（应用化学专业论文）酶催化制备芳香羟胺及手性取代芴醇.pdf

大连理t 大学博士学位论文 摘要 芳香羟胺是一类非常重要的化合物，是合成许多精细化学品、天然产物和生物活性 化合物的中间体，某些芳香羟胺本身也具有很高的药理及生理活性。芳香羟胺的化学制 备方法书要是催化转移加氢或金属还原相应的硝基化合物。但是这些制备方法对羟胺的 选择性比较差，在这些硝基还原条件下，生成的羟胺能被迅速地再被还原为胺，并且容 易牛成偶氮、氢化偶氮和氧化偶氮等副产物。而且，这些制备反府条件也比较苛刻，需 要使用危险的高压装置、易燃的氢气、有毒的重金属或有害的化学试剂等。 首次探索了使用酶催化方法制备芳香羟胺。使用面包酵母作为生物催化剂选择性还 原带有吸电子基团的硝基化合物到相应的羟胺，反应显示出高的选择性( 羟胺胺= 7 0 3 0 9 8 2 ) 。这个反应除了牛成相应的羟胺和胺以外，只检测到有非常少的副产物 ( 9 8 2 、u n d e rm i l dc o n d i t i o n s i na l l c a s e s ，a p a r tf r o ma m i n e s ，o n l yaf e ws i d ep r o d u c t s ( 9 6 c ( c h 也n 0 2 ，c h 2 0 h ( c h 2 ) 2 c h = ：c ( c h 3 ) 2 卦已基 图1 5 面包酵母催化酮的还原反应链脂肪酮 f i g 1 5b a k e r sy e a s tc a t a l y z e dr e d u c t i o no f a l k y lk e t o n e s 卢一酮酸酯的立体化学差异性取决于烷氧基和取代基的相对大小。p 酮酸酯可以被酵 母还原成伊羟基酯】，如图1 6 。它是声内酰胺、昆虫性幼激素和类胡萝h 素合成的手 性起始材料。 。：。人q h 火0 尘型。且且。竺骂洲。足足。 ”勰。：。嚣 图l _ 6 面包酵母对肛酮酯的还原 f i g 1 6b a k e r sy e a s tc a t a l y z e dr e d u c t i o no f 口k e t oe s t e r s 只= c h 3 6 4 曲 c 2 h 5 e e5 4 e e r t - c 3 h 7e e2 7 e e 卢一环二酮也可以选择性地被还原生成手性的卢羟基酮，反应中没有二羟基产物生 成，式中r 基团不同，产物的s y n a n t i 的比例也有很大的差别，如图1 7 。 。毽0 一慨“畿一“豫 s y n a r c 图1 7 酵母还原环状乒二酮 f i g 1 7b a k e r sy e a s tc a t a l y z e dr e d u c t i o no f f l - d i k e t o n e s 相反，a 二酮的还原无法停止在羟基酮阶段。一般来说，较少位阻的羰基被迅速 还原生成( 国羟基酮，而空间阻碍较大羰基则以较慢速率被还原生成相应的手性二醇 1 1 3 ，如图1 8 。 ：pm 大连理工大学博士学位论文 堕望墅兰- 快 耍曼壁里- 慢 呈“ + ，r i o h 反武( 主)顺式( 次) r tp h 厦式二耵e 日= 9 4 反代，顺式= 9 5 ：5 r = c h 2 $ p h ，反式一醇e e 9 7 反式，顺式# 9 5 ：5 图l _ 8 酵母还原环状伊二酮 f i g 1 8b a k e r 5y e a s tc a t a l y z e dr e d u c t i o no f 8 - d i k e t o n e s 1 3 3 面包酵母催化烯烃还原反应 酶催化潜手性烯烃双键的还原具有立体选择性，这是常规化学还原法所无法实现 的。负责这种还原反应的酶一般是n a d h 依赖的烯烃还原酶，这类酶存在于多种微生 物中，如梭状芽孢杆菌、变形杆菌属和面包酵母等。虽然烯酸还原酶已被分离纯化和鉴 定，但使用纯酶作催化剂时需要辅酶循环，因此绝大多数制备性生物转化巾仍采用完整 细胞作为酶源。 ( 1 ) 口不饱和酯的还原：酵母催化2 氯2 烯酸甲酯还原产物是高光学纯的2 一氯 烷基羧酸。在这个还原反应中，产物的绝对构型由烯烃底物的( 目一或( z ) 一构型所决定， 产生相应的( 月) 一或( 羧酸。酶对( 2 3 型烯烃的手性识别性能比较好，而对( 句趣! 异构 体识别则差，如图1 9 。 ：帅百b a k e r s 万 y e a s t b a k e s y e a s t f 水解酶) 弋，。，。 掣 、0 2 h 丽函j 鬲8 v 人c 。2 h r = c 2 h s e - 尺e4 7 r i c h ( c h 3 ) 2h 尺6 8 r = c h c l 2 ， b r 9 2 r = c 2 h 5z _ s 9 8 r = c h ( c h 3 ) 2z _ s ，9 8 r - c h c l 2 ，z _ se b5 2 图19 酵母还原g ，口- 不饱和酯 f i g 19b a k e r sy e a s tc a t a l y z e dr e d u c t i o no f a ，8 - u n s a t u r a t e de s t e r s 争取代的a ，声- 不饱和五冗环内酯巾的c = c 很容易被面包酵母还原为( 月) 一型产物 后者是萜类化合物合成的c ；原料14 1 ，如图1 1 0 。 掣1掣吖。 文嚣蔗 李峰：酶催化制备芳香羟胺及手性取代芴醇 、一、一。 0 乏0 一、 图1 1 0 酵母还原伊取代- a ，p - 不饱和内酯 f i g1 1 0 b a k e r s y e a s tc a t a l y z e dr e d u c t i o n o t 伊s u b s t i t u t e d - a ，f l - u n s a t u r a t e da c e t o n e ( 2 ) 烯丙醇的还原：a 取代或口- 取代的烯丙醇中c = c 双键可被还原生成手性醇 1 5 1 ，如图1 。“。 丫1 矿v 竺! ：竺! ! 分以，o 一 夕八八，皿“ i r - 香茅辞( 9 7 ) 分 “ 图1 1 1 酵母还原烯丙烯 f i gi iib a k e r sy e a s tc a t a l y z e dr e d u c t i o no f m e t h y ls u b s t i t u t e dp e n t a d i e n l - o l s ( 3 ) a ，卢不饱和酮的还原：光学活性的a 一氯醇( 仅一e h l o r o h y d r i n ) 可以通过倪一氯- q ，f t 不饱和酮的酵母还原制得，如图1 1 2 。 剑 8 竺骂 掣c - 8 、入+ 8 、人 6 h6 h r _ c 2 酮。：觚7 。燃毛燃毛 r = n - c 5 h 1 1 酮8 2 岷脚反：b 9 1 1 1 r = , - c e h i r 艉8 4 峨顺，反：9 5 5 图i 1 2 酵母还原峨f l - 不饱和酮 f i g 1 1 2b a k e r sy e a s tc a t a l y z e dr e d u c t i o no f a f l - u n s a t u r a t e dk e t o n e s 叶 大连理工大学博1 ：学位论文 ( 4 ) 硝基烯烃的还原 含硝基烯烃很容易被酵母还原为手性硝基烷烃f 1 7 】，如图1 1 3 。 型翌。即料” 气。? 业峰时h ： ：，i 。= p h ，, 耻r 2 = 。c h 3 。；6 嚣。 ：，1 ；= 。n - c o h 。i ：3 鬟黜嚣：黧 图1 1 3 酵母还原含硝基烯烃 f i g 1 1 3b a k e r s y e a s t c a t a l y z e dr e d u c t i o no f n i t r oo l e f i n s 1 4 酶催化的氧化反应 氧化反应是向有机化合物分子中引入功能基团的重要反应之 。化学氧化方法主要 采用金属化合物如六价铬、七价锰衍牛物以及醋酸铅、醋酸汞和有机过氧羧酸等作为氧 化剂，化学氧化法缺少立体选择性、副反应多，且金属氧化剂会造成环境污染。采用酶 催化氧化可以解决这些问题，这对有机合成来说用处很大。 1 4 1 单加氧酶催化的氧化反应： 单加氧酶可以使分子氧中的一个氧原子偶合到底物分子巾，另一个氧原子被还原 ( 通常为n a d h 或n a d p h 还原) 形成水。荦功n 氧酶催化的氧化还原反应是酶法合成 醇、酚、环氧化物等的重要方法之一。 底物+ h - 绐体+ 0 2 垫越氮酸， 单埘i 氧产物+ h 受体 +h20 多酚氧化酶( p o l y p h e n o l o x i d a s e ) 属于单加氧酶中的种。它对于对位有取代基r 的 酚的氧化反应具有良好的位置选择性，而邻和问位的取代酚不能发生此反应。反应活性 取决于基团r 的性质，r 为供电子基团一般具有较高的活性1 1 ”。空间位阻大的酚活性很 低。某些非酚类化合物如对甲苯胺也可被该酶催化氧化生成酚类化合物。 完整的细胞也能实现芳香化合物的区域选择性羟化。例如，工业化生产中采用假单 胞菌( p s e u d o m o n a s s p ) 或芽孢杆菌催化尼克酸转化为6 羟基尼克酸 19 1 ，如图1 1 4 。 c 。2 “掣。c 叫 李峰：酶催化制各芳香羟胺及手性取代芴酵 图l r1 4 假单胞菌催化的芳烃羟化反应 f i g 1 1 4 p s e u d o m o n a ss p c a t a l y z e d h y d r o x y l a t i o no f a r o m a t i c s 烯烃氧化生成环氧化合物：食油假单胞菌( p s e u d o m o u a so l e o v o r a n s ) 等细菌可以催化 烯烃的环氧化，环氧化物的光学纯度取决于使用的菌种的种属，如图1 1 5 。 微生物：食汕假单胞菌lr 。n - c s h r ，e e 7 0 8 0 一诋型。一 9 7 图1 2 0 马肝醇脱氢酶催化二元酵的拆分 f i g 1 2 0 h l a d hc a t a l y z e do x i d a t i o no f l , 2 - d i o l s 潜手性二元醇的不对称氧化是手性内酯合成的有效方法。一般来说，在使用马肝醇 脱氢酶( h l a d h ) 时，酶对p r o - , 7 - 或p r o - r 一羟基的氧化具有良好的选择性。在1 ，4 或1 ，5 一 二醇中，中间产物羟基醛自动地环化形成更稳定的5 或6 元环状半缩醛。然后再被 h l a d h 氧化形成相应的内酯1 2 4 1 ，如图1 2 1 。 一 器一 h ob h、h o 骂8 q 岽r 1 0 酶循糌 l l ii，掣弋 大连理工大学博士学位论文 图l ，2 1 马肝醇脱氧酶催化潜手性或内消旋体的不对称氧化 f i g 1 2 1h l a d hc a t a l y z e do x i d a t i o n so f d i o l sc o n t a i n i n g a p r o c h i r a lc e n t e r 1 5 酶催化的水解反应 在所有类型的酶催化反应l h i 水解反应是比较简单和容易进行的一类反应。水解酶 ( h y d r o l a s e s ) 种类繁多，而且容易得到适刚的酶。这类酶具有不太严格的底物专一性，因 此对有机合成来说，是类特别有用的酶。 15 1 酶催化的酯水解反应 ( 1 ) 单羧酸酯的水觯：某些第醇和第二醇的厶酸酯，如厶酰环内酯等，用酸或碱 催化水觯时会引起结构的变化。酶催化水解反应条件温和，对于乙酰环丙酯等不稳定化 合物的水解特别有利【2 ”，如幽1 2 2 。 ! ! e 塑21 ：型- 移。一渗“ 图1 2 2 猪小- 酯酶催化单羧酸酯水解 f i g 1 2 2p l e - c a t a l y z e dh y d r o l y s i so f m o n o c a r b o x y l j ca c e t a t e s a 芳基或芳氧基的羧酸酯用羧酸酯酶( c a r b o x y l e s t e r a s en p ) 催化水解，可得到高光学 纯的产物【2 6 】，如图1 2 3 。 州、。人。+ 叭。人。筹等。人。 蔫驯人删 +l a r y l 、c o o c h 3 图1 2 3 羧酸酯酶催化* 取代丙酸酯拆分 f i g 1 2 3c a r b o x y l e s t e r a s ec a t a l y z e dr e s o lo f a s u b s t i t u t e dp r o p y la c e t a t e s 洲厶。八厶 李峰：酶催化制备芳香羟胺及手性取代芴酵 ( 2 ) 二元羧酸酯的水解：- - ) d 羧酸酯含有两个酯基，利用酶的选择性水解性质，可 以选择性地将其中一个酯基水解除去。 苹果酸二甲酯( d i m e t h y lm a l a t e ) 用p l e 催化水解时，水解只发生在i - 位上1 2 7 ，如图 1 2 4 。 一o m l坠! 一o - m 1 e 瑷冲剂 6 , h 2 ( ! o o m e亡o o m e 图1 2 4 猪肝酯酶催化酯医域选择性水解 f i g 1 2 4p l ec a t a l y z e dr e g i o s e l e c t i v eh y d r o l y s i so f d i c s t e r s p l e 和胰凝蛋白酶广泛川于二元酸的消旋化酯的拆分。如q ，q 二取代的丙二酸二酯 能选择性地被p l e 或胰凝蛋白酶水解成相应的手性单酯f 2 8 1 ，如图1 2 5 。 旦：笾上坚一嚣：。 r r = p h c 2 h 5 ，n - c 3 h 7 n - c 4 h 9r = n - c 6 h 1 n - c e h l a n - c t h l 5 p - c h 2 c e h o m e 图1 2 5p l e 催化潜手性_ 酯的对映选择性水解 f i g 12 5p l ec a t a l y z e de n a n t i o s e l e c t i v eh y d r o l y s i so f p r o c h i r a ld i e s t e r s ( 3 ) 内酯的水解：酯酶p l e 和h l e 以及猪胰脂肪酶( p o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s e 。p p l ) 都可以用于内酯的选择性水解。底物为5 7 元o ) 环的消旋化的内酯时可以得到光学纯 度为9 0 的导构型内酯( 未被水解部分) 和r 构型廿羟基酸【2 9 1 ，如图1 2 6 。 图1 2 6p p l 催化内酯的对映选择性水解 f i g 1 2 6p p lc a t a t y s e de n a n t i o s c l e c t i v eh y d r o l y s i so f l a c t o n e s 本；吣 者 苁 大连理工大学博士学位论文 ( 4 ) 氨基酸酯的水解：常用的是胰凝蛋白酶、枯草杆蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白 酶等。这类水解酶能选择性水解由l 氨基酸形成的酯，而对d 一氨基酸所形成的酯则不 起催化作用。利用这种性质，可以将消旋化的氨基酸酯进行酶法拆分【3 0 】，如图1 2 7 。 p 。詈州r + p ：r 嘞冒“1 + 广”2 r = a k y l ，a r y l ；r 1 = m e e t ；r 2 - h a e y v 图i 2 7 酶法制各l - “氨基酸 f i g 1 2 7e n z y m ec a t a l y s e dp r e p a r a t i o no f l - a a m i n oa c i d s 1 5 2 酶催化的环氰化物水解反应 从肝脏组织巾分离得到两种类型的环氧化物水解酶：微粒体环氧化物水解酶 ( m i e r o s o m a le p o x i d eh y d r o l a s e ，m e h ) 和胞外环氧化物水解酶( c y t o s o l i ce p o x i d e h y d r o l a s e ，c e h ) 。对于非天然环氧化物，m e h 具有较高的催化活性和选择性。 m e h 可拆分消旋化的单取代环氧化物。在反应过程中，( 月) 环氧化物容易被水解，产 生( 两二醇，剩下未起反应的( 曲环氧化物。取代基r 的性质对反应选择性有很大的 影响，直链烷基环氧乙烷不能被有效地拆分，而支链烷基则可增加反应的选择性 3 q ，如图 1 2 8 。 p 昔 。+ 人瓣套嚣薰嚣- - - - 1 日e e ，1 嚣, 4 r s r n - c 4 h 9 9 2 = 转化率3 8 二醇e e 图1 2 8 艇h 催化单取代环氧乙烷的水解拆分 f i g1 2 8m e hc a t a l y z e dh y d r o l y s i so f m o n o s u b s t i t u t e do x i r a n e s 1 5 3 酶催化的腈水解反应 芳香族的和杂环的腈化物可以被玫瑰色红球菌( r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u s ) 选择性水 合为相应的酰胺。该法有高度选择性、无完全水解的产物羧酸生成1 3 2 - 3 3 】，如图1 2 9 。 李峰：酶催化制备芳香羟胺及手性取代芴醇 h 图1 ，2 9 腈水解酶催化芳香腈水解 f i g 12 9n i t r i l a s ec a t a l y z e dh y d r o l y s i so f a r o m a t i cc a r b o n i t r i l e s r h o d o c o c c u ss p a j 2 7 0 可使甜氨基腈水解水解生成酰胺和羧酸，这种类型水解反应 具有良好的立体选择性，如图1 3 0 。 r h o d o c o c c u s $ p , 0 2 7 0 p h o s p h a t e b u f f e t 3 0 。c 7 + r c o o n h 2 r = c 8 h 5 4 七a - c e h 4 3 c l 七b h 4 - c 日h i 4 - m e h 4 4 - m e - c s h 4 ，3 4 - 0 c h 2 0 c s h 5 c 叫o h e n x y l c 6 h 6 c h 2 ( c h s ) 2 c h 图1 3 0 微生物催化* 氨基腈对应选择性水解 f i g 1 3 0m i c r o b i a le n a n t i o s e l e c t i v eh y d r o l y s i so f a - a m i n o n i t r i l e s 1 6 酶催化的碳一碳键形成反应 碳碳键形成的反应，是生物合成的重要反应类型之一。生物体内存在着多种能够 催化碳碳键形成反应的酶系，其中最重要的是醛缩酶。醇醛缩合反应是有机合成中形 成碳碳键的重要方法学之。 兔肌醛缩酶( r a b b i tm u s c l ea l d o l a s e ，r a m a ) 能够催化磷酸二羟基丙酮( d h a p ) 加成 到3 磷酸甘油醛( g a p ) 上形成1 ，6 - 二磷酸果糖【3 ”。许多非天然底物，也可以作为底物被 还原，从而可以合成龠有些含硝基的糖、脱氧糖、禽氟糖以及其他稀有的糖类化合物 【3 6 37 。= 9 8 2 ) 。 利用面包酵母还原对甲基硝基苯和对甲氧基硝基苯也进行了尝试，但是反应没有进 行。说明面包酵母对这类含有供电子基团的芳香硝基化合物没有还原活性。 大连理t 大学博l ：学位论文 通过粗产品的1 h n m r 可以看出，除了胺以外，只有非常少的副产物( 3 0 0o c 3 氨基邻苯二甲酰l e 胺( 1 1 - s d ) 1 hn m r ( 4 0 0m h z ，d m s o 一吨) 61 0 7 5 ( s ，n h ) ，7 4 1 ( d d ，j = 8 4 ，7 2h z ， 1 h ) ，6 9 6 ( s ，j = 8 4 ，1 h ) ，6 9 1 ( d ，d = 7 2h z ，1 h ) ，6 2 9 ( s ，n h 2 ，2 h ) ；r a p ： 2 7 1 2 7 2 。c ( r e f 2 7 0 2 7 1 。c ) t 3 1 4 羟氨基邻苯二甲酰胺( i i 9 c ) 硅胶柱层析( 展开剂：h e x a n e e t h y l ：a c e t a t e = 1 0 ：l ，v v ) ，产率：7 1 。 1 hn m r ( 4 0 0m h z ，d m s o - 比) 61 1 0 6 ( s ，- n h ) ，9 0 7 ( s ，- n h ) ，8 8 6 h o h n ( s ，- o h ) ，7 6 4 ( t ，= 7 5 9 h z ，lh ) ，7 4 0 ( d ，j = 7 5 9h z ，1 h ) ，7 1 3 ( d ， = 7 5 9h z ，1 h ) ；”cn m r ( 1 0 0m h z ，d m s o 一如) 61 6 9 9 3 ，1 6 9 5 0 ， 1 4 8 8 9 ，1 3 5 6 9 ，1 3 3 2 4 ，1 18 0 0 ，1 1 2 6 5 ，1 1 1 6 9 ；i r ( n e a t ，c m “) 3 3 7 4 8 ， 3 318 9 319 7 4 ，l7 6 2 6 ，l7 2 0 2 ：h r m s e i ( 7 0e v ) r n zc a l c df o r c s h 6 n 2 0 3j7 8 0 3 7 8 ，f o u n d 】7 8 0 3 7 0 ；r a p ： 3 0 0o c 4 一氨基邻苯二甲酰亚胺( 9 d ) 1 hn m r ( 4 0 0m h z ，d m s o 比) 61 0 8 1 ( s ，- n h ) ，7 4 9 ( d d ，j = 8 0 ，7 2 t t z ，i h ) ，6 9 7 ( s ，l h ) ，6 9 1 ( d ，= 8 0h z ，l h ) ；m p2 9 2 2 9 4 0 c ( r e f 2 9 4 。c ) t “4 3 5 妒噻嚼时 李峰：酶催化制备芳香羟胺及手性取代芴醇 4 羟氨基一1 ，8 萘酰e 胺( i i - 1 0 e ) 硅胶柱层析( 展开剂：h e x a n e e t h y l ：a c e t a t e = 1 0 ：1 ，v v ) ，产率：7 2 。 1 hn m r ( 4 0 0m h z ，d m s o 一, 6 ) 6l0 8 5 ( s ，一n h ) ，9 5 9 ( s ，一o h ) ，8 5 2 ( d ， j = 8 5h z ，1 h ) ，8 4 5 ( d ，j = 7 4 h z ，l h ) ，8 3 5 ( d ，l ，= 8 5 ，l h ) ，7 7 3 ( d d ， j = 8 5 ，7 4h z ，l h ) ，7 2 1 ( d ，j = 8 5 h z ，1 h ) ；”cn m r ( 1 0 0m h z ， d m s o d 6 ) 61 6 1 6 1 ，1 6 0 2 l ，1 5 2 6 2 ，1 3 5 9 9 ，1 3 2 5 0 ，1 3 1 4 9 ，1 2 9 4 0 ， 1 2 4 9 8 ，1 1 8 3 7 ，l1 7 5 8 ，1 0 8 3 2 ，1 0 4 5 5 ；1 r ( n e a t ，c m “) 3 4 3 9 0 ，3 3 0 1 6 ， 17 5 9 0 ，l7 0 2 3 ；h r m s e l ( 7 0e v ) m zc a l c df o rc i 2 h t ? q 0 4 ，2 2 9 0 3 7 8 ， f o u n d2 2 9 0 3 7 5 ；m p ： 3 0 0 ”c 4 氨基一i ，8 萘酰娅胺( 1 i - 1 0 d ) 1 hn m r ( 4 0 0m h z ，d m s o d 6 ) 68 6 9 ( d ，= 8 4h z ，1 h ) ，8 4 4 ( d ，t ，= 7 2 ， 1 h ) ，8 1 9 ( d ，j = 8 4 ，】h ) ，7 7 8 ( s ，n i l 2 ，2 h ) ，7 7 0 ( t ，d = 8 0 ，l h ) ，6 8 8 ( d ，j = 7 2 ，l h ) ；n a p ： 3 0 0 。c ( r e f 3 5 0 。c ) t 1 1 5 】 2 3 5 液相分析数据 1 1 1 a - i i 一1 d e l u e n t ：c i t r i ca c i d ( 1 9 l ) i nw a t e r ( s o l v e n ta ) + c i t r i ca c i d ( 1 9 l ) i nm e t h a n o l ( s o l v e n tb ) ，a l i n e a r g r a d i e n t o f 3 0 o f b t o6 0 o v e r 2 6 m i n ，u vd e t e c t i o na t 2 5 4a m ，f l o w0 8 0 n a l m i n ， r e t e n t i o nt i m e ：1 1 - l a ，1 9 9m i n ；l i l e ，1 1 3n a i n ；i i l d ，1 2 4m i n r 。w r 研i 舔4 际i n r 面：w 匝n 。 面 ra。atj 瑚j i ； 。一：，! ：一 ! j 二二二一过二：一五i 二_ 一正二二1 五_ j 蔓：二一二童! 二i l i 2 a 4 i - 2 d e l u e n t ：c i t r i ca c i d ( 1 9 l ) i nw a t e r ( s o l v e n ta ) + c i t r i ca c i d ( 1 9 l ) i nm e t h a n o l ( s o l v e n tb ) ，a l i n e a rg r a d i e n to f3 0 o rbt o6 0 o v e r2 6m i n ，u vd e t e c t i o na t2 5 4a m ，f l o w0 8 0m lm i n ， r e t e n t i o nt i m e ：i i 一2 a ，2 0 0m i n ；i i - 2 e ，1 5 9m i n ；i i 一2 d ，1 9 0m i n 一3 6 砭 邵 查堕望王奎堂堡主堂笪迨奎 。 一m i e 1 c x “m x m m 1 。 6255 l i l g 一一j l f 二一z 二二五二二矗：二二二旦 一二f ：面i 词 i i - 3 a i i - 3 d e l u e n t ：c i t r i ca c i d ( 1g l ) i nw a t e r ( s o l v e n ta ) + c i t r i ca c i d ( 1 9 l ) i nm e t h a n o l ( s o l v e n tb ) ，a l i n e a rg r a d i e n to f3 0 o fbt o51 o v e r18m i n ，u vd e t e c t i o na t2 6 4t i m ，f l o w0 8 0m lm i n 一1 r e t e n t i o nt i m e ：i i 一3 a ，11 7r a i n ；i i - 3 c ，5 0m i n ；i i - 3 d ，5 7r a i n c 莉蜥ar 而丽面诵月i 日 | | g 1 l i 1 lf ii l 、l 、一 4ob1 n1 2 ：卫： ：= 二：盈 4 a j i 4 d e l u e n t ：c i t r i ca c i d ( 1 9 l ) i nw a t e r ( s o l v e n ta ) + c i t r i ca c i d ( 1 9 l ) i nm e t h a n o l ( s o l v e n tb ) ，a l i n e a rg r a d i e n to f3 0 o f bt o6 0 o v e r2 6m i n ，u vd e t e c t i o na t3 0 0n m ，f l o w0 8 0m lm i n 一， r e t e n t i o nt i m e ：i i - 4 a ，2 1 8m i n ；i i 一4 e ，8 2m i n ；i i 一4 d ，9 5m i n ；1 - ( 4 一n i t r o p h e n y l ) e t h a n o l ，2 0 2 m i n 3 7 - 奎些! 堕堡些鱼! 鱼蒸重鲨堕墨王壁墼垡翌壁 g ； r 九 一v + - 、- - - - - - - - - - - - - - - - - - j - - - - - - - - - - - - - - - - - - 一 二二二二二：卫二二_ 二_ 二盈 i i 一5 a i i 5 d e l u e n t ：c i t r i ca c i d ( 1 9 l ) i nw a t e r ( s o l v e n ta ) + c i t r i ca c i d ( 1 9 l ) i nm e t h a n o l ( s o l v e n tb ) ，a l i n e a rg r a d i e n to f3 0 o fbt o6 0 o v e r2 6m i n ，u vd e t e c t i o na t2 5 4n m ，f l o w0 8 0m lm i n + r e t e n t i o nt i m e ：i i - 5 a ，15 7m i n ；1 1 - 5 e ，8 2m i n ；l l - s d ，9 7m i n 啪 。 = ：， 。j 2 2 5 i i 6 a i i 6 d e l u e n t ：c i t r i ca c i d ( 1 9 l ) i nw a t e r ( s o l v e n ta ) + c i t r i ca c i d ( 1 9 l ) i nm e t h a n o l ( s o l v e n tb ) ，a l i n e a rg r a d i e n to f3 0 o fbt o5 4 5 o v e r2 1m i n ，u vd e t e c t i o na t2 9 4n n l ，f l o wo 8 0m l m i n ，r e t e n t i o nt i m e ：i i 6 a ，17 5m i n ；i i 6 e ，6 8r a i n ；i i 6 d ，8 1m i n 3 8 大连理工大学博士学位论文 口丽百5 烈ia 晰日w 丽$ n d 而r 一 一 啪 脚 2 1 0 口。 fi a i i 7 a - 1 1 7 d e l u e n t ：c i t r i ca c i d ( 1g l ) i nw a t e r ( s o l v e n ta ) + c i t r i ca c i d ( 1g l ) i nm e t h a n o l ( s o l v e n tb ) ，a l i n e a rg r a d i e n to f3 0 o fbt o6 0 o v e r2 6m i n ，u vd e t e c t i o na t2 8 6n m ，f l o w0 8 0m lm i n ， r e t e n t i o nt i m e ：i i 一7 a ，1 2 5m i n ；i i - 7 c ，1 0 2m i n ；i i - 7 d ，11 7m i n 一 j - p ， 二：二二t 。”：丑二一二一j 芷二二疆_ _ _二量! 二：二五二二三匡二二面 - 8 a i i 8 d e l u e n