（应用化学专业论文）离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征.pdf

摘要 本文通过直接键合和包夹聚合的方式制备了两种离子液体键合固定相：1 烯丙基3 甲基咪唑氯盐离子液体键合固定相( s i 】a m 心d ) 和1 丙基3 甲基咪唑氯盐离子液体键合 固定相( s i l p r m i m ) 。芳香类化合物、阴离子、核苷酸、麻黄碱和酚类等物质在制备的 固定相上都能得到较好的分离，通过考察流动相中甲醇含量、磷酸缓冲盐溶液的p h 值 和浓度对各分析物容量因子k 的影响，结合反相c 1 8 柱对上述分析物保留性能，结果表 明：s i l a m i m 与s i l p r m i m 两种固定相都与分析物间同时存在疏水作用和静电相互作用， 固定相表现出双重色谱分离机理，即反相色谱和离子交换色谱分离模式。s i l p r m i m 固 定相对不同种类的复杂混合物( 有机阴离子、无机阴离子、酸性、碱性和中性化合物) 能同时进行有效分离。 另外，本文还考察了n 丁基吡啶四氟硼酸盐( b p y 】 b f 4 】) 离子液体的添加对植物 水解酶抑制法检测克百威中植物酶活性、抑制率、反应速度及最低检出限的影响。与磷 酸缓冲溶液体系相比，添加8 ( v v ) b p y c b f 4 的体系使农药对酶的抑制率提高2 2 倍，克百威等7 种农药的最低检测限降低约1 个数量级；同时使分析时问缩短4m i n 。 添加1 丁基3 一甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体( b m i m b f 4 】) 有类似的影响。 关键词离子液体固定相高效液相色谱酶抑制法农药残留 a b s t r a c t t w os i l i c ag e lb o n d e ds t a t i o n a r yp h a s e sb a s e d0 1 1 a m 舢c 1a n d 【p m i m c 1i o n i c l i q u i d sw e l ep r e p a r e da n de h a r a c t o r i z e df o rh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h e c h r o m a t o g r a p h i cp e r f o r m a n c eo ft w ob o n d e ds t a t i o n a r yp h a s e s ，s i l a m i ma n ds i l p r m i m w e r ee v a l u a t e d b yu s i n g a r o m a t i ch y d r o c a r b o n , a n i o n s ，n u c l e o t i d e s ，e p h e d r i n e sa n d h y d r o x y b e n z e n e s 船p r o b e t h ee f f e c to fp hv a l u e c o n c e n t r a t i o n so fp h o s p h a t eb u f f e r s o l u t i o na n dt h ec o n t e n to fo r g a n i cs o l u t i o ni nm o b i l ep h a s eo nt h ec a p a c i t yf a c t o r s o ft h e a b o v ea n a l y t e sw e r ei n v e s t i g a t e d c o m p a r a t i v es t u d yo ft w os t a t i o n a r yp h a s e sw i t hc l sw a s d o n eu n d e rt h es a m ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s t h er e s d ts h o w e dt h a th y d r o p h o b i ca n d s t a t i ce l e c t r i ci n t e r a c t i o n se x i s t e db e t w e e na n a l y t e sa n ds t a t i o n a r yp h a s e s ，a t t r i b u t et ot h e c h r o m a t o g r a p h i cc h a r a c t e ro fs t a t i o n a r yp h a s e s ，i no t h e rw o r d s ，s i l a m i ma n ds i l p r m i mh a v e r e v e r s e d - p h a s ea n da n i o n e x c h a n g ep r o p e r t i e s f u r t h e r m o r e ，d i f f e r e n tc o m p o u n d si n c l u d i n g o r g a n i ca n i o n s ，i n o r g a n i ca n i o n s ，a c i d ，b a s ea n dn e u t r a l s o l u t e sc a r ls u c c e s s f u ls e p a r a t e d s i m u l t a n e o u s l y o nt h eo t h e rh a n d ，t h ei n f l u e n c e so f ( 0 3 e y b f 4 ) i o n i cl i q u i do nt h ee n z y m ea c t i v i t y , t h ei n h i b i t i o ne f f i c i e n c y ，t h er a t eo f r e a c t i o na n dt h ed e t e c t i o nl i m i ti np l a n tl i p a s e si n h i b i t i o n m e t h o df o rd e t e r m i n i n gc a r b o f u r a nw e r ei n v e s t i g a t e d u s i n g8 b p y 】0 3 f 4 ( v v ) 一p h o s p h a t e b u f f e rm i x t u r e si n s t e a do f p u r ep h o s p h a t eb u f f e r ，t h ee n z y m ei n h i b i t i o ne f f i c i e n c yi n c r e a s e d 2 2t i m e s ，t h ea n a l y s i st i m ew a ss h o r t e n e d4m i l l ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i t so fc a r b o f u r a na n d o t h e rs e v e np e s t i c i d e sd e c r e a s e db y1o r d e ro rs ou n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n a d d i t i o no f 0 3 m t m 【b f 4 】t op h o s p h a t eb u f f e rh a ss i m i l a re f f e c t si nt h ee n z y m ea c t i v i t ya n di n h i b i t i o n e f f i c i e n c y k e y w o r d s i o n i cl i q u i d ；s t a t i o n a r y p h a s e ；h i g h e n z y m ei n h i b i t i o n ；p e s t i c i d e sr e s i d u e s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河 南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 论文作者签名：堑垄整日期：苎芝：兰：兰! 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本 人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：五墨垒垫 日期： 圭= z ! ： 导师签名： 4 弯l 臁弘 有关知识产权的保证 本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。本人在校期间的研究成果及发表的论文，知识产权归河南 工业大学所有。本人毕业后发表的、以本人在校期间研究成果为基础完 成的论文、研究报告及其它科研成果，将署名河南工业大学为作者单位。 论文作者签名：堡整日期：兰聋：型： 导师签名：仁琴年日期：垄乏乙也 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 1 1 离子液体及其组成 第一章前言 离子液体( i o n i cl i q u i d s ，i l s ) 是指熔点低于1 0 0 c 且完全由离子组成的一类化合物， 由于大部分离子液体在2 5 c 时呈液态，所以离子液体又通常被称为室温离子液体( r o o m t e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ，r t i l s ) i “。 离子液体一般由有机阳离子和无机阴离子组成。常见的阳离子有烷基季铵离子 n r x i - h - ；】十、烷基季膦离子 p r x h ；】+ 、1 ，3 二烷基取代的咪唑离子或称n ，n 二烷基取代 的咪唑离子、n 一烷基取代的吡啶离子【r p y 】+ 【2 】。其中研究较多的是正烷基吡啶和l ，3 二 烷基咪唑( r r i m ) 两类，如正丁基吡啶 n b u p y + 和1 一乙基- 3 - 甲基咪唑 e m i m + 都是常 用的阳离子【3 】。常用的阴离子有：p f 6 一、b f 4 一、a i c l 4 一、c u c l 2 一、n 0 3 一、c 1 0 4 - 和 c f 3 c o o 一等州。表l - 1 所示为目前常见的离子液体阴阳离子组成。 表卜1 常见离子液体阴阳离子组成 阳离子( c a t i o n s )阴离子( a n i o m ) 碱性( b a s i c ) ： b f 4 一， p f 6 一，n 0 3 一，n 0 2 一，s 0 4 2 一，c h 3 c 0 0 一， 【s b f 6 】一，【c ( c f s s 0 2 ) 3 】_ ，f c f 3 c 0 2 】_ 酸性( a c i d i c ) ：【a u 2 c 1 7 一， c u 2 c h 一， c u c h 一，【a 1 2 c 1 7 】一， 【a b c l l o l 一，【c 1 0 4 】一， 中性( n e u t r a l ) ：c i 一 1 2 离子液体的性质 离子液体是一类新兴的极具应用前景的溶剂，以其特有的优良性能成为近年来绿色 化学的研究热点之一。离子液体有不同于水及普通有机溶剂的诸多性质，主要为： 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 ( 1 ) 对大多数的无机、有机以及高分子材料表现出良好的溶解能力； ( 2 ) 通常含有弱配位离子，所以具有高极化潜力和非配位能力： ( 3 ) 具有非挥发性特征，几乎没有蒸气压，无色、无臭，因此可以用于高真空体 系中，同时也可减少因挥发而产生的环境污染问题，实现化工行业绿色化； ( 4 ) 具有较宽的稳定温度范围，通常在3 0 0 c 范围内为液体，有利于动力学控制； ( 5 ) 表现出b r o n s t e d 、l e w i s 、f r a n k l i n 酸以及超强酸性； ( 6 ) 电化学稳定，电位窗口较宽； ( 7 ) 通过阴阳离子的设计可获得“需求特定”、“量体裁衣”的离子液体，既可 调节其对无机物、水、有机物及聚合物的溶解性，也可通过调节烷基链长及阴阳离子种 类等，对它的特性进彳亍调控，得到不同种类的离子液体，并可根据特定的目的设计所需 离子液体体系。离子液体在很大范围内的化学可调控性，成为它在各种化学领域应用中 的独特之处【5 】o 鉴于上述优点，目前离子液体已经被广泛应用于许多领域，如有机合成【6 】、催化反 j 匣【7 ，引、电化学吲等，近年来其在分离分析 1 0 - 1 3 领域的应用也日趋广泛。 1 3 离子液体在分离分析中的应用 1 3 1 离子液体在毛细管电泳中的应用 1 3 1 1 在非水毛细管电泳中的应用 室温离子液体的物化性质具有很大的可调控性，且挥发性低，是非水毛细管电泳中 非常有效的电渗流修饰剂。v a h e r 研究小组最早将 b m i m c f s c 0 0 作非水毛细管电泳电 解质添加剂，对水不溶性染料( 烟鲁绿、亮甲酚蓝、苏丹黑、百里酚酞和酚酞) 进行了 成功分离【1 4 1 。用 b m i m c f 3 ( c f 2 ) 2 c o o 的乙腈溶液作为电解质溶液，也能快速实现对 酚类化合物( p 乙基苯酚、苯酚、间苯二酚和二水间苯三酚) 的基线分离 1 ”。溶质洗脱 顺序与其核质比无关，分离是基于在非质子性溶剂中，离子液体的阴离子与分析物( 质 子酸) 间复共轭作用： n r h + a - 一( r t - d n a ( n = 1 ，2 ；r h 为比h a 更弱的质子酸) 2 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 离子液体所带阴离子( b f + 一、c f 3 c 0 0 一或c f 3 ( c f 2 ) 2 c 0 0 一) 不同，与溶质的共轭作用大 小及共轭程度不同，因而分离效果也不同。将此类似体系( 1 5m m 【b m i m 】 【c 6 h s c h o h c o o 的乙腈溶液) 用于植物提取物中聚酚化合物的分离，分离选择性明显 高于用硼酸缓冲水溶液作电解质溶液的分离结剁6 1 。 1 3 1 2 在水相毛细管电泳中的应用 y a n e s 等【l7 】用1 烷基3 甲基咪唑基室温离子液体作c e 的电解质溶液，对葡萄籽萃 取液中的聚酚物质进行了成功的分离，该法简单、重复性好。分离是基于聚酚与涂敷在 毛细管壁的咪唑阳离子和溶液中的自由咪唑离子的相互缔合( 图1 - 1 ) ，此缔合作用与疏 水作用、氢键作用及离子- 偶极，离子诱导偶极作用有关。与 e m i m b f 4 相比较，【b m i m 】 b f 4 有更好的分离度，但分析时间要长，重复性也差。基于相同的分离机理，j i a n g 【i 州 等将室温离子液体动态涂敷在熔融毛细管壁，在1 5k v 、x = 2 4 0n l l l 条件下，用9 0m m e m i m b f 4 作电解质溶液对4 种碱性蛋白质( 洳糜蛋白酶原、胰蛋白酶原、溶菌酶和 细胞色素c ) 实现了基线分离。碱性蛋白质在毛细管壁产生不可逆吸附，分离重现性差， 当熔融毛细管壁上涂敷离子液体，其电渗流发生反转，排斥带正电荷的分析物，使分离 效率提高。与普通毛细管电泳缓冲剂相比， b m i m b f t i t l o 】作电解质溶液能在更短时间 内对除草剂苯甲酸和氯代苯氧基酸位置异构体进行分离。 。，j x 、。，i 、。，i 、哪，i 、m 。，、m 。，：，。； f 磐蕾p 卜一 ? ：耋奠二j 娑：j 蔓婆：3 ：! “二鲤：j 蠖蔓： 图 i - i 卜烷基一3 一甲基咪唑基离子液体分离聚酚化合物的作用图式 在 b m i m b f 4 添加p 一环糊精( p c d ) 修饰剂，分析物与咪唑基团和p - c d 同时作 用，部分或完全被包埋在b - c d 空腔内的分析物与游离的咪唑基团缔合作用非常弱，未被 包埋的分析物与咪唑基作用相对强，基于此作用机理，q i 等1 9 1 成功分离了4 种葸醌混合 物，并建立了中药p a e d i c a l y xa t t o p e v e n s i s 提取物中蒽醌的快速( 1 0 4 块米) ，峰形好。 1 9 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 3 5 0 2 5 0 譬 暑1 5 0 右5 0 o ，5 0 3 5 0 2 5 0 1 5 0 5 0 5 0 o 5 1 01 5 r e t e r i t i o nt k n e ( m i n ) b 3 051 01 5 r e t e n t i o nt h n e ( m 图3 - 66 种芳香类化合物在s ii m i m 柱( a ) 和c ，。柱( b ) 上的分离色谱图 ( 流动相为h ：0 ：c h 3 0 h = 6 0 ：4 0 ( v v ) ( a ) ，h 2 0 ：c h 3 0 h = 2 0 ：8 0 ( v v ) ( b ) ，其它色谱条件同图3 - 5 峰：苯( 1 ) ，甲苯( 2 ) ，二甲苯( 3 ) ，萘( 4 ) ，联苯( 5 ) ，蒽( 6 ) 。) fl昌_)o口oao-口。嚣uo苗凸 离子液体液相色谱键合固定相的制各及表征 表3 - 3 在s ii a m i m 柱上得到的6 种芳香类化台物分离色谱参数 ( 色谱条件同图8 ) 3 3 1 2 对阴离子的分离 s i l a m n d 有带正电荷的咪唑基团，对阴离子有一定的静电吸引作用，实验评价了 s i 蝴i m 固定相对阴离子的保留性能，阴离子包括无机阴离子如碘酸根、亚硝酸根、硝 酸根、碘离子和有机阴离子如苯甲酸根、水杨酸根。同时考察了流动相中磷酸缓冲盐p h 值、浓度及甲醇含量对6 种阴离子容量因子k 值的影响。 当2 0 m m o l l 。1 的磷酸缓冲盐p n 值从3 5 增加到5 5 时，6 种阴离子的k 值都随之 减小，特别是有机阴离子，如图3 7 a 所示。阴离子的k 值随p h 值的增加而减小，这可 能是由于p h 值的增加，使溶液中h p 0 4 2 一浓度增加， 玎j 0 4 z 一比h 2 p 0 4 一有更强的离子交 换能力，从而使分析物与固定相之间的静电作用减弱。而对有机阴离子而言，k 值随p h 值变化更快，可能是样品和固定相间疏水作用和静电作用的共同结果，这正是s i l a m i m 柱与普通反相色谱柱的最大不同。 图3 7 b 为6 种阴离子的k 值随磷酸缓冲盐浓度变化的曲线图，无机阴离子的k 值在 1 0 m m o l l - l 5 0 m m o ll 1 的浓度范围内里下降趋势，即随着磷酸缓冲盐溶液浓度的增大 而逐渐减小，这可能是因为在缓冲溶液浓度较高时，阴离子与固定相上咪唑阳离子基团 间的相互作用会有所减弱，使保留值减小。有机阴离子的k 值随缓冲盐溶液浓度的变化 与无机阴离子稍有不同，其k 值先增大后减小，在磷酸缓冲盐溶液浓度为2 0m m o ll 4 时达到最大，这也可能是疏水作用和离子交换作用共同作用的结果。 流动相中甲醇含量对阴离子分离的影响见图3 7 c ，从图中可以看出，4 种无机阴离 子的k 值基本不随甲醇含量的改变而改变，而两种有机阴离子的k 值均随甲醇含量的增 2 1 加而降低。这说明此固定相除存在离子交换分离作用外，还同时存在反相色谱分离作用。 s 6 - 4 2 0 6 4 c 2 0 一b d a t e n i t r i t e - n i t r a t e 3 j 4 b 1 0 6 5 4 3 2 1 o 4 55 p h - i o d a t e e 一n h r i t e - r n h r 砒e 一i o d i d e 2 0 3 0 4 0 5 0 n c e n 雠b “n o i r l ) 卜l o d a t e 卜- n 赴r i c o 0 51 0 1 5 2 0 2 5 c o n c e n t r a t 自o n c o ) 图3 - 7 不同流动相对阴离子分离的影响 ( 检测波长为2 2 0 衄，其它色谱条件同图3 5 2 0m 。l l - 1 不同p h 值的磷酸缓冲盐溶液( 8 ) ；p h 值为4 5 的不同浓度的磷酸缓冲盐溶液( b ) ；甲醇含量不同的2 0 m m o ll - 1 的磷酸缓冲盐( 。) ) 离子液体液相色谱键合固定相的制各及表征 图3 - 8 为2 0m m o ll - 1 的磷酸缓冲盐中添加不同浓度的甲醇时，碘酸根、亚硝酸根、 硝酸根、苯甲酸根、碘离子和水杨酸根六种阴离子在s i l a m i m 柱的分离色谱图。当甲 醇含量从o 增加到2 5 时，总的保留时间减少，峰拖尾现象减弱。有趣的是，随着流 动相中甲醇含量的增加，阴离子在s i 认m 讧柱上的选择性发生了改变，当甲醇含量低 于1 0 时，苯甲酸根的保留时间小于碘离子的保留时间，而当甲醇含量高于1 5 时，苯 甲酸根的保留时间则大于碘离子的保留时间。这可能是由于分析物与固定相间同时存在 疏水作用和静电相互作用的共同结果，即反相色谱分离和离子交换色谱分离机理同时起 作用。当甲醇浓度较低时，分析物与固定相间存在的静电作用起主要作用，即分离以离 子交换分离模式为主，碘离子和s i l a m 订固定相间的作用较强，在苯甲酸之后被洗脱； 随着甲醇的浓度进一步增大，分析物和固定相之间的静电作用逐渐变弱，而疏水作用逐 渐增强，起主要作用，从而对苯甲酸的保留作用增强，使它在碘离子之后被洗脱。 7 5 5 5 3 5 1 5 5 7 5 5 5 3 5 1 5 - 5 o2468 0 5 7 5 5 5 3 5 1 5 5 1 41 61 8 o24681 01 21 41 6 02468l o1 21 41 61 8 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 7 5 5 5 3 5 1 5 - 5 9 5 7 5 5 5 3 5 1 5 - 5 9 5 7 5 5 5 3 5 1 5 5 024681 61 8 02 4 68 1 01 21 41 61 8 02468 1 41 61 8 图3 - 8 甲醇含量不同时6 种阴离子在s ii a m i i a 柱上的分离色谱图 ( 色谱条件同图3 - 7 峰：碘酸根( 1 ) ，亚硝酸根( 2 ) ，硝酸根( 3 ) ，苯甲酸根( 4 ) 碘离子( 5 ) ，水杨酸根( 6 ) ) 图3 9 a 为六种阴离子在s i i a m m 柱上的分离色谱图，从图上可以看出，当流速为 1 0m l m i n ，流动相为2 0m m o ! l o 磷酸缓冲盐溶液( p h = 4 5 ) 时，6 种阴离子得到了较好 的分离。通过实验我们发现，有机阴离子与固定相之间有较强的相互作用，若流动相中 不添加有机溶剂，即使使用较高p h 值的缓冲溶液也不易被洗脱，这也进一步说明 s i l a m i m 固定相不仅存在反相色谱分离机理，同时也有其它作用如静电作用。 c 1 8 是目前使用最多的反相色谱固定相，阴离子在其上基本不会有保留。为了阐明 s i l a m m 固定相的色谱分离机理，实验在相同色谱条件下考察了以上6 种阴离子在c t s 固定相上的保留，如图3 9 b 所示，碘酸根、亚硝酸根、硝酸根和碘离子4 种无机阴离 子不被保留，同时被洗脱。苯甲酸根和水杨酸根离子本身结构有疏水性基团，故在c 1 b 柱上有一定保留，因水杨酸根离子带羟基基团，极性大于苯甲酸根离子，故c 1 8 对苯甲 离子液体液相色谱键合固定相的制各及表征 酸根的保留强于水杨酸根离子。正是由于水杨酸根离子上的羟基基团，它在一定流动相 条件下，有部分离解，带负电荷，故相对于苯甲酸根离子而言，水杨酸根离子与s i 执m 珊i 作用更强，保留时间更长，导致此两种分析物在c 1 8 和s i l a m i m 上选择性不同。 a 0 b 2 4 6 r e t e n t i o nt k n e ( n m ) 0 24681 01 2 r e t e n t i o nt l m e ( n m ) 图3 - 96 种阴离子在s i i m l m 柱( a ) 和g e 柱( b ) 上的分离色谱图 ( 流动相为2 0m m o ll - 1 磷酸缓冲盐溶液( p i t = 4 5 ) ：c m 0 h = 7 5 ：2 5 ( v v ) ，其它色谱条件同图3 - 7 峰：碘酸根( 1 ) ，亚硝酸根( 2 ) ，硝酸根( 3 ) ，苯甲酸根( 4 ) ，碘离子( 5 ) ，水扬酸根( 6 ) 。) 由上可知，无机阴离子与离子液体中的咪唑阳离子问存在相互作用，从而使它们在 s i l a m i m 柱上被保留，因此，可以更加确定 a m i m c i 离子液体已经被键合到了硅胶上。 另外，两根柱子对苯甲酸根和水杨酸根阴离子表现出不同选择性。 3 3 1 3 不同类型物质同时分离 由于带有疏水性的烷基基团以及眯唑阳离子基团，s i l a m i m 固定相与样品间的作用 2 5 坫 竹 巧 一o邑冀口。骨2 eo一苦口p古 抛 瑚 啪 啪 珊 (n县端口。音普口oil。op口 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 主要包括疏水作用和静电作用。由前面结果可知，此固定相对无机阴离子、有机阴离子、 苯环化合物都有良好的分离能力。由此，通过选择合适的缓冲溶液浓度以及有机溶剂含 量，该固定相对以上物质的混合物预期也能达到较好的分离。实验考察了s i l a m i m 固 定相对苯丙氨酸、苯胺、亚硝酸钠、甲苯、苯甲酸、碘化钠、水杨酸钠和联苯8 种混合 物的分离性能，其色谱分离图如图3 1 0 所示。从图中可以看出，8 种不同类型的化合物 在9m i n 内基本得到基线分离，这表明s i l a m i m 固定相具有同时分离包括酸性、中性、 碱性物质、有机和无机阴离子复杂混合物的潜力，这一特点是普通反相色谱柱( 如c 1 8 ) 所不能比拟的。图中水杨酸根( 峰7 ) 和联苯( 峰8 ) 的峰形有一定的拖尾，这可能是 由于硅胶表面部分未被键合的自由硅羟基对这些物质强保留的原因。 7 5 一 o 5 5 吾 墨3 5 兰 皇 羔1 5 若 - 5 o 2 孙4 n t l o n t 妇缸血) 8 1 0 图3 1 08 种物质在s ii a m i m 柱上的分离色谱图 ( 色谱条件同图3 - 9 峰：苯丙氨酸( 1 ) ，苯胺( 2 ) ，亚硝酸钠( 3 ) ，甲苯( 4 ) 苯甲酸( 5 ) ，碘化钠( 6 ) ，水杨酸根( 7 ) 和联苯( 8 ) 。) 3 3 1 4 对核苷酸的分离 k n a 和d n a 在生命科学研究中占有极其重要的地位，而核碱、核昔和核苷酸是组 成r n a 和d n a 的基本单元，对核碱、核苷和核苷酸的分析在h p l c 发展中一直处于 核心地位【搠。 核苷是由嘧啶碱或嘌呤碱与呋喃戊糖组成的分子；核苷酸是由核苷与磷酸根组成的 线性分子，由于戊糖和磷酸根的引入增加了整个分子的亲水性，高效液相色谱分离分析 核苷酸主要使用反相色谱柱 s o , s 1 。 实验也考察了s i l a m i m 固定相对胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的分离性能，其色谱分 离图见图3 1 l a 。对比此四种核苷酸在c l s 柱上的分离色谱图( 3 1l b ) 可知，胞苷、尿 苷、鸟苷和腺苷在两种固定相上的洗脱顺序完全相同，这也表明s i l a m i m 固定相具有 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 反相色谱分离的特征。相同流动相条件下，核苷酸在c 1 8 上的保留较强，且胞苷和尿苷 没有达到基线分离。因此可以看出，s i l a i v l i m 柱分离一些极性的有机化合物如核苷酸有 一定的适用性。 0i23456 r e t e n t i o nt i n e ( r m ) 图3 1 14 种核苷酸在s i l 娴l m 柱( a ) 和c ，e ( b ) 上的分离色谱图 ( 流动相为2 0m m o ll “磷酸缓冲盐溶液( p i f = 3 5 ) ，其它色谱条件同图3 - 7 峰：胞苷( 1 ) ，尿苷( 2 ) ，鸟苷( 3 ) 和腺苷( 4 ) ) 由于核苷酸含有氨基、羟基和氧氮原子，因此是一类的典型的极性水溶性化合物。 图3 1 2 a 所示为胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的容量因子k 随流动相( 2 0m m o ll d 磷酸缓冲盐 溶液( p h = 3 5 ) ) 中甲醇含量改变而改变的曲线图。随着甲醇含量的增大，胞苷的值 增大，尿苷的七值减小，而鸟苷和腺苷的 值则都随甲醇含量的增加先增大后减小，并在 坫 竹 拈 巧 fl巨一o口。鱼oh h 。芑。苗q 加 m j县口。骨2口。=u暑廿凸 离子液体液相色谱键合固定相的制各及表征 甲醇含量为5 时后值达到最大。这也表明固定相与核苷酸间的疏水作用对分离有明显的 作用。 图3 1 2 b 所示为缓冲溶液p h 值对4 种核苷酸保留的影响，4 种核苷酸的 值随缓冲溶液 p h 值的增加先增加后减小，在p h = 4 5 时达到最大。在考察的p h 范围( 2 5 5 5 ) 内，4 种核苷酸在水溶液中均有部分离子化。随着缓冲溶液p h 值的增加，胞苷、尿苷、鸟苷和 腺苷离解程度增加，在固定相与分析物间既存在疏水作用，同时也存在静电作用，故使 核苷酸的保留增强；但当缓冲溶液d h 值继续增加时，核苷酸离解己接近完全，保留主要 依赖于固定相与分析物间存在的疏水作用，故核苷酸的保留减弱。 1 2 _ n 6 o - 一e y t i d h l e 51 01 52 0 c o n c e n t r a t i o n ) b - c y t i d i n e - - i t - - u r i d i n e 图3 - 1 2 不同流动相对核苷酸分离的影响 ( 色谱条件同图3 7 甲醇舍量不同的2 0m m o ll 。的磷酸缓冲盐( p h = 3 5 ) ( a ) ；2 0m m o ll - 1 不同p h 值的磷酸缓冲盐溶液( b ) 。) ” 0 离子液体液相色谱键合固定相的制各及表征 3 3 1 5 对麻黄碱的分离 麻黄碱是从植物中提取获得的含氮有机物，其种类繁多，大多数具有特殊的镇痛生 理作用，已在i f 缶床医疗上广泛使用。由于麻黄碱含有氨基和羟基基团，因此和硅胶通常 会有较强的相互作用，造成保留时间较长，峰拖尾严重等不良影响。实验考察了去甲基 麻黄碱( n e ) 、伪麻黄碱( p e ) 和甲基麻黄碱( m e ) 在s i l a m i m 固定相上的分离性能。 当流动相为2 0m m o ll 1 磷酸缓冲盐溶液( p h - - - 2 5 ) ：甲醇= 8 0 ：2 0 ( v v ) 时，3 种麻黄碱在较 短的时间内被洗脱并得到良好的分离( p e n e ，结果证明s i l a m i m 固定相表现出反相色谱分离机理。但部分残留自由硅 羟基造成的色谱峰拖尾现象仍没有得到较好的解决。 i 2 0l23456 r e t e n t i o n t i n t ( m i n ) 图3 1 33 种麻黄碱在s iia i i m 柱上的分离色谱图 ( 流动相为2 0m m o lr 磷酸缓冲盐溶液( p h = 2 5 ) ：甲醇= 8 0 ：2 0 ( v v ) ，其它色谱条件r q 图9 。 峰：n e ( 1 ) ，p 已( 2 ) 和m e ( 3 ) ) 同样，也考察了流动相中甲醇浓度和磷酸缓冲溶液p h 值对分离麻黄碱的影响。从图 3 - 1 4 a 可以看出，3 种麻黄碱的七值均随流动相中甲醇含量的增加而逐渐降低，n e 、p e 和 m e 的出峰顺序( 即选择性) 一直没有发生改变，符合反相色谱分离机理。 图3 1 4 b 昴_ 示三种麻黄碱的容量因予随磷酸缓冲盐溶液p h 值的改变呈现不同的变化 趋势：p e 和m e 的尼值随磷酸缓冲盐溶液p h 值的增加先减小后增大，而n e 的膛改变不明 盯 弘 筋 u 5 巧 一fl暑i目oa窭-o芑。苗凸 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 显，有随磷酸缓冲盐溶液p h 值增大而一直增大的趋势。 5 4 b 5 1 0 1 5 c o n c e n t r a t i o n ( ) 图3 1 4 不同流动相对麻黄碱分离的影响 ( 甲醇含量不同的2 0m m o ll 1 的磷酸缓冲盐( p h = 2 5 ) ( a ) ；2 0m m o ll - 1 不 同p h 值的磷酸缓冲盐溶液( b ) 。其它色谱条件同图3 - 7 ) 3 3 1 6 对酚类化合物的分离 对苯二酚、间苯二酚和苯酚三种酚类化合物在s i l a m i m 柱上的分离结果如图3 一1 5 所示，在一定流动相条件下，三者能实现基线分离。其保留强弱顺序依次为：对苯二酚 间苯二酚 苯酚。相对于对苯二酚和间苯二酚而言，苯酚分子结构中只含有1 个羟基基 团，极性相对最小，在表现出反相色谱分离机理的s i l a m i m 柱上，有最强的保留。间 8 6 4 2 o _ 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 苯二酚由于存在分子内氢键，使整个分子结构疏水性增强，故其保留较对苯二酚强，后 出峰。 0l23456 r e t e n t i o nt i m e ( m ) 圈3 1 5 三种酚类化合物在s ii a m i m 柱上的分离色谱图 ( 流动相为2 0m m o ll - 1 磷酸缓冲盐溶液( p h = 4 5 ) ，其它色谱条件同图3 - 6 峰：对苯二酚( 1 ) ，问笨二酚( 2 ) 和苯酚( 3 ) 。) 在反相色谱分理模式中，甲醇含量的增加使对苯二酚、间苯二酚和苯酚的保留时间 减小，易被洗脱。当流动相中甲醇浓度由o 增大到2 0 时，三种酚的 值从总体趋势上 来看是都减小的( 图3 1 6 a ) ，除了在5 1 0 的范围内有少许的增加。 可能是由于酚类物质为弱酸，三种酚的k 值随磷酸缓冲盐溶液p h 值的变化不明显， 当磷酸缓冲盐溶液的p h 值的变化范围为2 5 5 5 时，苯二酚、间苯二酚和苯酚的容量因 子k 值变化几乎无规律可循( 图3 1 6 b ) ，确切原因还有待实验进一步阐述。 l n 8 0 6 _ 0 4 吡 0 51 01 5 c o n c e n t r a t i o n 惭) 3 i 珊 瑚 啪 渤 一fl昌一冀#ods2苫艺苗o 离子液体液相色谱键合固定相的制各及表征 l 0 8 n 6 _ 0 4 0 2 0 b 图3 - 1 6 不同流动相对酚类化合物分离的影响 ( 甲醇含量不同的2 0m m o ll - l 的磷酸缓冲盐( p h = 4 5 ) ( 8 ) ；2 0m m o ll - 1 不同p h 值 的磷酸缓冲盐溶液( b ) 。其它色谱条件同图3 - 7 ) 3 3 1 7 s il a m i m 的耐碱性 硅胶键合固定相使用的p h 值范围窄，一般只能在p h 值为2 7 范围内操作，否则 会发生水解，降低色谱柱的使用寿命，包夹聚合法制备的固定相在一定程度上弥补了化 学键合相的上述不足，可以在较高p h 值下使用。我们考察了s i l a m i m 固定相的耐碱性， 图3 1 7 为碘离子在p h = 8 0 的2 0m m o ll 1 磷酸缓冲盐条件下的色谱图，和图3 - 9 中( 流 动相为2 0m m o ll 1 磷酸缓冲盐溶液( p h = 4 5 1 ：c h 3 0 h = 7 5 ：2 5 ( v v ) ) 的碘离子相比，峰形 基本没有改变。 o 皇 = 3 5 0 暑 2 g1 5 0 芑 2 o l2 r e t e n t i o n t h n e ( r a m ) 图3 - 1 7 碘离子s ii a m i m 柱上的色谱图 ( 流动相为2 0t o o ll - 1 磷酸缓冲盐溶液( p h = 8 0 ) ，其它色谱条件同图3 - 7 。) 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 s i l a m i m 柱经过长时间使用后( 约5 0 0h ，并在高p h 值的磷酸缓冲盐溶液运行数 天) ，再次对芳香类化合物进行色谱评价。图3 1 8 为苯、甲苯、二甲苯、萘、联苯和蒽 6 种芳香类化合物在s i l a m m 柱上的色谱分离图，由图可知，当流动相组成为 h 2 0 ：c h 3 0 h = 6 0 ：4 0 ( 与5 0 0 h 前完全相同) 时，6 种化合物也得到了较好的分离，保留 时间变化不大，出峰顺序也没有变化，说明s i l a m i m 固定相有较好稳定性，能在碱性 条件下使用而基本不降低其柱效，具有包夹聚合固定相的特点，只是蒽的峰形稍微差了 一点。 s2 5 0 旦 譬 g 1 5 0 骨 2 暑 5 0 竺 占 - 5 0 05l o r e t e n t i o nt k a e ( r m ) 图3 1 86 种芳香类化合物在s ii 朋i m 柱上的分离色谱图 ( 色谱条件同图3 - 6 a 。峰：苯( 1 ) ，甲苯( 2 ) ，二甲苯( 3 ) ，萘( 4 ) ，联苯( 5 ) ，蒽( 6 ) ) 3 3 2s ii p r m i m 的应用 3 3 2 1 对芳香类化合物的分离 用苯、甲苯、萘和联苯4 种苯环化合物对s i l p r m i m 固定相的色谱性能进行了评价， 图3 1 7 为这4 种物质在水甲醇( 7 0 ：3 0 ) 作为流动相时的分离色谱图，4 种芳香类化 合物能实现基线分离，且峰形对称不拖尾。苯、甲苯、萘和联苯在s i l p r m i m 固定相上 的洗脱顺序与c 1 8 柱上相同，这可推断出：苯环化合物与s i l p r m i m 结构中的咪唑基团 间存在疏水作用，此作用影响分析物在s i l p r m i m 固定相上的保留程度。 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 2 3 51 01 5 r e t e n t i o n t h n e ( m i n ) 图3 - 1 74 种芳香类化合物在8 ii p r m i m 柱上的分离色谱图 ( 流动相为h ：o ：c h ，o h = 7 0 ：3 0 ( v v ) ，其它色谱奈件同图3 - 6 。 峰：苯( 1 ) ，甲苯( 2 ) ，萘( 3 ) 和联苯( 4 ) ) 随着流动相中甲醇浓度增加，流动相极性减小，4 种分析物的容量因子k 减小( 图 3 - 1 8 ) ，这进一步说明s i l p r m i m 固定相表现出显著的反相色谱分离机理特点。 8 4 o 2 02 53 03 5 c o n c e n t r a t i o r i 惭) 图3 - 1 8 流动相中甲醇浓度对芳香类化合物k 值的影响。 ( 色谱条件：s i l p r m i m 柱( 1 5 0 i l l m 4 6mi d ，5 “m ) ，其它色谱条件同图3 - 6 。) 一j昌icods苦一。2po 离子液体液相色谱键合固定相的制备及表征 3 3 2 2 对核苷酸的分离 占 g 哥 翟 置 墅 暑 暑 o 8 0 4 0 481 2 r e t e a t i o n t l m e ( t r 血) 图3 - 1 94 种核苷酸在s ii p r m i m 柱上的分离色谱图 ( 流动相为2 0m m o l l 。磷酸缓冲盐溶液( p h = 3 0 ) ，检测波长为2 2 0i l m ， 其它色谱条件同图3 - 1 8 峰：胞苷( 1 ) ，腺苷( 2 ) ，尿苷( 3 ) 和鸟苷( 4 ) 。) 以s i l p r m i m 为固定相，用2 0m m o ll 1 ，p h = 3 0 的磷酸盐缓冲溶液作流动相，胞苷、 腺苷、尿苷和鸟苷4 种核苷酸混合物能得到满意分离，其色谱分离图如图3 1 9 所示。 离子液体的味唑基团具有给电子性能，因此s i l p r m l m 固定相是一个电子给予体。核苷 和核苷酸是一类强的电子接受体，它们与s i l p r m i m 固定相之间存在着电荷转移的相互 作用，此外，咪唑基团和核苷酸间存在一种结构相似的亲和作用力，所以，s i l p r m i m 固 定相显示对核苷酸有较好的分离效果。 3 3 2 3 对有机酸的分离 图3 2 0 为苯甲酸、水杨酸钠和问苯二甲酸在s i l p r m i m 固定相上的色谱分离图。3 种化合物都含有苯环和羧基，和固定相之间都可能同时存在疏水作用和静电相互作用。 3 种物质分子结构的不同是其所带羧基数量和羧基在苯环上的取代位置，苯甲酸的苯环 上有1 个羧基取代，与s i l p r m i m 固定相间的静电相互作用相对较弱；而间苯二甲酸有 2 个取代的羧基，空间位阻相对邻位来说较小，因此和固定相之间有较强的静电相互作 用；水杨酸钠分子结构中的1 个羧酸根和1 个羟基取代，互在相邻位，