显微镜的使用和微生物鉴定六部分.doc

下次仍要带预习报告来，概括的写就可以了，目的、原理、构造、使用操作步骤写写就可以了。本周二督导来查过，下周有可能还要来。 实验三 显微镜的使用和微生物鉴定一、实脸目的1.了解普通生物显微镜的分类、构造、工作原理及普通生物显微镜的使用、维护方法。2.学习并掌握油镜的原理和使用方法，熟悉几种常见微生物的基本形态。二、基本原理微生物学研究用的显微镜通常有低倍物镜（16mm，10）、高倍物镜（4mm，40-45）和油镜（l.8 mm，95-100）三种。油镜常在镜筒外标有白圈，它是三者中放大倍数最大的。使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n = 1.52与玻璃基本相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了（图l ）。图1 接物镜和标本之间不同折射率时的光线通路（A：空气，B ：香柏油）显微镜的分类：目前，显微镜根据结构和原理不同主要分为光学显微镜和电子显微镜，它们中又分成几种类型。 光学显微镜有明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、偏光显微镜和立体显微镜等。 明视野显微镜普通生物显微镜暗视野显微镜利用特殊的集光器，不使被照射物体的光线直接射入物镜，我们看到的是检测物体表面散发的散射光而观察到物体，所以实际是在暗视野中见到明亮的物象。这样可以观察比较透明的活的微生物，省去染色等步骤，能比较清楚的观察微生物的形态。 相差显微镜人眼能观察物体主要是物体所散发出的光线，光具有波粒二相性。波长对应的是颜色，振幅对应亮度。普通生物显微镜观察物体时的染色就是改变被观察物体的波长。但染色时，通常会破坏微生物内部的结构，如果不染色，它有时无法和它周围环境相区分。我们利用透明物体不能改变波长和振幅，但能改变相位的特性，相差显微镜把光线分解成直射光和衍射光，使之相互干涉，即能区分明暗，观察到物体。 荧光显微镜一一主要用于微生物内部结构的观察。一般通过荧光染色剂使特殊结构在特殊光源下发光，以便观察。 倒置显微镜主要用于观察需要进一步生长的活的微生物或动植物细胞。 电子显微镜利用光线波长的变化，主要用于观察微生物内部的结构。三、实验器材1仪器：普通生物显微镜2材料：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、曲霉、青霉等标本片、香柏油、二甲苯或乙醚-乙醇混合液（70：30）、擦镜纸。四、操作步骤和内容 1普通生物显微镜的一般构造 光学显微镜的基本结构如图2，都可分为光学系统和机械系统两大部分，只有在光学和机械二系统良好的配合下才能发挥显微镜的性能，因此要正确掌握显微镜的用法，必须了解显微镜的结构和原理。机械部分镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、推进器、粗调（10mm/圈）、微调（0.1mm/圈） 光学部分反光镜、聚光镜、光圈、物镜（10、40、100）、目镜（5、10、16），较好的显微镜还有光源。 镜座是显微镜的基座，使显微镜能平稳地放置在桌子上。 载物台是放置标本的地方，通常为方形或圆形。镜台上有压片夹用的固定被检标本，较好的显微镜则有标本移动器，转动螺旋可使标本前后和左右移动。有的标本移动器带有游标尺，可指明标本所在位置。 镜臂用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。镜筒是连接目镜和物镜的金属筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。物镜转换器安装在镜筒的下端，其上装有3-5个不同放大倍数的物镜，可以通过转动物镜转换器物镜。调解器安装在镜臂基部，是调节物镜与被检标本距离的装置，通过转动粗、细调节螺旋便可清晰地到标本。 目镜一般由两块透镜组成。上面一块称接目透镜，下面一块称场镜。在两块透镜中间或场镜的下方光阑。在进行显微测量时，接目测微尺便要放在视场光阑上不同的目镜上刻有5、10、15或20等字符以表示该目镜的放大倍数。可根据需要选择适当的目镜使用。 物镜是显微镜中很重要的光学部件，由多块透镜组成。根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三类，低倍物镜有4、10、20。高倍物镜有40和45等。油镜有90、95和100等。聚光镜（又称聚光器）安装在镜台下，是由多块透镜构成，其作用是把平行的光线聚焦于标本上，增强照明度。聚光镜的焦点必须在正中，使用聚光镜上的调节器可以进行调中。通过转动手轮调节聚光镜的上下，以适应使用不同厚度的载玻片，也能保证焦点落在被检标本上。但因聚光镜的焦距短，载破片也不能太厚，一般以0.9-1.3mm之间为宜。聚光镜上附有虹彩光阐（俗称光圈），通过调整光阑孔径的大小，可以调节进入物镜光线的强弱。 反光镜是普通光学显微镜的取光设备，使光线射向聚光镜、它一面是凹面镜，另一面是平面镜。有聚光镜的显微镜，无论使用低倍或高倍物镜均应用平面镜，只在光量不足时才使用凹面镜。没有聚光镜的显微镜，低倍物镜时用平面镜，高倍物镜及油镜均用凹面镜。 内光源是较好的光学显微镜自身带有的照明装置，安装在镜座内部，由强光灯泡发出的光线通过安装在镜座上的集光镜射入聚光镜。集光镜上有一视场光阑，可改变照明视场的大小。集光镜上可放置不同颜色的滤光片，以改变进入聚光镜光线的波长。图2 光学显微镜的构造1物镜转换器 2接物镜 3游标卡尺 4载物台 5聚光器 6彩虹光阑 7光源 8镜座 9电源开关 10光源滑动变阻器 11粗调螺旋 12微调螺旋 13镜臂 14镜筒 15目镜2显微镜的放大倍数与分辨率这是显微镜的两个重要参数。放大倍数目镜倍数物镜倍数分辨率R (resolution)指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径NA成正比，与入射光的波长入成反比。因此，物镜的数值孔径越大，光波波长就越短，则显微镜的分辨率越大，被检物体的细微结构也越能明晰地区分出来。因此，一个高的分辨率意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨率说成是多少m或nm，这实际上把分辨率和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨率是用可分辨的最小距离D来表示的。 式中：是光波波长；NA是数值孔径，指光线投射到物镜时，入射光线与折射光线之间的最大夹角（称为镜口角）的一半正弦乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，如右图3，可用下列公式表示：n介质折射率； 最大入射角，即镜口角。 图3 物镜的光线入射角1物镜前透镜 2载玻片 入射因此，光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能就越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，的理论限度为180，sin/2最大值为1。空气的折射率n = 1，水的折射率n=1.33，玻璃的折射率n =1.52。因为香柏油的折射率n =1.515，很接近玻璃的折射率。当光线通过载玻片后，几乎直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，当光线通过载玻片后，受折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这就降低了视野的照明度。利用油镜不但能增加照明度，更主要能增加数值孔径，提高显微镜的分辨率。图4 物镜的主要参数3显微镜的使用方法（1）取镜显微镜是光学精密仪器，使用时应特别小心。从镜箱中取出时，一手握镜臂，一手托镜座，放在实验台上。在使用时要特别小心。使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否完全合用，镜身有无尘土，镜头是否清洁。做好必要的清洁和调整工作。（2）调节光源a将低倍物镜旋到镜筒下方，旋转粗调螺旋，使镜头和载物台距离约为0.5cm左右。b上升聚光器，使之与载物台表面相距lmm左右。c左眼看目镜调节反光镜镜面角度（在天然的光线下观察，一般用平面反光镜；若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜），开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的照明为止。一般染色标本油镜检查时，光度宜强，可将光圈开大，聚光器上升到最高，反光镜调至最强；未染色标本，在低倍镜或高倍镜观察时，应适当地缩小光圈，下降聚光器，调节反光镜，使光度减弱，否则光线过强不易观察。（3）低倍镜观察低倍物镜（8或10）视野面广，焦点深度较深，为易于发现目标确定检查位置，故应先用低倍镜观察为宜。操作步骤：a先将标本玻片置于载物台上（注意标本朝上），并将标本部位处于物镜的正下方、转动粗调螺旋，上升载物台使物镜距标本约0. 5cm处。b左眼看目镜，同时顺时针方向慢慢旋转粗调节螺旋使载物台缓慢上升，至视野内出现物象后，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物象，及时确定需进一步观察的部位。c移动推动器。将所要观察的部位置于视野中心，准备换高倍镜观察。（4）高倍镜观察 将高倍物镜（40）转至镜筒下方（在转换物镜时，要从侧面注视。以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞），调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野中央，待油镜观察。（5）油镜观察a调螺旋提起镜筒，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。右手逆时针方向慢慢转动粗调螺旋，上升载物台，并及时从侧面注视使油镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止（注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头）。b左眼看目镜，右手顺时针方向微微转动粗调螺旋，下降载物台（注意：此时只准下降载物台，不能向上调动），当视野的标本物象时，改用微调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。c如果向上转动粗调螺旋已使镜头离开油滴又尚未发现标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。 d观察完毕，下降载物台，取下标本片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜的金属部件。 e将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。4几点使用技巧：（1）检查看到的是否是标本，只要移动玻片标本，如果物象随着标本移动，就可证明观察到的是否是标本。（2）如果在观察标本时，无论如何调整焦距都得不到清晰的图象，试将物镜拿下，重新用二甲苯擦拭后再观察。（3）一般情况下，物镜与标本的距离为低倍镜：7.63mm、高倍镜0.50mm、油镜0.098mm。（4）在调节焦距时，如果显微镜的各个镜头是原配，在低倍镜调节好时，直接转动转换器，在高倍镜和油镜下基本已经达到合适焦距，只要调节微调即可。5显微镜的维护 搬动显微镜时，必须一手持镜臂，一手托住镜座，切不可单手斜持。避免使用手、粗糙的纸、布等去擦拭镜面，如有灰尘需用擦镜纸或绸布拭擦，如沾油请用镜纸沾少量二甲苯擦净。使用完毕应检查