酸：其中2 个为跨膜区。c f r r 广泛分布在各种 组织的上皮，尤其是分泌性上皮中，例如：呼吸道，胰腺，小肠上皮等等。作为 一种上皮细胞中重要的离子通道，c f t r 的主要功能是在细胞内c a m p 调节下开 放c l _ 通道，使得c l _ 可以正常分泌。这一基因缺失导致的疾病被称为囊性纤维 变性( c f ) 。由于上文提到c l 一和n a + 作为上皮细胞分泌的重要离子成分，这两 种离子的分泌如果出现失调将可能会导致整个分泌过程的崩溃。事实证明这一突 变是致命的，罹患这一疾病的人通常会在诸如呼吸系统，消化系统乃至生殖系统 产生病变最终丧失生命。作为分泌上皮的一种，脉络丛上皮细胞中的离子通道是 否也是c f t r ，这方面的研究已经在开展中，但是目前只有很少的研究员对此进 行过研究。此方面研究的重复工作也几乎没有报道【2 4 1 。 1 4 脉络丛上皮细胞研究的电生理技术 1 4 1 膜片钳技术 膜片钳技术是一种测量细胞微弱电信号的电生理技术。通过玻璃微电极与细 胞膜形成高阻抗( gq ) 封接，此技术可以测量由于离子通过离子通道运动而产 生的微小电流( p a ) ，或者整个细胞所有离子通道开闭引起的总电流变化，从而 对细胞生理功能进行研究。此技术出两位德国细胞生物学家e r w i nn e h e r 和 b e r ts a k m a n n 在1 9 7 6 1 9 8 1 年间创立，此项技术对细胞生理学的影响及其深远， 两位科学家也因此获得1 9 9 1 年诺贝尔生理学医学奖。 位于细胞表面的离子通道是膜片钳技术的细胞生理学基础。通过玻璃微电极 与细胞膜间封接加上先进的电子放大技术，可以对小至p a 量级的电流进行测定， 由于整个体系是一个典型的低噪声测量体系，因此在实际操作中会有一定困难。 膜片钳技术的原理如下图所示。 图1 2 膜片钳技术示意图 f i g 1 2t h eg e n e r ni l l u s t r a t i o n so f p a t hd a m p 参考电极，浴液，细胞，玻璃微电极以及放大器探头共同构成一个回路，由 于负反馈放大原理可以通过给定电压v c 使得细胞被钳制在一个固定电压值上。 而膜片钳探头则可以通过将输入电流值转化为电压进行电生理测量和记录。 目前的通过膜片钳对细胞进行记录的方式大致可以分为四种模式( 图1 3 ) ， 分别是细胞贴附式，全细胞记录，膜外朝外和膜内朝外。细胞贴附式是指由于玻 璃微电极尖端可以达到非常细小的水平( 直径约1l am ) ，冈此微电极在与细胞膜 达成高阻抗封接后，在封接的玻璃微电极内的面积将非常小，因此可以大致认为 此区域仅仅包含一种特定类型的离子通道。当然这是一种理想情况，也可能在此 区域内有着多于一个的离子通道，对于此种情况需要使用其他方法进行研究。由 于单通道的丌放具有随机性，因此需要通过统计来对结果进行分析。 1 2 盘“”“州 毖盘 裂器棼- - 艘珊l h c e 羁芝 i u _ c e l l 醚 澄三妙 。i 。w 。l 犯。1 。! 。e 。c 。e 。1 1 1 l 。o 。u 。t 。s 。i 。d 。e 。- 0 1 。u 。t il i n s 涮e - o u t l lr e o o r d i n g ilp a t c hll p a t c h i 图1 3 膜片钳记录示意图 f i 9 1 3 t h eu s eo fp a t c hc l a m pf o ri o nc h a n n e lr e s e a r c h 全细胞记录是另一种重要膜片钳研究方法。此时的玻璃微电极尖端口径要略 大于细胞贴附式时的玻璃微电极尖端。首先玻璃微电极也需要达到高阻抗封接， 但是其后可以通过外力或施加额外电压等方法将封接于微电极内的细胞膜打破， 从而使得整个细胞内液和电极内液沟通，这就是全细胞技术的由来。全细胞离子 记录技术应用非常广泛，可以对离子通道的性质和分类进行研究。由于细胞内液 的体积相对于电极内液几乎可以忽略不计，因此可以通过改变电极内液与浴液对 离子通道进行广泛的研究。但是对于某些依赖细胞内酶或者其他细胞信号通路的 离子通道，则往往由于细胞内液被替换，导致这些物质的流失而使得离子通道不 能表现出正常的生理学活性，因此这是应用这一技术必须考虑的问题。 此外还有膜外朝外和膜内朝外两种研究方法。在全细胞记录过程中如果将玻 故飞n屈少鞋，_ _ 蝴 璃微电极回撤，则与微电极接触的细胞膜会发生断裂，但随后断裂的端口又回再 一次重新封接而形成新的膜融合。此时原先细胞膜的外表面会仍然对着浴液而形 成膜外朝外的模式。由于对于浴液的替换是非常方便的，因此在膜外朝外的模式 中通过对浴液的替换可以模拟离子通道在不同细胞外液时表现出的不同生理状 态。但是由于这一小片膜是完全分离自细胞的，因此对于那些依赖细胞内物质发 挥生理作用的离子通道的研究有着一定困难。膜内朝外的模式是在细胞贴附式的 基础上拉回电极，此时细胞膜在断裂后会自动形成一个小的囊泡，然后将微电极 暴露在空气中使得囊泡破裂就形成了膜内朝外的模式。此时浴液就相当于细胞内 液，因此可以方便的替换浴液而达到模拟不同的细胞液的目的，此方法也存在这 与膜外朝外一样的问题。 1 4 2 短路电流技术 短路电流技术是一种用来专门设计用来研究上皮细胞电介质转运的专门技 术。在生物体中，上皮细胞的作用往往是用来分隔两个不同的环境，如皮肤分隔 了生物体内环境与外界环境，肺泡上皮细胞分隔了血液与外环境中的气体，肾小 管上皮细胞分隔了血液与尿样两个液体环境。而短路电流技术正是通过将上皮细 胞放置在一个由两个可分离的c h a m b e r 之问来模拟上皮在体内的生长以及生理 情况。然后在两个c h a m b e r 中灌入生理盐溶液使得上皮细胞保持在生理状态下， 在这一环境中尽量保持上皮组织或者细胞的生理活性，维持和细胞在正常生理状 态下的渗透压和p h 值使得细胞可以尽可能保持与正常生理状态相同或相近的生 理活性。然后通过在c h a m b e r 中连接入电流和电压探头对上皮细胞中带电离子的 跨上皮运输进行实时监控。通过人为外加电压可以将上皮细胞两侧钳制在希望的 电位来研究离子跨膜转运。 这一实验的原理是是建立在对上皮细胞的电性质进行特定的扰动从而研究 上皮细胞电解质分泌。短路电流技术主要分为电流钳和电压钳两种基本模式。在 电流钳模式中通过给定一个外加电流将跨上皮电流钳制在毗a ，使得没有跨上皮 的净电流出现，从而可以模拟组织在体内的情况，可以用来研究跨上皮净离子转 运。而电压钳则是指通过外接电压使得样品电压处于一个特定数值，然后对上皮 转运离子进行测定。短路电流技术可以得到的基本数据是顶膜面与底膜面浴液之 1 4 间的跨上皮电压( v t ) ，将跨上皮电压( v t ) 钳制到零所需的电流( i s c ) 和跨上 皮电阻。这些数据在实际实验中可以反应上皮细胞在短路电流系统中表现出的带 电离子跨上皮运动的生理特性。 对于离体的上皮组织可以直接放入短路电流系统中进行实验。但是体外培 养的细胞则需要使用一种特制的r i n g 来进行。培养的上皮细胞需生长在一种通 透性支持物上才能用于短路电流实验。通透性支撑滤膜由两部分组成，通透性滤 膜( p e r m e a b l ef i l t e r ) 和硅胶圈( s i l i c o nr i n g ) 。硅胶圈的制作如图1 4 所示。首 先将硅胶完全融解，充分搅拌。然后将融解状态下的硅胶倒入培养皿中静置等待 其凝固变硬完全定性。此过程中培养皿应放置在绝对水平的台面上，以防止最后 定型的硅胶出现厚薄不均匀的现象。然后使用内面积一定的双圈冲刀将硅胶制成 中空的硅胶圈“r i n g ”，然后使用生物胶将硅胶圈粘合在m i l l i p o r e 的微孔滤膜上。 使用前许提前放入紫外中照射灭菌4 小时以上。在种植细胞以日