（植物学专业论文）沙丘芦苇所含独特化合物对细胞膜流动性的影响.pdf

兰州大学硕士学位论文 英文缩写 p a a c a n s 英文缩略词表 英文全称中文名称 p o l y a m i n ea r o m a t i cc o m p o u n d 多氨基芳香族化合物 8 - a n i l i n o 1 - n a p h t h a l e n es u l f o n i c8 一苯胺基一1 萘磺酸盐 d p h 1 , 6 一d i p h e n y l 一1 ，3 ，5 一h e x a t r i e n e d s c 1 , 6 二苯基1 ，3 ，5 己三烯 d i f f e r e n t i a g c a l o r i m e t r y d i t l e r e n t i a ls c a n n i n g c a l o r i m e t r y差示扫描量热法 左不列猫重热法 e s re l e c t r o ns p i nr e s o n a n c e s o d s u p e r o x i d ed i s m u t a s e c a tc a t a l a s e p b s 电子自旋共振 超氧化物岐化酶 过氧化氢酶 p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n磷酸缓冲液 g b g l y c y l b e t a i n e p r o p r o l i n e 4 ： 甘氨酰甜菜碱 脯氨酸 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行 研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、 数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不 包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成 果做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作秘轹支嗣彩辱胁心j 冶 糁黪孥绣穸多 硕士学位论文 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰 州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学 校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被 查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本 人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：鑫碑导师签名：互鲁堑拄日 期： 兰州人学硕上学位论文 摘要 质膜在细胞内外物质运输、维持细胞内外的离子平衡、信息传递、细胞间的识别及 细胞运动等重要的生命过程中起着关键性的作用。 本实验以绿豆( v i g n ar a d i a t al ) 黄化下胚轴和水生芦苇( p h r a g m i t e sc o m m u n i s t r i n ) 为材料，用荧光染料8 苯胺基1 萘磺酸盐( 8 a n i l i n o 1 n a p h t h a l e n es u l f o n i c ，a n s ) 和1 , 6 二苯基1 ，3 ，5 己三烯( 1 ，6 - d i p h e n y l 一1 ，3 ，5 一h e x a t r i e n e ，d p h ) 为荧光探针研究外源 p a a c 处理后线粒体膜的流动性的变化。荧光探剂a n s 与膜结合后主要有两种因素可 引起a n s 荧光的变化，一是它所处环境的极性改变，二是与a n s 合的膜脂流动性变化。 如果前者不变，则与膜结合的a n s 荧光强度即能反映膜脂的流动性，荧光强度越大， 膜脂流动性越小。此荧光强度反映的是整个脂区运动状态的平均值。d p h 是研究膜脂 流动性比较敏感的一种常用探针。d p h 掺入到膜脂的膜脂酸烃链区后，介质粘度变大， 顺反异构化受到抑制，成为全反构型，即唯一能发荧光的构型。由于d p h 分子长轴接 近于与膜脂酸链分子长轴平行，所以，荧光偏振度( p ) 能很好地反映膜脂区域的微粘 度，定量地说明膜脂分子的运动情况。 结果表明：p a a c 处理对线粒体膜的流动性有降低的作用，并且和p a a c 的浓度呈一 定的量效关系。在实验范围内，高温胁迫下同样降低膜的流动性，最重要的是能够稳定 膜的流动性，但对相变温度的改变似乎不起作用。因此推测，在夏季自然高温环境下， p a a c 可以通过降低膜的流动性而对植物膜的功能起到稳定和保护作用。 关键词：p a a c ；荧光光谱；荧光偏振；生物膜脂流动性 2 兰州大学硕上学位论文 a b s t r a c t m e m b r a n ei sp l a y i n gac r u i c a lr o l ei ns u b s t a n c et r a n s p o r t a t i o nb e t w e e no u t s i d ea n di n s i d eo fc e l l ， m a i n t a i ni o nb a l a n c e , i n f o r m a t i o nt r a n s m i s s i o n , c e l li d e n t i f i c a t i o na n dc e l lm o v e m e n ta n da l s oo t h e r i m p o t a n tl i f ep r o c e s s u s i n ge t i o l a t e dh y p o c o t y l e d o n a r y a x i so fm u n gb e a na n d s w a m pr e e d a sm a t e r i a l s 8 - a n i l i n o n a p h t h a l e n e - 1 - s u l f o n i c a n d 1 , 6 - d i p h e n y l - 1 ，3 ，5 - h e x a t r i e n e 舔p r o b e s ，a f l u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t r ym e t h o d w a sp e r f o r m e dt or e s e a r c ht h ec h a n g eo fm e m b r a n ef l u i d i t yo f m i t o c h o n d i at r e a t e db ye x t r a n e o u sp a a c t w of a c t o r sw i l lc h a n g et h ef l u o r e s c e n c eo fa n sw h e n a n sc o m b i n ew i t hm e m b r a n e o n ei st h ep o l m t yo fa n s se n v i r o n m e n tc h a n g e s ，t h eo t h e ri st h e f l u i d i t ，r o fm e m b r a n ei i p o i dc o m b i n e dw i t ha n sc h a n g e s i ft h ef i r s ti si n v a r i a b l e , t h a tt h ei n t e n s i t yo f a n s sf l u o r e s c e n c ec a nr e f l e c tt h ef l u i d i t yo fm e m b r a n el i p o i d f l u o r e s c e n c em o r ei n t e n s i t y s l o w e ro f f l u i d i t y a n dt h i sf l u o r e s c e n c er e f l e c t st h ea v e r a g ev a l u eo fa l lt h el i p o i dr e g i o n 。sm o v e m e n t d p hi sa s e n s i t i v i t ya n dc o m m o mp r o b ew h e nl e a r na b o u tt h ef l u i d i t yo fm e m b r a n el i p o i d w h e nd p hm i x e s i n t ot h eh y d r o c a r b o nc h a i nr e g i o no fm e m b r a n ef a ta c i d ，m e d i u mw i l lb em o r es t i c k ya n dt h e t r a n s f o r mo fc i si s o m e rw i l lb es u p p r e s s e d ，s ot h a ta l la r er e s v e r ，t h a ti sc a nl a u n c hf l u o r e s e n e e o w i n g t ot h el o n ga x i so fd p hm o l e c u l ei sn e a r l yp a r a l l e l i n gw i t ht h el o n ga x i so fm e m b r a n el i p i o da c i d m o l e c u l e t h e r e f o r et h ed e g r e eo ff l u o r e s e n c ep o l a r i z a t i o n ( p ) c a nw e l l ys h o wt h em i n v i s c o s i t yo f m e m b r a n el i p o i dr e g i o n , a n dq u a n t i f i c a t i o n a l l yi l l u m i n a t et h em o v e m e n to fm e m b r a n el i p o i d m o l e c u l e t h er e s u l t so ft h es t u d ys u g g e s tt h a tm e m b r a n ef l u i d i t yo fm i t o e h o n d i ah a v eb e e nr e d u c e da f t e r t r e a t e db yp a a c ，f t l r t h e r m o r e ，t h e r ei sad o s e - e f f e c tr e l a t i o n s h i p c o n f i n e dw i t h i no u re x p e r i m e n t , p a a cr e d u c e st h em e m b r a n ef l u i d i t yu n d e rt h eh i g ht e m p e r a t u r es t r e s s ，m o r ei m p o r t a n t l y , i tc 锄 s t a b i l i z et h ef l u i d i t yo fm e m b r a n c e ，h o w e v e r , i th a sn oe f f e c to nt h ec h a n g eo ft h et r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e t h e r e f o r e ，i tc a nb es u p p o s et h a tp a a cg a l ls t a b i l i z ea n dp r o t e c tt h ef u n c t i o no ft h e b i o m e m b r a n ei np l a n t sb yr e d u c e i n gt h ef l u d i t yu n d e rt h eh i 曲t e m p r a t u r ei ns u m m e r k e y w o r d s ：p a a c ；f l u o r e s c e n c e ；f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o n ；b i o f i l mf l u i d i t y 3 兰州大学硕士学位论文 第一章文献综述及前言 生物膜的流动性是了解膜结构与功能关系的重要环节。可以用差示扫描量热( d s c ) ， 电子自旋共振( e s r ) ，荧光标记等方法从不同角度对生物膜流动性进行研究，其中，荧光 标记法较简便、直接，已得到了较广泛的应用。细胞膜的正常功能有赖于膜结构的完整 性和膜脂的流动性。磷脂的脂肪酸组成能控制膜的流动性，成为决定植物抵抗高温性的 主要因素。 植物生理学的位置：最近有人总结报道，在过去的第2 0 世纪中，特别是后5 0 年内， 主要由于作物天然遗传潜力的挖掘和耕作管理水平的改善，世界范围内农作物平均产量 发生了巨大的提高。但是，这仍然难以满足在不远的将来达到8 0 亿世界人口的粮食需 求特别是近期的分析表明，在过去的1 0 年中，几种作物产量的增长速率明显降低的 情况下更是如此。那么，未来的出路何在? 他认为以往的方法已难以使产量有大的突破 性的进展，由于其耗时，费力，并难以改变单一性状，因而只能寻求更有效的方法。而 遗传学角度的改良和遗传工程则是能寻求突破的领域，重组d n a 技术的不可估量的潜力 既可用于作物生产量的分子分析，也可用于可能的新的改良产量方法的探索。为了达到 这一目的要从三个角度着手：原初端的植物基因组全序列分析；终极端的利用遗传标记 技术进行基因型的遗传分析；中游的生化生理代谢分析。它们互相依赖和补充，不可替 代这也是我们生化生理学研究的用武之地。 胁迫含义：植物在其生长地，遭受多种限制发育乃至生存的胁迫。地球上的大部分 地区，如干旱半干旱区，盐壤区，沙漠，高原，高山区等等，其适宜植物生长的条件即 使有也是短暂的。一个地区永久的或暂时的多种不利但不立即使植物致死的环境条件， 或一种显著偏离于植物最适生活条件的环境条图1 环境胁迫对植物生产率的影响，a 暂 时受到不超过植物耐性极限的胁迫仅引起生理过程的暂时变化，而长时间的胁迫则引起 永久性破坏。前者的功能失调恢复后，干物质的增长速度可恢复到原来水平( 角度a 1 3 ) ，所以，产量损失较少产生变化和反应，尽管开始的时候是可逆的，但也可变为永 久性的( 图1 ) ，一般称为“胁迫”。这种不利条件引发植物在机体的所有功能性水平上。 生态型产生：植物不受到胁迫则不具备防卫能力，而高强度胁迫诱导植物最大程度 的抗性或耐性和死亡。作为一种限制和一种刺激，胁迫除了影响个体生长发育外，正如 沿地理胁迫梯度所见那样，促进更加适应的基因型的进化发育和筛选( 自然或人工) 。在 自然长期胁迫下生存的群体中，由“物竞天择”原则决定逐渐产生了一个从再生产策略 兰州人学硕l ：学位论文 + 霎i a 彳t i - l 盯狮啦 彳 i i - - _；t j l ：常一胁迫究仝饿盟状态 i f 常一胁迫未宠争愀缸帻怠 向保持性生存策略的过渡并形成特定的植物形态。植物在长期的适应不同生长环境过程 中发生生理、形态等的变异，并成为其稳定的遗传特征，从而形成不同的植物生态型。 自然环境与抗性研究：自然环境胁迫形式多种多样，相互联系影响。在恶劣的边缘 生境中，胁迫主要由非生物因子所至，其中气候因子占大多数，这些气候因子在大气、 土壤和水下施加影响于植物：过高或过低辐射；过高或过低温度；缺雨和干旱；强风； 在土壤中，植物面临高浓度盐和矿物或匮乏、土壤过酸或过碱及缺氧等等，都对植物造 成胁迫，而且，在自然界，各种胁迫因子很少单独发生而不受其它不正常现象的影响， 而是时常包含复合胁迫，如高辐射、过热或干旱等组合。所以，在研究分析中，虽然讨 论单个胁迫因子是必要的和不可避免的，但这并不意味着它们在自然界也单独施加影响 于植物。这也是我们研究自然逆境下植物抗性的难点和意义所在，不易明确阐述特定抗 性机理和因子与引发该机理表达的主导环境因子间的因果关系。尽管环境胁迫因子形式 多种多样，它们往往多能通过共有途径如影响细胞水分状态( 失水) 而发生胁迫效应，而 且，至少是部分地通过干扰体内的氧化还原平衡，导致植物遭受氧化伤害，因此，我们 主要就这二方面进行论述而暂时忽略胁迫因子的种类，并侧重于小分子渗透介质和渗透 保护介质以及酶和非酶的小分子抗氧化剂讨论。 很多环境胁迫至少部分地通过氧化损伤而伤害植物，因而，植物的抗氧化保护系统 6 兰州大学硕士学位论文 研究引起了广泛的注重。植物的光合器官能有效地吸收和利用可见光进行光合作用。然 而，强光给叶片提供超过光合作用所能利用的光化学能时同样会引起伤害性结果，而且， 光合过程的超负荷引起更低的量子利用率和更低的光合产量( 光抑制) ，当然，更高的辐 射将直接破坏光合色素和类囊体结构。从另一角度看，生长在开阔地带的植物，如高山、 荒漠植物，通过一定的机制适应强光，忍耐高强度的辐射乃至u v 辐射而能生存于这些 边缘地带。植物防御光破坏的机制多种多样，不同植物也可通过相同或不同的一种或多 种机制抵御高光胁迫。 巴丹吉林沙漠地区沙丘芦苇叶片中含有的多氨基芳香族化合物( m r 8 5 6 ) ( p o l y a m i n e a r o m a t i cc o m p o u n d ，简称p a a c ) ，是沙丘芦苇生态型所特有的一种小分子化学物质。有 报道表明p a a c 对高温下叶绿体的功能具有保护作用。自然条件的极端温度可以影响到 生物的膜系统相变状态，进而影响到膜的功能；膜酯的流动性或相变温度也与膜环境的 二价或多价阳离子，如m 9 2 + ，c a 2 + 有很大关系，它们可与膜磷脂亲水端结合，从而影 响膜系统的相变温度【1 】。p 从c 可以以多价阳离子形式存在的，可能具有同样的结合保 护作用机理，从而保持较高温度下膜的相态和功能。线粒体是一种研究外源物质对膜结 构影响的较好的模式系统。生物膜的流动性的研究方法，可以用差示扫描量热法( d s c ) 、 电子自旋共振( e s r ) 、荧光标记等方法从不同角度对生物膜流动性进行研究，其中荧光 标记法具有较简便、直接的特点，已经得到了较广泛的应用1 2 1 。以往对线粒体膜的流动 性的研究多是针对植物或者是作物抵抗低温、耐寒性的研究，陈靠山1 3 】用荧光标记法研 究脱落酸对线粒体膜的流动性的影响，证明脱落酸增加了膜的流动性，刘世名【4 】用此方 法研究了外源氯化胆碱对小麦线粒体膜的流动性的影响，证明氯化胆碱可以增加膜的流 动性，季宇斌【5 】通过实验证明龙葵碱能提高小鼠红细胞膜的流动性。杨福愉【2 1 采用此法 研究水稻的抗冷性，本实验采用这种方法来研究植物耐热性。实验选用绿豆黄化下胚轴 线粒体为材料，分别用i n s 、d p h 两种不同的标记物标记绿豆黄化下胚轴的线粒体，通 过施加外源p a a c 观察线粒体膜的荧光光谱、平均微粘度等的变化，研究外源p a a c 对线 粒体膜的流动性的影响，以揭示p a a c 在高温下对植物的保护作用机制。为了说明p a a c 对膜的保护机制中p a a c 与膜的结合方式，提取了线粒体类脂进行相关参数的测定。 7 兰州人学硕j ：学位论文 1 1 芦苇及其四种生态型 芦苇是一种多年生水生草本植物，其典型生境为淡水或含盐的沼泽、湖边，可适应 多种生境条件，并演化为对干旱、盐渍或低温等陆生胁迫环境有较强抗性、基因型差异 的不同生态型【_ 7 1 。内蒙( 西部) 和甘肃( 中部) 接壤处的巴丹吉林沙漠南缘荒漠地区( 河西走 廊) 生长着4 种生态型芦苇，我们在十多年的研究中发现它们的形态和生理特征由于不 同生境的影响发生了与环境相适应的稳定变异【8 】。根据生境特点，这类芦苇被划分为水 生芦苇、沙丘芦苇、轻度盐化草甸芦苇( 盐化草甸沙丘过渡态芦苇) 和重度盐化草甸芦苇。 巴丹吉林沙漠地区为典型的干旱荒漠气候，年降水量为11 8 r a m ，且主要分布在7 - 9 月 份：年蒸发量2 2 3 8 m m ，为降水量的2 0 倍，风大沙多，光照和水分配置极不均衡，土壤 次生盐渍化严重，植物的生长环境十分恶劣。这一地区起源于沼泽生境中的芦苇长期生 长于沙丘或盐化草甸土壤中，其形态发生了与各自环境相适应的极大变异，但分类学上 仍鉴定为同一个种1 9 j 。多年来，我们利用这一理想的自然变异体系，以水生芦苇为对照， 以盐渍、干旱及盐渍干旱过渡生境中生长的芦苇不同生态型为研究对象，从群体、个 体、细胞和分子等不同水平，用植物生理生态学的观点对4 种生态型芦苇进行了形态解 剖、生理、生化及分子生物学的比较研究，探究不同生态型芦苇在长期适应不同生境过 程中所形成的抗耐逆境的综合机制，进而阐明其关键的调控机制以及植物适应环境变化 而发生的生理生态适应的意义，试图为采用基因工程技术提高作物抗逆性提供理论依 据。 1 2 四种生态型芦苇抗逆生理的研究 植物抗逆性的研究已经深入到细胞和分子水平，且已取得了很大的进展。但由于绝 大多数研究成果是在实验室人为胁迫条件下获得的，这种单因子、快速而剧烈的人为胁 迫处理与渐进而持续的自然胁迫对植物的影响以及植物对胁迫的应激和适应反应有所 不同1 1 0 1 。人为胁迫容易造成细胞损伤，这种状态下诱导的一些基因可能仅仅是细胞损伤 或植物处于应激状态的表达结果【l ，所以，利用自然变异体系来分析植物在自然胁迫条 件下的响应对全面认识植物对逆境的适应机理显得尤为重要。植物抗逆生理的研究一般 3 兰州大学硕七学位论文 都从抗氧化保护系统、膜结构组成变化和膜结合酶活性变化、渗透调节物质积累和渗调 物合成中的关键酶活性变化三个方面，也就是说，是从植物抗逆的抗氧化保护机制、膜 修饰机制和渗透调节三大主要机制进行的。自然条件下植物所遭受的逆境因子几乎从来 不是单独存在的，在不同逆境因子共同作用的条件下，逆境对植物的影响和植物的适应 性响应也不同于单因子胁迫处理2 1 。4 种生态型芦苇对各自生境的适应是不同抗逆机制 的各种响应成分共同协调作用的结果。 。1 2 1 生物膜修饰 有人认为，生物膜是环境胁迫对植物造成伤害的原初部位，植物与外界环境之间发 生相互作用时，必然要以具有生活力的质膜作为感受外界环境信息的受体，同时，质膜 又能对环境作出相应的反应【1 3 1 。逆境条件下，植物膜质脂肪酸不饱和指数增大，膜流动 性增强，有利于植物抗逆性的提高和逆境下膜结合酶功能的调节。 1 2 2 渗透调节的响应 一般认为，低分子量的渗透调节物质积累是植物适应盐渍和干旱胁迫以维持生存和 自我保护的重要生理环节和抗逆策略。不同季节的芦苇叶片中k + 、c a 2 + 的持续积累对遭 受干旱胁迫的沙芦以及盐渍胁迫的过渡态芦苇和盐芦均有适应意义，在盐渍生境中表现 得尤为突出。这3 种陆生型芦苇叶片中c a 2 + 水平升高还伴随着n a + 含量的降低，其中， 过渡念芦苇和盐芦叶片中n a + 水平显著降低还与其根茎q b n a + 的积累呈显著正相关【1 4 l ，说 明高钠盐渍土壤下生长的芦苇根茎中积累n a + ，并可通过限$ 1 j n a + 过量进入地上部分，从 而避免盐害。 种内遗传变异是与生境差异和生态适应密切相关的。c h e n g ”】等研究与逆境适应 性相关的基因，结果表明，沙芦和盐芦对干旱和盐渍生境的适应只涉及为数不多的基因， 暗示植物适应逆境的分子机制可能是对多个代谢途径的少数几个关键酶类进行控制。他 们通过e d n a 文库筛选并克隆出沙芦茎中高度表达的胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖脱水酶的 基因( p c t g d ) 后，采用野外自然生境条件下和移栽于温室中的良好水分条件下的不同生 态型芦苇，以全长p c t g d 为探针进行n o r t h e r n 杂交分析。结果表明，自然生境条件下， 不同生态型芦苇茎中此酶均高度表达，沙芦茎中的表达量为水芦的3 倍，它在沙芦的根 茎中也有较高表达，而在水芦和盐芦的根茎中几乎检测不到，表明这一基因与水分胁迫 相关。对移栽于温室良好水分条件下1 个月的不同生态型芦苇进行n o r t h e r n 分析的结果 9 兰州人学硕上学位论文 表明，与自然生长条件下的表达水平相比，水芦茎中的表达量不变，沙芦和盐芦中均下 降，尤其是沙芦茎中的表达量仅为自然生境条件下的1 3 1 4 ，进一步证明在沙芦茎中 高效表达的p c t g d 与水分胁迫呈正相关。 1 2 3 抗氧化保护体系的响应 植物抗氧化酶系统和非酶系统的活性和含量高低往往是决定植物抗逆能力大小的 因素之一【1 6 】。沙芦和盐芦叶片中超氧化物歧化酶( s o d ) 活性高于水芦，但它们的同工酶 谱相同；过氧化氢酶( c a t ) 和过氧化物酶( p o d ) 活性虽比水芦低，但在干旱条件下c a t 和p o d 同工酶谱条带增加3 条，盐渍条件下增加2 剩7 1 。这种通过基因调控所发生的 抗氧化酶系统酶多型的出现及抗氧化酶活性的提高，不仅与芦苇的耐脱水能力相关，而 且还有助于通过清除活性氧而降低对d n a 的损伤 1 s 】，这可能是芦苇忍受干旱和盐渍胁迫 诱导的次级氧化胁迫能力提高的生理基础之一。 1 2 4 相容性溶质( c o m p a t i b l es o l u t e s ) 有人认为【1 9 】，抗性强度不同的植物，如栽培种与野生种，甜土植物与盐生及早生植 物，它们的保护功能方式是非常相似的，并在能改善植物抗性的、产生不同产物途径和 过程的之间具有叠加性，甚至可能是协同性，抗胁迫机理是具有广泛的适用性。因此， 所谓的高抗逆性植物可能仅仅是它们更有效地运行几个与耐性有关的，基础性的生化途 径而己。几乎所有生物在一定的程度上抵抗非生物胁迫的方法之一是累积或大量累积一 些在高浓度下相对地无害于细胞代谢的，不会干扰正常生化反应的小分子化合物，也称 之为相容性溶质( c o m p a t i b l es o l u t e s ) ，即文献中通常出现的渗透物质和渗透保护物质， 有关这方面的早期综述很岁2 0 之2 1 。这些溶质的基础功能是提高渗透压( 势) ，伴随水分流 入或至少降低流出细胞，提供细胞生长比需的膨压。而且它们在植物受到胁迫期间往往 具( 兼) 有其它的有益作用，如对失水细胞的生物膜和大分子有直接的稳定和保护作用， 对代谢失调而产生的过量r o s 有直接的清除作用1 2 3 之6 1 。在体内，它们可延迟酶的热变性， 抵抗p e g 对蛋白的沉淀作用【2 7 1 ，稳定生物膜系统以及保护酶分子抵抗某些类型的化学变 性1 2 8 1 ，等等。实践证明，作为相容性溶质不同种类在植物体内究竟有哪些有益的功能， 目前还不清楚，在活体研究中，也很难确定这些相容性溶质的具相互叠盖的效应的相对 重要性【2 9 】。理论上，在摩尔基础上有机和无机电解质( 应为离子对) 在产生渗透势上比渗 透介质更有效，但大多数的证据一致地支持这样的观点，即细胞质中相容性溶质浓度更 l n 兰州人学硕j ：学位论文 高，而耗能较少的电解质主要保持液泡和胞间的渗透势p 2 1 。 不同植物细胞质中累积的溶质可能是不同，有脯氨酸，甜菜碱，d m s p ，多醇类( 甘露 醇，山梨醇，o n o n i t 0 1 ) ，兼性季氨类化合物和海藻糖等等。几种常见相容性溶质的分 子结构在过去的5 年中出现了一些能过量累积或累积源植物没有的溶质的转基因植物， 证明了它们能够改善胁迫，甚至很轻微胁迫下植物的生长1 3 引。甘氨酰甜菜碱( g b ) 积累于 分类学上有限的物种，与p r o 不同，g b 不会在胁迫消失后迅速降解【3 2 1 。在高等植物中，g b 是在叶绿体中通过胆碱的两步氧化，途经一个不稳定的中间产物，甜菜碱醛，由胆碱单 加氧酶( c m o ) 和甜菜减醛脱氧酶( b a l d h ) 催化合成的【3 4 ”j 。可是有些细菌是由胆碱通 过胆碱氧化酶一步反应生成。在c 3 植物中，高光强，高温，干旱均引起光呼吸( 且l j p c o ) 或p c o p c rt ：匕值的上升【3 6 1 ，p c o ；o 高速度的g b 合成提供大量原初前体( g l y ，s e r , n 5 m e t h y l e n e t e t r a h y d r o f o l a t e ( m e t h f ，一碳单位供体) ) 的供应。姑且不论光呼吸是否有适应逆境的功 能，从能量角度分析，胁迫下g b 的合成从p c o 途径中分流a a 显然是有益的【2 6 j 。在胁迫条 件下，上升的p c o 会产生更多的h 2 0 2 ，加剧r o s 产生和淬灭之间的矛盾，如在胁迫下的c 3 植物中，内源的c a t 活性可能不足以应付水解h 2 0 2 1 3 刀。所以，g b 合成消耗线粒体s e r 和 m e t h f 及p r o 合成消耗酮戊二酸，谷氨酸l l 圳，均可减轻光下受胁迫植物的h 2 0 2 的产生。 体外，体内实验均证明g b 具有多重作用，它首先可以稳定细胞蛋白质的天然结构和保护 生物膜的完整性，同时也有渗透势调节功能，但其抗次生氧化胁迫的作用不明显。对于 g b 没有去除o h 等的解释是在积累g b 的同时也积累其他溶质，如小麦，大麦【3 8 】和一些盐 生植物【3 9 1 ，特别是在急剧或严重的渗透胁迫下，可同时累积p r o 。在藜科的一些种中， 在轻度，渐进胁迫时，只累积g b ，但随着胁迫程度的加剧或快速胁迫时，还积累脯氨酸。 这时，因为植物可能还来不及作出适应性代谢调整，如蛋白质( 抗氧化酶类等) 合成，p r o 提供额外的抗氧化机理就显得特别重要1 2 州，a r t h r o b a t e rg l o b i f o r m i s 的编码胆碱氧化酶 的c o d a 基因已被在原不积累甜菜碱的拟南芥菜中表达。该基因具有叶绿体的引导序列。 它在叶中的平均浓度低，但如果只考虑叶绿体，其浓度可达5 0 r a m ，达到了具渗透意义 的浓度。通过照相和植株长度的鉴定，该转基因植物比较能耐受n a c l 和连续照光( 5 ) 1 4 o l ，而定向细胞质的则仅具较低的这种效应。在烟草和马铃薯中【4 1 1 ，当通过转基因获得g b 合成能力，尽管只是在仅占细胞5 空间的胞质中产生5 t t r n o l gd w 的g b ，也同样提高了 抗盐、抗低温的能力，虽不能明确排除渗透调节作用1 4 2 ，但可以认为g b 具有稳定细胞结 构和大分子的作用。另外，叶面喷施g b 也可改善试验中水分胁迫下烟草的生长以及大田 玉米，高粱，黄豆的生长 4 3 4 5 1 。 兰州大学硕士学位论文 甘露醇累积是很多植物种类对干旱和盐等胁迫的反应，通过将编码甘露醇脱氢酶的 大肠杆菌m t l d 基因转入烟草而使转基因烟草具有甘露醇合成能力，这些植物积累中等量 的甘露醇，并据说有较高的耐盐性l 4 6 】，t a r c z y n s k i 观察到可表达m t l d 基因的转基因番茄在 非n a c l 胁迫时累积的甘露醇不影响其生长，但在高盐胁迫3 0 天后，明显提高了植物高度 和鲜重。b o h n e r t ( 1 9 9 7 ) 及其同事现也已获得了m t l d 表达的转基因烟草，该基因表达产物 定向于叶绿体中，并在叶绿体中累积了据估计有1 0 0 m m o l l 的甘露醇。但他们还是认为 甘露醇更主要是通过作为渗透保护物质提高抗性。人们认为相容性溶质包括甘露醇，除 了在较高浓度下具有渗透调节作用，往往还可以是抗氧化剂，可消除o h 等r o s l 2 6 】。这 一点可能对干旱，高盐，高光胁迫下植物是很具意义的，因为众多证据证明这些条件下， 活性氧类氧化剂产生量明显上升【3 3 1 。利用上述叶绿体内积累甘露醇的烟草，发现甘露醇 不影响光合作用，但转基因植物对由于甲基紫精( m e t h y lv i o l o g e n ) 处理而人为叶绿体内产 生的o h 的耐受性增加了，同时转基因植物自身的o h 含量也比较低，表明这种保护应该 是由于o h 消除作用。另一报道阱2 5 1 光照下类囊体产生的o h 的一个关键伤害部位是 c a l v i n 环酶，磷酸核酮糖激酶( 由巯基一二硫键转换调节活性) 。在含有类囊体和该酶的 混合物中，对酶的钝化作用可为甘露醇保护，并能解释甘露醇在自然体内的保护作用。 用同一个m t l d 基因转化一个由于不能合成正常的渗透调节物质甘油，而不能在高渗透介 质上生长的的突变酵母( s a c c a r o m y e e s e e r e v i s i a e ) ，通过引入甘露醇合成能力恢复了在高 渗介质上生长能力，而且该转基因酵母也更能耐受生长介质中化学产生的o h ，进一步 地证明了体内甘露醇作为o h 消除剂【47 1 ，这些研究表明，渗透调节物质甘露醇确实具有 多方面功能，并能解释在不具渗透调节的低浓度下的保护作用f 4 引。 脯氨酸也是很多植物在逆境下累积的溶质之一。由于p r o 合成消耗大量n a d p h ，使 n a d p + 得以再生而有益于氧化还原循环1 4 9 1 ，同样的有益作用也出现在谷胱甘肽- - v c 循环 之中。但尽管p r o 的绝对含量常可可靠地反应抗性的大小，它的的累积常常是在伤害出 现时才明显，同时，有关的合成酶类，如p 5 c 合成酶【5 0 】和p r o 脱氢酶1 5 l 】等在发生胁迫的1 小时内就上升，而p r o w l 在数小时后才出现累积，所以，可能p r o 合成生化途径的运行量 比累积的p r o 量本身更重要，p r o 的累积仅是适应过程早期植物有益的代谢调节的征兆， 而p r o 降解则又可为恢复时期提供cn 和能量【3 引。另外，因为脯氨酸在植物体内的日变化 很大，如在烟草中可达5 倍，所以，有人对其逆境期间的保护作用提出了怀疑巧2 1 。 兰州大学硕十学位论文 图为几种常见相容性溶质的生化合成途径 兰州大学硕上学位论文 一c 。 a 。i i l l l l 啊n s p 口 3 ：一。卜y i e , r lu t ：c 0p ，4 ” c - t o ho h ，在础 o 一 鼢c c h | o h c ho h ? ? 龟。一 h o 龟。h 户一 矗o h f - u r fow - i v 掣一 ds 埘b t 儿种常虻1 1 l 窬。h i 济质的分6 1 i l l 构 1 2 5 其它溶质及其意义 不同植物在逆境下可累积的渗透介质或渗透保护介质还有很多，所以不能合成特定 渗透物质的高等植物可代偿性地累积另一些溶质。由于这些溶质往往处于高还原态特 征，通常被认为都是有价值的胁迫下过量还原力的贮存物质和或从胁迫中恢复时期的c n 源，而不同植物累积溶质种类也与逆境时这些溶质前体的可用性有关，包括前体的来 源、数量和胞内及组织定位。这些溶质在毫摩尔范围内具有一些效应，但往往要在摩尔 浓度范围内才具有最佳的保护作用。溶质合成前体可由胞内现有代谢途径提供，且累积 g b 的植物其胆碱合成途径非常活跃【5 3 1 ，同时也可从生长环境中摄取。特定溶质种类和较 广的前体来源，有助于在细胞脱水、正常代谢受干扰时，迅速合成这些有益的相容性溶 质，保持一定的细胞稳态平衡以及在适应特定生境中具有额外的意义。如在具有较高抗 性的白花丹科不同种类中发现，尽管作为渗透保护介质与g b 比较，其它的季胺类并不具 有优越性，但在白花丹科植物中显示出不同季胺的累积与植物所遭受的特定综合胁迫中 主导胁迫应子之间有很好的关系。例如，o 一硫酸胆碱具有渗透保护作用外，还可清除 体内硫酸根毒害；在低盐( h y p o x i c ) 条件下，1 3 一丙氨酰甜菜碱优于g b ：而脯氨酰甜菜碱 则在急剧出现的干旱环境中具有特别的优越性。结构上各异的渗透保护物质根据其大 小、形状、电荷等而有益于细胞内不同类别的分子。我们一般假设如果逆境下不累积某 些渗透保护物质，植物所发生的损伤将严重得多，而胁迫诱导的渗透保护物质的功能一 般解释是基于三种观察：l 、它们是在干旱或高盐条件下累积【5 4 1 ，在很多情况下，同一物 种的不同植物( 植株、亚种等) 特定化合物与抗性能力有相关性【5 5 1 ，2 、外施一些天然存 在的溶质可提高植物抗性1 5 6 1 ，3 、通过遗传手段证明，如转基因提高甘露等能提高渗胁 条件下植物生长i 拍】，而能表达海藻糖合成酶的转基因植物与源植物比较，不易丧失水分 【5 刀，在这实验中由于海藻糖浓度很低，作者认为它是通过保护性作用而不是改变渗透势 1 4 兰州大学硕r j ：学位论文 发生效应，在体外实验中表明该渗透保护物质可降低酶失活或维持膜结构【5 3 】。 芦苇是禾本科多年生草本植物，在世界范围内广泛分布。英国学者很早就观察到， 这种具湿生结构特性的植物能够适应广泛的生境条件，其结果不仅导致芦苇形态显著不 同，在生理和遗传等方面也有深刻的变异。此外，其它人的工作也表明，不同生境芦苇 在叶片气孔密度、叶面积指数、群丛密度、光合能力、内源激素水平、抗耐盐能力等 方面均存在显著差异。我国甘肃省河西走廊也有芦苇分布。由于该地区大陆性气候极为 显著，次生盐渍化严重，再加上戈壁沙漠的分布，使得植物的生存环境十分恶劣。由于 生境水分和盐渍化程度的不同，该地区芦苇形态差异很大，形成不同生态型芦苇。 不同生态型芦苇及其生境特征：由于本实验中所涉及的几种生态型芦苇生长于一个 相对较小的地域范围( 1 5 x 2 公里) ，所以它们承受的是相对一致的气候环境，同时也表 现出比较一致的生长期( 5 一1 0 月) ，但水芦( 当地俗称苇子) 生长于终年积水的淡水体中， 生境潮湿，生物产量最大，群体茂密，互相遮荫严重，平均株高通常大于4 m ，基径2 c m 左右，群落密度为三者中最高，且蔓延成片；沙丘芦苇( 俗称芦草) 生长于2 米一5 米以上 的沙丘上，无可见的地表水源，生境干旱，生物产量次之，最终株高一般不超过1 5 m ， 基径0 5 一l c m 。群落密度远较水芦为小。往往由横向根茎上单一节间芽发展成为稀疏小 丛，簇丛直径一般不超过0 3 5 米，互相几乎无遮荫。沙丘芦苇有发达的入土很深的地下 横向根茎，距地表达0 3 米( 迎风面) 一1 5 米( 背风面) ，并依靠它行营养繁殖；盐生芦苇 ( 俗称鸡爪芦) 生长于有明显或严重地表盐结晶的，季节性干涸的较潮湿的低洼地，生 物产量小，最终株高仅o 0 5 米左右，基径0 3 a m 左右，通常呈匍匐状。群落密度小呈稀 疏片状。与前二者不同，未见明显的有性繁殖过程。只进行专性的通过其入土浅且纤细 的地向根茎的营养繁殖。表1 表述了几种芦苇叶片形态参数平均值( 表1 ) 兰州大学硕上学位论文 植物对干旱，高温，低温，高盐等不良环境的生理反应，最为显著的共同点之一是 水分丧失，并伴有光合作用的下降。而具有一定抗逆性的植物则经常表现为细胞内某种 代谢物质的累积。已知具有增强植物抗逆能力的代谢物质多属于含氮化合物( 脯氨酸， 季胺类化合物及多胺类) 或多羟基化合物( 蔗糖，多元醇，寡糖) 。这些代谢物质不会干扰 细胞中的正常生化反应，但能通过调节细胞渗透势和保护生物大分子的结构以抵抗因细 胞失水所引起的渗透胁迫等，这些代谢物质被称之为可相容溶质( c o m p a t i b l es o l u t e s ) 。 可是，由众多不同的实验体系所得的研究结果，为判断可相容溶质的累积对增强植物忍 耐复杂的自然环境所起的贡献造成了一定的难度。因此，使用在自然条件下具有稳定遗 传耐抗逆性植物进行实验以获得可相容溶质的累积和植物适应干旱等逆境之间的关系 是十分有意义的。芦苇是一种禾本科草本植物，其典型生境为水沼，河流及其周边地带。 但是它可适应广泛的甚至是高度不良的陆地生境，并演化出具有遗传差异的多种生态 型。在中国西北沙漠地区( 约3 3 x 1 0 5 h a ) 生长着水芦和三种陆生性芦苇生态型。我们在前 期研究中发现在其对干旱，高温，高盐等生境的长期适应过程中表现出相应的和稳定的 形态学和生态学特征。这些稳定的芦苇生态型是生态生理学研究植物对土壤干旱，高盐 抗性或耐受性的理想材料体系。 1 3p a a c 的发现及物理化学特性 文献认为所有生物在一定的程度上抵抗非生物胁迫的方法之一是累积或大量累积一 些不会干扰正常生化反应的相容性溶质，而不同植物由逆境诱导积累的溶质的种类和数 量是不同。这与各植物处于逆境时所积累溶质前体的丰度与可用性有关1 2 9 1 ，同时，也与 自然环境之间存在一定的相关性【1 9 1 ，在适应不同生境中通过积累不同的溶质提高抗性在 植物所遭受的特定综合胁迫中其有额外的意义。例如d 一硫酸胆碱具有渗透保护作用外， 还有消除体内硫酸根的毒害。我们在前期以不同芦苇生态型为材料的研究中发现，与水 芦和盐芦比较，在沙芦的可溶性物质提取液，特别是酸性提取液( o 1 nh c i ) q a ，因含有 不同的成分呈现淡黄褐色。所以我们试图分离可能存在的沙芦特有的溶质，最终在沙丘 芦苇的叶片中发现并纯化了一种与其它芦苇比较，为沙芦特有的褐色化合物。这种褐色 化合物经实验测定它的物理及化学特性得出初步结论，该小分子物质是一个多氨基芳香 族化合物( m r 8 5 6 ) ( p o l y a m i n ea r o m a t i cc o m p o u n d ，简称p a a c ) 1 1 1 。但是尽管在专业人员帮 助下，根据上述四谱特征，应用化学文摘( c a ) 等检索工具，仍未见相同或类同的已知化 1