（化学工艺专业论文）人参中农残的脱除及人参皂甙有效成分的提取新工艺研究.pdf

中文摘要 有机氯农残含量偏高是制约我国人参以及人参浸膏制品进入国际市场的重 要因素之一。在国家中药现代化和国际化进程中，利用绿色高效的超临界萃取 ( s f e ) 技术脱除中药材中残留的多种有机氯农药( o c p s ) ，具有重要经济与现 实意义。 本文在前期超临界c 0 2 脱除参类中药材中o c p s 农残的小试实验研究基础上， 进行了中试放大研究。实验以人参为原料，利用超临界萃取技术脱除人参中的有 机氯农残，以萃余物为原料按现行工艺提取人参浸膏，拟探讨一条既能有效脱除 人参中有机氯农残，又能保证人参中有效成分人参皂甙低损失率的新工艺集成路 线。 本文首先建立人参中的有机氯农残含量分析方法；按照中国药典( 2 0 0 0 版) 方法提取人参皂甙，利用紫外分光光度法检测总皂甙含量，并利用高效液相色谱 ( h p l c ) 分析其中单体皂甙r g l 、r e 含量。 通过中试实验系统考察了不同条件下进行超临界二氧化碳萃取时人参中有 机氯农残的脱除率与人参皂甙的损失率。研究表明，通过使用1 0 乙醇溶液静态 浸泡，在3 0 m p a 、6 0 条件下进行超临界萃取，有机氯农残的一次脱除率可在9 2 以上，而萃取物中人参总皂甙损失量 t c ，压力p 压力 p c ，物质便处于超临界状态。在这种状态下，它既不完全与一般的气体相同，又 不是液体，称为超临界流体( s u p e r c r i t i c a lf l u i d ，简称s c f 或s f ) 。s c f 粘度小、扩 散系数大，具有良好的溶解特性和传质特性，兼有气体和液体的优点。s c f 既有 与气体相当的高渗透力和低的粘度，又兼有与液体相近的密度和对物质优良的溶 解能力，还具有比液体分子大得多的能量和作用力。s c f 对溶质的溶解度取决于 其密度，密度越高，溶解度越大。当改变其压力和温度时，密度即发生变化。一 般来说，物质的溶解能力与其密度成正比关系。从而导致溶解度发生变化。利用 s c f 的这些特性发展起来的萃取分离方法o q s f e ，s f e 技术是指体系在超临界状 态下，从原料中萃取溶质，然后改变温度或压力，溶质和溶剂分离，从而达到萃 取的目的旧j 。 超临界流体萃取工艺具有以下四个主要特性【4 1 ： i 超临界萃取兼具精馏和液一液萃取的特点：由于溶质的蒸气压、极性及分子 量大小是影响溶质在超临界流体中溶解度的重要因素，使在萃取过程中被分离物 质间挥发度的差异和它们分子间亲和力的不同这两种因素同时起作用，如超临界 萃取物被萃出的先后常以它们的沸点高低为序，非极性的超临界二氧化碳仅对非 极性和弱极性物质具有较高萃取能力。 2 操作参数易于控制：仅就萃取剂本身而言，超临界萃取的萃取能力取决 于流体的密度，而流体的密度很容易通过调节温度和压强来加以控制，这样易于 确保产品质量的稳定。 3 溶剂可循环使用：在溶荆分离与回收方面超临界萃取优于一般液一液萃 取和精馏，被认为是萃取速度快、效率高、能耗少的先进工艺。 4 特别适合于分离热敏性物质，且能实现无溶剂残留：超临暴萃取工艺的 操作温度与所用萃取剂的临界温度有关，目前最常用的萃取剂c 0 2 的临界温度 由于接近室温，故能防止热敏性物质的降解，达到无溶剂残留。这一特点使超临 界萃取技术用于天然产物提取成为研究热点。 已研究过的萃取剂有多种，如：乙烯、乙烷、正戊炕、二氧化碳、乙醇、丁 醇、水等。在这些溶剂中，尤以二氧化碳以其无毒、无臭、无污染、不燃、不爆 和廉价，具有特殊的应用价值，是工业上常用的溶剂。在温度为5 5 3 l 、压 力为0 4 o 5 m p a 的条件下，亚临界的c 0 2 呈现出非极性溶剂的性质，可溶解分子 量小于4 0 0 的组分，特别是非极性组分f 6 j 。 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 技术，已大量被应用于中药领域的研究与开发h 1 1 。 1 2 1 超临界流体的性质及其萃取原理 物质有其固有的临界温度( t c ) 和临界压力( p c ) 。若温度t t c ，压力p 压力 p c ，物质便处于超临界状态。在这种状态下，它既不完全与一般的气体相同，又 不是液体，称为超临界流体( s u p r a c r i t i c a lf l u i d ，简称s c f 或s f ) 。s c f 粘度小、扩 散系数大，具有良好的溶解特性和传质特性，兼有气体和液体的优点。s c f 既有 与气体相当的高渗透力和低的粘度，又兼有与液体相近的密度和对物质优良的溶 解能力，还具有比液体分子大得多的能量和作用力。s c f 对溶质的溶解度取决于 其密度，密度越高，溶解度越大。当改变其压力和温度时，密度即发生变化。一 般柬说，物质的溶解能力与其密度成正比关系。从而导致溶解度发生变化。利用 s c f 的这些特性发展起来的萃取分离方法口q s f e ，s f e 技术是指体系在超临界状 态下，从原料中萃取溶质，然后改变温度或压力，溶质和溶剂分离，从而达到萃 取的目的m j 。 超临界流体萃取工艺具有以下四个主要特性【4 1 ： 1 超临界萃取兼具精馏和液液萃取的特点：由于溶质的燕气压、极性及分子 量大小是影响溶质在超临界流体巾溶解度的重要因素，使在萃_ 墩过程中被分离物 质问挥发度的差异和它们分子间亲和力的不同这两种因素同时起作用，如超临界 萃取物被萃出的先后常以它们的沸点高低为序，非极性的超临界二氧化碳仅对非 极性和弱极性物质具有较高萃取能力。 2 操作参数易于控制：仅就萃取剂本身雨言，超临界萃取的萃取能力取决 于流体的密度，而流体的密度很容易通过调节温度和压强来加以控制，这样易于 确保产品质量的稳定。 3 溶剂可循环使用：在溶剂分离与回收方面超临界萃取优于一般液一液萃 取和精馏，被认为是萃取速度快、效率高、能耗少的先进工艺。 4 特别适合于分离热敏性物质，且能实现无溶剂残留：超f 临界萃取工艺的 操作温度与所用萃取剂的临界温度有关，日前最常用的萃取剂c o ：的临界温度 由于接近室温，故能防止热敏性物质的降解，达到无溶剂残留。这一特点使超临 界萃取技术用于天然产物提取成为研究热点。 已研究过的萃取剂有多种，如：乙烯、乙烷、正戊烷、二氧化碳、乙醇、丁 醇、水等。在这些溶剂中，尤以二氧化碳以其无毒、无臭、无污染、不燃、不爆 和廉价，具有特殊的应用价值，是工业上常用的溶剂。在温度为5 5 3 i 、压 力为0 4 o 5 m p a 的条件下，亚临界的c 0 2 呈现出非极性溶剂的性质，可溶解分子 量小于4 0 0 的组分，特别是非极性组分”j 。 量小于4 0 0 的组分，特别是非极性组分6 】。 5 天津大学硕十学位论文 第一章文献综述 超临界二氧化碳萃取技术用于药物、食品等的提取和纯化方面尤其具有以下 优点： 1 t c 为常温( 3 1 2 ) ，p c 较低( 7 2 3 m p a ) ，临界点容易达到，适于分离热敏性 物质； 2 所用溶齐t j c 0 2 具有无毒、价廉、容易制取和回收、无味、不燃、不腐蚀、 价格便宜、易于精制、易于回收等优点； 3 具有惰性性质，一般不与被萃取物质发生反应； 4 与传统溶剂萃取法相比，无溶剂残留：同时避免了大量有机溶剂的使用， 防止了提取过程对人体健康的危害和对环境的污染； 5 超临界二氧化碳萃取还具有抗氧化灭菌作用，有利于保证和提高天然物产 品的质量。 上述的这些优势无疑为中药生产现代化提供了一种提取、分离、制备及浓缩 的全新方法【”。 1 2 2 超临界流体萃取技术与传统技术的对比 对比传统分离技术，s f e 技术的特点如下所述： 1 采用s f e 技术萃取分离，通常是在较低温度下进行，特别适用于分离热敏 性物质。而用一般的蒸馏方法分离含热敏性组分的原料，容易引起热敏性组分的 分解、聚合甚至结焦，虽然可以采用真空蒸馏，但降压对温度的降低有限，分离 热敏性物料仍然受到限制。 2 s f e 技术可同时完成蒸馏和萃取二个过程，可分离较难分离的有机混合物， 对于同系物的分离精制尤其具有优势。 3 s c f 具有优良的传递性能和较强的渗透力，有利于快速萃取和分离。 4 s c f 具有良好的选择性，密度可在相当宽的范围内随压力和温度的改变而 改变，操作方便，过程调整灵活。 5 。萃取率高，产品质量好。s f e 的密度接近于渡体，粘度又近似于气体。其 扩散系数比液体大1 0 0 倍左右，与液体相比，s c f 的传质性能更优异。因此，它 的萃取比通常液液萃取达到相平衡的时间短，萃取率高，同时还可提高产品质量。 在一些天然物质的萃取中，比传统萃取方法更能有效地保留易挥发的成分，保持 其原有品质。 6 节省能源。在s f e 工艺中，往往没有相变过程，只涉及显热。而通常的蒸 馏操作，必须给蒸馏塔提供大量的热能，所提供热能只有少部分得到有效利用， 大部分被冷凝器中的介质带走。若采用液液萃取，溶质和溶剂的分离和浓缩也往 往来用蒸馏和蒸发的方式，亦要消耗大量的热能。相比之下，s f e 节能效果相当 6 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 显著。 7 超临界c 0 2 是无毒溶剂。在食品、医药和日用化工等工业部门，不仅要求 分离的产品纯度高，而且应不合有毒有害物质。用有机溶剂萃取法往往不能满足 这一要求，采用s f e 技术则可防止有毒有害物质混入产品。 8 s f e 技术要求压力高，相应对设备的要求也高。 传统中药的制剂方法存在一些明显的不足，如：常常大量使用易燃的有机溶 剂，工艺步骤繁杂、耗费时间长，从中药提取到净化分离与纯化少则2 - 3 天，多 则近一周。无论水煮或有机溶剂的加热回流提取均由于较长时间的加热而易造成 热敏性成分的降解和挥发成分的损失。而且残留在有效成分中的有机溶剂很难通 过蒸发或干燥得以较彻底地去除。其总体结果是影响中成药的质量和稳定性。因 而，要生产出“安全、高效、稳定、可控”的现代中药，急需国人考虑对传统技 术的改造与更新。而新型绿色化工技术一超临界流体萃取可在一定程度上克服 上述一些瓶颈问题i “。 1 2 3 超临界c 0 2 萃取在控制痕量农残方面的应用 如前所述，超临界萃取技术具有工艺简单、无有机溶剂残留、操作条件温和、 不易破坏有效成分等优点，特别适合于从天然资源中提取脂溶性农残。另外，s f e 对极性和中等极性农残的萃取，可克服传统的萃取方法中因回收溶剂而导致样品 损失和对环境的污染；对于极性偏大的农残，可采用加入极性的央带剂如乙醇、 甲醇等，改变其萃取范围提高抽提率。近十几年来，超临界流体技术的应用研究 相当活跃，在化学工业、能源、燃料、医药、食品、香精香料、海洋化工、生物 化工、分析化学等都得到关注与应用，被列为我国中药现代化生产的关键技术之 一。这罩着重介绍其在控制痕量农残方面的应用。 农药指切能够阻止，破坏，驱避或减少害虫的物质或混合物”【8 】。根掘不 同的分类标准，农药可以分为许多不同的种类1 3j 。按其化学成分农药可分为有机 氧农药、有机磷农药、有机氮农药、氨基甲酸酯、有机氟农药等。不同种类的农 药其效用和毒性各不相同，一般说来，有机氯类农药容易通过在生物体内积聚引 起慢性中毒，而有机磷农药则容易引起急性中毒。目前，人们最为关注的农药为 含氯农药如六六六( b h c ) 、环氧七氯、d d t 、五氯硝基苯等以及一些有机磷农 药。 超临界流体技术用于痕量药检制样时目前最广泛使用的萃耿剂为c 0 2 。分析 型超临界萃取设备一般将s f 一次性放空，这一点与需要s f 循环操作的s f e 工 艺不同。超临界流体萃取技术用于制各痕量药检制样近十年来已有大量文章发 表。采用s f e 技术对各种基质( 如土壤、淤泥、水、植物、蔬菜及生物体等) 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 中的各种农残( 如有机氯农药、有机磷农药、特异性杀虫剂等) 的回收与检测策 略进行了报道0 1 。d i r ks t e r z e n b u c h 1 0 等用超临界技术分析了海底沉淀中的含氯 农药并与传统的溶剂法进行了比较，发现超临界萃取农残的效果与有机溶剂萃取 相当或优于有机溶剂萃取，且所需样品量少，对环境无污染，对研究人员无害。 研究表明，s c c 0 2 对非极性或低极性的农残如有机氯农药有较高溶解度，而对 中等极性的有机磷农药及其他强极性的农药，溶解度一般都很低。因而，许多研 究者采用加入适当的极性改性剂的s c c 0 2 从各种基质中回收极性的农残【9 】。另 外p a r k 和m a x w e l l 1 等针对不同物系将超临界萃取与吸附结合的在线吸附和非 在线吸附型制样方法，以便消除检测干扰背景物质，使预处理后的样品不需进一 步纯化而能直接进行仪器分析。 近年来，s f e 技术无论在中药农残检测制样方面，还是在农残脱除工艺的开 发方面，均引起国人的广泛关注。但由于中药材成份复杂，其中许多成分的结构 和理化性质等与农药相似，因而怎样使农残尽可能地回收而药用成份损失尽可能 低，是目前s f e 技术应用于中药农残脱除工艺的关键。有人采用s f e 与吸附相 结合的技术从啤酒花中去除农残时，首先除去了8 7 的农残，而后再通过改变 s f e 条件从啤酒花中提取出了有效成分苦味酸口“。在中药除农残方面可借鉴这一 方法。张曙明等【l 副在综述中药中农药残留量研究状况及安全控制时介绍了s f e 在该领域中应用，但目前s f e 技术直接应用于中药农残去除工艺的文献报道主 要为本实验室的发表的关于超临界农残脱除论文 1 4 - 1 8 】。 另外，s f e 原理用于仪器分析的超临界色谱( s f c ) 近年来也获得快速发展。 由于超临界色谱具有高效快速、操作条件易于交换等特点而成为一种比较理想的 药物分析分离方法。s f c 以s f 作为流动相，使其具有气相色谱( g c ) 的分离效 率和高压液相色谱( h p l c ) 的溶剂强度哆j ，从而可从复杂的基体中有效分离与 检测天然物中的待测组分，有些样品甚至不需要进一步纯化。从第五届国际 s f c & s f e 会议信息表明，s f c 继续朝着g c 和h p l c 难于分析的领域扩展，对 那些通常被认为难挥发、沸点高的物质通过改变参数，可按照化学类型或沸点进 行分离。近年来s f c 的论文很多 1 9 - 2 2 j ，在分析胺类、芳香油、鸦片碱等的应用 同益广泛。丌管柱型s f c 分离胺类、氨基吲哚效果良好：填充柱s f c 分离 内酰胺、安息香类镇静剂等已取得了成功 2 l 】；制备型色谱已经问世，它可用来纯 化不饱和脂肪酸，t e r f l o t l 2 2 用p r i k l e 型固定相制备苄丙酮香豆素，一次进样就可 分离5 m g 药物；刘志敏1 2 3 j 等用s f c 法分离测定银杏叶提取物含量，发现这种方 法定量结果准确，重现性好。另外，s f c 与g c 、h p l c 、薄层色谱及质谱等联 用，大大拓宽了s f c 的应用范围，特别是s f c m s 联用为分析高分子量和热敏 性化台物提供了重要的分析手段【2 4 】，是进一步开发的重要方面。 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 综上所述，s f e 技术既可用于从天然药物中提取分析有效成份，又可用于从 然药物中去除农残，具有广阔的开发前景。再加上入世后对s f e 提出了进一步 开发和应用的新要求，相信s f e 技术在中药现代化进程中将会发挥越来越大的 作用。 1 3 人参 人参为五加科植物人参( p a n a xg i n s e n gc a m e y ) 的干燥根，多年生草本， 高3 0 6 0 ，根茎短，直立。主根粗壮，肉质，纺锤形或圆柱形，下部有分枝，外 皮淡黄色。茎直立，单一，不分枝，有综纹，无毛，基部有宿存鳞片。掌状复叶 轮生茎顶。 人参生于海拔数百米的针阔叶混交林或杂木林子下，主要分布于中国、朝鲜、 俄国。我国野生人参分布于黑龙江、吉林、辽宁等省和河北省北部深山中。大约 在北纬4 0 度4 8 度，东经1 1 7 度1 3 4 度的区域内的各种类型的山地；园参在辽 宁和吉林二省有大量栽培，山东、河北、山西、湖北等省及北京地区亦有引种栽 培。此外，日本和韩国也有种植闭。 1 3 1 人参的分类 1 根据束源分类 ( 1 ) 野山参：野外生长的：( 2 ) 园参：人工栽培的。 这种分类方法说明了人参的来源。在临床应用上指导意义不大一般认为野 山参由于生长年限一般比较长，药用价值大于园参。现在山参极少，绝大多数为 园参。 2 根据产地分 ( 1 ) 高丽参：主要产于主要产于中国、韩国、俄罗斯及日本。( 2 ) 吉林参：主要 产于我国的吉林省。产于长白山的又称长白参。( 3 ) 西洋参：泛指大西洋西岸( 如 美国、加拿大) 所产者。产于美国的又称作花旗参。( 4 ) 种洋参：为我国和日本弓l 进种植的西洋参。从1 9 7 5 年起，我国在东北、北京等地大规模引种栽培近年来已 有大量商品应市。 以产地分类：说明了人参的产地、来源。因以前科学技术不发达，人参处于 野生或原始的生产方式，该地区的特定土壤、气候条件、造就了人参特有的优良 品质，如我国的长白山人参驰名中外。以产地分类为选用优质地道药材提供了依 据。但随着科学技术的发展，人工造就原产地生长条件日趋完善，随着人参的产 区也不断扩大，人参的产量、品质也在逐渐提高。 9 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 3 根据加工方法分 人参的加工方法和商品名称很多，现仅就市售常见品种列举如下。 ( 1 ) 人参鲜根整体加工时：由人参鲜根直接晒干制成的称为全须生晒参；人参 鲜根经过沸水烫后，再通过针刺用糖汁浸泡后干燥的称为糖参( 又名白参) 。 ( 2 ) 人参鲜根中部分加工时以主根为原料可分为：选用人参中的主根直接晒 干的称为生晒参；刮去人参主根外皮晒干称为白干参；新鲜的人参主根经过 蒸煮后干燥，支根较短者称为红参，支根较长者称为边条红参。若采用鲜根的支 根须为原料d n i ，直接晒干的称为白参须，经过蒸煮后晒干的称为红参须 2 6 1 。 从上可以看出人参加工成不同商品规格的主要区别在于： ( 1 ) 加工部位：全部“连根带须”加工出来叫全须参；主根加工出来的叫参；支 根、须根加工出来的叫参须。 ( 2 ) j n z 方法：如果采用加热蒸煮后干燥的叫红参；浸糖汁干燥后叫糖参；直 接晒干的叫生晒参。 1 3 2 人参的化学成分 人参的化学成分比较复杂，近代医学研究证明，人参含有人参皂甙类、挥发 油、有机酸及脂、甾醇及其甙、蛋白质、多肽、氨基酸及腐胺、精胺等其他许多 含氨化合物、维生素类、微量元素类、木质素、黄铜类、糖类、糖蛋白以及其他 许多成分【2 “1 。其中人参皂甙是主要的生物活性物质。日本学者s h i b a t a 等将人参 根中提取到的总皂甙称为人参皂甙r x ( g i n s e n o s i d e r x ) ，并根据薄板层析的 r f 值出低到高把人参皂甙命名等级，并测定了这些皂甙的化学结构。此后，人 们又从人参的茎、叶、花、果中相继发现了很多新的人参皂甙。至今已发现包括 r o 、r a 、r b l 、r b 2 、r c 、r d 、r e 、r f 、r g l 、r 9 2 、r 勘和r h 等四十余种人参皂 甙单体【2 8 - ”l 。人参中6 种人参皂甙r g i ，r e ，r b l ，r c ，r b 2 及r d 的含量约占人 参总皂甙含量的9 0 以上p 仉”j ，其中还含有两种西洋参没有的皂甙r f 和r g z ， 对这8 神皂甙的检测被视为对人参进行鉴别和质量检测的依据。人参皂甙属于三 萜类皂甙，按结构不同可分为三种类型【3 2 l ：一类是齐墩果烷型( o l e a n o n i ct y p e ) 五环三萜皂甙，其皂甙元为齐墩果酸( o l e a n o n i ca c i d ) ，此类皂甙普遍存在于含 有三萜皂甙类的植物中，自然界并不乏见。另两类是达玛烷型( d a n u n a r a n el y p e ) 的四环三萜类皂甙，它们在人参皂甙中占大多数，目f ；仃认为是人参的主要活性成 份之一。在达玛烷型人参皂甙中，依皂甙元不同，将此型皂甙分为两类，即皂甙 元为2 0 ( s ) 一原人参二醇的，均称为人参二醇型皂甙俾a n a x a d i o ls a p o n i n ，p d s l ， 有r a i 、r a 2 、r b l 、r b 2 、r e 、r d 、r 9 3 、r h 2 等；皂甙元为2 0 ( s ) - 原人参三醇 的，均称为人参三醇型皂甙( p a n a x t r o ls a p o n i n ，p t s ) ，有r e 、r f 、r g l 、r _ h l 和 0 2 0 ( s ) 葡萄糖人参皂甙r f 等。一般人参中含原人参二醇类皂甙为4 5 6 0 ， 原人参三醇类皂甙为1 2 2 0 ，含齐墩果酸类皂甙为7 1 0 。所谓人参二醇、 人参三醇并非是人参皂甙的真性皂甙元，因为真性皂甙元在酸性条件下，难以保 持原来形态。宋长春等从引进西洋参叶中分得人参皂甙2 0 ( s ) 一人参皂甙- r h l ，r h 2 和r h 3 3 2 , 3 3 。 1 3 3 人参皂甙应用研究进展 人参皂甙r 1 r 2r 3 f o r m u l a m w g i n s e o s i d er b l g i n s e o s i d er b 2 g i n s e o s i d er b 3 g i n s e o s i d er c g i n s e o s i d er d g i n s e o s i d er e g i n s e o s i d er f g i n s e o s i d er g l g i n s e o s i d er g a g i n s e o s i d er h f g l c o l c l o l c g 1 c g i c g l c g l c g 1 c 。g l c g i c h h h h h g l c g l c g i c a r a ( p ) 4 g l c x y l 2 ，g l c - a r a ( f ) 5 g l c g l c h g l c h h h h ，h h h 0 g l c 2r j l a 3 o - 1 3 i c 2 一g l c ，o g i c g l c 2 r h a g i c c 5 4 h 9 2 0 2 3 11 0 8 0 5 3 h 9 0 0 2 2 10 7 8 c 5 3 h 9 0 0 2 2 1 0 7 8 c s 3 h 9 0 0 2 2 1 0 7 8 c 4 8 1 - 1 8 2 0 i8 9 4 6 c 4 8 h 8 2 0 18 9 4 6 c 4 2 h 7 2 0 1 4 8 0 0 c 4 2 h 7 2 0 1 4 8 0 0 c 4 s h 7 2 0 i3 7 8 4 c 3 6 h 6 2 0 9 6 3 8 g i n s e o s i d er h ， + g l eh h c 3 6 h 6 2 0 s 6 2 2 1 g i c ：葡萄糖( g l u c o s e )2 - x y l ：木糖( x y l o s e ) 3 - r h a ：鼠李糖( r h a m n o s e ) 4 - a r a ( p ) ：阿拉伯吡糖( a r a b i ap y r a n o s e ) 5 - a r a ( f ) ：阿拉伯呋喃糖( a r a b i af u r a n o s e ) 图卜2 典型皂甙分子结构 f i g ，1 - 2s t r u c t u r e so f t y p i c a lg i n s e n o s i d e s 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 人参皂甙( g i n s e n o s i d e ) ：是j k 参的主要有效成分，主要分布于根部，其次为茎 和叶。各皂甙单体均具有其独特的药理作用，临床应用十分广泛。目前由于人参 皂甙尚未实现全化学合成，某些单体皂甙可从根、茎、叶部位提取以满足部分医 疗需要，但对于一些含量甚微、活性较强的单体皂甙如具有强效抗肿瘤活性的 r 出、i 池2 ，以及抗衰老先导化合物r g l 和r b l 等新药开发还较为困难。人参皂甙 主要分布在人参根部，其次为茎、叶。有文献报道【3 4 1 人参中人参皂甙含量约4 ， 多数为白色无定形粉末，或五色针状结晶。味微甘苦，具有较强的吸湿性。一般 对酸不稳定( 人参皂甙r o 除外) ，弱酸下即可水解，但在水解后得不到真正的 原形皂甙元。人参皂甙易溶于水、甲醇、乙醇，可溶于正丁醇、醋酸和醋酸乙酯， 不溶于乙醚、苯。此外，人参皂甙具有光学活性，在甲醇中呈现右旋性，水溶液 振摇易产生强烈泡沫。图1 2 为几种典型人参皂甙的结构【3 5 】 1 3 - 3 1 人参皂甙的生理活性 人参作为高档的滋补珍品已有几千年的历史，神农本草经一书详细介绍 了人参有“补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目开心益智，久服健 身延年”的功效。现代药理研究证明，人参中主要成分人参皂甙的生理活性 极为广泛，涉及入体中枢神经、心血管、免疫和消化等系统，并对机体合成代谢、 性腺功能等具有良好作用。各国学者通过制作人参的粗制剂或粗提取物，注射进 小鼠体内，研究其药理作用，大量结果表明：人参总皂甙具有延缓衰老、增加免 疫系统功能、抗疲劳、提高记忆力和增强神经反射、调节心血管和血液系统、抗 肿瘤的作用1 3 6 4 0 1 。 人参具有多种也要活性成分，其中人参皂甙为其主要的药用活性成分。每种 人参皂甙在药理方面又有其各自的特点。齐墩果酸型人参皂甙：人参皂甙r o ， 主要有抗炎、抗血小板释放作用。原人参二酵型人参皂甙：人参皂甙r b l 和r b 2 表现为中枢神经抑制、降低细胞内钙含量、抗氧化、清除体内自由基和改善心肌 缺血、镇痛、安神、消炎等作用。原人参三醇型人参皂甙：人参皂甙r 蜀则表现 为中枢神经兴奋，益智，促进蛋白质、d n a 和r n a 的合成等作用。人参皂甙 r e 可促进血清蛋白质合成，蛋白质分解酵素活性化，促进刺激副肾皮质荷尔蒙 分泌，是抗心律失常有效成分，可抑制吗啡诱发小鼠产生的耐药性等作用【3 7 】。原 人参二醇皂甙不具有溶血活性，而原人参三醇皂甙具有溶血活性等等【3 6 3 8 】。 另外，不同的人参单体具有不同的药理作用，有关人参皂甙单体成分的生理 活性研究，一直是很活跃的领域。各人参皂甙单体的生理活性【”】如下表l 一2 所 7 k 2 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 表卜2 单体人参皂甙活性列表 ! 呈! ! ：! 生i 墅匹垒! ! ! 宝! 翌墨盟! i 曼2 望也g ! 旦! ! 翌2 1 i 垒! 人参皂甙名称生理活性 人参皂甙r o具有抗炎、解毒、抗酵索以及细胞活性化作用： 人参皂甙r b 具有抑制中枢神经、催眠、镇痛、安神、消炎，促进血清蛋白质合成， 抑制中性脂肪分解，促进合成( 类似胰岛素) ，促进胆阉醇再合成， 蛋白质分解酵素活性化，促进d n a 合成； 人参皂甙r b 2具有抑制中枢神经作用，促进d n a 、r n a 合成，使分解蛋白质酵素 活性化，促进刺激副肾皮质荷尔蒙分泌，抗糖尿作用； 人参皂甙r c具有抑制中枢神经作用，抑制r n a 合成，促进血消蚩白质合成，蛋 白质酵素活性化，促进刺激副肾皮质荷尔蒙分泌； 人参皂甙r d具有促进副肾皮质荷尔蒙分泌作用； 人参皂甙r e具有抑制中枢神经，促进d n a 、r n a 合成，促进血清蛋白质合成， 蛋白质分解酵素活性化，促进刺激副。肾皮质荷尔蒙分泌； 人参皂甙r f 具有与脑神经细胞有关联的镇痛作用： 人参皂甙r g i 具有使中枢神经兴奋作用，抗疲劳、改善记忆与学习机能，促进d n a 、 r n a 合成，蛋白质分解酵索活性化i 人参皂甙r 9 2具有抑制血小板凝集，蛋白质分解酵素活性化作用； 人参皂甙r h t具有抑制癌细胞增殖、抗肿瘤作用； 人参皂甙r h ：具有抑制癌细胞增殖、抗肿瘤作用。 1 3 4 人参皂甙的提取分离与鉴定分析方法 1 3 ，4 1 人参皂甙提取分离方法 人类对人参中有效成分的提取研究，可以说有着上千年的经验积淀。迄今为 止，传统的人参总甙分离提取方法有索式法、渗漉法、煎煮法，以索式法为最佳； 工业应用最广的为醇法、水提醇沉法、醇一吸附树脂法、醇提醚( 酮) 沉淀法、 大孔树脂吸附法、硅胶柱层析法；新开发的现代方法有超临界流体萃取法、微波 提取法和超声波提取法。 下面列举了几种提取方法并作简要介绍： i 传统提取方法 ( 1 1 索式法 摄有代表性的传统提取方法就是索氏提取法。取一定量人参置索氏提取器 中，加适量氯仿加热回流数小时，弃去氯仿，药渣挥去氯仿，用乙醇继续进行索 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 氏提取，浓缩提取液。索氏法是经典的提取方法，应用范围较广，提取比较彻底； 缺点是提取时间长，提取物成分复杂，操作繁琐，约需2 个工作日 4 0 j o ( 2 ) 渗漉法和煎煮法 渗漉法采用溶媒和人参动态接触，人参中的有效成分逐渐溶解到溶媒中，浓 缩提取液。渗漉法溶媒用量大，有效成分不易完全浸出，既浪费药材，又影响疗 效：煎煮法受热时间长，温度商，对于热敏性有效成分易被破坏【4 “。 2 常用提取方法 ( 1 ) 乙醇法 以一定浓度的乙醇水溶液回流提取一段时间，减压回收溶剂，将残渣置于水 中，滤出不溶物，水溶液经乙醚( 或苯、石油醚) 萃取脱脂后，用水饱和的正丁 醇萃取皂甙，皂甙转溶于正丁醇中，减压蒸去正丁醇即得总皂甙粗品。 该工艺的优点是提取的人参皂甙r 訇及人参二醇含量较高，缺点是提取过程 繁杂，耗时较长，所得到的皂甙颜色较深，杂质含量高。考虑到工厂生产周期及 节约成本诸因素，人参采取乙醇回流提取法较为适宜。 张玲等4 】通过正交试验筛选乙醇回流提取最佳工艺条件，实验结果表明使用 7 0 醇浓度回流提取2 次，3 h 次，每次加入8 倍量乙醇，人参皂甙r g i 含量较高。 吴正中等【4 列通过正交实验对乙醇法提取工艺进行研究，结果发现，影响人参皂甙 提取的最主要因素是乙醇量，其次是乙醇浓度及回流时间，但随着提取时间延长， 并不会使提取率随之提高，提取时间6 0 m i n 时反而低于4 5 m i n ，这可能是受热时 间过长造成了有效成分被破坏所致。张崇禧等【4 3 l 通过对不同提取方法作对比实 验，证明乙醇法对人参皂甙的提取率能高达8 以上。 ( 2 ) 水提醇沉法 以蒸馏水煎煮人参须根一段时间，减压抽滤，将滤液浓缩至小体积，加乙醇 沉淀多糖、多肽等大分子物质，减压回收乙醇，加水去胶，过滤，以水饱和的正 丁醇萃取，正丁醇液通过吸附柱( 中性氧化铝和活性炭) 脱色，流出液减压回收 溶剂，真空于燥得到人参总皂甙。 该工艺的优点是得到的皂甙较纯，缺点是耗时长，过程繁杂，提取的人参皂 甙r g l 及人参二醇含量不如乙醇法的提取结果高】。 ( 3 ) 醇- 吸附树脂法 将乙醇提取液通过d 型吸附树脂柱( d 型大孔吸附树脂先用丙酮处理后装 柱) ，用水、不同浓度乙醇、氯仿洗脱，可得分组皂甙。水洗脱液中含非皂甙极 性成分，3 0 乙醇洗脱液中含人参皂甙r b 组分，5 0 乙醇洗脱液得r g 组分，9 5 乙醇洗脱液主要为弱极性组分】。该方法可获得相对较纯的人参分组皂甙，缺点 是耗时较长，需要大量乙醇作为洗脱液。 1 4 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 大孔树脂吸附法 大孔树脂比色法是指用大孔吸附树脂吸附人参皂甙后，先用水洗脱除去皂甙 中混杂的糖类等水溶性杂质，再用一定浓度的乙醇洗脱人参皂甙。该方法常用于 对人参皂甙进一步分离纯化制各单体人参皂甙。 人参皂甙可以完全吸附在树脂柱上，且易于解析回收，并且树脂在充分淋洗 后，可反复使用，方法简单、易行，适用于工业化生产，缺点在于工艺耗时较长， 溶剂消耗量较大。这种方法对纯化、分离植物中的皂甙有一定价值。 桂双英等 4 6 1 采用正交设计对人参总皂甙大孔树脂吸附法提取工艺进行优化， 实验结果表明人参总皂甙大孔树脂吸附法的最佳提取工艺为：以6 0 乙醇洗脱， 加入量为原料的8 倍，提取3 次，4 1 9 次。张崇禧等【4 1 以人参皂甙的收率为指标， 研究大孔树脂吸附人参总皂甙的性能及再生使用的条件，得出结论：以5 0 的乙 醇洗脱大孔树脂吸附的人参总皂甙，洗脱率在9 0 以上，纯度为6 0 ，可获得最 佳效果。 实践认为，先用乙醇法提取总皂甙，再用大孔吸附树脂比色法分离单体组分 效果较好。 3 现代提取方法 ( 1 1 微波提取法 称取人参须根粗粉，加入适宜浓度的乙醇溶液，于微波炉中低火提取一定时 间，用抽滤漏斗过滤，合并滤液，回收乙醇蒸干，用水溶解。水溶液经乙醚( 或 苯、石油醚) 萃取脱脂后，用水饱和的正丁醇萃耿人参皂甙，人参皂甙转溶于正 丁醇中，减压蒸去正丁醇即得总皂甙粗品。 张晶等 47 1 通过比较不同提取方法对人参皂甙提取率的影响，证明了采用微波 法，以乙醇作溶剂提取人参皂甙工艺节省时间，操作简捷，提取率较高。但此法 不宜采用中高火，否则会破坏皂甙s ( 2 ) 超声波提取法 称取一定量人参须根粗粉加入适量的溶剂浸泡一定时间，设定合适的提耿时 间、功率、温度，于超声波中提取，提取后，减压抽滤，滤液浓缩至小体积，经 乙醇沉淀多糖、多肽等大分子物质，减压回收乙醇，加水去胶，过滤，以水饱和 的正丁醇萃取，减压回收溶剂，真空干燥后得到人参总皂甙1 4 8 。 张崇禧等1 49 】通过对不同提取方法作对比实验，证明超声波法耗时较少，用水 作溶剂节省了成本、提高了安全性，低温操作避免了皂甙的破坏，此法对人参皂 甙的提取率最高，并且得到的皂甙纯度高、杂质少。 许多国家常用人参皂甙与其他中药配伍制成各种中药制剂。在国外，韩国、 日本等国家大量进口人参皂甙，但目前国内人参皂甙的提取工艺还存在着许多问 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 题，如成本高、提取效率低、有机溶剂污染、干燥温度过高而使人参皂甙结构发 生变化以及人参浸膏中农残无法脱除等。因此，制定科学、合理的人参皂甙提取 工艺，把成本降到最低，使操作更简便、更安全，同时确保人参皂甙药理活性， 是目前人参皂甙提取方法研究工作的最大的目标【5 们。 1 3 4 2 人参皂甙的鉴定分析方法 人参总皂甙的测定方法有：重量法、比色法、薄层层析比色法、大孔吸附 树脂比色法、气相色谱、液相色谱以及液质联用等等。下面作简要介绍： 1 比色法 ( 1 ) 直接比色法 由于人参皂甙本身不显颜色，用比色法测定之前先要进行显色反应。比色法 由于没有将皂甙的混合物分离，皂甙互相之间会有影响。直接比色法一般用来测 定总皂甙的含量。桂双英等【4 6 】采用比色法测定人参总皂甙。实验结果认为该方 法精密度高，重现性、稳定性均较好，平均回收率为1 0 0 6 1 ，可以用于人参药 材及含人参制剂的质量控制。 ( 2 ) 薄层层析一比色法 将薄层层析与比色法结合起来，先以适当的展开剂在薄层上将人参皂甙分 离，碘蒸汽中显色后，刮下斑点，溶于试剂中，进行显色反应，并测定吸收度。 这样的好处是减少了干扰成分的影响，可以以某一种皂甙为对照品进行初步的定 量测定。闻雅芝 5 q 等人用薄层层析法对人参多甙口服液主要成分黄芪甲甙进行定 性鉴别，采用草醛硫酸比色法鉴定黄芪甲甙的含量。实验结果认为本法简便易 行，结果稳定，可做人参多搪口服液中黄芪甲甙的含量测定方法。 ( 3 ) 大孔吸附树脂比色法 与薄层层析与比色法的目的相同，这种方法也是为了去掉干扰的杂质，尤其 是中药复方的分折中，干扰测定的组分较多，以吸附树脂净化柱对样品进行处理， 然后同样的显色方法在5 6 0 n m 处测定吸收度。刘颖欣 5 z 】等采用大孔吸附树脂比 色法测定人参酒中的人参总皂甙。大孔吸附树脂为有机高聚物吸附剂，具有良好 的吸附性能，试验证明，试验所用的d 型大孔树脂可将人参酒中的人参总皂甙完 全吸附，且易于解吸回收，方法简便。另外大孔吸附树脂除去供试液中的糖类等 水溶性杂质效果好，易于溶剂洗脱，易于比色测定。此法分离度高、影响因素小、 重现性好、方法易于掌握。 2 薄层色谱法 薄层色谱法在实现仪器化、自动化之前，只有薄层层析一种方法。随着薄层 扫描法的出现，能够在一定程度上实现分析的自动化和保证实验结果的重复性、 可靠性，因此大量的被应用到人参皂甙的分析上。一般的方法是以人参皂甙的提 j 6 天津大学硕士学位论文 第一章文献综述 取液点在某种类型的硅胶板上，用显色剂显色后，在不同的波长下扫描。如张瑞 琦等 5 3 将消栓通络片样品经2 的k o h 甲醇溶液皂化处理后，用薄层色谱分离 测定，建立了消栓通络片中人参皂甙r g l 的含量的检测方法，试验结果表明方法 灵敏准确。薄层色谱法还被用来测定含人参的复方制剂中的r e 和r g l 的含量1 5 4 ”1 。此外还有傅强等人【5 6 】依据人参皂甙r g 】在薄层板上分离效果较好和荧光分 光光度法高灵敏度的特点，建立了薄层色谱法一荧光分光光度法测定人参中人参 皂甙r gl 的含量。 3 气相色谱法( g c ) 由于人参皂甙本身不能够挥发，所以在用g c 之前要对人参皂甙衍生，进行 三甲基硅烷化反应，然后进气相色谱进行分析。用衍生化的方法同样可以对皂甙 元进行o c 测定。关紫烽等f 5 目通过对人参茎叶的提取和衍生处理后，采用毛细 管气相色谱法分析了人参茎叶中单糖的含量，测定出人参茎叶含有鼠李糖、阿拉 伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，结果证明该方法操作简便，可为人参质 量的评价提供一个可靠的依据。 4 扁效液相色谱法( h p l c ) h p l c 采用了新型高压输液泵、高灵敏检测器和高效微粒固定相，具有分离 效能高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广范的特点，特别适合于高沸点、 大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。对性质非常接近的同位素、 同分异构体、空间异构体、自旋异构体或光学导构的对映体有较好的分离效果。 h p l c 只要求样品能制成溶液，而不需要气化，因此不受样品挥发性的约束。对 于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物尤为有利。 人们发展了各种h p l c 方法用来分离人参皂甙。所用的色谱体系有正相色谱也有 反相色谱。用得最多的是反相色谱体系，所用色谱柱多为o d s ，也有m p g o d s ( m i c r o p o r eg l a s s o d s ) 的报道口2 1 。流动相体系以已腈水为多，也有甲醇一水 的，但因为甲醇在低波长下吸收较大，而人参皂甙的检测波长较低，般选2 0 2 r i m 左右，所以相比之下用已腈水体系相对较好。为了改善分离，还有在流动相加 入缓冲盐的报道。朱萱萱等【5 酬采用反十n h p l c 法测定药用人参中多种人参皂甙的 含量，不同产地药用人参中多种人参皂甙( r f 、r c 、r d 、r b l 、r b 2 、r 9 1 、r 9 2 、 r c ) 进行定量分析，流动相分别选用乙腈0 0 5 m o y l 磷酸二氢钠( v ：v = 3 0 ：7 0 ) 和 ( v ：v = 2 0 ：8 0 ) ，流速l m l m i n ，紫外检测波长2 0 3 n m 色谱柱：y m cp a r k a 3 1 2 0 d s ( s m m 1 5 0 m m i d ) ，柱温3 5 ，回收率均 9 6 9 0 ，r s d 0 5 6 。该法操作简 便，精确度高，重现性好，为评价药用人参的品质提供了参考依据。 采用高效液相色谱分析人参皂甙时，可选用不同检测器进行检测分析。其中 示差折光检测器为通用型检测器，但灵敏度差，不适合对梯度洗脱的过程进行检 天津大学硕十学位论文 第一章文献综述 测。蒸发光散射( e l s d ) 检测器是另外一种通用型检测器，用在人参皂甙分析 检测中能得到很好的效果。紫外检测器虽然是一种常用的选择型检测器，运用比 较普及灵敏度相对较高，因此目前多选用紫外检测器分析检测人参皂甙。 高效液相色谱法的应用很多，已经成为近年来颇受关注的一项技术。王隶书 5 9 1 等使用z o r b 出x c l 8 ( 4 6 m m 2 5 0 m m ) 色谱分析柱，以乙腈一o 4 磷酸水溶液 ( v ：v = 1 9 ：8 i ) 为流动相，检测波长2 0 5 n m ，实验结果表明h p l c 方法可靠，简 单可行，为建立清脑口服液的质量标准提供了科学依据。任杰等1 6 0 j 等建立一种反 相高效液相色谱法测定人参提取物及其胶囊中人参皂甙r b l 含量的方法，采用 h y p e r a i l c l 8 ( 2 5 0 m m 4 6 m m ，5 u x n ) 色谱柱，7 , n 水f v ：v = 3 0 ：7 0 ) 为流动相，检 测波长为2 0 3 n m 。凌芳等1 6 l j 等研究了高效液相色谱法测定人参提取物中人参皂 甙r h 2 含量的方法，结果表明，人参提取物中人参皂甙r _ h 2 的平均含量为o 3 2 ( n = 3 ) ，加样回收率为9 8 5 ( n - 5 ) ，方法准确，可靠，重复性好。 5 高效液相色谱质谱联用法( h p l c m s ) 液一质联用是近年来发展起来的一种新的大气压源的电离技术，其喷雾口末 端加上电压，液滴在吹扫气的作用下形成雾状气溶胶，液滴表面带上电荷，随着 液滴进一步蒸发，其中的样品分子从液滴中溅射出来成为带电离子，进入质谱仪 检测。根掘紫外光谱可大致判断其化合物类型，由电喷雾质谱得到各成分的分子 量，再由串联质谱获得进一步的结构信息，进而推测出其中主要成分的可能结构。 该方法在准确测定单体皂甙含量的同时能够测出其分子质量。徐智秀【6 3 l 等人 采用高效液相色谱质谱联用方法分析人参皂甙，以反相高效液相色谱法分离了 人参皂甙r b l 、r b 3 、r e 、r d 、r e 、r g l 、r 9 2 、r h 和r h z