（应用化学专业论文）增强化学发光分析新体系的研究及其在免疫分析中的应用.pdf

青岛科技火学研究生学位论文 增强化学发光分析新体系的研究及其在免疫分析中的应用 摘要 本文将化学发光传感技术、纳米技术相结合，探索构建了高灵敏度化学发光 免疫传感器的新方法。基于化学发光、光谱学、电化学等手段对构筑的免疫传感 器性能进行研究及优化。金属金纳米粒子作为固相载体，增加酶标抗体( 或抗体) 在固体表面的固定量，利用新型化学发光增强剂放大化学发光信号，提高化学发 光免疫传感器的灵敏度。结果表明，所建立的检测方法灵敏度高，易制作、简便， 在生物分析中将具有广阔的应用前景。 本文主要开展了以下几个方面的工作： 一、l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p 4 ( 1 ，2 ，4 三氮唑1 基) 苯酚增强化学发光新体系的研究及 其应用 研究了一种新型酚类衍生物4 - ( 1 ，2 ，4 三氮唑1 基) 苯酚( t r p ) 对 l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p 化学发光体系的增强作用。结果表明t r p 可以作为化学发光 体系l u m i n 0 1 h e 0 2 h r p 的增强剂。建立了一种增强化学发光新体系 l u m i n 0 1 n 2 0 2 h r p t i 冲，并对新体系的各项影响因素进行了优化。在最佳实验条 件下，对游离h r p 进行了测定，测定游离h r p 的线性范围为8 0 x 1 0 d og m l 。 5 x 1 0 一g m l ，检测限为5 0 1 0 。1 0g m l 。与经典增强剂对碘苯酚( p i p ) 相比， t i 心增强的化学发光强度相对要高，发光时间更长。对l u m i n 0 1 h e 0 2 h r p t l 心 增强化学发光体系的机理进行了讨论。利用l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p t r p 增强化学发 光体系并结合磁性微球技术对n 2 0 2 进行了测定。研究表明，磁性微球作为固相 载体固定h r p 时，本体系对h 2 0 2 测定的线性范围为2 x 1 0 币m o l l 1 x 1 0 。3m o l l ， 检测限为2 x 1 0 币m o l l 二、l u m i n 0 1 n 2 0 2 h r p - p f 1 ，2 ，4 卜三氮唑基苯酚磷酸单酯预增强化学发光新体系的 研究 利用三氯氧磷法制备了p - 1 ，2 ，4 卜三氮唑基苯酚磷酸单酯( t a p m ) 。在碱性磷 酸酯酶( a l p ) 催化水解下，t a p m 对l u m i n o l n 2 0 2 h r p 化学发光体系具有明 显的预增强作用。考察了这一预增强发光体系中，影响发光强度的各种因素。建 增强化学发光分析新体系的研究及其在免疫分析中的应用 立了l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p t a p m - a l p 发光体系测定创口的化学发光新方法。该方 法测定铷l p 的检出限可达1 0 州l ( s n = 3 ) ，m 浓度在1 0p l 一1 0 0p g l 范 围内与化学发光强度呈良好的线性相应关系。 三、l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p 4 羟基_ 4 7 碘联苯( i p p ) 增强化学发光新体系的研究及 其应用 研究了一种对位具有活性取代基的酚类化合物4 羟基4 一碘一联苯( i p p ) 对 l u m i n o l h 2 0 2 一h r p 化学发光体系的增强作用。建立了新型增强化学发光体系 l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p 口p ，并对体系的各影响因素进行了优化，确定了反应的最佳 条件。在最佳实验条件下，对游离h r p 进行了测定，测定游离h r p 的线性范围 为5 0 1 0 - 1 1g m l 。4 0 1 0 一g m l ，检测限为9 0 1 0 。1 2g m l 。研究表明口p 的 增强效果优于经典增强剂对碘苯酚( p 口) 。对l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p 口p 增强化学发 光体系的机理进行了讨论。并利用l u m i n 0 1 h z 0 2 h r p m p 增强化学发光酶联免疫 分析新体系，采用双抗体夹心法，结合免疫磁性微球分离和化学发光分析技术建 立了血清中a f p 含量的测定方法。该方法操作简单、快速，对a f p 测定的线 性范围为0 5n g m l 5 0n g m l ，检测限为0 5n g m l ，比e l s a 法低。用所建立 的方法对病人血清样品进行了测定，并与酶联免疫吸附测定光度法( e u s a ) 进 行了对照，二者相关性良好。 四、l u m i n 0 1 h 2 0 2 一h r p 溴酚兰增强新化学发光体系的研究及其应用 研究了一种新型化学发光增强剂溴酚兰( b p b ) 对l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p 化学 发光反应的增强作用。建立了新型增强化学发光体系l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p b p b ， 并对体系的各影响因素进行了优化，确定了反应的最佳条件。在最佳实验条件下， 对游离h r p 进行了测定，测定游离h r p 的线性范围为5 0 1 0 。1g m l 1 0 1 0 。9 g m l ，检测限为1 0 1 0 d 1g m l 。对l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p b p b 增强化学发光体系 的机理进行了讨论。利用l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p b p b 增强化学发光酶联免疫分析新 体系，采用双抗体夹心法，结合免疫磁性微球分离和化学发光分析技术建立了血 清中j a f p 含量的测定方法。该方法操作简单、快速，对a f p 测定的线性范围 为1 0n g m l 。5 0 0n g m l ，检测限为o 2n g m l 。用所建立的方法对病人血清样 品进行了测定，并与e l i s a 法进行了对照，二者相关性良好。 五、基于金纳米粒子作固相载体的增强化学发光免疫传感器的研制 研究了以金纳米粒子作为酶标抗体的固相载体，利用静电吸附作用将h r p 标记a f p 抗体固定在其表面，结合磁性微球的高效分离技术，采用双抗体夹心法， 建立了l u m i n 0 1 h ：0 2 一h r p b p b 测定a f p 、l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p 口p 测定a f p 的新型化学发光免疫传感器。二者对，。a f p 测定的线性范围分别为0 1n g m l 。 5 0n g m l ，0 0 0 8n g m l 一0 3n g m l ，检测限分别为0 0 1n g m l ，5p g m l 。以金 青岛科技人学研究生学位论文 纳米粒子作为固相载体，利用共价结合作用将发光底物鲁米诺和c e a 抗体同时 固定在其表面，结合磁性分离技术，采用双抗体夹心法，建立了一种新型的、简 便的化学发光标记技术，研究了一种新型的l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r p 口p 增强化学发光 体系测定c e a 的化学发光免疫传感器。对c e a 测定的线性范围为0 5n g m l 一 5 0 0n g m l ，检测限为0 5n g m l 。用所建立的方法对病人血清样品进行了测定， 并与e u s a 法进行了对照，二者相关性良好。 关键词化学发光免疫分析增强剂磁性微球金纳米粒子肿瘤标记物 增强化学发光分析新体系的研究及其在免疫分析中的应用 s t u d i e so nt h en e we n h a n c e d c h e m i l l u m i n e s c e n c es y s t e ma n di t sa p p l i c a t i o n i ni m m u n o a s s a y t h i sp 印e rd i s c u s s e dt h en o v e la n ds e n s i t i v ec h e m i l u m i n e s c e n c el m m u n o a s s a y b i o s e n s o r si n t e g r a t i n gw i t ht h ec h e m i l u m i n e s c e n c et e c h n i q u ea n dn a n o t e c h n i q u e t h e c lr e a c t i o nc o n d i t i o n sa n dt h ep e r f o r m a n c eo ft h eb i o s e n s o r sw e r es t u d i e db yu s i n g c h e m i l u m i n e s c e n c ea s s a y , s p e c t r a la n a l y s i s ，a n de l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d s t h en o v e l a n ds e n s i t i v ec h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ( c l i a ) h a sb e e nd e v e l o p e db y e m p l o y i n g t h en e wc h e m i l u m i n e s c e n c e ( e l ) e n h a n c e r sb a s e do nc o l l o i d a lg o l d n a n o p a r t i c l e s ( a u n p s ) m o d i f i e dw i t hh r p l a b e l e da n t i b o d y ( o ra n t i b o d y ) f o rf u r t h e r s i g n a la m p l i f i c a t i o n i ns u m m a r y ，e a s eo ff a b r i c a t i o n ，al o wc o s ta n dh i g hs e n s i t i v i t y m a k et h ep r o p o s e db i o s e n s o r si nt h i ss t u d ym a yp r o v i d ea l li n t e r e s t i n ga l t e r n a t i v et o o l f o rd e t e c t i o np r o t e i ni nc l i n i c a ll a b o r a t o r y t h em a i nj o b so ft h i st h e s i sc a nb ec o n c l u d e da sf o l l o w s ： 1 t h es t u d yo nt h en e we n h a n c e dc ls y s t e mo fl u m i n o l h 2 0 2 - h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e - 4 一( 1 ，2 ，4 - t r i a z o l 一1 一y 1 ) p h e n o la n d i t sa p p l i c a t i o n s t h i s s t u d y d e s c r i b e dt h e e m p l o y m e n t o fan o v e l p - p h e n o l d e r i v a t i v e 4 - ( 1 ，2 ，4 - t r i a z o l 一1 一y 1 ) p h e n o l ( t r p ) a s a h i g h l y p o t e n ts i g n a l e n h a n c e ro ft h e l u m i n o l - h 2 0 2 一h r pc ls y s t e m t h ec lr e a c t i o nc o n d l i t i o n sw e r eo p t i m i z e da n di t s e n h a n c e m e n tc h a r a c t e r i s t i c sw e r ec o m p a r e dw i t ht h a to fp - i o d o p h e n o l ( p i p ) u n d e rt h e o p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ed y n a m i cr a n g eo fh r pb yu s i n gt l 冲a sa ne n h a n c e rw a s 8 0 1 0 。1 0g m l 一5 0 1 0 培g m l , w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f5 0 1 0 1 0g c m l , c o m p a r e d w i t h4 - i o d o p h e n o l ( p i p ) t r pi sam o r e p o t e n t e n h a n c e rf o rt h el u m i n o l c h e m i l u m i n e s c e n c e t r pp r o d u c e das t r o n ge n h a n c e m e n to ft h ec lw i t ht h ee f f e c to f p r o l o n g i n gt h el i g h te m i s s i o n t h ep r e c i s em e c h a n i s mo ft h eh r p - c a t a l y z e dc l i v 青岛科技大学研究生学位论文 o x i d a t i o no fl u m i n o li nt h ep r e s e n c eo ft r ph a sb e e nd i s c u s s e d t h ed e v e l o p e ds y s t e m w a st h e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fh 2 0 2w i t hi m m o b i l i z e dh r pu s i n gm a g n e t i c b e a d sa sas o l i ds u p p o r t 1 1 1 el i n e a rr a n g ef o rh 2 0 2w a s2 x 1 0 由m o l l l x l 0 。m o l l t h ed e t e c t i o nl i m i tf o rh 2 0 2w a s2 x 1 0 om o l l 2 t h es t u d i e so nt h en e wp r o e n h a n c e dc ls y s t e m o fl u m i n o l - h 2 0 2 一h r p - - p - 【1 ，2 ，4 】- t r i a z o l e p h e n o lp h o s p h a t em o n o e s t e r i nt h i sw o r k , an o v e lp r o e n h a n c e r ，p 一【1 ，2 ，4 】一t r i a z o l e - p h e n o lp h o s p h a t em o n o e s t e r ( t a p m ) w a ss y n t h e s i z e db yt h ep c i 0 3m e t h o d u n d e rt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i so ft h e a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( a l p ) ，t a p mp r o d u c e das t r o n gp r o e n h a n c e m e n to i lt h e l u m i n 0 1 h 2 0 2 h r pc h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e m t h e r e a c t i o n c o n d i t i o n so f l u m i n o l h e 0 2 - h r p t a p m - a l pc h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e mw e r eo p t i m i z e d ，a n dt h e s y s t e mw a sa p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fa 皿t h e c h e m i l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yw a s l i n e a rt ot h ec o n c e n t r a t i o no fa l pi nt h er a n g eo f1 0p l 一1 0 0 “l ，w i t had e t e c t i o n l i m i to f1 0 肛l ( s n = 3 ) 3 t h es t u d yo nt h en e we n h a n c e dc ls y s t e mo fl u m i n o l h 2 0 2 一h r p 一4 一( 4 - i o d o ) - p h e n y l p h e n o la n di t sa p p l i c a t i o n s i nt h i sw o r k , an o v e le n h a n c e r ，4 - ( 4 - i o d o ) p h e n y l p h e n o l ( i p p ) w a se m p l o y e di n t h el u m i n 0 1 h 2 0 2 h r pc ls y s t e m t h eo p t i m i z e dc lr e a c t i o nc o n d i t i o n sa n dt h e e v a l u a t i o no fi t se n h a n c i n gc a p a b i l i t i e si nt h el u m i n o l h 2 0 2 - h r pc ls y s t e mw e r e d e s c r i b e d u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ed y n a m i cr a n g eo fh r pb yu s i n gp i pa s a ne n h a n c e rw a s5 0 1 0 d 1g m l 一4 0 1 矿g 细lw i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f9p g m lt h er e s u l t ss h o w e dt h a ti p pw o u l db eam o r ep o t e n te n h a n c e rt h a np i p ，w h i c h w a st h em o s tw i d e l yu s e de n h a n c e r t h ep r e c i s em e c h a n i s mo ft h eh r p c a t a l y z e dc l o x i d a t i o no fl u m i n o li nt h ep r e s e n c eo fi p ph a sb e e nd i s c u s s e d a f pw a sc h o s e nt o p r o v et h en o v e lc li m m u n o a s s a ya sat y p i c a lm o d e l t h en e wc li m m u n o a s s a y i n v o l v e dab i n d i n ge v e n tb e t w e e nc a r b o x y l i ca c i dc o a t e dm b sa n da n t i - a f p ，a n dt h e f o r m a t i o no fs a n d w i c hi m m u n o c o m p l e x e sb e t w e e nt h em b sa n da n t i - a f p h r p t h e c o n c e n t r a t i o no fa f pw a sm o n i t o r e db a s e do nt h eh r pl a b e la c t i v i t yt o w a r dt h e o x i d a t i o no fl u m i n o l ，w h i c hw a sq u a n t i f i e db yc lm e t h o d t h ec o r r e s p o n d i n g c a l i b r a t i o np l o to fr e l a t i v ec li n t e n s i t yv e r s u st h ec o n c e n t r a t i o no fh u m a na f pw a s l i n e a ro v e rt h er a n g ef r o m0 5n g m lt o5 0n g m l , a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s0 5 n g m l , w h i c hw a sl o w e rt h a nt h a ti nt h ee l i s a t h ef e a s i b i l i t yo ft h ei m m u n o a s s a y s y s t e mf o rc l i n i c a la p p l i c a t i o n sw a si n v e s t i g a t e db ya n a l y z i n gs e v e r mr e a ls a m p l e s ，i n c o m p a r i s o nw i t ht h ee l i s am e t h o d t h ec a l i b r a t i o nc u r v ei n d i c a t e dt h a tt h e r ew a s n o v 增强化学发光分析新体系的研究及其在免疫分析中的应用 s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h er e s u l t sg i v e nb yt w om e t h o d s 4 t h es t u d yo nt h en e we n h a n c e dc l s y s t e mo fl u m i n o l h 2 0 2 - h r p - b r o m o p h e n o lb l u e a n di t sa p p l i c a t i o n s i nt h i sw o r k , an o v e le n h a n c e r ，b r o m o p h e n o lb l u e ( b p b ) w a se m p l o y e di nt h e l u m i n o l h 2 0 2 一h r pc ls y s t e m t h eo p t i m i z e dc lr e a c t i o nc o n d i t i o n sa n dt h e e v a l u a t i o no fi t se n h a n c i n gc a p a b i l i t i e si nt h el u m i n o l - - h 2 0 2 h r pc ls y s t e mw e r e d e s c r i b e d u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ed y n a m i cr a n g eo fh r p b yu s i n gb p b a sa ne n h a n c e rw a s5 0 1 0 。1 1g m e 一1 0 1 0 - 9e d m lw i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f1 0 1 0 。1 1 g m l t h er e s u l t ss h o w e dm a tb p b w o u l db eam o r ep o t e n te n h a n c e rt h a np i p ， w h i c hw a st h em o s tw i d e l yu s e de n h a n c e r t h ep r e c i s em e c h a n i s mo ft h e h r p - c a t a l y z e dc lo x i d a t i o no fl u m i n o li nt h ep r e s e n c eo fb p bh a sb e e ns t u d i e d a f t e ro p t i m i z i n gt h ec lr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，t h i sn e wl u m i n o l - h 2 0 2 一h r p b p bc l s y s t e mw a sa p p l i e dt oas a n d w i c h t y p ec l i ab a s e d0 1 1t h em a g n e t i cs e p a r a t i o n a l i n e a rr a n g ew a so b t a i n e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o n so fa f pw e r ef r o m1 0n g m lt o 5 0 0n g m l , w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f1 0 n g m l t h ep r e s e n tm e t h o dw a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fa f p i nh u m a ns e r u ms a m p l e s t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h i sp r o p o s e dp r o t o c o lc o u l db eq u i t ep r o m i s i n gf o rt h ea p p l i c a t i o ni n i m m u n o a s s a y 5 t h es t u d i e so nt h ee n h a n c e dc h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a yb i o s e n s o rb yu s i n g g o l dn a n o p a r t i c l e sa ss o l i ds u p p o r t s i nt h i sw o r k , w ed e s c r i b e das e n s i t i v ea n dp r o m i s i n ga n a l y t i c a lm e h t o de m p l o y i n g n e wc le n h a n c e r s ，b p bo r 口eb a s e do nm b ss e p a r a t i o na n dg o l dn a n o p a r t i c l e s ( a u n e s ) l a b e l i n gt e c h n i q u e h r p l a b e l e da f pa n t i b o d yw a s f i r s tb o u n do nt h es u r f a c e o fa u n p sb ye l e c t r o s t a t i c ，t h e nt h en e wl u m i n o l h 2 0 2 - h r p b p b ( o ri p p ) c ls y s t e m s w e r ea p p l i e dt oas a n d w i c h - t y p ec l i af o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa f pb a s e do nt h e m a g n e t i cs e p a r a t i o n t h i sn o v e ls t r a t e g yt a k e sa d v a n t a g eo fe a s ym a g n e t i cs e p a r a t i o n b ym b sa n da m p l i f i c a t i o nf e a t u r eo fc o l l o i d a lg o l dl a b e la l o n gw i t hc li n t e n s i t y e n h a n c e db yb p b ( o ri p p ) f o rl u m i n o l - h 2 0 2 - h r ps y s t e m al i n e a rr a n g e so fa f p s t a n d a r ds o l u t i o nw e r e0 1n g m l 一5 0n g m la n d0 0 0 8n g m l 一0 3n g m l ， r e s p e c t i v e l y a n dt h ed e t e c t i o nl i m i t so fa f pw e r e 0 0 1 n g m la n d5p g m l , r e s p e c t i v r l y a ne n h a n c e dc h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a ym e t h o df o rt h es e n s i t i v ea n d r a p i dd e t e r m i n a t i o no fc e aw a sp r o p o s e di n t h i sp a p e r f i r s t l y , l u m i n o la n d a n t i c e a - a n t i b o d yw e r es i m u l t a n e o u s l yb o u n do n 血es u r f a c eo fa u n p sb yc o v a l e n c e v i 青岛科技大学研究生学位论文 s e c o n d l y , t h e n e wl u m i n o l - h 2 0 2 一h r p - 口pc ls y s t e m sw e r e a p p l i e d t oa s a n d w i c h - t y p ec l i af o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc e a b a s e do nt h em a g n e t i cs e p a r a t i o n al i n e a rr a n g eo fc e as t a n d a r ds o l u t i o nw a s0 5n g m l 一5 0 0n g m l , w i t hd e t e c t i o n l i m i to f0 5n g m l t h ep r o p o s e dm e t h o d sw e r ea l s ou s e dt od e t e r m i n ea f p ( 0 rc e a ) i nh u m a n s e r u ms a m p l e s ，a n dt h er e s u l t sw e r ew e l lc o r r e s p o n d i n gt ot h o s eo fc o n v e n t i o n a l e i j s a k e yw o r d s c h e m i l u m i n e s c e n c e ；e n h a n c e r ；i m m u n o a s s a y ；m a g n e t i cb e a d s ； g o l dn a n o p a r t i c l e s ；t u m o rm a r k e r s v 增强化学发光分析新体系的研究及其在免疫分析中的应用 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请 的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了 明确的说明并表示了谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名：日期：年月日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解青岛科技大学有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或 使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科 技大学。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密口。 ( 请在以上方框内打“”) 本人签名： 导师签名： 日期： 日期： 1 1 6 年月 同 年月同 青岛科技人学研究生学位论文 1 化学发光 第一章前言 发光是指当一个分子的电子从激发态跃迁到基态时所发出的光，它包括荧光 ( f l u o r e s c e n c e ) 、磷光( p h o s p h o r e s c e n c e ) 和化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ) ， 其中荧光和磷光属于光致发光。当基态分子吸收化学反应释放的能量跃迁到激发 态，处于激发念的分子以光辐射的形式返回基态时产生的光称为化学发光。根据 化学发光反应在某一时刻的发光强度( 如峰值强度) 或发光总量来确定反应中相 应组分含量的分析方法称为化学发光分析法【1 1 。 化学发光分析法具有灵敏度高，线性范围宽，选择性好，仪器设备简单等优 点，已成功应用于生命科学，材料科学，食品科学，临床医学以及环境检测等领 域，成为现代分析领域中一种有效的微量及痕量分析技术。 1 1 化学发光反应的基本原理 化学发光( c h e m i l u m i n e s e c e ，c l ) 是化学物质在特定化学反应中产生的光辐 射的现象。此过程可描述为： a + b _ i 】- 产物+ 光 ( 1 - 1 ) 其中f 1 1 木是由反应试剂a 和b 反应生成的激发态产物。处于激发态的物质不稳 定，很快跃迁到较低的能量状态( 例如基态) ，同时将能量以光( 通常为可见光) 的形式发射出来。 化学发光之所以能够用于分析测定，是因为化学发光强度与化学发光速率相 关联，因而一切影响反应速率的因素都可以作为建立测定方法的依据。因此，化 学发光强度取决于化学反应的速率、激发态产物的效率和激发态物质的发光效 率，即： i c l = o c l d c d t = o e x o e m d c d t ( 1 2 ) 式中，i c l 为化学发光强度；d c d t 指化学反应速率；o c l 为化学发光量子效率， 指每一个参加反应的分子发射的光予数；o e x 为激发态的量子产率，指每一个参 加反应的分子产生的激发态；魄m 为激发态的发光量子产率，指每一个激发态产 生的光子数。 对于一定的化学发光反应，c l 为一定值，但化学发光测定易受化学反应条 增强化学发光分析新体系的研究及其在免疫分析中的应用 件，j t h p h 、离子强度、溶液组成、温度的影响，影响反应反应速率或任一个量子 效率的因素都可以改变发光强度。因此，在一定化学反应条件下，通过测定化学 发光强度就可以测定反应体系中某种物质的浓度【2 1 。 1 2 常见的化学发光反应体系 常用的化学发光分析的发光物质有鲁米诺( l u m i n 0 1 ) 、光泽精( l u c i g e n i n ) 、 过氧草酸酯( p e r o x y o x a l a t e ) 等，其中鲁米诺是研究最多和应用最广泛的有效的 化学发光试剂之一。 1 2 1 鲁米诺化学发光反应体系 鲁米诺( 5 氨基一邻苯二甲酰肼) 属于酰肼类有机化合物，性质稳定，结构简 单，易于合成，无毒，不污染环境，且水溶性较好，它在强碱性溶液中可以被氧 化剂氧化生成3 氨基酞酸盐( 3 - a p a ) 发出蓝色光。目前国际上比较认可的鲁米 诺发光机理如图1 1 所示【3 1 。与鲁米诺反应的各种氧化剂中，如过氧化氢、次氯酸 盐、碘、铁氰化钾、高锰酸钾，使用最多的是过氧化氢。使用过氧化氢作氧化剂 时，一般需要用催化剂。常用的催化剂有过氧化物酶1 4 - 5 1 、血红素【6 1 、过渡金属元 素离子如c 0 2 + 【7 1 、c u 2 + 1 8 l 和a u 3 + 1 9 等。另外，有一些物质对鲁米诺的化学发光反 应具有增敏或抑制作用【坶1 2 】。因此，鲁米诺作为一种有效的化学发光试剂被广泛 用于各种氧化剂、催化剂和抑制剂的测定【1 孓1 6 1 。 n h h 2 0 2 o h 。 - - - - - - - - - - n h c a t a l y s t o l u m i n o l o 0 - 0 - 3 - a m i n o p h t h a l a t e 1 3 - a p a ) e x c i t e ds t a t e p 。+ h v o 。 i c a 4 2 5 n m l o 3 - a m i n o p h t h a l a t e 3 - a p a ) g r o u n ds t a t e 图1 1 鲁米诺化学发光机理 f i g 1 1l u m i n o lc h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o n s c h e m e 1 2 2 吖啶酯类化合物 吖啶酯化学发光试剂以光泽精的研究和应用最为代表性。光泽精( n ，n 二甲 基j y 啶硝酸盐，l u c i g e n i n ) 自身在碱性环境中产生微弱的化学发光，加入过氧 化氢氧时化学发光强度会大大增加，被氧化而发出4 2 0 5 0 0n n l 的光，具有较高的 发光效率。吖啶酯的化学反应原理如图1 2 所示1 1 7 1 。h 2 0 2 在c 9 位发生亲电加成 反应生成过氧化物，过氧化物经过过渡态二氧乙烷酮分解成激发态的n - 甲基吖啶 酮和c 0 2 ，f j 者返回到基态时，在4 3 0n l n 处释放出光子。吖啶酯也能通过不发 光的反应途径分解生成最终产物n 甲基吖啶酮。研究表明，分解反应的历程受离 去基团的性质、过氧化物浓度和溶液p h 值的影响【1 8 】。离去基团共轭酸的p k a 小 2 青岛科技大学研究生学位论文 于h 2 0 2 的p k a 时，有较高的发光量子产率【1 9 1 。 早h 。彳h 3 x o h 。 h 2 0 2 口 图1 - 2 吖啶酯的化学发光机理 f i g 1 - 2t h ec h e m i l u m i n e s c e n c em e c h a n i s mo fa c r i d i n ee s t e r 光泽精可在一些还原性物质存在的情况下产生化学发光，因此该化学发光试 剂主要被用于无机还原剂和有机还原剂的测定。大多数化学发光反应在无催化剂 作用下是一个非常缓慢的氧化反应，光泽精发光体系亦是如此。当分别选择s n 4 + 、 f e “、u 3 + 等金属离子作为催化剂时，光泽精发光体系的发光速率急剧加快，发光 强度也随之增强【2 0 】。增强的发光强度与金属离子的